SK89893A3 - Peg-interferon conjugates - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka konjugátov PEG-interferón. spôsobu ich prípravy a ich použitia ako liečiv.

Doterajší stav techniky

P.ôzne prirodzené a rekombinačné proteíny majú medikálne a farmaceutické použitie. Ak sa čistia a spracujú na prípravky, môžu byť parenterálne podávané pri rôznych terapeutických indikáciách. Parenterálne podávané proteíny však môžu byť imunogenické, môžu byť relatívne nerozpustné vo vode a môžu mať krátku dobu farmakologického polčasu rozpadu. Následkom toho je niekedy ťažké dosiahnuť terapeuticky vhodnú krvnú hladinu proteínov u pacientov.

Tieto problémy môžu byť prekonané konjugovaním proteínov k polymérom ako je polyetylénglykol. Davis a spol., US patent č. 4179337í popisuje konjugáciu polyetylénglykolu /PEG/ k proteínom, ako sú enzýmy a inzulín, za účelom získania konjugátov, v ktorých by proteín mal byť menej imunogenický, ale mal by si udržať podstatnú časť svojej fyziologickej aktivity. Nakagawa a spol. popisujú konjugáciu PEG k cstrovčeky-aktivujúcemu proteínu na zníženie jeho vedlajších účinkov a imunogenicity. Veronese a spol., A.pplied Biochem. and Biotech, 11:141-152 /1935/ popisuje aktiváciu polyetylénglykolov fenylchlórformiátom na modifikáciu ribonukleázy a superoxiddismutázy. Katre a spol., US pat. č. 476610c a 491738 tiež popisujú solubilizáciu proteínov konjugáciou s polymérom. PEG a iné polyméry su konju— gované s rekombinačnými proteín:r:i na zníženie ich imunogenicity a zvýšenie ich polčasu rozpadu. Viä Nitecki a spol., US pat. č. 4902502, Enzon Inc., Medzinárodná prihláške č.PCT/US9O/O3133,

Nishimura a spol., európska patentová orihláška 15 43—6 a Tomáši, Medzinárodná prihláška č. PCT/^TT£35/C2572 ·

Predošlé metódy prípravy PEG/proteín konjugátov a konjugáty, ktoré vznikajú týmito metódami, predstavujú určité nroblémy. K týmto problémom patrí, že určité metódy tvorby týchto konjugátov proteír.-PEG môžu inaktivovai proteín, takže výsledné konjugáty môžu mal nevyhovujúcu biologickú aktivitu. Ďalej určité linkery použité pri tvorbe takých konjugátov FEG-prcte^ ín,môžu byť náchylné k in vivo hydrolytickému štiepeniu. Ak také štiepenie prebieha po podaní, strácajú tieto konjugáty zlepšené vlastnosti poskytnuté im pomocou PEG·

Podstata vynálezu

Jedným prevedením vynálezu sú nové konjugáty interferon--EC-, s jedinečnými lir.kermi, ktoré spájajú interferónc-vú /ZFN/ aminoskupinu s PEC-· predložený vynález je riadený najmá na fyziologicky aktívne interferóncvé konjugáty majúce všeobecný vzorec I

T_ J interf 'O ,, , _1 _2 . a_ky_, P. , y. , m je vybraté z celých číselil skupín v interfercne,

C- alebo NH, celé číslo medzi 1 a 1CCC kc ,1 * SÚ alebo- nižší alkyl, ’V je x je každé z y je celé číslo do 1000 a súčet x, y a z s tou podmienkou, že aspoň jeden je az i □

1OCC

-Λ

P.-' a R- je nizsi alkyl

Je zrejmé, že -NH-skupina vo vzorci I je odvodená od voľnej aminoskupiny molekuly interferónu.

- 3 Špecifickejšie majú dva rôzne interferónové konjugáty nasledujúce vzorce:

RO-(CH₂CHO)x — (CH₂CH0)— (CH2CHO)_z-CH₂CHNH r1 R² R³ R⁴

interferón l-A

RO-fCHzCHOk i/°\ ^Nh —(CH₂CHO)y- (CH₂CHO)z-CH₂CH

II O

R⁴ —interferón l-B kde R je nižší alkyl, r\ R^, R^, p5 sú H alebo nižší alkyl, m je číslo až do počtu dostupných aminoskupín v interferóne a x, y a z sú vybraté z akejkolvek kombinácie čísel tak, že konjugát má aspoň časť biologickej aktivity proteínu, ktorý tvorí konjugát, s tou podmienkou, že aspoň jeden z R , R , R^J a P.4 je nižší alkyl.

Popis obrázkov

Obrázok 1: Časový priebeh PEG modifikácie zlúčeninou z príkladu 7· Interferón / 5 mg/ml / bol inkubovanjŕ s 10-, 20- alebo 40-násobným prebytkom činidla k proteínu počas uvedenej doby v ?5 mM Tricinu /pH 10,0/, 0,5M KSCN, 100 mM NaCl. V rôznych časoch boli odobraté podiely, reakcia prerušená glycínom a analyzované na 15% SBS-P AGE gélu. Na značke I je interferón .

