SU1621811A3

SU1621811A3 - Способ получени производных резоруфина

Info

Publication number: SU1621811A3
Application number: SU864027894A
Authority: SU
Inventors: Кляйн Кристиан; Батц Ханс-Георг; Херрманн Руперт
Original assignee: Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма)
Priority date: 1985-07-25
Filing date: 1986-07-24
Publication date: 1991-01-15
Also published as: JPS6236368A; JPS62174066A; CS549286A2; ES2002110A6; US5304645A; US4954630A; YU130286A; DE3526565A1; ATE55998T1; CS273617B2; EP0209875B1; CA1338320C; DE3673715D1; JPS62174067A; YU45348B; KR870001184A; EP0209875A1

Abstract

Изобретение относитс к гетероциклическим соединени м, в частности к получению производных резоруфина формулы 1а или 16 .СНЛ,С(0)ЦЦ ( где RI- Нили С1 в положении 2; H или С|-Сд-алкил; Кэ - Н, С(-С4-алкил или С1; Кд - Н или R -fR -аннелирован- ное фенильное кольцо; или 2; LI -N-CHu-CHu-N -CHu-CHfc, -N(CHs)-CHft-COO - или -С(0)-СН-СН,г-СНй-К-в свободном виде. 9 ил, -СН4-СНе;1,с-св зь, -С(0)-(, где ,2 штиЗ, -NH-NHCHuCH 2-,-C(0)CHaCHe- -С(0)-, -С(0)СН(ОН)СН(ОН)С(0)-; А - радикал, образованный из гидан- тоина, дифенилгидантоина, трет-бутил- оксикарбонил-Ь-тироксина, фенобарбитала , эстрадиола, 7-теофиллина, диг гоксигенина, дигоксигенинмонодигиток- созида, З-амино-3-дезокситетраиодо- тироуксусной кислоты, тироксинметило- вого эфира или ксантина, причем радикал - (CH$)m-C(O)-L4-L$-A при находитс в положении 4 и при - в положении 2, а в случае и п 0,8-6,4 L Н(СНа)СН«Ј(0) - или -С(О) - CH-CH -CHfc-N-CH -CHfc; Le - проста св зь и А - радикал, образованный из иммуноглобулина G, которые вл ютс флуоресцирующими метками низкомолекул рных или высокомолекул рных соединений. Цель - разработка способа получени указанных соединений . Получение ведут из соединени формул 1а и 16, где , вместо заместител LЈA имеетс реакционноспособный радикал , С1 или -О- -N-C(0)-CH$-CH2-C(0), и соединени формулы X4L(jA, где L. jj А - укаэа- но выше; Х4 - Н или (0)-CHg- (О), причем активные радикалы соединений могут иметь защитные группы , которые при необходимости удал ют с выделением целевого продукта (Л в свободном виде. 9 ил, 1 табл. Од Ю 00 04

Description

Изобретение относитс к химии гетероциклических соединений в частности к способу получени новых производных резоруфина общей формулы la .( или 16 ,

(сн2)тс(о)цъ2

О

/

ра или ксантина, причем радикал -(СНг)т-С-Ь1-1 -А при

находитс в положении 4 и при га«2 в положении 2, а в случае и ,8-6,4

Лг-Ґсн2о ш/ |

сн3 оо

2-(СН2)даС(0)Ъ1Ъ2

ОН

R« - Н или С1 в положении 2;

R$ - И или О -С 4га ки ;

Кэ- Н, СЦ-Сд-алкил или С1;

R4 - Н или Ra и R вместе образуют аннелированное фенильное кольцо,

или 2;

п-1,

Целью изобретени вл етс полу ние новых производных резоруфина о щей формулы It которые в качестве флуоресцирующих меток низкомолекул ных или высокомолекул рных соедине позвол ют повысить чувствительност и точность определени концентраци 30 компонентов проб крови.

Поставленна цель достигаетс т

О 35

,-J- ,

СНЭ .

кт OTJ -ГПГГ пап- V-C- что соединение общей формулы Ila UU ,tWi/ 1N /у или 116

СН3

L к- сЬ зь . - С - (СНо)л 21

О где ,2шиЗ,

-NH-,- NHCH2CH2-1

О

40

45

(

О

он i

о Т о

-ССН2СН2С-,-ссН(он)сн(ОН)с-R

IIII 4о

А - радикал, образованный из ги- 5° где R«-R4, m и Ъ, имеют указанные дантоина, дифенилгидантоина,вьшв значени

трет-бутилокс карбонил-L-тироксина , фенобарбитала, эстра- диола, 7-теофиллина, д гокси- генина, дигоксигенинмоноди- гитоксозида, 3-аминогЗ-дезок- ситетрайодотироуксусной кислоты , тироксинметилового эфиi L | - проста св зь и А - радикал , образованный из иммуно- глобулина G,

которые вл ютс флуоресцирующими метками низкомолекул рных или высоко- Молекул рных соединений и могут быть использованы в медицине в флуоресг центном иммуноанализе дл определени концентрации гаптека или антигена в пробе крови.

Целью изобретени вл етс получение новых производных резоруфина общей формулы It которые в качестве флуоресцирующих меток низкомолекул рных или высокомолекул рных соединений позвол ют повысить чувствительность и точность определени концентрации компонентов проб крови.

Поставленна цель достигаетс тем,

что соединение общей формулы Ila или 116

О

40

(,

О

WH CLjXj

он i

о

подвергают взаимодействии с соединением общей формулы III

jXal А

где Ьг и А имеют указанные выше значени ;

О.

Н или

-о0

:

причем активные радикалы соединений Ila или 116 и III могут иметь защит- ные группы, которые при необходимости удал ют, с выделением целевого продукта в свободном виде.

На фиг. 1 - 9 представлены кривые, по сн ющие способ.

Пример 1. з-(1-Дифенилгидан- тоииил)пронионил пиперазид резоруфин- 4-карбоновой кислоты.

а. Резоруфин-4-карбонова кислота.

16 г нитрозорезорцина, 15,5 г 2,6- диоксибензойной кислоты и 8,6 пиролюзита суспендируют в 200 мл метилового спирта, после чего суспензию охлажца- ют до . Затем к суспензии прибавл ют по капл м 10,6 мл концентрирован ной серной кислоты, после чего смесь дополнительно перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Выде- ливиуюс в виде окрашенного в красный цвет осадка резапурин-4-карбоно- вую кислоту отфильтровывают, промывают метиловым спиртом и Ъушат.

Производное диазорезорцина раствор ют в 200 мл воды и 50 мл 25%-ного раствора аммиака и раствор фильтруют. К окрашенному в голубой цвет фильтрату при охлаждении льдом прибавл ют порци ми 50 г цинковой пыли, причем реакционной смеси дают возможность нагретьс до комнатной температуры. За ходом восстановлени легко следить с помощью хроматографии в тонком слое (элюирующее средство:метиловый спирт - этиловый эфир уксусной кислоты в соотношении 1:1; DC-пластины с силика- гелем). Реакционный раствор фильтруют, а затем фильтрат подкисл ют лед ной уксусной кислотой и небольшим количеством концентрированной сол ной кислоты . Выделившуюс в осадок резоруфин- 4-карбоновую кислоту отфильтровывают и сушат в вакууме над п тиокисью фосфора .

Выход 16,33 г.

16218116

Rf (силикагель, элтоирующее средство: н-бутиловый спирт - лед на уксусна кислота - вода в соотношении 4:1: : ,4.

0

5

c

0

5 0

$ 0

б.Н,0,0-Триацетилдигидрорезору- фин-4-карбонова кислота.

12,9 г резоруфин-4-карбоновой кислоты раствор ют в 30 мл лед ной уксусной кислоты и 30 мл ангидрида уксусной кислоты, раствор смешивают с 27,6 г хлорида олова (II), после чего смесь перемешивают в течение 1 ч при 80°С. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл воды со льдом, производ т перемешивание в течение 1 ч, после чего осадок отфильтровывают. После сушки твеодое вещество раствор ют в 500 мл ацетона. Раствор фильтруют и фильтрат упаривают, в результате чего получают после сушки 11,3 г продукта.

Н-ЯМР(Д 4-ДМСО),(У: 2,24, 2,26 и 2,29 (по S, 9H); 6,94 (dd, ,5 и 2,2 Гц, 1Н); 6,98 (d, ,2 Гц, 1Н); 7,04 (d, Гц, 1Н); 7,61 (d, J 8,5 Гц, 1Н); 7,67 (d, Гц, 1Н) .

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,46.

в.Хлорангидрид Н,0,0-триацетил- дигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты .

38,5 г триацетата, описанного в примере 16, смешивают с 54 мл окса- лилхлорида и смесь охлаждают до 0°С. К охлажденной смеси прибавл ют несколько капель диметилформамида, после чего смеси дают возможность нагретьс до комнатной температуры. При этом растворение твердого вещества сопровождаетс выделением газа. Реакционную смесь упаривают в вакууме досуха, по ТРИ раза продукт раствор ют в 200 мл сухого хлористого метилена и раствор вновь упаривают досуха.

