SU1362021A1 - Штамм бактерии ЕSснеRIснIа coLI ВКПМ В-3420 - продуцент L-треонина - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микрс;- биологической проьышлешюсти и касаетс  НОВОГО штамма бактерий 5 продуцирующего аминокислоту L-треонин, котора  может примен тьс  в различных отрасл х народного хоз йства. Новый штамм- продуцент Ij-треонина Escherichia coli ВКПМ В-3420 (ВНИИгенетика-ТДГ-6) имеет гибридную ппазмиду, содержасцую ге ны треонинового оперона, блокирующие биохимическую деградацию L-треонина. Использование нового прод; а1,ента позвол ет повысить уровень на.коале1ш  L-треонина в ферментационной среде до 85 г/л, а также С1шзить удельный расход углеводного сырь  на 15-22% по сравнению с лучшими изБест а1№1 штам- мa a ;-пpoдyцeнтaми L-треонина. 2 табл. up Новый штамм бактерий PJscherichia coli ВКПМ способен накагьчивать до 85 г/л треонина за 54 ч ферментации . При этом удельный расход Сахаров составл ет 2 г/л. Новый штамм получен на основе штамма Е. coli ВШШгенетика 472 Т-23 и, сохран   его генетические особенности , отличаетс  от него неспособностью - к ферментативной деградации треонина , первый этап которой катализируетс  треониндегидрогеназой. Штамм Е, coli ВКПМ В-3420 получен путем передачи в исходный штамм Е. coli ВНИИгенетики 472 Т-23, инактивиро- нанного транспозоном Тп5, гена, кодирующего треониндегидрогеназу, методом s:

Description

общей трансдукдии бактериофагом F1, дзыращенным на клетках мутанного штамма Е. coli ИЗО, дефектного по трео- v да ид е ni др о г е н аз е.5

Транспозон Тп5 сообщает клеткам устойчивость к манамицину.

Таким образом, новый штамм в отличие от всек других продуцентов трео- 1-шна, созданных на основе Е, coli, . 10 не способен к превращению синтезиро- ванного им или добавленного в среду треонина в продукты деградации (амино- ацетон, глицин, , ацетил-КоА), .что способствует повышению, уровн  HaKoraie-fS ни  треонина в культуральной жидкости и снижает расход углеродного сырь ,

Штамм Е, coli. БКПМ-3420 (ВШИген.е- тика ТДГ-б) имеет следующие культу- рапьно-морфологические и физиолого- 20 биохимические признаки,

Морфолого-культуральные признаки, Грамотрицательные, слабоподвижные палочки с зaкpyглeнны и концами размером 1,5-2 мкм в длину,25

На м со-пептонном агаре через 24 ч роста при 37°С образует , беловатые , полупрозрачьые колою1и диаметром мм, поверхность колонии гладка , кра  ровные или спегка вол- 30 нистые, центр колонии приподн т, структура однородна , консистенци  пастообразна , легко эмульгируетс .

На агаризованной среде Адамса через 40-48 ч роста при or образует колOHiiJi 0,5-1,5 мкм в дiiaмeт- рб , серовато-белые, полупрозрачные, слегка выпуклые, с блест  1;ей поверхностью .

На м со-пептонном бульоне удельна  Q скорость роста при 37°С 1,2-1,3 После 24 ч роста - сильное равпомер- ное помутнение, небольшой осадок, запах характерный.

На жтздкой ьн1шмальной среде А,цам- 45 са удеиьна  скорость роста при 37 С 0,1-0,2 Ч , Через 2 сут роста с аэрацией - сильное равномерное помутнение, 3 an ах X ар акт ер ный,

По уколу в м со-пептонном агаре хо роший рост по BceNjy уколу,

11изиа11ого-био,химические признаки, Желатину не разжижает. Хороший рост с ко.агул цией молока. Индол образует. Хорошо растет на сахарозе, глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, кошо- зе, фруктозе, глицерине,. MaiiiDiTe с образованием кислоты и газа.

0

5

0

r

Q

5

0

5

Устойчив к пенициллину и к&иамицину ..

Клетки содержат многокопийную плаз- миду pYN7 (мол,мае, 5,8 мегадальтон), обеспечивающую устойчивость к пенициллину и несущую гены треонинового опе- рона.

Устойчив к L-треонину и L-гемосери- ну,.

При росте в присутствии L-треонина аминоацетон не образует.

Получение L-треонина с использованием нового штамма-продуцента осуществл етс  следующим образом.