Obrázok 2: Časový priebeh PEG modifikácie so zlúčeninou z príkladu 5· interferón bol inkubovaný s 3- až 10-násobným prebytkom činidla počas dôb uvedených rovnako ako na obr. 1.

V uvedených časoch boli odoberané podiely, reakcia v nich Dre-

v označenie

Obrázok 3: porovnanie PEC- modifikácie so zlúčeninou z príkladu 1 /lavá strana/ a z príkladu 3 /Pravá strana/. Interferón bol inkubovaný s trojnásobným prebytkom každého činidla po C,25,

1,5 alebo ?4 hodín. Boli odobraté podiely, reakcia prerušená glycínom a analyzované na 15% SDS-PAGE gélu. S” je značka pre štandardy molekulovej hmotnosti proteínov, I je značka pre i interferón.

podlá predloženého vynálezu sa IFN konjugáty vzorca IA a IB môžu pripraviť kondenzáciou aktivovaného PEC, kde terminálna hydroxy alebo aminoskupina bola nahradená aktivovaným linkerom. Tieto činidlá môžu potom reagovať s jednou alebo viacerými aminoskupinami v τρν. Kondenzácia iba s jednou sminoskupinou za vzniku monoPEC-ylovaného konjugátu je výhodným Drevedením tohto vynálezu. Vynález sa teda tiež týka nových aktivovaných zlúčenín /činidiel/, ktoré môžu byť použité na prípravu interferovaných konjugátov podlá predloženého vynálezu. Tieto zlúčeniny majú nasledujúci všeobecný vzorec II

kde B je nižší alkyl, alkyl, su alebo nižší /11/

x je celé číslo medzi 1 a 1000 a každý z y a z je celé číslo od C do 1COO a súčet x, y a z je j až 1OOC, s tou podmienkou, že ak je W NE, alebo ak je W O a R^ je H,

/111/ kde R je nižší alkyl, r\ R^, R^ _a p4 alebo metyl, x je celé číslo od 1 do 1OCO a každý z y a z je celé číslo od O do 1OOO a súčet x, y a z je 3 až 1000·

Špecifickejšie, vzorec II zahŕňa zlúčeniny nasledujúcich dvoch typov:

I1A

RCHCH₂CHO)_x —(CH₂CHO)ý- (CH^HO^-CHjCHO

Ŕ¹ Ŕ² Ŕ³ R⁴

U B

Vo vzorcoch IH, He a IU r, pj, r- , r\ , r^ majú vyššie uvedený význam a x, y,a z sú vybraté z akejkoľvek kombinácie čísel tak, že colymér, ak je konjugovaný k proteínu, umožňuje proteínu podržať si aspoň časť úrovne jeho biologickej aktivity, ktorú má, ked nie je konjugovaný, s podmienkou uvedenou vyššie pod vzorcom II.

V súlade s týmto vynálezom, pri použití aktivovaných PEG činidiel vzorca IIA, IIB alebo III na výrobu konjugátov, sa vytvorí spojovacia vazba medzi voľnými aminoskupinami v proteíne ako je interferón /IFN/ a PEG tak, že výsledný konjugát si udržiava aspoň čast biologickej aktivity proteínu so zní* ženou imunogenicitou. Ďalej spojovacie skupiny vytvorené v konjugáte podľa tohto vynálezu pri použití akéhokoľvek z aktivovaných polyetylénglykolcv vzorca IIA, IIB alebo III produkuje proteínový konjugát, ktorý nie je ľahko náchylný k in vivo hydrolytickému štiepeniu a nie je sprevádzaný nevýhodami, spôsobenými v REG proteínových konjugátoch podľa známeho stavu techniky.

V súlade s týmto vynálezom R,

R¹, R², P.\ p/ a r5 môžu byt kyl mov akékoľvek nižšie alkyly, výhodne metyl. Výraz nižší aloznačuje nižšie alkylové skupiny, obsahujúce 1 až 6 ató uhlíka, ako je metyl, etyl, n-propyl, izopropyl ata. Vše obecne je výhodnou alkylovou skupinou nižšia alkylová skupina, obsahujúca od 1 do 4 atómov uhlíka, kde najvýhodnejší je metyl. R¹, R², R^, R^ a ?? môžu byť tiež vodík, ale R¹, R², r3 _a r4 _nj__e súčasne vodík.

