SU1123704A1

SU1123704A1 - Method of obtaining conjugated antigens

Info

Publication number: SU1123704A1
Application number: SU833605523A
Authority: SU
Inventors: Лев Арамович Пирузян; Игорь Ефимович Ковалев; Ольга Юрьевна Полевая; Любовь Анвардовна Башарова
Original assignee: Научно-Исследовательский Институт По Биологическим Испытаниям Химических Соединений
Priority date: 1983-04-08
Filing date: 1983-04-08
Publication date: 1984-11-15

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ на основе морфина при рН 8-9, отличающийс тем, что, с целью упрощени процесса, осуществл ют взаимодействие морфина, антигенного белкового носител и феррицианида кали при соотношении 1:A method for producing morphine-based conjugated antigens at pH 8-9, characterized in that, in order to simplify the process, morphine, antigenic protein carrier and potassium ferricyanide interact in a ratio of 1:

Description

Изобретение относитс к иммунохимии, а именно к способу получени конъюгированных антигенов морфин-антигенный носитель , которые могут найти применение в медицине и биологии дл получени антител к морфину и родственным ему соединени м , нейтрализации их токсического и фармакологического эффекта, а также дл определени опиатов в жидкост х и ткан х организма.The invention relates to immunochemistry, in particular, to a method for producing conjugated antigens of morphine-antigenic carrier, which can be used in medicine and biology for producing antibodies to morphine and related compounds, neutralizing their toxic and pharmacological effects, as well as for determining opiates in a liquid x and tissues of the body.

Известны способы получени конъюгированных антигенов .морфин-антигенный носитель, согласно которым обычно получают реакционноспособное производное морфина , которое затем ковалентно св зывают с антигенным белковым носителем, например сывороточными белками.Methods are known for the preparation of conjugated morphine antigen carrier antigens, according to which a reactive morphine derivative is usually obtained, which is then covalently bound to an antigen protein carrier, for example, whey proteins.

Известен способ получени конъюгированных антигенов на основе морфина путем сочетани морфина с диазониевой солью п-аминофенилацетамида, выделени полученного азопроизводного .морфина и гид ролиза его с получением .морфиназофениламина , который зате.м с по.мощью производного карбодиимида ковалентно св зывают с бычьим сывороточным альбумином. Полученный конъюгированный антиген выдел ют известными способами 1.Known is a method for producing conjugated antigens derived from morphine by combining the morphine with a diazonium salt of p-aminophenylacetamido, isolating the resulting azoderivatives .morfina Roliz and guide it to obtain .morfinazofenilamina which zate.m with po.moschyu carbodiimide derivative covalently linked to bovine serum albumin. The resulting conjugated antigen is isolated by known methods 1.

Недостаткам такого способа вл ютс .многостадийность и трудоемкость.The disadvantages of this method are multi-stage and labor intensive.

Наиболее близким к нредлагаемо.му вл етс способ получени конъюгированных антигенов на основе морфина, предусматривающий взаимодействие морфина с монодиазотированным бензидином с выделением полученного производного, его диазотированием и св зывание.м с антигенны.м белковым носителем при рН 7-9. Обычно в качестве антигенного белкового носител используют бычий сывороточный альбумин и соотношение производного морфина и белкового носител составл ет 1:(2-10) 2.The closest to the proposed one is a method for producing conjugated antigens based on morphine, involving the interaction of morphine with mono-azotized benzidine to isolate the resulting derivative, its diazotization and binding m to the antigen with protein carrier at pH 7-9. Usually, bovine serum albumin is used as an antigenic protein carrier and the ratio of morphine derivative and protein carrier is 1: (2-10) 2.