Выход 41 г.

г.N-трет-Бутилоксикарбонил (БОК)- пиперазин.

12,61 г N-бензгидрилпипераэина (EMPA-cheraie) раствор ют в 100 мл смеси 1,4-диоксана и воды, вз тых / в соотношении 3:t. К приготовленному раствору прибавл ют по капл м раствор 12,0 г ди-трет-бутилдикарбоната в

50 мл 1,4-диоксана. Смесь перемешивают в течение 0,5 ч, затем прибавл ют к ней по капл м 50 мл волы, фильтруют , после чего осадок сугаат,

Выход 16,2 г N-БОК-м -бензгидрил- пиперазина.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,92.

7 г N-BOK-N -бенэгидрилпиперазина раствор ют в 100 мл этилового эфира уксусной кислоты и 5 мл лед ной уксусной кислоты. Производ т гидрирование в присутствии 0,3 г паллади на активированном угле, после чего катализатор отфильтровывают, а фильтрат упаривают. Полученный остаток смешивают со 100 мл воды и 20 мл 1 н. раствора сол ной кислоты, фильтруют, фильтрат дважды экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, а затем водную фазу довод т до основной реакции путем прибавлени раствора гидро- окиси натри . Выделившийс в осадок маслообразный продукт экстрагируют дихлорметаном. После сушки органической фазы над сернокислым натрием и упаривани получают 3,2 г N-БОК-пипе- разина в виде маслообразного вещества которое спуст несколько суток полностью закристаллиэовываетс .

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на ук- сусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,05 с нингидрином становитс синим.

д.N -Бок-пиперазид Ы,0,0-триаце- тилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты .

К 25 г хлорангидрида кислоты, описанного в примере 1в, и 17,3 мл три- этиламина в 450 мл дихлорметана при 0°С прибавл ют по капл м раствор 13,8 г N-БОК-пиперазина в 50 мл ди- хлорметана. Реакционную смесь дополнительно перемешивают в течение 1 ч без охлаждени , затем три раза экстрагируют водой, после чего органическую фазу упаривают.

Выход 36,0 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,64.

е.N -БОК-пиперазид N-ацетилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты,

34,3 г триацетата, описанного в примере 1д, и 17,1 г сульфита натри

0

5

0

5 Q

0

с

0

перемешивают в течение 1 ч при в 500 мл смеси 1,4-диоксана и воды, вз тых в соотношении 1:1. После этогс реакционную смесь упаривают, остаток раствор ют в этиловом эфире уксусной кислоты, раствор отфильтровывают от нерастворимой соли, после чего фильтрат хроматографируют на 2 л силика- гел (элюирующее средство:этиловый эфир уксусной кислоты - дихлорметан в соотношении 4:1, как только начинает вымыватьс продукт, переключаютс на чистый этиловый эфир уксусной кислоты ) .

Выход 14 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: этиловый эфир уксусной кислоты - дихлорметан в соотношении 4:1)0,28.

ж.N -БОК-пиперазид резоруЛин-4- карбоновой кислоты.

5 г N-ацетильного соединени , описанного в примере 1е, раствор ют в 200 мл метилового спирта и 600 мл воды. К приготовленному раствору прибавл ют 1,8 г кислого углекислого натри и 10,7 мл 1 н. раствора гидроокиси натри , а затем 14 г калийгексациа- ноферрата. Реакционную смесь перемешивают в течение 0,5 ч при комнатной температуре, после чего рН смеси довод т до 5. Выделившийс в осадок продукт отфильтровывают с применением вакуума.

Выход 2,72 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,28.

з.Трифторацетат пипераэида резору- фин-4-карбоновой кислоты.

1 г БОК-проивводного, описанного в примере 1ж, выдерживают в течение 15 мин в 20 мл трифторуксусной кислоты . Затем реакционную смесь упаривают , остаток обрабатывают диэтиловым эфиром, после чего продукт отфильтровывают .

Выход 0,96 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,02.

и. Взаимодействие пиперазида резо- руфин-4-карбоновой кислоты с N-окси- сукцинимидным эфиром 3-(1-дифёнилги- дантоинил)пропионовой кислоты.

191 мг трифторацетата, описанного в примере 1з, и 210 мг N-оксисукцини9162181

мидного эфира 3-(1-дифенилгидантои- нил)пропионовой кислоты (получен из | натриевой соли дифенилгидантоина и этилового эфира 3-бромпропионовой кислоты) перемешивают в течение 15 ч в 20 мл диоксана и 20 мл О,1 М калий- фосфатного буферного раствора с рН 8,5. Выделившийс в осадок продукт отфильтровывают, фильтрат упаривают ./, и хроматографируют остаток на сили- кагеле RP 18 (элюирующее средство: изопропиловый спирт), в результате чего получают дополнительное количество продукта. Продукт кристаллизуют 5 из смеси этилового эфира уксусной кислоты и метилового спирта, в результате чего суммарно получают 250 мг сопр женного продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средст-эд во: хлороформ-метанол лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,61.

н-ЯМР(д16-ДМСО),д: 2,6-2,8 (т, 2Н); 3,0-3,8 (т, ЮН); 6,74 (d, J 25 2,2 Гц, 1Н); 6,82 (d, ,5 Гц, 1Н); 6,91 (dd, ,5 и 2,2 Гц); 7,25-7,33 (т, ЮН), 7,55 и 7,66 (по d, ,5 Гц, 2Н) млн .

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный бу- 30 ферный раствор с рН 7,5):flMQKC 576,8 нм.

Эмисси флуоресценции: 592 нм.

Пример 2. Взаимодействие пипе-г разида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром 3-(1-ди- фенилгидантоинил)уксусной кислоты.

По аналогии с описанным в примере 1и из 365 мг трифторацетата пиперази 40 да резоруфин-4-карбоновой кислоты и 339 мг N-оксисукцинимидного эфира 3-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают 210 мг (2-дифенилгидан- тоинилметилкарбонил)пипераэида резо- руфин-4-карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - лед на уксусна кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,82.

Н-ЯМР (Д16-ЛМСО),Я: 3,2-4,5 (га, sn ЮН); 6,60 (d, ,4 Гц, 1Н).; 6,71 и (d, ,5 Гц, 1Н); 6,80 (dd, ,05 и 2,04 Гц, 1Н); 7,39 (S, ЮН); 7,52 (d, ,5 Гц, 1Н); 7,61 (d, ,0 Гц, 1Н); 9,65 (S, 1H) млн. .55

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0): ,4 нм.

Эмисси флуоресценции:fl макс 592 нм.

10

П р и м е р 3. Взаимодействие пи- перазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром N-BOK -L-тироксина.

По аналогии с описанным в примере 1и из 212 мг трифторацетата пипера- зида резофурин-4-карбоновой кислоты и 419 мг N-оксисукцинимидного эфира N-BOK-L-тироксина получают 320 мг продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,58.

N-Оксисукцинимидный эфир N-BOK-L- тироксина получают следующим образом.

а) N-BOK-тироксин.

Раствор 10 г (12,5 ммоль) натриевой соли L-тироксина з смеси, состо щей из 300 мл смеси диоксана и воды в соотношении 2:1 и 15 мл 1 н. раствора гидроокиси натри , смешивают с 3 г (13,75 ммоль) ди-трет-бутил- дикарбоната (БОК)О, после чего реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре в услови х , исключающих доступ света.

Прибавлением 2 М раствора KHSO рН смеси довод т до 2, смесь экстрагируют этиловым эфиром уксусной- кислоты, экстракт, представл ющий собой раствор продукта в этиловом эфире уксусной кислоты, промывают водой, сушат над сернокислым натрием и упаривают. Твердый остаток растирают с петролейным эфиром, отфильтровывают продукт с применением вакуума и сушат в эксикаторе.

Выход 9,45 г (86% от теоретически рассчитанного значени ).

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - лигроин - уксусна кислота в соотношении 6:3:1)0,6.

б. N-Оксисукцинимидный эфир N-БОК- тироксина.

К раствору 8,8 г L-БОК-тироксина в 200 мл диметилового эфира этилен- гликол прибавл ют 1,2 г (9,5 ммоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаэдают до 10вС, после чего его смешивают по капл м с раствором 2,3 г (9,9 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 40 мл диметилового эфира этиленгликол . Реакционную смесь перемешивают в тече-. ние 2 ч при комнатной температуре, . выделившуюс в осадок дициклогексилмо- чевину отфильтровывают с применением вакуума, после чего фильтрат упариваП16218

ют в вакууме лри 40СС. Полученный остаток растирают с иэопропиловым спиртом и отфильтровывают с применением вакуума, а затем сушат в эксикаторе при комнатной температуре.

Выход 9,19 г Ы-(№-ВОС-Ь-тироксин) пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты (94% от теоретически рассчитанного значени ), общий выход по отноше-,,. нию к тироксину 81%.