V súlade s týmto vynálezom x, y a z môžu byť vybraté z akejkoľvek kombinácie čísel tak, že výsledný konjugát obsahuje aspoň časť biologickej aktivity IFN, ktorý tvorí konjugát. Je zrejmé, že súčet x, y a z a m je v obrátenom pomere k množstvu biologickej aktivity IFN, ktorá sa udrží v konjugáte. Číselná hodnota x, y a z predstavuje počet glykolových

- 7 jednotiek v polyglykole, ktoré tvoria konjugát. Výraz m predstavuje počet voľných alebo dostupných aminoskupín nachádzajúcich sa v IFN, ktoré môžu reagovať s aktivovanou FEG zmesou. Vyššie hodnoty m a x, y a z vedú k vyššej molekulovej hmotnosti konjugátu. V súlade s tým sú podlá vynálezu x, y a z akékolvek čísla také, že molekulová hmotnosť konjugátu, bez hmotnosti proteínu, je medzi asi 300 až asi 30000 dalton. Výhodné pre IFN je m číslo od 1 do 3. zvlášť výhodným prevedením je monopegylovaný konjugát, kde m je 1, získaný za takých podmienok, že sa vo vysokom výťažku získa IFN konjugát, zložený z IFN, kde iba jedna volná aminokyselina reagovala s PEG činidlom vzorca II-A alebo II-B alebo III. V súlade s výhodným prevedením je m 1, x,y a z sú akékolvek čísla také, že glykol, ktorý tvorí konjugát má priemernú molekulovú hmotnosť od asi 300 do asi 30000 dalton, výhodne asi 1000 až 10000 dalton, obzvlášť výhodne asi 1000 až asi 5000 dalton. V mimoriadne výhodnom prevedení je molekulová hmotnosť asi 2000 dalton.

Pokial sa čísla x, y a z týkajú jednotiek, je x celé číslo od 1 do 1000 a každé y a z je celé číslo od C do 1000 a súčet x, y a z je 3 až 1000.

Vo výhodnom prevedení konjugátov vzorca IA a 13 sú x,a y 5 až 500 a z je 0 až 4. V mimoriadne výhodnom prevedení je použitým glykolom zmes glykclov, kde x je medzi 10 až 100, y je medzi 1 až 10 a z je 0. Najvýhodnejším je interferónový konjugát vzorca IA, kde v IA je m 1, R, R^ a R⁴ sú CH^, R je H, x je asi 19, y je asi ? a 2 je 0. Toto zodpovedá priemernej molekulovej hmotnosti v PEG jednotke asi 1000 dalton.

Za účelom odstránenia akýchkoľvek pochybností, týkajúcich sa počtov jednotiek v PEG molekule, je charakterizácia polyetylénglykolového polyméru molekulovou hmotnosťou preferovaná pred uvádzaním čísel a počtov samotných opakujúcich sa jednotiek /SRU = self repeating units/ v FEG pclymére pomocou

x. y a z. Tieto hodnoty môžu byť obtiažne stanovitelné vzhľadom na potenciálnu nehomogenitu východiskových PEG zlúčenín, ktoré sú obvykle definované svojou priemernou molekulovou hmotnosťou a nie počtom samotných opakujúcich sa jednotiek, ktoré obsahujú. Východiskové FEG zlúčeniny rôznych molekulo vých hmotností

alebo môžu byť získané od obchodných dodávateľov.

V prípade, že hodnoty x, y a z získané stanovením molekulových hmotností alebo ako je uvedené dodávateľom nie sú celé čísla /čo bude všeobecný prípad/, zaokrúhľujú sa tieto hodnoty nahor alebo nadol obvyklým spôsobom na určenie celých čísel pre polymérnu molekulu, ktorá pravdepodobne tvorí hlavnú časť polymérnej zmesi.

Ak činidlo ktoréhokoľvek zo vzorcov IIA> IIB alebo III reaguje s IFN, ktorý obsahuje viac než jednu voľnú aminoskupinu, môže byť konjugát získaný ako zmes rôznych reakčných produktov IFN so zmesami PEG-reaktantu. Tieto reakčné produkty sa tvoria ako výsledok reakcie PEG činidla s jednou alebo viacerými voľnými aminoskupinami. Tieto sú označené m. vo vzorci IA a IB. Napríklad, ak IFN obsahuje tri voľné aminoskupiny, môže aktivovaný PEC- reaktant reagovať s jednou z voľných aminoskupín, s dvomi z voľných aminoskupín alebo so všetkými tromi. Za tejto situácie zmes obsahuje konjugované reakčné produkty vytvorené vo všetkých troch prípadoch. Pretože rôzne konjugované reakčné produkty v tejto zmesi majú velmi odlišné molekulové hmotnosti, závisiace od hodnoty m, t.j. 1, 2 alebo 3, môžu byť tieto reakčné produkty rozdelené obvyklými metódami ako je chromatografia., Pre stanovenie toho, či m a x, y a z boli zvolené správne, môžu byť separované konjugované reakčné produkty skúšané na biologickú aktivitu rovnakými spôsobmi použitými na skúšky východiskového IFN

- 9 pre stanovenie toho, či si konjugovaný reakčný produkt udržiava časť biologickej aktivity IFN použitého na vytvorenie konjugátu. V takom prípade sa môžu hodnoty max, y a z upraviť akýmkolvek požadovaným spôsobom na poskytnutie požadovanej aktivity.