Клетки штамма-продуцента Е, coli выращивают на агаризованной среде Адамса в присутствии пенициллина, затем суспензией клеток, смытых со скошенного агара, засевают жидкую пита- тел-ьную среду, содержащую источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, питательную добавку в виде гидролиз ата белок содержащих субстратов и пенициллин. Посевной материал выращивают в ферментере, оснащенном системой рК-статировани , при рН 6,8- 7,2, температуре 36-38 0 и непрерывном аэрировании перемешивании в течение 20-24 ч. Приготовленный посевной материал в 10-15% используют дл  засева ферментационной среды, содержащей источник углерода, например сахар или мелассу, источник азота и необко.цимые минеральные соли, Ферментацию осуществл ют в ферментерах, оснаценных системой рН-статировани  , при рН 6,8-7,2, температуре 36-38 0 и непрерывном аэрировании и перемешивании , В качестве рН-статирук цего агента примен ют аммиачную воду или сбалансгпровашгую по углероду и азоту ам миачно-углеводную подпитку. Продолжительность ферментации 40-60 ч, К концу культивироваш1Я в культуральной жидкости накапливаетс  до 85 г/л треонина. Удельный расход источника углерода на синтез Г г треонина составл ет 2 г, Накопление аминоацетона в культуральной жидкости отсутствует,

Пример 1, Культуры Е, coli ВНИИгенетика 472 Т-23 и штамма Е, coli ВКГШ В-3420 параллельно выращивают на агаризованной среде Адамса, содержащей сахарозу (0,2%) и пенициллин (500 ед/мл) и засеивают ими жидкостную посевную среду следующего состао   7 9 с  , /о

Сахароза Аммоний сернокислый Аммоьшй фосфорно- кислый двузамещенный Магний сернокислый 7-водный Калий хлористый Железо (Ц) сернокислое Т- водное Марганец (II) сернокислый 5-воднь1й Дрожжевой экстракт Бензилпенициллинат натри  Вода :

Пос.евной материал выращивают в ферментерах емкостью 0,5 л при аэрировании 0,5 л воздуха в 1 мин и перемешивании со-скоростью 900 ,об/мин при 37°С, Значение рН поддерживаетс  в пределах 6,8-7,2 путем автоматичес кой подачи по сигналу от датчика рН сахаро-аммиачной подпитки, котора  готовитс  смешиванием 6,5 объемов стерильного 40%-ного раствора сахарозы с одним объемом 14,7 н, аммиачной воды. Через 20 ч культивировани  50 мл культуры внос т в ферментационную среду следующего состава, Z: Сахароза3,0

Аммоний сернокислый0,5

Аммоний фосфорнокис- льй двузамещенный0,12

Калий хлористый0,06

Натрий хлористый0,06

Магний сернокислый 7-водный 0,04

Железо (II) серно- ,.,-кислое 7-водное0,002

Марганец (II) сернокислый 5-водный0,002 ВодаОстальное Ферментаци  осуществл етс  в ферментерах емкостью 0,5 л при аэрировании 0,5 л воздуха в 1 мин и перемешивании со скоростью 900 об/мин при

О

температуре 37 С. Значение рН поддерРедактор Л,Вельска 

60

Составитель В.Варламов Техред М. Мрргентал

Заказ 3087

Подписное

Тираж 486

ВНШШИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

620216

живаетс  в пределах 6,8-7,2 .путем автоматической подачи по сигналу от датчика рН сахароаммиачной подпитки, - приготовление которой указано выше. Ферментацию провод т в течение 48 ч, Показатели процесса биосинтеза треонина через 48 ч ферментации приведе- ны в табп, 1,

10Пример 2, Выращивание штаммов на посевной и, ферментационной средах ведут в услови х, аналогичных примеру I, Отличие состоит в том, что в ферментационную среду добавлен

15 дрожжевой экстракт в количестве 0,1% Ферментаци  продолжаетс  54 ч. Показатели процесса биосинтеза треонина в эти услови  приведены в табл. 2,

20Фо рмула изобретени 

Штамм бактерии Escherichia coli ВКПМ В-3420 - продуцент Ъ-треонин с

25

Таблица}

30

35

Таблица2

40

45

Корректор О.Циште

Подписное

Claims (1)

1. 20 Фо'рмула изобретения

   Штамм бактерии Escherichia coll

   ВКПМ В-3420 - продуцент 1-треонина_с

   Таблица! Шт амм Накопление треонина, г/л Потребление сахарозы в расче- . те на | г синтези.ровэнного треонина, г/г 472 Т-23 '57,0 2,38 ТДГ-6 75-9 2,01

   f

   Т аблица2

   Штамм Накопление треонина, г/л Потребление сахарозы в расчете на 1 г синтезированного треонина, г/г 472- Т-23 66,9 2,55 ТДГ-6 85 ₀0 1,99