Rf (HPTLC-RP 18; элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 9:1)0,8 или (HPTLC-RP 18; элюирующее средство; ацетонитрил - вода в COOT- jj ношении 8:2)0,6.

Н-ЯМР f(U ЛМСО) ,): 1,36 (S, 9H); 2,81 (S, 4H); 2,9-3,2 (m, 2H); 4,5- 4,9 (та, 1Н); 7,08 (S, 2H); 7,63 (d, Гц, 1Н); 7,90 (S, 2Н); 9,2 (S, 20 1Н) млн- .

Пример4. Сопр жение пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с 3-0- 3-(М-сукцинимидоксикарбонил)про- пил экстрадиолом.25

По аналогии с описанными примере 1и из 212 мг трифторацетата пиперазида реэофурин-4-карбоновой кислоты и 220 мг 3-0- СЗ-(М-сукцинимидилоксикар- бонил)пропил} эстрадиола получают 30 295 мг (З-карбонил)пропил эстрадиолилпиперазида резоруфин-4- карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, элюирующеб средство: хлороформ - метанол - лед на ук-,, сусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,58.

3-0-{.3-(ы-Сукцинимидоксикарбонил) пропил эстрадиол . получают обычным способом из 3-0-карбоксипропилэстра- 40 диола (получен из эстрадиола и бром- масл ной кислоты), и N-оксисукцинимида в присутствии дициклогексилкарбоди- имида.

Пример 5. Сопр жение пиперази- е да резоруфин-4-карбоновой кислоты с N з-(К-сукцинимидоксикарбонил)пропил фенобарбиталом.

По аналогии с описанным в примере 1и из 212 мг трифторацетата пиперазида , резоруфин-4-карбоновой кислоты и 205 мг ((М-сукцинимидоксикарбо- ннл)пропил фенобарбитала получают 220 мг Јм-(3-карбонил)пропил фенобарбитала резоруфин-4-карбоновой кислоты..

55

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) -0.45.,

5

,.

j

0

5

0

,

0

е

5

112

N-L3-(N-Сукцинимидоксикарбонил) пропил фенобарбитал получают обычным способом из фенобарбитал-1-масл ной кислоты и N-оксисукцинимида в присутствии дициклогексилкарбодиимида.

П р и м е р 6. Сопр жение пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром теофил- лин-7-пропионовой кислоты.

Из 212 мг трифторацетата пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты и 175 мг N-оксисукцинимидного эфира тео- филлин-7-пропионовой кислоты получают по аналогии с описанным в примере 1 и 200 мг М-(теофиллин-7-пропионил) пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,44.

N-Оксисукцинимидный эфир теофил- лин-7-пропионовой кислоты получают обычным способом из теофиллин-7-про- пионовой кислоты и N-оксисукцинимида в присутствии дициклогексилкарбодиимида .

Пример 7. Сопр жение N-оксисукцинимидного эфира Ы-(4-реэоруфи- нил-карбонил)саркозина с 1-(2-амидо- этил)дифенилгидантоином.

а.(трет-Бутоксикарбонилметил)ме- тиламид Н,0,0-триацетилдигидрорезору- фин-4-карбоковой кислоты.

10 т хлорангидрида кислоты, описанного в примере 1в, ввод т во взаимодействие по аналогии с описанным в примере 1д с трет-бутиловым эфиром саркозина.

Выход 7,5 г.

Rf (силикагель, .элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,77.

б.(трет-Бутоксикарбонилметил)ме- тиламид Н-ацетилдигидрорезоруфин-4- карбоновой кислоты.

7,5 г продукта, описанного в примере 7а, деацетилировали по анлогии с описанным в примере 1ж.

Выход 5,2 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на .уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,56.

в.- (трет-Бутоксикарбонилметил)ме- тиламид резоруфин-4-карбоновой кислоты .

4,5 г продукта, описанного в приере 76, ввод т во взаимодействие по налогии с описанным в примере 1ж.

Выход 2,6 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,t) 0,64.

г.N-(карбоксиметил)метиламид резо1 уфин-4-карбоновой кислоты.

0,55 г продукта, описанного в приере 7в, выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре в 6 мл три- торуксусной кислоты Затем реакционную смесь упаривают досуха, остаток растирают с диэтиловым эфиром, после чего продукт отфильтровывают.

Выход 0,45 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1)- -О, И.

д.N -оксисукцинимидный эфир N-(4- резоруфинилкарбонил)саркоэина.

200 мг продукта из примера 7 в те- чение 14 ч перемешивают с 72 мг N-ок- сисукцинимида и 138 мг дициклогексил- карбодиимида в 40 мл тетрагидрофурана Выделившуюс в осадок мочевину отфильтровывают , фильтрат упаривают и полученный остаток хроматографируют на силикагеле RP 18 (элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1).

Выход 150 мг.

Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1)0,79.

е.Сопр жение N -оксисукцинимидно- го эфира М-(4-резоруфинилкарбонил)сар Козина с 1-(2-аминоэтил)дифенилгидан- тоином.

125 мг N-оксисукцинимидного эфира из примера 7д перемешивают в течение 1 ч с 90 мг 1-(2-аминоэтил)дифенил- гидантоина в 40 мл смеси, состо щей из диоксана и калийфосфатного буферного раствора с рН 8,5, вз тых в соот ношении 1:1. Диоксан отгон ют от реакционной смеси, к остатку прибавл ют аммиак до полного изменени цвета, производ т фильтрование, после чего из фильтрата осаждают продукт прибавлением сол ной кислоты.

Выход №-(4-резоруфинкарбонил)сар- косинил-1-(2-аминоэтил)дифенилгидан- тоина 110 мг.

5

0

5

0

5

0

5

Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - лед на уксусна кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,78.

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0) :/lNvavt ; 575 нм.

Эмисси флуоресценции:fl нлцс т 572 им.

Примерв. 2-(1-Дифенилгидан- тоинил)этиламид резоруфин-4-карбоно- вой кислоты.

а.2-(1-Дифенилгидантоинил)этил- амид К,0,0 триацетилдигидрорвзоруфин- 4-карбоновой кислоты.

По аналогии с описанным в приме- ipe 1д 1,37 г 1-(2-аминоэтил)дифенил- гидантоина ввод т во взаимодействие с 1,2 г хлорангидрида М,0,0-триацетилт дигидрорезоруфинкарбоновой кислоты. В результате получают 1,9 г продукта в виде слабо окрашенного пенообразного вещества.

б.2-(1-Дифеннлгидантоинил)этил- амид резоруфин-4-карбоновой кислоты.

Полученный в примере 8а продукт окислительно деацетилируют по аналогии с описанным в примерах 1е и 1ж. Из 1,9 г вещества получают 600 мг N- 2т( 1-дифенилгидантоинил) этил резог руфин-4-карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,68.

Н-ЯМР ( -ДМСО),У: 3,2-4,6 (т, 4Н); 6,73 (d, ,2 Гц, 1Н); 6,84 (d, ,5 Гц, tH); 6,86 (dd, ,5 и 2,2 Гц, 1Н); 7,2-7,4 (т, ЮН); 7,62 и 7,66 (по d, ,5 Гц, 2Н); 8,66 (t, широкий, Гц, 1H)j 9,58 (S, 1Н) млн- .

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0): 575 нм.

Эмисси флуоресценции: дк 591 нм.

Пример 9. Сочетание пиперази- да 6-метилрезоруфин-4-карбоновой кислоты с N-окснсукцинимидным эфиром 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты .

а. 2-Метил-4-нитрозорезорцин.

19,8 г 2-метилрезорцина и 13,4 г гидроокиси кали раствор ют в 120 мл этилового спирта, после чего раствор охлаждают до 5°С„ После этого к : охлажденному раствору прибавл ют по капл м 24 мл изопентилнитрила, смесь

перемешивают в течение Зч, после чего отфильтровывают образовавшийс осадок. Окрашенное в желтый цвет твердое вещество перемешивают в - 200 мл 5 н. раствора серной кислоты. При этом в осадок надел етс окрашенный в светло-желтый цвет продукт.

Выход 22 г.

Rf (силикагель, элюирующее средст-tO во: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) «0,53.

б.6-Метилрезапурин-4-карбонова кислота.15

15,3 г 2 метил-4-нитроэореэорцина, 15,4 г 2,6-диоксибензойной кислоты, 8,8 г пиролюзита и 11 мл концентрированной серной кислоты ввод т во взаимодействие по аналогии с описанным в 20 примере 1а.

Выход 28,7 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1)5 0,15.,

в.Н,0,0-Триацетил-6-метилдигидро- резоруфин-4-карбонова кислота.

Из 10 г 6-метилрезапурин-4-карбо- новой кислоты, 19,8 г хлорида оло-. 30 ва (II), 20 мл ангидрида уксусной кислоты и 150 мл лед ной уксусной кисло ты получают по аналогии с описанным в примере 16 непосредственно триацети- лированное лейкосоединение. Неочищен- ,5 ный продукт очищают путем обработки кип щим ацетоном.