V súlade s výhodným prevedením je m 1. Ak je m 1, môže byť tento konjugát získaný, aj ked sú prítomné dve alebo viac volných aminoskupín. Aktivovaný PEG reaktant bude najskôr reagovať s jednou z volných aminoskupín nachádzajúcich sa v IFN· Reguláciou koncentrácie činidiel ako je IFN a reakčných podmienok, v súlade so štandardnými metódami amínovej kondenzácie je možné regulovať stupeň pegylácie volných aminoskupín nachádzajúcich sa v proteíne. V proteínoch, obsahujúcich jednu alebo viac volných aminoskupín, kde jedna z volných aminoskupín je reaktívnejšia než ostatné aminoskupiny, môžu byť podmienky zvolené tak, že proteín reaguje s aktivovanou PEG zlúčeninou za vzniku zlúčeniny vzorca IA alebo IB, kde m je 1. Ostatné volné aminoskupiny, nachádzajúce sa v aminokyselinách, ktoré tvoria proteín, môžu následne reagovať s PEG kondenzačnou reakciou uskutočňovanou dlhšie alebo použitím iných silnejších podmienok.

V predloženom popise a nárokoch výrazy interférón a IEN označujú všetky typy interferónu /molekuly s interferónovou aktivitou/, napríklad % (i, a tí> interferón a všetky podtypy týchto typov, ako je <£ 1 ,cC2A , oC 2B alebo cC 20 a hybridy alebo chiméry rôznych typov a/alebo podtypov. Interferón môže byť akéhokoívek pôvodu a môže byť získaný z prírodných zdrojov, tkanivových kultúr alebo technikami rekombinačnej DNA. Metódy prípravy a izolácie prírodných alebo rekombinačných interferónov sú v obore dobre známe a sú popísané, napr. v patentových prihláškach č. EP 43980, EP 211148, EP 140127» DE 3028919, USP 4503035 a USP 44I4I5O.

Výhoda použitia činidiel vzorcov IIA, IIB a III, kde aspoň jeden z R^, R^, r\ R^ je nižší alkyl, najmä metyl /alkyl-substituovaných činidiel/ spočíva v neočakávanom zvýšení výťažku konjugátu, t.j. PEGylovaného proteínu, pri použití alkyl-substituovaných činidiel v porovnaní s príslušnými nesubstituovanými činidlami. Alkyl-substituované činidlá poskytujú aspoň dvojnásobné množstvo konjugátov za rovnaký reakčný čas v porovnaní s príslušnými nesubstituovanými činadlami pri príprave takých konjugátov.

Pri podaní pacientom na terapeutické účely by konjugáty vzorcov IA a IE pripravené z vyššie popísaných substituovaných činidiel, mali mať neočakávane zvýšený polčas rozpadu in vivo v krvnom prúde pacienta pri porovnaní s konjugátom vytvoreným z príslušných nesubstituovaných činidiel. Aj keň polčas rozpadu in vivo je priamo úmerný molekulovej hmotnosti konjugátu, konjugát vytvorený zo substituovaného činidla prekvapivo bude mať dlhší polčas rozpadu i vyššiu molekulovú hmotnosť oproti konjugátu získanému z nesubstituovaného činidla. Dlhší polčas rozpadu terapeutického činidla v krvnom prúce pacienta poskytuje zvýšenú účinnosť podania činidla pacientovi. Napríklad konjugáty vyrobené z alkylsubstituovaných Činidiel môžu byť podávané menej často a/alebo v nižších množstvách než konjugáty vyrobené z príslušných nesubstituovaných činidiel.

Za účelom zvýšenia účinnosti podania biologicky aktívnych proteínových konjugátov s polyetylénglykolom boli použité zvýšené molekulové hmotnosti polyetylénglykolu pri tvorbe týchto Droteínových konjugátov. Avšak biologická účinnosť aktívneho konjugovaného IFN sa znižuje so zvyšovaním molekulovej hmotnosti. Avšak pri použití konjugátov podlá vynálezu získaných so substituovanými činidlami sa účinnosť podania zvyšuje v porovnaní s použitím príslušného nesubstituovaného konjugátu s menším zvýšením molekulovej hmotnosti.

- 11 V ďalšom predvedení sa predložený vynález tiež týka spôsobu prípravy nových konjugátov.

Konjugáty vzorca I~A môžu byt pripravené nasledovne:

-12RO-(CH₂CHO)_X — (CH₂CriO)ý— (CH₂(j:HO)_z-CH₂CHNH2 Ŕ’ Ŕ² R³ Ŕ⁴

PEG-amírt

l-A

1 P 7 4

Kde R, R , R“, R- a ŕc a význam s tou podmienkou, zo substituentov R , ,

P/, max, y a z majú vyššie uvedený že aspoň akýkoívek jeden alebo viac P?, R^ môžu byť nižší alkyl.