Недостатка .ми этого способа вл ютс длительность и трудоемкость процесса получени конъюгированных антигенов на основе морфина. Реакционноспособное производное морфина получают в несколько стадий , при этом исходна молекула морфина значительно измен етс за счет введени дополнительных химических группировок, что в дальнейшем сказываетс на специфичности антител. Необходима также стади выделени и очистки промежуточных производных , применение в ходе синтеза растворителей , концентрированных солей и щелочей , а также токсичных веществ (бензидин ).The disadvantage of this method is the length and complexity of the process for producing conjugated morphine antigens. The reactive derivative of morphine is obtained in several stages, with the initial molecule of morphine changing significantly by introducing additional chemical groups, which further affects the specificity of the antibodies. The stage of isolation and purification of intermediate derivatives, the use of solvents, concentrated salts and alkalis, and also toxic substances (benzidine) during the synthesis are also necessary.

Цель изобретени - упрощение процесса получени конъюгированных антигенов.The purpose of the invention is to simplify the process of obtaining conjugated antigens.

Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу получени конъюгированных антигенов на основе морфина при рН 8-9 осуществл ют взаимодействие морфина.This goal is achieved in that, according to the method for producing conjugated morphine-based antigens at pH 8-9, morphine reacts.

антигенного белкового носител и феррицианида кали при соотношении 1:С2-10) :1.antigenic protein carrier and potassium ferricyanide at a ratio of 1: C2-10): 1.

В предлагаемом способе конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель получают в одну стадию. В реакцию св зывани с антигенным носителем вступает реакционноспособное производное морфина -соответствующийфеноксирадикал морфина, который образуетс при взаи.модействии морфина с феррицианидо.м кали .In the proposed method, the conjugated antigen morphine-antigen carrier get in one stage. A reactive morphine derivative, the corresponding phenoxy radical of morphine, which is formed by the interaction of morphine with potassium ferricyanide, is involved in the reaction of binding to the antigenic carrier.

Способ осуществл етс следующим образом .The method is carried out as follows.

Водный раствор хлоргидрата инкубируют с равным весовым количеством феррицианида кали в присутствии раствора бычьего сывороточного альбу.мина в течение 1-2 ч при рН 8-9 и 0-25°С при соотношении морфин: антигенный носитель: феррицианИд кали 1: (2-10):1.An aqueous solution of hydrochloride is incubated with an equal weight amount of potassium ferricyanide in the presence of a solution of bovine serum albu.min for 1-2 hours at pH 8–9 and 0–25 ° C with a morphine: antigenic carrier: ferricyanide ratio 1: (2–10 ):one.

Полученный конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель отдел ют от низкомолекул рной фракции гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Содержание морфина в синтезированном конъюгированном антигене определ ют по разнице введенного в реакцию и непрореагировавщего морфина известным способом. В зависимости от соотношени исходных реагентов получают конъюгированные антигены, в которых с одной молекулой антигенного носител (бычьего или человеческого сывороточного альбумина) ковалентно св заны от 11 до 20 молекул морфина. Структура полученных конъюгированных антигенов подтверждена данными УФ-спектров, в которых по сравнению со спектром исходного белка увеличиваетс интенсивность поглощени и смещение .максимума за счет присоединившихс к белку молекул морфина.The resulting conjugated antigen, morphine antigen carrier, is separated from the low molecular weight fraction by gel filtration on a Sephadex G-25. The morphine content of the synthesized conjugated antigen is determined by the difference in the amount of unreacted morphine added to the reaction in a known manner. Depending on the ratio of the initial reagents, conjugated antigens are obtained, in which from one to twenty antigenic molecules of a morphine molecule are covalently bound to one antigenic carrier molecule (bovine or human serum albumin). The structure of the conjugated antigens obtained was confirmed by UV-spectra, in which the absorption intensity and the shift of the maximum increase, as compared to the protein spectrum, due to morphine molecules attached to the protein.