Выход 7,3 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на 40 уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,51. Q

Н-ЯМР (д 6-ДМСО),0: 2,10; 2,25; 2,29; 2.33 (по 12Н); 7,00; 7,09; 7,50 и 7,74 (по d, ,8 Гц, 4Н) . $

г.N -BOK-пипераэид N1 ,0,0-триаце- тил-6-метилдигидрорезоруфин-4 карбо- новой кислоты.

По аналогии с описанным в примерах 1г и 1д из 5 г К,0,0-триацетил-6-ме- JQ тилдигндрорезоруфин-4-карбоновой кислоты , 10,7 мл оксалилхлорида и 2 г (N-БОК-пиперазина получают 3 г продукта .

Rf (силикагель, элюирующее средст-55 во: этиловый эфир уксусной кислоты) «0,57.

д.Трифторацетат пиперазида 6-ме- тилреэоруфин-4-карбоновой кислоты.

1 г триацетильного производного, описанного в примере 9г, ввод т во взаимодействие по аналогии с описанным в примерах 1ж и 1з.

Выход 0,43 г.

е. Взаимодействие пиперазида 6-ме- тилрезоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром 2-( фенилгидантоинил)уксусной кислоты.

222 мг соединени , полученного в примере 9д, ввод т во взаимодействие с 200 мг N-оксисукцинимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты .

Выход N- (1-дифенилгидантоинил)ме- тилкарбонил пиперазида 6-метилрезору- фин-4-карбоновой кислоты 250 мг.

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буфер раствор, рН 8,0): $waKC 584 нм.

Эмисси флуоресценции: avtc 600 нм.

Пример 10. Взаимодействие пиперазида 9-окси-5-бензоЈа феноксазон- 8-карбоковой кислоты с N-оксисукцини- мидным эфиром 2-(1-дифенил-гидантои- нил)уксусной кислоты.

а.12-Оксид 9-окси-5-бензоСа фе- ноксазон-8-карбоновой кислоты.

2,84 г 1,3-диокси-4-нитрозонафтали- на, 2,31 г 2,6-диоксибензойной кислоты , 1,29 г пиролюзита и 1,6 мл концентрированной серной кислоты ввод т во взаимодействие по аналогии с описанным в примере 1а.

Выход 2,8 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - лед на уксусна кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,63.

б.12-Ацетил-5,9-диацетоксибен- зо СаЗ феноксазон-8-карбонова кислота.

По аналогии с описанным в примере 9в из 2,4 г 12-оксида Э-окси-5- бензо д феноксазон-8-карбоновой кислоты получают 1,8 г триацетилированного дигидросоединени .

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0.31.

в.М -БОК-пиперазид 12-ацетил-5,9- диацетоксибензо(а}феноксазил-8-карбо- новой кислоты.

1,6 г триацетильного соединени , описанного в примере 106, ввод т во взаимодействие по аналогии с примером -9г с оксалилхлоридом и N-БОК-пи- перазином.

Выход 1,2г.

5

Н-ЯМР (CDC19),: 1,49 (S, 9H): 1,12, 2,27, 2,46 (по S, 12H); 3,0- 3,9 (т, 8Н); 7,03 (d, Гц, 1Н); 7,16-7,94 (т, 6Н) .5

г.N - БОК-пиперазид 9-окси-5 бен- зо а 1феноксазон-8-карбоновой кислоты.

По аналогии с примером 1е из 0,93 г триацетильного соединени , полученного в примере 10в, получают 10 0,51 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующве средство; хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,69.5

д.Трифторацетат пиперазида 9-ок- си-5-бензо а1феноксазон-8-карбоновой кислоты.

Из 0,5 г БОК-эащищенного соединени , описанного в примере Юг, по 20 аналогии с примером 1з получают 0,5 г продукта.

е.Сопр жение пиперазида 9-окси-5- бензоЈа феноксазон-8-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром

2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кис- ™ лоты.

Из 50 мг пиперазида, полученного в примере 10д, и 150 мг N-оксисукци- нимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил ) уксусной кислоты получают по ано- 35 логии с примером 1и 70 мг N-Ј( 1-дифенилгидантоинил )метилкарбонилЗпиперазида 9-окси-5 бензо а2Феноксазон-8- карбоновой кислоты.

40

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотногаении 9:1: ;0,1)-0,57.

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный бу- 45 ферный раствор, рН 8,0): $мйкс 560 нм.

Эмисси флуоресценции: yi маке 615 нм.-.

Н-ЯМР (Сд 6-ЛМСО),д: 3,0-4,5 (m, SQ ЮН); 6,37 (S, 1H); 6,80 (d, Гц, и 1Н); 7,2-7,35 (т, ЮН); 7,35-8,0 (га, ЗН); 8,10 (dd, и 2 Гц, 1Н); 8,56 (dd, Гц, 1Н); 9,60 (S, 1H) .55

Пример 11. (1-Дифенилгиданто- инилметилкарбонил)пиперазид 8-этилре- эоруфин-4-карбоновон кислоты.

а. 6-Этил-4-нитрозорезорцин.

По аналогии с описанным в примере 9а из 7,5 г 4-этилрезорцина, 4,5 гидроокиси кали и 8 мл изопентилнитри- ла получают 6-этил-4-нитрозорезорцин в виде окрашенного в желтый цвет твердого вещества.

Выход 7,5 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,37.

б.8-Этилрезоруфин-4-карбонова кислота.

По аналогии с описанным в примере 1а из 7,4 г 6-этилнитрозореэор- цина, 6,8 г 2,6-диоксибенэойной кислоты , 3,9 г двуокиси марганца и 5 мл концентрированной серной кислоты получают после восстановлени с применением 8 г цинковой пыли 9,5 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,05. t

в.N -БОК-пиперазид Ы,0,0-триаце- тил-8-э тилдигидр оре з оруфин-4-кар боно- вой кислоты.

По аналогии с примером 16 из 7,7 г 8-этилрезоруфин-4-карбоновой кислоты, 15,4 г хлорида олова (II), 30 мл ле- д ной уксусной кислоты и 15,3 мл ангидрида уксусной кислоты получают N,0,О-триацетил-8-этилрез оруфин-4-кар- боновую кислоту, которую в виде неочищенного продукта подвергают дальнейшей переработке по аналогии с примером 1в непосредственно в хлорангид- рид кислоты и по аналогии с приме- ром 1д - в БОК-пиперазид.

Выход 4г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,86.

г.N -БОК-пиперазид 8-этилрезору- фин-4-карбоновой кислоты.

Из 4 г N -БОК-пиперазида ы ,0,0- трнацетнл-8-этилдигидро езоруфин-4- карбоновой кислоты получают по аналогии с примерами 1е и 1х N -БОК-пиперазид соответствующей карбоновой кислоты .

Выход 0,5 г.(

Rf (силикагель, элюирующее средст во: хлороформ - метанол - в соотношении 4:1)0,67.

д.Трифторацетат пиперазида 8-этил- резоруфин-4-карбоновой кислоты.

330 мг соответствующего БОК-пипе- разида выдерживают в течение 1,5 ч в 35 мл смеси, состо щей из дихлор- метана и трифторуксусной кислоты, вэ - тых в соотношении 6:1. Полученный после упаривани остаток обрабатывают днэтиловым эфиром, продукт отфильтровывают с применением вакуума и сушат..

Выход 350 мг.

Rf (силикагель, элюирукнцее средство: бутанол - лед на уксусна кислота - вода в соотношении 4:1-: 1)0,33,

е. Взаимодействие с N-оксисукцин- имидным эфиром 2-(1-дифенилгидантои- нил)уксусной кислоты.

По аналогии с примером 1 и из 325 мг трифторацетата пиперазида 8- этилрезоруфин-4-карбоновой кислоты 2 и 435 мг N-оксисукцинимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают 120 мг продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на 2 ( уксусна кислота в соотношении 9:1:

:0,1)0,43. .

н-ЯМР (д6 -ДМСО),д: 1,15 (t, J 7,2 Гц, ЗН); 2,52 d, ,2 Гц, 2Н); 3,1-4,0 (т, 8Н); 4,25-4,45 (т, 2Н); 3 6,42 (S, широкий, 1Н); 6,94 (d, J 9,0 Гц, 1Н); 7,3-7,5 (S, 11H); 7,68 (d, ,0 Гц, 1Н); 9,54 (S, 1H); 11,2 (S, широкий, 1Н) млн .

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буфер-, ный раствор, рН 8,0) :Яма)С(575 нм.

Эмисси флуоресценции: $MOW нм.

Пример 12. (1-Дифенилгиданто- инилметилкарбонил)пиперазид 8-хлор- д резоруфин-4-карбоновой кислоты.

а.8-Хлорреэапурин-4-карбонова кислота.

Из 17,3 г 4-хлор-6-нитрозорезорци- на, 15,4 г 2,6-диоксибензойной кислоты , 8,6 г пиролюзита и 10,7 мл концентрированной серной кислоты получают по аналогии с примером 1 а 8-хлор- резапурин-4-карбоновую кислоту.