V tejto reakcii sa PEG-amín zmieša so zlúčeninou vzorca IV v uhlovodíkovom alebo chlórovanom uhlovodíkovom rozpúštad kondenzovať vo vodnom prostredí s jednou alebo viacerými vol nými aminoskupinami za vzniku konjugátu vzorca IA· Reakcia môže byť uskutočnená za podmienok obvyklých pre kondenzáciu amínov vo vodnom prostredí. Všeobecne sa reakcia uskutočňuje v štandardnom vodnom tlmivom roztoku, majúcom pH medzi 7 a 10 za vzniku konjugátu vzorca IA· Táto reakcia môže poskytoval PEG proteínový konjugát s rôznymi molekulovými hmotnosťami v závislosti od počtu volných aminoskupín v proteíne a času reakcie. PEG proteínové konjugáty môžu byt potom rozdelené na svoje individuálne zložky obvyklými metódami, ako je vyso-r ko citlivá kvapalinová chromatografia /HPLC/ alebo gélová elektroforéza. Môžu byť použité akékolvek bežné podmienky na delenie zlúčenín podlá molekulovej hmotnosti, pomocou HPLC alebo gélovej elktroforézy. Delenie tejto zmesi môže byť vykonané podlá molekulových hmotností produktov, vytvorených ako už bolo tu popísané.

IFN konjugát vzorca 13 môže byť pripravený podlá nasledujúcej reakčnej schémy:

4>

RO-íCH₂CHO)_x — (CH₂CHO)y- (CHjCHO^-CHzCHOH + Ŕi Ŕ² Ŕ³ Ŕ⁴

1'

PEG-aJJphol

IV

RO-fCHgCHOJx —(CH₂CHO)j- (CHzCHOk-CHzCHO

R² Ŕ³ R⁴

U-B

NH^intariarón

A NF RO-(CH₂CHO)x — (CHjCHOJy- (CHjCHO^-CHzCH V I I I I ¹¹

R¹ R² R³ R^{4 0} interferón

1-8

- 15 kde R, R¹, R², r\ R^, R^, m, x, y, z a podmienka sú vyššie uvedené.

Zlúčenina vzorca IV sa získa kondenzáciou fosgénu s 2-hydroxypyridínom /substituovaným, pokial je R^ = nižší alkyl/ za použitia akejkolvek obvyklej metódy na kondenzáciu halogenidu s alkoholom.

Kondenzácia PEG alkoholu so zlúčeninou vzorca IV sa uskutočňuje za použitia obvyklých podmienok na kondenzáciu alkoholu s karbonátom za vzniku zlúčeniny vzorca II-B. Zlúčenina vzorca II-B sa kondenzuje s proteínom cez jednu alebo viac volných aminoskupín v proteíne za vzniku zlúčeniny vzorca I-B. Táto reakcia sa uskutočňuje spôsobom popísaným pre kondenzáciu zlúčeniny vzorca II A za vzniku konjugátu vzorca I-A· V závislosti od počtu volných aminoskupín nachádzajúcich sa v proteíne, ktorý reaguje so zlúčeninou vzorca II-B, môže byť konjugát vzorca I-B vytvorený ako zmes konjugátov majúcich rozdielne molekulové hmotnosti. Táto konjugátová zmes môže byť delená spôsobmi popísanými už skôr v tomto popise.

Zlúčenina vzorca IB môže byť tiež pripravená za použitia nasledujúcej reakčnej schémy;

- i 6RO-(CH₂CHO)_x-{CH2CHO)_y-(CH₂CHO)_z-CH₂CHOH ₊ R’ Ŕ² Ŕ² L

IV

RO-(CH2CHO^-(CH2CHOý(CH₂CHO)£CH₂CHO — C=0 Ŕ¹ Ŕ² R³ Ŕ^{4 J}2

NH₂-intarferón ^— O

Á

RO-(CH₂CHO)_x-(CH2CHO)_y-{CH2CHO)_z-CH₂ CH- Q

R¹ R² Ŕ³ R⁴

NH---irrterferón l-B

R³

Ο > 4 R ' kde P., R , R, R^ , F7, R^y , m, x a y ma ju definovaný význam tu vyššie.

V reakčnej schéme sa PEG-alkohol kondenzuje so zlúčeninou vzorca IV za vzniku zlúčeniny vzorca III· V tejto reakcii sa zlúčenina vzorca IIB vytvorí ako medziprodukt, ktorý reaguje s druhým mol PEG-alkoholu za vzniku zlúčeniny vzorca III. Pri uskutočnení tejto reakcie je PEG-alkohol prítomný v aspoň 2 mol na mol zlúčeniny vzorca IV· V tomto postupe môže byť použitý akýkoívek obvyklý spôsob pre kondenzáciu alkoholu s karbonátom. zlúčenina vzorca III reaguje s interferónom za vzniku konjugátu vzorca J-B spôsobom popísaným pre konverziu zlúčeniny vzorca HA na zlúčeninu vzorca ΙΑ· V závislosti na množtvách volných aminoskupín nachádzajúcich sa v proteíne, kondenzácia zlúčeniny vzorca III s oroteínom poskytuje zmes konjugátov, ktoré môžu byť rozdelené na svoje jednotlivé zložky spôsobmi popísanými tu vyššie pre oddelenie konjugátu vzorca IA-

V súlade s týmto vynálezom bolo zistené., že interferónové konjugáty podlá vynálezu môžu mať rovnakú použitelnosť ako proteín použitý na tvorbu konjugátu. Freto sú tieto konjugáty terapeuticky aktívne rovnakým spôsobom ako proteín, z ktorého boli pripravené a môžu byť použité ako proteín samotný bez vzniku nežiadúcich imunitných odoziev, ktoré môžu byť spojené s podávaním samotných proteínov subjektom, predložený vynález tak teda tiež zahŕňa farmaceutické prÍDravky na báze zlúčenín vzorca I alebo ich solí a spôsoby ich prípravy.