Соотношение исходных компонентов (1:10:1 -1:2:1) в реакции конъюгировани вы.брано в таких пределах, что получают конъюгированный антиген оптимального качества , т. е. содержащий от 11 до 20 молекул морфина на молекулу белка. При меньшем количестве морфина в конъюгированном антигене ухудшаютс его антигенные свойства, при замещении больщем, чем,20 молекул морфина на моль белка, ухудщаетс растворимость конъюгированного антигена. Выбранный интервал рН (8-9) позвол ет проводить реакцию с достаточной скоростью при стабильности белкового антигенного носител .The ratio of the starting components (1: 10: 1 -1: 2: 1) in the conjugation reaction was chosen within such limits that an optimum quality conjugated antigen, i.e., containing 11 to 20 morphine molecules per protein molecule, is obtained. With a smaller amount of morphine in the conjugated antigen, its antigenic properties are impaired; replacing with more than 20 molecules of morphine per mole of protein, the solubility of the conjugated antigen deteriorates. The selected pH range (8–9) allows the reaction to proceed at a sufficient rate with the stability of the protein antigen carrier.

В предлагаемом способе по сравнению с известным достигаетс значительное упрощение технологии (проведение технологии в одну стадию, без очистки и выдатени промежуточных продуктов. исключение целого р да реактивов и растворителей, убыстрение процесса примерно в 20 раз). Это стало возможным в результате ис3 11237 пользовани другого приема получени реакпионноспособного производного морфина и другого типа реакционноспособного производного . Установлено, что антигенные свойства, полученного продукта не уступают свойствам конъюгированны.х антигенов, полученных известным способом. Пример 1. К раствору 10 мг феррицианида кали в 0,5 мол воды добавл ют раствор 10 мг хлоргидрата морфина в 1 мл воды и раствор 100 мг бычьего сывороточного, альбумина в 2 мл воды. Полученную реакционную смесь выдерживают в течение 2-х ч при 25°С, поддержива рН 8 добав- j лением 10%-ного раствора гидроокиси натри . Реакционную массу хроматографируют на колоннах с сефадексо.м G-25 и собирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают, что в конъюгированном антигене морфин-бычий сывороточный аль20 бумин с одной молекулой белка ковалентно св заны 11 молекул морфина. Пример 2. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носител человеческого сывороточного аль-25 бумина получают конъюгированный антиген .морфин-человеческий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой альбумина ковалентно св заны 13 молекул морфина. Пример 3. К раствору 10 мг феррициани-30 да кали в 0,5 мл воды добавл ют раствор 10 мг хлоргидрата морфина в 1 мл воды и раствор 20 мг бычьего сывороточного аль бумина в 2 мл воды. Полученную реакционную массу выдерживают при 10°С в течение 1 ч, поддержива рН 9 добавлением 10%-ного раствора едкого натра. Реакционную массу хроматографируют на колонках с сефадексом G-25 и собирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают , что в конъюгированном антигене40 морфин-бычий сывороточный альбумин с одной молекулой белка ковалентно св заны 20 .молекул морфина. 4д Пример 4. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носител человеческого сывороточного альбумина получают конъюгированный антиген морфин-человеческий сывороточный альбумин , в котором с одной молекулой белка ковалентно св заны 22 молекулы морфина, Антигенные свойства конъюгированного антигена морфин-белок, полученного в примере 1, исследовали на кроликах. Дл этого 5 кроликов массой 2 кг иммунизировали конъюгированным антигеном морфин-белок внутримышечно по 25 мг/кг 2-3 раза в неделю в течение 6 недель (аналогичным образом проводилась иммунизаци и в известном способе). В сыворотке крови животных определ ли наличие антител к морфину реакцией пассивной гемагглютинации и торможени пассивной гемагглютинации, как и в способе-прототипе. Было установлено , что в сыворотке крови им.мунизированных кроликов имеютс антитела на весь конъюгированный антиген, приче.