Выход 17,1г.e

Rf (силикагель, элюирующее средство: бутанол - лед на уксусна кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,58.

б.М,0,0-Триацетил-8-хлордигидро- резоруфинкарбонова кислота. е

16,3 г 8-хлоррезапурин-4-карбоно- вой кислоты и 18,9 г хлорида олова (II) нагревают в течение 0,5 ч в 100 мл смеси лед ной уксусной кислоты

и ангидрида уксусной кислоты, вз тых в соотношении 1:1 при 80°С, после чего реакционную смесь выливают в 500 мл воды со льдом. Смесь перемешивают в течение 2 ч, осадок отфильтровывают и сушат над Sicapent . Твердое вещество раствор ют в 500 мл ацетона , после чего от раствора отдел ют фильтрованием остатки нерастворенного вещества. Фильтрат упаривают, причем после сушки остатка получают 12,3 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,39.л

ГН-ЯМР (д16-ЛМСО), О: 2,25 (S, ЗН); (S МО; 7,16 (d, ,8 Гц, Ш) 7,30 (S, 1Н); 7,76 (d, ,8 Гц, 1Н); 7,90 (S, 1H) млни .

в.N -БОК-пиперазид 8-хлоррезору- фин-4-карбоковой кислоты.

По аналогии с примерами 16, 1в, 1д и 1ж из 5 г М,0,0-триацетил-8-хлор дигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты получают 0,8 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,7.

г.Трифторацетат пиперазида 8-хлор- резоруфин-4-карбоновой кислоты.

По аналогии с примером 1з из 0,8 г БОК-защищенного соединени , полученного в примере 12в, получают 0,81 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в роотногаении 9:1:0,1) 0,07.

д.Сопр жение пиперазида 8-хлор- реэоруфин-4-карбоновой кислоты с N- оксисукцинимидным эфиром 2-(1-дифенилгидантоинил ) уксусной кислоты.

По аналогии с примером 1и из 400 мг трифторацетата пиперазида 8- хлоррезоруфин-4-карбоковой кислоты и 410 мг N-оксисукцинимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают желаемый продукт.

Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,38.

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0) : нм.

Эмисси флуоресценции: $какс 597 нм.

Пример 13. Сопр жение пипера- эида 8-хлоррезоруфин-1-карбоновой кислоты с (2-аминоэтил)амидом теофиллин- 7-пропионовой кислоты.

а.8-Хлоррезоруфин-1-карбонова кислота.

8,7 г 4-хлор-6-нитрозорезорцина и 7,71 г 3,5-диоксибензойной кислоты раствор ют в 200 мл метилового спирта. К приготовленному раствору при прибавл ют 4,8 г пиролюзита и порци ми 5,3 мл концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре , фильтруют и прибавл ют к раствору аммиак до изменени окраски на голубую, а затем 200 мл воды. Раствор фильтруют, фильтрат при охлаждении смешивают с 25 мл концентрирован- 2 ного раствора аммиака и 20 г цинковой пыли, после чего смесь дополнительно перемешива ют без охлаждени примерно в течение 15 мин. Затем к смеси прибавл ют 200 мг активированного угл , 2 производ т фильтрование, фильтрат подкисл ют до рН 2, после чего выделившеес в осадок производное разоруфина отдел ют с помощью центрифугировани .3

Выход 3,9 г.

Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - лед на уксусна кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,88.

б.N,0,0-Триацетил-8-хлордигидр о- резоруфин-1-карбонова кислота

Из 3,5 г 8-хлоррезоруфин-1-карбо- новой кислоты по аналогии с примером 16 получают 3,2 г продукта. t Rf (силикагель, элюирующее средст-4 во: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,43.

в.Трифторацетат пипераэида 8-хлор- резоруфин-1-карбоновой кислоты.

Из 3 г триацетильного соединени , полученного в примере 116, по аналогии с примерами 1в - 1з получают 1,4 г продукта.

Rf (силикагель, элюирующее средст- 5 во: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,08.

г.Взаимодействие пиперазида 8- хлоррезоруфин-1-карбоновой кислоты с с ( 2-аминоэтил)амидом теофиллин-7-про- пионовой кислоты.

По аналогии с примером 8 из 420 мг . пиперазида К,0,0-триацетил-8-хлорди3

Q 5 0 5 0

д

5

О

г

5

гидрорезоруфин-1-карбоновой кислоты и 300 мг (2-аминоэтил)амида теоф л- лин-7-пропионовой кислоты получают 190 мг N-С(теофиллин-7-пропионил)- 2-аминоэтил амида 8-хлоррезоруфин- 1-карбоновой кислоты.

Пример 14. Мечение иммуноглобулина G N-оксисукцинимидным эфиром N-(4-резоруфинилкарбонил)саркозина.

100 мг IgG человека раствор ют в 10 мл 0,1 М калийфосфатного буферного раствора с рН 8,0, после чего приготовленный раствор смешивают с 5 мг Н -оксисукцинимидного эфира N-(4-pe- эоруфинилкарбонил)саркозина (пример 7д). Реакционную смесь выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре , а затем хроматографирукт на Ultrogal АСА 202 (LKB) Ы-(4-реэоруфи- нилкарбонил)саркозинил-иммуноглобулин. При этом меченый белок вымываетс до свободного низкомолекул рного резо- руфина. Степень мечени определ ют с помощью измерени экстинкции. Она составл ет 3, т.е. молекула IgG св зана с трем молекулами производного резоруфина.

П р и м е р 15. Мечение иммуноглобулина G N -оксисукцинимидным эфиром (4-резоруфинилкарбонил)пиперидин-4- карбоновой кислоты.

а.К1-(4-Резоруфинилкарбонил)пипе- ридин-4-карбонова кислота.

2,0 г хлорангидрида Н,0,0-триаце- тилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты , описанного в примере 1в, по аналогии с примером 1д ввод т во взаимодействие с 0,9 г гидрохлорида метилового эфира пиперидин-4-карбоновой кислоты , по аналогии с примерами 1е и 1ж производ т деацетилирование и окисление , после чего продукт омыл ют раствором гидроокиси натри до N-(4-резоруфинилкарбонил ) -пиперидин-4-карбоно- вой кислоты.

Выход 0,9 г.

Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1)0,44.

УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,5): л/цацс.576,2 нм.

б.N -оксисукцинимидный эфир N-(4- р е зор уфинил кар бонил ) -пип еридин-4-кар- боновой кислоты.

Из 200 мг №-(4-реэоруфинилкарбо- кил)пиперидин-4-карбоновой кислоты, 240 мг (N-оксисукцинимида и 468 мг ди- циклогексидкарбодиимида получают по

аналогии с примером 7д 190 мг продукта .

Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1)0,7.

ИК (прессованный с бромистым калием образец):3415 (га, широкий), 1814 (т), 1773 (т), 1734 (S), 1626 (т), 1214 (га) .,

в. Мечение IgG кроликов N -окси- сукцинимидным эфиром №-(4-резоруфинил- карбонил)пиперидин-4-карбоновой кислоты .

10 мг IgG кроликов в 1 мл О,1 М калийфосфатного буферного раствора с рН 8,5 смешивают со 100 мкл раствора 1,9 мг N-оксисукцинимидного эфира И-(4-резоруфинилкарбонил)пиперидин- 4-карбоновой кислоты в 1 мл 1,4-диок- сана, после чего приготовленную смесь выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре. Это отвечает мол рному соотношению производного резору- фина и IgG кроликов 6,4:1. 2

После хроматографировани на АСА 202 (элюирующее средство: 0,1 М калий- фосфатный буферный раствор, рН 8,5) получают фракцию белка, котора имеет отношение поглощений А578/А$70 0,97, з соответственно степень нагрузки

3.4моль резоруфина на 1 моль IgG. Если в аналогичном опыте 10 мг IgG

кроликов смешивают с 20 мкл раствора активированного резоруфина, то при

1.05моль указанного красител на 1 моль IgG получают степень нагрузки 0,8.

Максимум поглощени меченного резо- руфином IgG около 578 нм. Раствор дает сильную флуоресценцию светло- красного цвета.

Если раствор меченного резоруфи- ном IgG в течение мес ца подвергают воздействию дневного света, то интенсивность флуоресценции уменьшаетс до 59% от первоначального значени , в то врем как аналогично полученный, но меченный флуоресцениизотиоцианатом IgG уменьшает интенсивность до 16%, а меченный красителем Texas Rot IgG - до 12%.

Пример 16. Определение ди- фенилгидантоина в сыворотке человека с помощью ФНИА.

1950 мкл (0,1 М натрийфосфатного буферного раствора (рН 7,8) смешивают с 5 мкл пробы (1), 25 мкл раствора антитела (2) и 25 мкл раствора дифенил5

- 5

о

О

5

гидантоин-резоруфина (3). Смесь выдерживают в течение 5 мин при 37°С, а затем измер ют флуоресцентную пол ризацию (длина возбуждающей волны 575 нм, длина излучаемой волны 594 нм, измерительный прибор - флуоресцентный спектрометр 650-10 Хитачи).