Farmaceutické prípravky podlá predloženého vynálezu, použité na kontrolu alebo prevenciu chorôb, obsahujú interferónovaný kojugát všeobecného vzorca I a terapeuticky inertný, netoxický a terapeuticky prijateľný nosičový materiál. Farmaceutické prípravky na použitie vyššie uvedené môžu byť pripravené a dávkované spôsobom, ktorý je v súlade s lekárskou praxou,

- ιε ktorá berie do úvahy poruchy, ktoré sú liečené, stav jednotlivého pacienta, miesto doručovania proteínového konjugátu, spôsob podávania a iné faktory známe lekárom.

Nasledujúce príklady predstavujú ilustratívne predvedenie predloženého vynálezu bez toho, aby ho akokoľvek obmedzovali.

týchto príkladoch Jeffamine -207C je monometoxyoolyoxyalkylénpropylamínový polymér s priemernou molekulovou hmotnosťou 2070, odvodený od propylénu a etylénoxidu, ktorý je zložený z polyetylénglykolového reťazca a obsahuje Driememe 30 % náhodne zabudovaných Dropylénoxidových skupín.

Jeffamin M-10C0 je monometoxypolyalkylénpropylamínový polymér s priemernou molekulovou hmotnosťou 1000, odvodený od propylénu a etylénoxidu, ktorý je zložený z polyetylénglykolového reťazca, obsahujúceho 14 % špecificky zabudovaných propylénoxidových skupín, kde x je primerne 18,6, y má priemer 1,6 a z je C /x, y a z sú tu použité v rovnakom význame, ako bol uvedený vyššie/.

Všetky činidlá popísané v týchto príkladoch môžu byť uchovávané v desikátoroch z jantárového skla pri 4 °C až do svojej spotreby. Na každú modifikáciu boli coužité čerstvé podiely.

príklady predvedenia vynálezu

Príklad 1

Príprava alfa, alfa-oxometylén-bis/omega-metoxypoly/oxy-1,2-etándiyl)/SRU 111

Zo suspenzie 1,5 g MPEG /metoxypolyetylénglykol/ /mol. hmotn. 5000/ v 80 ml suchého toluénu sa oddestiluje 50 ml rozpúšťadla. Roztok sa potom ochladí a pridá sa 30,5 mg di-2- I? pyridylkarbonátu. Výsledná zmes sa potom refluxuje 24 hodín. Roztok sa potom ochladí a výsledná zrazenina sa odfiltruje a premyje malým objemom toluénu a potom dietyléteru. Pevná látka sa potom suší vo vysokom vákuu, získa sa 0,6 g alfa,alfaoxometylén-bis/omega-metoxypoly (oxy-l,2-etándiyl) /SRU 111 ako bieleho prášku. PEG-modifikovaný interferón sa pripraví spôsobom 1 popísaným Šalej.

Príprava PEG-modifikovaného interferónu-alfa

Spôsob 1: Rekombinačný interferón-alfa /5 mg proteínu na ml/ sa dialýzuje proti pufru, obsahujúcemu 5 “M octanu sodného, pH 5,0, 120 mM NaCl. pridá sa tiokyanát draselný do konečnej koncentrácie 0,5 M a pH sa upraví prídavkom jednej desatiny objemu 1M trici-hydroxidu sodného, pH 11,9, získa sa konečné pH roztoku 10,0· PEG činidlo sa pridá k proteínu v mólovom pomere 3:1 vzhľadom na pevné látky alebo rozpusteného v DMSO /objem DMSO bol menší než 10 % celkového objemu/. Modifikácia prebiehala pri teplote miestnosti 30 minút až 4 hodiny s nasledujúcim prídavkom 1?/ L-glycínu /pH 6,3/ na konečnú koncentráciu 20 mM pre znemožnenie dalšej modifikácie. PEG-modifikovaný proteín bol zrážaný prídavkom 3,5 M síranu amónneho, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7,0 na konečnú koncentráciu 1,

1,1 M síranu amónneho /1,0 M síranu amónneho na PEC—10000/, z zrazenina sa oddelí odstredením, premyje sa a znovu sa rozpustí v 25 mM octane amónnom, pH 5,0· PEG-modifikované proteíny sa čistia chromatografiou na hydrofóbnej výmennej kolóne /napr. 75 x 7,5mm/ ako je BioRad TSK Phenyl-5-PW alebo Toyopearl Phenyl-65OM, za použitia gradientu zníženia síranu amónneho v 50 mM fosforečnane sodnom, pH 7,0. Aternatívne sa PEG-IFN čistí gélovou filtráciou na kolóne Saphacrylu S-2C-0 /napríklad 90 cm x 3,2 cm kolóna/ /pharmacia/, ktorá bola ekvilibrovaná v 25 mM octane sodnom /pH 5,0/, 200 mM NaCl. PEG-modifikovaný proteín bol identifikovaný pomocou SDS-PAGE· Proteín eluovaný z kolóny zodpovedá interferónu, majúcemu jednu /PEG-^-IFN/ alebo dve /PEG₄-IFN/ väzbu PEG, bol spojený, zahustený a proteín bol stanovený absorbanciou pri 2S0 nm alebo kolorimetrickou skúškou /pierce/. PEC—IFN bol skladovaný pri 4°C v pufri, obsahujúcom 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7,0, 0,3 M síranu amónneho.

