SU1441787A1 - Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к молекул рной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточньгх систем трансл ции дл  синтеза биологически активных полипептидов и белков in vitro. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевого про .дукта за счет увеличени  срока работы системы трансл ции. Способы получени  полипептидов в бесклеточных системах трансл ции обладают р дом пре- им:,1деств как по сравнению с химическими методами (отсутствие необходимо- . сти защиты активных групп, высока  оптическа  чистота продукта, относительно низка  cToTtMOCTb и др.), так и по сравнению с вариантами, в которых используютс  генно-инженерные ме- годы (предотвращение возможности деградации целевого продукта, отсутствие ограничений в отношении природы синтезируемого полипептида и др.). Основным недостатком всех известных способов синтеза палипептидов с использованием клеточного аппарата трансл ции  вл етс  их низка  эффективность . Предложенна  совокупность методических приемов (нейрерное удаление из сферы реакции синтезированного продукта-, непрерывное восстановление расходуемьгх в реакции низкомолекул рных веществ и введение системы регенерации АТР и GTP) обеспечивает функционирование аппарата трансл ции в длительном режиме и общее повьппе- ние зффективности процесса в несколько дес тков раз. Благодар  этому новый способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе может примен тьс  дл  препаративных целей. Особо важным представл етс  использование изобретени  дл  получени  полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков , т.к. производство их химическим путем  вл етс  дорогосто щим, а синтез при помоп(и методов генной инженерии - во многих случа х малодоступным . 2 ил. § (Л ( 00

Description

, . t i

Изобретение относитс  к молекул рной биологии и биотехнологии, а имен- но к использованию бесклеточных сис- |тем трансл ции дл  синтеза биологи- чески активных полипепт1одов in vitro. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевого продукта за счет увеличени  срока работы систе.мы трансл ции ,

В насто щее врем  разработан целый р д бесклеточных систем трансл ции на основе клеточ(гых экстршстов из различных прокариотическик и эукар ио- Т1«еских организмов. Все эти системы характеризуютс , низкой эффективностью процесса и обьшно обеспечивают синтез лишь нескольктос .молекул полипептида на рибосому. Основные причины столь низкой э4х|1ективности бескле точных систем трансл ции состо т в следующем:

1)бесклеточные системы трансл ции содержат ограниченное количество субстратов реакции, в первую очередь источников энергии (АТР .и GTP), Попы шение содержани  этих тсомпонеитов в системах имеет определелтггые пределы,

при превышении которых пабл одаетс  ингибирование системьг трансл ции

2)продукты распада субстратов реакции , В первую очередь ADP, AMP, GDP, фосфатЬ и пирофосфаты, ингибиторами системы трансл ции,

На происходит адсорбци  Поли пептида на иммунном сорбенте, специфичном к целевому полипептиду. Дл  более экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихс  AMP и GDP в АТР и GTP. Ву 4)ерньм раствор из блока 3- после адсорбции 1олипептида также проходит через систему регенерации АТР и GTP и через полупроницаемую мембрану . вновь поступает в реакцион1гую смесь, I П р и м е р 1 , Синтез белка оболочки вируса мозаики костра (BMV) на матрице BMV РНК. 4 в эукариотической системе трансл ции из зародьшшй пше- йигда в стандартной системе и в установке непрерывного действи .

Раствор (А) состо л из 20 мМ HE- FES, 2,1 мМ r-fg(oAc).j, 115 мМ КоАс, 1 мМ АТР, 25 мкМ GTP, 250 мкМ спермидина- 25 мкМ Г Н лейцина с удельной радиоактивностью 24 Ки/ммол и 25 мкМ каждой из осталььшх 9 .at-m- Г1окислот. 3 мл Инкубационной смеси, приготовлепной на растворе (А), содержали 80 пикомолей 80S рибосом, 20 пикомолей BMV РНК 4, 3,7 оп.ед, белковой фракции SlOO, 150. ед, активности ингибитора рибоиуклеаз из плацент человека. О, 1 мкг лейпелти- на, 0,1 мкг апротенина, 0,1 пеп- статипа. О, химостатииа. Кинетика синтеза белка оболочки в стан

3) сами продукты син.теза (полипеп-з; дгфтной системе при 25 С представлена

тиды) также могут быть ингиТ)Иторами отдельных стадий бесклетог ной системы трансл ции,

В насто щем изобретеь ии указан)ые причины устран ютс  за счет непрерь В 40 ного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного Восстановлени  исходной концентрации

низкомолекул рных веществ, расходую щихс  в процессе трансл ции, 45

Основна  реакци  (синтез) полил:еп- тида протекает в блоке 1 (фиг,1), В pe3yjnbTaTe ее расходуютс  свободные аминокислоты, АТР и GTP и образуютс 

на .2 (крива  1)

В параллельном эксперименте в установке непрерывного действи  к 3 мл той же К1 псуба11;ионной смеси непрерывно подавалс  раствор (А) со скоростью 0,6 мл/ч, а продукчъГ реакции отводи- . лись из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационнуто мембрану Х1 1-50. В резз льтате в каме- РУ , содвржап1ую бесклеточную систему трансл ц т. непрерывно подавались субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты ) и отводипись из нее продук- 1Ъ1. реакции (AltP, GDP, PJ, синтезирополипептид , AMP, GDP и неорганический5(| белок, оболочки). син .теза белка обо.почки в такой системе при 25°С в течение 15 ч представлена fta фиг. 2 (крива  2),

фосфат. Дл  IpeдoтвpaщeF и  остановки процесса из блока 1 происходит одновременно отбор GDP, AMP и PL и подача GTP, АТР и аминокислот из блока 2, Отбор синтезируемого полипептйда про 55 исходит (в блоке 3) через мембрану в резервуар, из которого буферны раствор с полипепттщом поступает в колонку с аффинным иммуносорбентом.