1.Проба: донорска сыворотка человека , дополненна известным количеством дифенилгидантоина. Дл получени калибровочной кривой примен ли донорскую сыворотку человека, котора содержит дифенилгидантоин в концентраци х , мкг/мл: а-2,5;б-5;в- 10; г - 20; д - 40.

2.Раствор антитела: 450 мкг антитела на 1 мл 0,1 М натрийфосфатного буферного раствора (рН 7,8).

Антитела получают обычным способом посредством иммунизации овец дифенил- гидантоином, который св зан с альбумином сыворотки крови крупного рогатого скота.

Антисыворотку очищают с помощью осаждени сульфатом аммони и хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе.

3.Раствор дифенилгидантоинреэору- фина (10 М): конъюгат дифенилгидантоина и резоруфина из примера 1и в

0,1 М натрийфосфатном буферном растворе (рН 7,8).

Результаты измерений, которые получают с растворами дифенилгидантоина 1а, 16, 1в, 1г и 1д, представлены на фиг. 1.

С помощью такой калибровочной кривой также могут быть определены концентрации дифенилгидантоина в пробах с неизвестным содержанием дифенилгидантоина .

Аналогичные калибровочные кривые также могут быть получены в тех случа х , когда вместо примененного выше конъюгата дифенилгидантоина из примера 1 примен ют конъюгаты дифенилгидантоина из примеров 2,7,8 или 10е.

На фиг. 2 - калибровочные кривые, полученные при применении конъюгата (1-дифенилгидантоинилметилкарбонил)пи- перазида резоруфин-4-карбоновой кислоты (пример 2); на фиг. 3 - то же, конъюгата М-(4-резоруфинилкарбонил) саркосинил-1-(2-аминоэтил)-дифенилгидантоина (пример 7); на фиг. 4 - то же, конъюгата 2-(1-дифенилгиданто- инил)этиламида резоруфин-4-карбоновой кислоты (пример 8); на фиг. 5 - то же,

25162

конъюгата 2-(1-дифенилгидантоинил)пи- перазидметилкарбонил.-пиперазида 9-окси-5-бензоЕаЗ-феноксазон-8-кар- боновой кислоты (пример 10).

Пример 17, Определение актив- ности эндогликозидазы резоруфин-высо- команнозным гликопептидом.

а.Мечение высокоманнозного глико- пептида Мг-оксисукцинимидным эфиром М-(4-резоруфинилкарбонил)-саркозина.

50 мг высокоманнозного гликопепти- да смешивают с 10 мл 0,1 М калийфос- фатного буферного раствора с рН 8,0. Раствор довод т до рН 8,0. Прибав- л ют к нему 25 мг м -оксисукцинимид- ного эфира М-(4-резоруфинилкарбонил) саркозина, растворенные в 3 мл диок- сана, через 1 ч еще раз прибавл ют такое же количество N-оксисукцинимид- ного эфира красител в 3 мл диоксана. Смесь перемешивают в течение 14 ч при комнатной температуре, затем производ т отгонку диоксана в вакууме, после чего остаток разбавл ют водой до 70 мл, а затем буферным раствором А (0,02М трис-HCl, 2 мМ хлористого магни , 2 мМ хлорида марганца (II), 2 мМ хлористого кальци , рН 7,2) до 140мл. Прибавлением водного раствора амми- ака рН довод т до 7,2. Образовавшийс при этом осадок отдел ют центрифугированием. Наход щуюс над осадком жидкость ввод т в заполненную Con А-сефарозой колонку (1х х15 см). Свободный краситель вымыва- ют буферным раствором А. Как только протекающа жидкость тер ет красную окраску, вымывают первую фракцию - реэоруфин-высокоманнозный гликопептид 2%-ным метилманнозидом в буферном растворе А в качестве элюирующего чсредства (приблизительно 100 мл). После этого элюируют вторую фракцию 2%-ным водным раствором метилманно- зида. Обе фракции подаергают диализу по отношению к воде и лиофилизуют. Обе фракции пригодны дл описанного ниже определени активности эндогликозидазы „

б,Определение активности эндогликозидазы .

Резоруфин-высокоманнозный гликопептид выдерживают в подход щем буферном растворе с эндогликозидазой, например в цитратном буферном растворе с рН 5,5 с эндогликоэидазой Н (проба 1). Параллельно готов т пробу, не содержащую эндогликозидазы (проба 2)

11

26

.Q

20 25 , 30

0

40

5

После инкубации обе пробы смешивают с Con А-сефарозой, после чего пробы встр хивают дл того, чтобы св залс резоруфин-высокоманнозный гликопептид. Меченный резоруфином пептид, у которого в результате активности фермента отщеплен фрагмент сахара, не св зываетс . Через 15 мин Con А-сефарозу отдел ют центрифугированием , наход щуюс над осадком жидкость довод т до рН 7,5, после чего измер ют флуоресценцию (возбуждение, например, 550 нм, эмисси 595 нм). Разница между пробой 1 и контрольным значением (проба 2) показывает количество расщепленного резо- руфин-высокоманнозного гликопептида и вл етс , следовательно, мерой активности фермента.

Пример 18. Соединение диги- токсигенин-З-гемисукцинат-Ы-гидрок.и- сукциьимидэфира с резоруфин-4-пипера- зидом карбоковой кислоты.

438 мг реэоруфин-4-пиперазида кар- боновой кислоты и 570 мг дигитоксиге- нин-З-гемисукцинат-Ы-гидроксисукцини- мид-эфира ввод т в 160 мл смеси диок- сан - вода 1:1. Раствор довод т до рН 8,5 5%-ным водным раствором карбоната кали и перемешивают 3 ч при комнатной температуре. Выпаривают ди- оксан, довод т до рН 1 и отсасывают осажденный продукт.

Выход 670 мг.

Rf (силикагель-HPTLC, средство текучести: бутанол - лед ной уксус - вода 4:1:1)0,64.

Rf резоруфин-4-пиперазид ка боно- вой кислоты 0,09.

Пример 19. Соединение резору- фина-4-пиперазида карбоновой кислоты с дигоксигенинмонодигитоксозид-(3Г- гемиглютарат)-N-гидроксисукцинимид- эфир ом.

Аналогично примеру 18 из 438 мг резоруфин-4-пиперазида карбоновой кислоты и 731 мг дигоксигенинмонодигиток- созид-(3 -гемиглютарат)-N-гидроксисук- цинимид-эфира получают 630 мг сырь . После хроматографии на силикагеле RP 18 (элюент:изопропанол - вода 2:1) получают 34 мг продукта.

Rf (силикагель-HPTLC, средство текучести: бутанол - лед ной уксус - вода 4:1:1)0,61.

Пример 20. Соединение N-(4- резоруфинилкарбонил)пиперидин-4-карбо- новой кислоты-N -гидроксисукцинимидэфира с З-амнно-3-дизоксидигоксиге- нином.

140 мг 3 амнно-3-дезоксидигоксиге- нина и 140 мг Ы(4--резоруфинилкарбо- нил)ггиперидин-4-карбоновой кислоты-N- гндроксисукцинимид-эфира из примера 15 перемешивают 2 ч в смеси из 80 мл 0,1М буферного раствора фосфата кали рН 8,5 и 120 мл смеси диоксанди- . метилформамид 1;1. Выпаривают при комнатной температуре до сухого и очищают на силикагеле RP 18 (элюент:градиент от 0,1% трифторуксусной кислоты в воде до 0,1% трифторуксусной кисло- $ ты в изопропаноле - воде 65:35).

Получают 30 мг продукта.

Rf (сшшкагель RP 18, средство те-, кучести: изопропанол - вода 1:1)0,60.

Rf аминодигоксигенина 0,55. 20

Rf резоруфин-Н-гидроксисукцинимид- эфира 0,71.

Пример 21. Получение N-(3- (резоруфин-2 -ил) тфопионил ) -тироксин- метилэфира путем соединени резору- 25 фнн-2-пропионовой кислоты с тироксин- метил эфиром,

а.Гидрирование 7-гидроксикумарина в дигидроксифенилпропионовую кислоту,

6,5 г 7-гидроксикумарина раствор -30 ют в 25 мл 5 М раствора едкого натра, 100 мл воды и 20 мл этанола и после добавлени 2 г Pd-активированного угл гидрируют при комнатной температуре и нормальном давлении. Отфильт- ровызают, подкисл ют и центрифугируют раствор.

Выход 90%,

НГ-ЯМР (nMCO-de, 2,4-2,9 (га, 4Н); 6,16-6,91 (m, 4H) млн-1.40

б.Резоруфнк-2-пропионова кислота. 40 ммоль дигидроксифенилпропионовой

кислоты и 40 ммоль нитрозореэорцина раствор ют в ДМФ, добавл ют 3 г двуокиси марганца и капл ми добавл ют 5 4 мл серной кислоты. Производное ре- зоруфинз отфильтровывают, раствор ют в аммиаке и восстанавливают цинком. Очистку продукта осуществл ют хроматографией на силикагеле (растворители: уксусный эфир - метанол 8:1).