Spôsob 2: Interferón c£-2a v koncentrácii proteínu približne 6 mg na ml, bol dialyzovaný v 5 mM octane sodnom, pH 5,0, 0,12 M NaOl. Koncentrácia proteínu bola stanovená .meraním absorbancie pri 280 nm za použitia 1,0 mg”^ml ako extinkčného koeficientu. Roztok proteínu bol zmiešaný s modifikačným činidlom v mólovom pomere 1:3, protein:činidlo. Modifikačná reakcia bola iniciovaná úpravou pH na 10,0 za použitia jednej desatiny objemu Ο,ΙΜ Νβ₂Β^0γ-Μβ0Η, pH 10,7· Po inkubácii pri teplote miestnosti počas jednej hodiny bola reakcia ukončená prídavkom jednej dvadsatiny objemu 1 M glycínu, pH 7,5· Po 3 - 5 minútach bolo pH znížené na 5,0 - 6,0 prídavkom jednej dvadsatiny objemu 1 M octanu sodného, pH 4,0.

Roztok, obsahujúci PEG-interferón, rušiaci činidlo a nemodifikovaný interferón bol zriedený štvornásobne 40 mM octanom amónnym, pH 4,5 a umiestnený do CM-celulózovej kolóny /Whatman CM-52, približne 0,5 ml živice na mg proteínu/. Po premytí kolóny 5 objememi 40 mM octanu amónneho, pH 4,5 bol PEG-interferón a nemodifikovaný interferón eluovaný za použitia lineárneho gradientu chloridu sodného /0-0,5 M/ v 40 mM octane amónnom, pH 4,5· Frakcie, obsahujúce protein boli identifikované absorbanciou pri 280 nm a PEG-interferón obsahujúce frakcie boli identifikované pomocou SDS-PAGE·

PEG-interferón bol čalej čistený gélovou filtračnou chromatografiou deliacou podľaveľkosti na kolóne, obsahujúcej Sephacryl S-200 živicu /Pharmacia LKB/· Frakcie eluované z kolóny boli analyzované pomocou SDS-PAGE a piky materiálu, obsahujúceho PEG-interferón, boli spojené.

- 21 Príklad 2

Príprava alfa,alfa-oxometylén-bis/omega-metoxypoly(oxy-1,2-etándiyl)/SRU 28,3 postupom popísaným v príklade 1 sa MPEG /mol. hmotn. 1300/ prevedie na alfa,alfa-oxometylén-bis/omega-metoxypoly ( oxy-1,2-etándiyl)/SRU 28,3 a PEG-modifikovaný interferón sa pripraví za použitia tohto činidla spôsobom 1 popísaným v príklade 1.

príklad 3

Príprava alfa-metyl-omega-/2-/ (2-pyridinyloxy) karbonyl/oxy/-e toxy/-poly -{oxy-1, p-etándiylý/SRU 111,7

Z roztoku 1 g MPEG molekulovej hmotnosti 5000 rozpusteného v 30 ml suchého CH^Cl^ sa oddestiluje 10 ml rozpúšťadla. Roztok sa ochladí na teplotu miestnosti a pridá sa 132 mg /0,6 mM/ di-2-pyridyl-karbonátu a 4 mg DMAP· Výsledný roztok sa nato mieša 14 hodín a rozpúšťadlo sa odstráni za vákua. Zvyšok sa trituruje s dietyléterom a výsledná zrazenina sa odfiltruje, produkt sa potom rozpustí v 7 ml suchého glymu, ohreje pre vyvolanie rozpúšťania a výsledný roztok sa nechá schladnúť a stál pri teplote miestnosti niekolko hodín. Výsledná zrazenina sa potom odfiltruje a premyje sa 2x 5 ml suchého glymu. pevná látka sa potom suší vo vákuovej sušiarni a pod prúdom dusíka. Získa sa C,7 g alfa-/'2-pyridinyloxy'-karbonyl/omega-metoxypoly (oxy-1,2-etándiyl) SRU 111,7· Elementárna analýza Dre C_Hn ->NO. /ΟΗ^ΟΗ^ΟΛ _Ί ->

χχ 4 á 2 xlx,z vypočítané 54,57 % C, 9,02 « R, 0,28 % N nájdené 54,51 % C, 9,19 % H, 0,28 % N-

PEG modifikovaný interferón bol pripravený za použitia tohto činidla spôsobom popísaným v príklade 1.