м их титры были высокими и составл ли в зависимости от индивидуальности животного 1:2560-1: ;10240. При введении в реакционную среду морфина в концентрации М, титр антител снижаетс до 1:128 - 1:256. Следовательно , полученный конъюгированный антиген морфин-белок обладает антигенными свойствами, так как он индуцирует у животных синтез антител, специфичных к морфину. Антигенные свойства полученного конъюгата не уступают, а даже в некоторой степени превосход т антигенные свойства конъюгата, полученного в известном способе , так как там были получены титры антител на весь конъюгат 1:2560, а при добавлени морфина он снижаетс до 1:320. Технико-экономическа эффективность от ,использовани предлагаемого изобретени заключаетс в упрощении процесса получени конъюгированны х антигенов на основе морфина, который проводитс в одну стадию и не требует использовани такого токсичного вещества как бёнзидин.In the proposed method, in comparison with the known, a significant simplification of the technology is achieved (carrying out the technology in one stage, without purification and extraction of intermediate products. Elimination of a whole series of reagents and solvents, speeding up the process about 20 times). This has become possible as a result of using 11237 the use of another method of obtaining a reactive derivative of morphine and another type of reactive derivative. It is established that the antigenic properties of the obtained product are not inferior to the properties of conjugated antigens obtained in a known manner. Example 1. To a solution of 10 mg of potassium ferricyanide in 0.5 mol of water is added a solution of 10 mg of morphine hydrochloride in 1 ml of water and a solution of 100 mg of bovine serum albumin in 2 ml of water. The resulting reaction mixture was incubated for 2 hours at 25 ° C, maintaining the pH 8 by the addition of 10% sodium hydroxide solution. The reaction mass is chromatographed on Sephadex® G-25 columns and the protein fraction is collected. It is found spectrophotometrically that, in a conjugated antigen, morphine-bovine serum al20 bumin with one protein molecule is covalently linked to 11 molecules of morphine. Example 2. According to this procedure, using conjugated antigen, morphine-human serum albumin, in which human anti-human serum al-25 bumin is used as antigenic carrier, in which 13 morphine molecules are covalently bound to one albumin molecule. Example 3. To a solution of 10 mg of ferricyanium-30 and potassium in 0.5 ml of water was added a solution of 10 mg of morphine hydrochloride in 1 ml of water and a solution of 20 mg of bovine serum al bumin in 2 ml of water. The resulting reaction mass is maintained at 10 ° C for 1 h, maintaining the pH 9 by adding 10% aqueous solution of caustic soda. The reaction mass is chromatographed on Sephadex G-25 columns and the protein fraction is collected. It is found spectrophotometrically that in conjugated antigen40, bovine serum albumin with one protein molecule is covalently bound to 20 morphine molecules. 4d Example 4. According to this method, when conjugated morphine-human serum albumin antigen is used as an antigenic carrier of human serum albumin, 22 morphine molecules are covalently bound to one protein molecule. Antigenic properties of the conjugated morphine protein obtained in Example 1 investigated on rabbits. To do this, 5 rabbits weighing 2 kg were immunized with conjugated antigen morphine-protein intramuscularly at 25 mg / kg 2-3 times a week for 6 weeks (immunization was carried out in the same way as in the known method). In the blood serum of animals, the presence of antibodies to morphine was determined by a reaction of passive hemagglutination and inhibition of passive hemagglutination, as in the prototype method. It was found that in the serum of immunized rabbits there are antibodies for the entire conjugated antigen, and their titers were high and were depending on the individuality of the animal 1: 2560-1:; 10240. When morphine at a concentration of M is introduced into the reaction medium, the antibody titer decreases to 1: 128-1: 256. Therefore, the resulting conjugated antigen morphine-protein has antigenic properties, since it induces in animals the synthesis of antibodies specific to morphine. The antigenic properties of the resulting conjugate are not inferior, and even to some extent, are superior to the antigenic properties of the conjugate obtained in a known method, since antibody titers were obtained for the entire conjugate of 1: 2560, and when morphine is added, it decreases to 1: 320. Techno-economic efficiency from the use of the present invention is to simplify the process of obtaining conjugated antigens based on morphine, which is carried out in one stage and does not require the use of such a toxic substance as benzidine.

Claims

METHOD FOR PRODUCING CONJUGATED ANTIGENS on the basis of morphine at pH 8-9, characterized in that, in order to simplify the process, an interaction of morphine, an antigenic protein carrier and potassium ferricyanide is carried out at a ratio of 1: (2-10): 1.