Выход 25%.

MS (продукт ТМ S 2, EDM+429.

в.Сопр женна реакци -.

30 мг реэоруфин-2-пропионовой кис-„ лоты превращают с N-гидроксисукцини- кидом и морфолиноэтилизоцианидом в ДМФ Б активный эфир. Затем добавл ют 00 мг т роксинметилэфира и триэтил50

$

0

5

0 с

0

5

0

амина. По окончании реакции подкисл ют и очищают через сефадекс 1 Н 20/ЛМФ.

Выход 20 мг.

Пример 22. Получение N-(3-pe- зоруфин-2 -ил-пропионил)-аминоэтил- гидантоина сопр жением резоруфин-2- пропионовой кислоты с аминоэтилгидан- тоином.

Аналогично предшествующей реакции превращени получают соответственно из 150 мг аддукта 100 мг требуемого продукта.

Н-ЯМР (ЛМСО-а6),0: 6,27-7,95 (m, 5H); 7,34 (S, ЮН), .

Пример 23. Получение резору- фин-4-карбонова кислота(дигоксиге- нинсукциноил)пиперазида путем сопр жени резоруфин-4-карбонова кислота- пиперазид-трифторацетата с дигоксиге .HHH-CyK4HHOHn-N-rHflpOKCHCyKUHHKMKflOM.

1 ммоль исходных соединений преобразуют , как в примере 1. Получают 170 мг требуемого продукта.

Rf (сшшкагель, растворитель: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота 9:1:0,,19.

Пример 24. Получение М-(реэо- руфин-4-карбонил)аминодигоксигеншт- саркозина путем сочетани саркозин- N-оксисукцинимидового эфира резоруфин- 4-карбоновой кислоты с аминодигокси- генином.

0,174 ммоль каждого вещества превращают в требуемый продукт при условии примера 7е.

Rf (силикагель, хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота 9:1: :0,1)0,28.

Пример 25. Сопр жение 2-хлор- резоруфин-4-карбонова кислота-пипе- разид-трифторацетата-с дифенилгиданто- инуксусна кислота-N-гидроксисукцини- мидом.

Превращение осуществл ют аналогично примеру 1. Из 270 мг 2-хлор-резору- фин-4-карбонова кислота-пиперазид- трифторацетата и 173 мг дифенилгидан- тоинилуксусна кислота-N-гидроксисук- цинимид-эфира получают 20 мг Ы-(ди- фенилгидантоинилметилкарбонил)пипора- зид-2-хлоррезоруфин-4-карбоновой кислоты .

Rf (силикагель, растворитель: хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота 9:1:0,1)0,380

Пример 26. Получение резору- фин-4-карбонил-тетраиодтироацетил-пиперазида путем сочетани N-оксисукци- нимидового эфира тетраиодуксусной кислоты с пиперазид-трифторацетатом реэо- руфин-4-карбоновой кислоты.

а.Тетрайодотироуксусна кислота- N-гидроксисукцинимид-эфир.

Обычным образом (например, как в примере 21) из кислоты (500 мг) путем превращени с N-гидросукцинимидом и 10 морфолиноэтилизоцианидом получают активный эфир.

Выход 300 мг.

Rf (силикагель, растворитель: хлороформ - метанол - лед на уксусна 15 кислота 9:1:0,,87.

б.Сопр женна реакци .

0,18 ммоль исходных соединений превращают , как описано в примере 1, в диоксановый буферный раствор с вели- 20 чиной рН 8,5 и очищают через препаратный HPLC. ,

Выход 20 мг. Q

1Н-ЯМР (СД3ОД),0: 7,06, 7,11, 7,80, 7,85 (4S, 4Н); 6,35-7,58 (m, 5H).И

Пример 27. Сопр жение резору- фин-4-карбонова кислота-пиперазид- трифторацетата с 1-метил-3-(М-сукцин- имидокарбонилпропил)ксантином.

Превращение осуществл ют знало- Ю гично примеру 1.

Из 194 мг 1-метил-3-(Ы-сукцинимидо- карбонил)пропилксантина и 245 мг ре- зоруфин-4-карбонова кислота-пипера- зид-трифторацетата получают 110 мг 35 (1-метил-З-Ы-сукцинимидокарбонилпро- пил)ксантинил-пипераэида резоруфин- 4-карбоновой кислоты.

Rf (силикагель, хлороформ - метанол - лед на уксусна кислота 9:1: ю :0,1)0,43.

Прим ер 28. Определение теофил- лина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.

Опыты провод т так же, как описано 45 в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор 7,5 мкг/мл поликлонального антитела по отношению к теофиллину, в качестве раствора резоруфина (3) - раствор JQ 2,14 нмол/л (теофиллин-7-пропионова кислота)пиперазида реэоруфин-4-карбо- новой кислоты в соответствии с примером 16, а в качестве пробы - человеческую донорскую сыворотку со следую-55 щими добавками теофиллина, мкг/мл: а) 2,5; Ь) 5; с) 10; d) 20 ; е) 40.

В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг. 6.

С помощью этой кривой можно определ ть концентрацию теофиллина в исследуемых пробах.

Пример 29. Определение тироксина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.

Опыты провод т так же, как описано в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор 376 кг/мл поликлонального антитела по отношению к тироксину, в качестве раствора реэоруфина (3) - раствор 1,56 нмол/л (L-тироксин)-пипера- зида резоруфин-4-карбононой кислоты, полученного из соединени в соответствии с примером 3 после отщеплени от него с помощью трифторуксусной кислоты защитной ВОС-группы, а в качестве пробы - человеческую донорскую сыворотку со следующими добавками тироксина, мкг/0,1 л: а)3; Ь) 6; с) 12; d) 18; е) 30.

В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг.7. С помощью этой кривой можно определ ть концентрацию тироксина в исследуемых пробах с неизвестной концентрацией .

Пример 30. Определение дигок- сина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.

Опыты провод т так же, как описано в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор 440 нг/мл поликлонального антитела по отношению к дигоксину, в качестве раствора резоруфина (3) - раствор 0,25 нмол/мл М-(4-резоруфинил-карбо- нил)саркосинил-3-аминодигоксигенина (пример 24). а в качестве проб - человеческую донорскую сыворотку со следующими добавками дигоксина, нг/мл: а) 0,5; Ь) 1; с) 2; d) 3; е) -5.

В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг.8. С помощью этой кривой можно определ ть концентрацию дигоксина в исследуемых пробах с неизвестной концентрацией .

В гетерогенном иммуноанализе, прежде чем определить концентрацию свободного или св занного лиганда, необходимо разделение лиганда, св занного с антителом, и свободного лиганда1 посредством осаждени подход щими ществами или посредством применени антитела, св занного с твердым носителем . В гомогенном иммуноанализе исследуют образование комплекса антитело - лиганд в пробе без такого разделени . К методам гомогенного имму- ноанализа могут быть причислены, например , флуоресцентный Qnenching-ме- тод, флуоресцентный Enhancement-метод и флуоресцентный пол ризационный метод , при которых флуоресцирующее вещество примен ют в качестве метки.

Так как соединени , отвечающие общим формулам 1а или 16, имеют максимумы поглощени и эмиссии, которые в значительной степени лежат вне области биологического материала, мешаю- щего определению вследствие своей собственной флуоресценции, они особенно пригодны дл применени в флуоресцентном пол ризационном иммуноанализе (ФПИА). Кроме того, предлагаемые сое- динени при подход щем замещении обладают особенно высоким Stokes-пврвмеще нием, достигающим приблизительно 70 нм.

В основном ФПИА-способ базируетс на принципе обычного флуоресцентного иммуноанализа„

Если подход щий флуоресцирующий меченый лкганд возбуждаетс плоско пол ризованным светом до флуоресцен- ции, то в результате незначительных временных задержек между возбуждением и эмиссией молекула, прежде чем эмит- тируетс излучение9 поворачиваетс . Таким образом плоскость плоско пол ризованного света равным образом поворачиваетс на определенный угол, Множество молекул внутри этого короткого промежутка времени может привести в результата вращательной диффузии к известной депол ризации флуоресцентной эмиссии. Дл пол ризации эмиттировакной флуоресценции характерно то, что она тем больше, чем больше молекула, и, следовательно, чем мед- дленнее вращение. Эта зависимость мо жет быть использована дл измерени св зи лиганда с антителом, так как свободный меченый лиганд имеет меньший объем молекулы, чем комплекс, состо щий из меченого лиганда, св занного с антителом. Пол ризаци обратно пропорциональна концентрации определ емого лиганда, наход щегос в пробе.