дгфтной системе при 25 С представлена

на .2 (крива  1)

В параллельном эксперименте в установке непрерывного действи  к 3 мл той же К1 псуба11;ионной смеси непрерывно подавалс  раствор (А) со скоростью 0,6 мл/ч, а продукчъГ реакции отводи- лись из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационнуто мембрану Х1 1-50. В резз льтате в каме- РУ , содвржап1ую бесклеточную систему трансл ц т. непрерывно подавались субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты ) и отводипись из нее продук- 1Ъ1. реакции (AltP, GDP, PJ, синтезирован ГоМ белок, оболочки). синван ГоМ белок, оболочки). син .теза белка обо.почки в такой системе при 25°С в течение 15 ч представлена fta фиг. 2 (крива  2),

Из сравнени  кинетических кривых 1 и 2 на фиг.2 можно сделать,следующие выводы;

Стандартна  бесклеточна  система трансл ции выходит, на плато по ринте- зу белка через ч, Количест1 о син-

тезированного белка при этом составл ет 0., 76 пикомолей белка оболочки на 1 пикомоль рибосом.

В Установке непрерывного действи  синтез белка оболочли идет линейно в течение исследованного интервала времени (15ч) и количество синтезированного белка за 15ч составило 40 пикомолей на 1 пикомоль рибосом, ю . В целом дл  предложенной модели установки непрерывного действи  эффективность синтеза белка за 15 ч возросла более чем в 50 раз.

П р и м е р 2. Синтез белка обо- is лочки фага MS 2 на матрице MS 2 РНК в прокариотической системе трансл ции Е. coll в стандартной системе и в установке непрерывного действи .

Раствор (А) содержал 20 мМ Tris- 20 HCl, рН l,l, 10 мМ MgCli, 100 мМ , 1 мМ APT, 0,2 мМ GTP, 5 мМ креатин фосфата, 10 мкг/мл кр. фосфат киназы, 25 мМ J лейцина с удельной радиоактивностью 348 мки/ммоль и 25 25 MicM каждой из остальных аминокисот , 3 мл Инкубационной смеси, приготовленной на буфере (А), содержали 1 наномоль рибосом 70S, 1 наномоль S2 РНК, 3,5 ед. A-jjp белковой ЗО фракции S100.

В параллельном эксперименте в установке непрерывного действи  к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подавалс  раствор (А) со скоростью g 0,5 мл/ч, а продукты реакции отводились из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтраЦионную ембрану РМ-30. В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему тран- Q сл ции, непрерывно подавались субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты ) и отводились продукты реакции (AMP, GDP, Pj , синтезированный белок ).45

Стандартна  бесклеточна  система трансл ции выходит на плато. По синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составл ет 1,1 пикомол  белка на 1 пикомоль ри- босом.

Сравнивают кинетику сиптоза белк;) оболочки п такой системе ттри 37 (; н течение 13 ч с кинетикой синтеза в стандартной бесклеточной системе,

В установке непрерывного дейст и  в течение 15 ч синтезировано 11 пикомолей белка на 1 пикомоль рибосом,

Таким образом-, предложенный спосо синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансл ции обеспечивает многократное Повьпцение скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме. В результате этого выход целевого продукта повышаетс  в несколько дес тков раз (по сравнению с npoToTimoM) , I

Достигаема  эффективность процесса позвол ет использовать способ дл  препаративного синтеза активных полипептидов и белков. Особо важное хоз йственное значение может иметь Получение этим способом полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем  вл етс  крайне дорогосто щим, а дл  методов генной инженерии - во многих случа х малодоступным.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции с использованием матри шых РНК с последующим выделением и очисткой конечного продукта, отл.ичающий- с   тем, что, с целью повьпиени  выхода целевого продукта за счет уве- ,личени  срока работы системы трансл ции , осуществл ют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекул рных веществ аминокислот , АТР, GTP, регенерацию АТР и GTP из образующихс  AMP н GDP с последующим возврап;ением регенерированных АТР и GTP в систему трансл ции.

   vf utfff/tue of. /frx 9ГР

   Omfof /f/I/A QSP,f

   Зародышей пшеницы

   40 30 , dfifpam t/rfcrfHfUffuHyrt

   Cfffe

   ffmfof eiMmt upjitHee fffftmued

   «/

   PHIC4 Si/pyca мозаики костра