Концентраци -меченого лиганда или аналога лиганда и необходимого дл такого иммунологического способа антитела определ етс в зависимости от

c 0

5

о 0 5 0 5

5

примененного измерительного прибора, а также от характерных свойств примененного меченого лиганда или аналога лиганда и самого антитела. Эта концентраци зависит также от подвергаемого определению лиганда и поэтому должна устанавливатьс эмпирически. Это установление может быть произведено посредством простой оптимизации.

Концентраци лиганда, который должен быть определен, в большинстве случаев колеблетс в области 10 - моль. Предпочтительна дл измерени концентраци лиганда в определ емой пробе составл ет 10 - 10 моль, наиболее предпочтительна - 10 - 10 /0моль. Более высока концентраци лиганда может быть измерена после разбавлени первоначальной пробы.

Измерение производ т при определенном значении рН, которое может находитьс в интервале 3 - 12. Обычно значение рН лежит в области 5 - 10, предпочтительно 6 - 9. Дл установлени и поддержани определенного значени рН во врем измерени могут быть применены различные буферные растворы, например боратный, фосфатный или карбонатный или трис-буфер. При использовании предлагаемых соеди нений не имеет решающего значени то, какой буферный раствор примен ют. Выбор определ етс , в первую очередь, в зависимости от примен емого антитела , лиганда, который должен быть определен, а также примененной флуоресцентной метки.

Метод ФПИА преимущественно осуществл ют при посто нной температуре, обычно при 10 - 40 С.

Точна зависимость между пол ризацией и концентрацией подвергаемого определению лиганда или аналога лиганда может быть определена по калибровочной кривой. Ее получают, измер значени пол ризации растворов с различными , но известными концентраци ми соответствующего вещества. Неизвестна концентраци лиганда в исследуемой пробе может быть определена затем по такой калибровочной кривой.

Соединени , отвечающие общим формулам 1а и 1в, могут широко примен тьс в качестве флуоресцентной метки.

Так, например,в иммунофлуоресцентной микроскопии в качестве антигена белки или целые клетки могут быть сделаны

33

видимыми с помощью флуоресцирующе меченного антитела. В соответствующих способах можно непосредственно наблюдать также распределение гаптена или антигена в клетке в том случае, когда в клетку ввод т в качестве флуоресцирующей метки соответствующее соединение, а затем производ т наблюдение , например, под микроскопом. При этом, в противоположность описанному выше гомогенному флуоресцентному имму ноанализу, флуоресцентные свойства производных резоруфина не измен ютс .

Недостаток известных красителей, которые примен ютс в качестве флуоресцирующей метки, например таких флуоресцеинов, как флуоресцеинизотио- цианат, или таких родаминовых красителей , как Texas Rot, заключаетс в том, что они флуоресцируют при относительно малых длинах волн. Кроме того, выход при реакции сочетани с соответствующим носителем чаще всего низок и образующиес в результате реакции продукты обладают плохой цвето- стабильностью.

Предлагаемые соединени , отвечающие общимформулам 1а и 16, флуоресцируют длинноволново при хорошей цвето- стабильности, причем они с хорошим выходом могут быть получены из соединени , отвечающего общей формуле На или 116, и соответствующего партнера,

примен емого дл реакции сочетани .

i.

Предлагаемые соединени могут быть применены дл мечени вещества и при других флуоресцентных иммунологических способах. Так, возможно мечение этими реакционноспособными соединени ми резоруфина и реагента другой комплек- сообразующей системы. При этом под комплексообразующей системой подразумеваютс все те комбинации веществ, которые, учитыва специфическую силу обменного взаимодействи , способны образовывать комплексы. Известными комбинаци ми вл ютс , например, гормон/спец , рецептор, биотин/авидин, про- изводное углевода/лектин и т.д. Например , меченный биотипом протеин может быть определен с помощью продукта сочетани , полученного из авидина и ре- акционноспособного соединени , отве- чающего общей формуле На или Нб. Кроме того, соединени , отвечающие общим формулам 1а и 16, могут быть применены при определении реагента

162

JQ

15 20 25

30

зэ

д« 50 ,,

181134

системы лектин - производное углевода .

При сортировании клеток в Fluorescent Activateo Cell Sorter применение наход т флуоресцирующие частицы латекса. Такие частицы могут быть хорошо флуоресцентно помечены, например , в результате реакции частиц латекса , содержащих гидроксильные группы , аминогруппы или же карбоксильные или сульфокислотные группы, с реакционноспособными соединени ми реэо- фурина, отвечающими общим формулам На или 116.

Соединени , отвечающие общим формулам 1а и 16, могут быть применены дл определени ферментов. Дл этой цели производное резоруфина, отвечающее общей формуле На или Нб, может быть св зано с субстратом, который способен расщепл тьс определ емым ферментом. Этот продукт реакции сочетани также вл етс соединением , отвечающим общей формуле 1а или 16. После взаимодействи меченного резоруфином субстрата, который не вступил во взаимодействие, может быть определена активность фермента. Например, реакционноспособное производное реэоруфина, отвечающее общей формуле На или Нб, может быть св зано с гликопептидом, причем полученный в результате этого продукт реакции сочетани может быть применен в качестве субстрата дл определени активности эндогликозидазы. Дл определени эндогликозидазы известно мечение соединени ми данзила. Производные резоруфина в сравнении с такими соединени ми отличаютс более высокой чувствительностью.

Недостаток известных соединений состоит в том, что длина волны их флуоресцирующего излучени находитс в области, где лежит излучение компонентов проб крови, что приводит к искажению результатов измерений. Это следует из кривой 1 на фиг. 9.

Очевидно, что при длине волны 525 нм, соответствующей максимуму флуоресценции известного соединени , сама проба испускает флуоресцирующее излучение, оказывающее мешающее действие . Максимум излучени кспускае-i мого предлагаемым соединением равеа1 по меньшей мере 590 нм. При этой длине волны фонова флуоресценци пробы крови значительно ниже, чем при

351621811

525 нм (максимум эмиссии известных соединений).

Таким образом, с помощью соединений , полученных по предлагаемому способу, можно без помех, вызываемых компонентами проб, определ ть содержание лигандов.

Claims

Формула изобретени

Способ получени производных резо- руфина общей формулы 1а или 16 ,

1снд,с№4

о

jKCH2)mC(OM.,Lj

де RI - Н или С1 в положении 2} RQ - Н или С -Сдгалкил; R3 - Н, С -Сд-алкил или С1; Кд - Н или RJ и RA вместе образуют аннелированное фенильное кольцо; m 0 или 2; п - 1,

- -СН2-С°°

СН3

ши-Ж V-c-: II О

L 0 сЬ зь , С (СНо)/) . 2,

О

где р - 1,2 или 3 ,

-NH-,-NHCH2CH2-,

-ССНоСНоС-,

IIII

оо

1

36

-ССН(ОН)СН(ОН)С-,

оо

А - радикал, образованный из ги- дантоина, дифенилгидантоина, трет-бутилоксикарбонил-Ь-ти- роксина, фенобарбитала, эст- радиола, 7-теофиллина, диго- ксигенина, дигоксигенинмоно- дигитоксозида, З-амино-3- дезокситетраиодотироуксусной кислоты, тироксинметилового эфира или ксантина, причем радикал -(CHg -C-L -Lg-A

при находитс в положении 4 и при в положении 2, а в случае и п 0,8...6,4

25

Ч

-НСН9С- ш/ I 2 I

CH О

О

L(j - проста

св зь и А - радикал, образо- 30ванный из иммуноглобулина G,

отличающийс тем, что сое- динение общей формулы На или 116

R,

35

I

(

о

СН2)

он 4

50 где Rj-R, m и L( имеют указанные значени ;

О

Х4 - Н, С1 или - О -

подвергают взаимодействию с соединением общей формулы III

де L и А имеют

Х - Н или

37t621811

XftLflA , указанные значени ;

о-к

О

У

пр ны уд ду

250

i

I

§да150100

:

4t

Ю 15 20 Z5 30 35 Концентраци дифенилшдантоина 6 пробе

Фиг.1

38

причем активные радикалы соединений ( На или 116 и III могут иметь защитные группы, которые при необходимости удал ют, с выделением целевого продукта в свободном виде.

J I I I I I H , I I .....,,, |

5 а а x л

юнцентрацив ИифениагиЭатюина Фиг. 2

50

О У/ОЯЯЯЯЯМ Кониснпраци Нифенитидон ючно 8 пробе фие.3

50

Ю J5 20 25 JO Я Концентраци ДФГ б пробе Фиг А

iff

ю а го а

Конценарщи ДФГ и араОе Фиг.9

9 V IS X 25 30 К «О Кои&мтрощ теофаплина

Фие.6

100-1

11 i-l I I I 11 f i I I I I I I f I I I 11 I 11 I I I I 11 t I I

-g -- g

Стандартный буфер

Фие.7

t г

Коииемтраци Лнвпина Ал

650 6 5600SSO $2S/n500

Фиг.9

Составитель Н.Нарышкова

Корректор М.Демчик

Редактор Л.Веселовска Техред М.Дидык

Заказ 4257ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д. 4/5

Корректор М.Демчик

Г 1