Príklad 4

Príprava alfa-/(2-pyridinyloxy)karbonyl/omega-metoxypoly/oxy-1,2-etándiyl)SRU 225

Fostupom popísaným v príklade 3 sa MrEG molekulovej hmotnosti lOOOOprevedie na alfa-/(2-pyridinyloxy)karbonyl/omega-metoxypoly (oxy-1,2-etándiyl/SRU 225·

Elementárna analýza pre 0^ ^Hll^N0 ₄/^CH2^CH2^C/225^: vypočítané 54,54 % C, 9,08 % H, 0,14 %N nájdené 54,54 % C, 9,12 % H, 0,11 %N.

PEG-modifikovaný interferón bol pripravený za použitia . tohto činidla sposobomípopísaným v príklade 1.

príklad 5

Príprava alfa-metyl-omega/2-/2-//2-pyridinyloxy) karbonyl/oxy/-propoxy/propoxy/polyŕ'oxy-1,2-etándiyl) SRU 64,7

Z roztoku 0,5 g alfa-2“/2~i hydioxypropoxy)propyl/-omegametoxypoly(oxy-1,2-etándiyl) SP.U 64,7 v 40 ml suchého CH^Cl^ sa oddestiluje 15 ml rozpúšťadla. ^T< roztoku sa potom pridá 1C8 mg di-2-pyridylkarbonátu, 4 mg ΓΜΑΡ a niekolko gulôčok 4Ä molekulového sita. Zmes se potom mieša cez noc, filtruje a rozpúšťadlo sa nato odstráni za zníženého tlaku. Zvyšok sa čistí spôsobom chromatografie vylučujúcej podía velkosti.

Toto činidlo zodpovedá zlúčenine vzorca II3-1

CH^-O-(ch₂ch₂o)

CHoCHCCIL,CH n 2, c j

(1IB—1) kde n je ssi. 64·

PEG-modifikovaný interferón bol pripravený za použitia tohto činidla spôsobom 1 popísaným v príklade 1.

príklad 6

Príprava alfa-metyl-omega-/2-/2-//(2-pyridinyloxy)karbonyl/oxy/propoxy/propoxy/poly (oxy-1,2-etándiyl) SRU 110 po.stupom popísaným v príklade 5 Pol alfa-2-/2-(hydroxypropoxy)propyl/-omega-metoxypoly [oxy-1,2-etándiyl) SPU 110, prevedený na alfa-metyl-omega-/2-/2·// (2/pyridinyloxy)karbonyl/oxy/ propoxy/propoxy/poly joxy-1,2-etándiyl) SRU 110·

Toto činidlo /IIB-2/ zodpovedá činidlu popísanému v príklade 5 /IIB-1/ sttým rozdielom, že n je asi 110, čo zodpovedá asi 5000 dalton.

PEC--modifikovaný interferón bol pripravený za použitia tohto Činidla spôsobomlpopíseným v príklade 1.

Príklad 7

Príprava polyméru metyloxirán-oxirán-/2-//í'2-pyridinyloxyjkarbonyl/ amino/propylmetyléter /MC/C = 10/32/

Z roztoku 1 g Jeffaminu M-2070 /Texaco Chemical Co/ v 40 ml suchého 0^0^ ^sa cddestiluje 15 ml rozpúšťadla. Roztok sa_r ochladí na 0 °C a pridá sa 215 mg di-2-pyridylkarbonátu. Výsledný roztok sa mieša aalšie 4 hodiny pri 0 °C, potom sa rozpúšťadlo odstráni za zníženého tlaku. Zvyšok sa potom čistí pomocou dvoch kolón, deliacich podlá velkosti, spojených za sebou /50 Ä a 1000 Ä/· Produkt vykazuje dva pruhy v UV pri 232 nm a 310 nm.

Toto činidlo zodpovedá zlúčenine vzorca IIA-1

CH₃OCH₂CH₂0 (CÍ^CHO) _a-CH₂CE - ΝΉ

Ŕ² CHj

(11^1 ) kde F.5 je H, R² je H alebo metyl a ako priemerná distribúcia je n 32, ak je R² H a n je 10, ak je R² metyl.

PEG-modifikovaný interferón sa pripraví použitím tohto činidla spôsobom 2 popísaným v príklade 1.

Príklad 8

Príprava polyméru metyloirán -oxirá- /2-//(3~metyl-2-pyridinyloxy) karbonyl/amino/propylmetyléter /M0/0 = 10/32/ postupom popísaným v príklade 7 reaguje 1 g Jeffaminu M-2070 s bis(3-metyl-2-pyridylj karbonátom za vzniku polyméru metyloxirán-oxirán - /?-//(3^-metyl^-2-pyridinyloxy, karbonyl/ amino/propylmetyléter /M0/0 = 10/32/»

Toto činidlo /IIA-2/ zodpovedá činidlu z príkladu 7 /IIA-1/ s tym rozdielom, ze R^y je

PEG-modifikovaný interferón bol pripravený za neužitia tohto činidla spôsobom!popísaným v príklade 1.

Príklad 9

Príprava polyméru metyloxirán -oxirán - ,/2-//f2-pyridinyloxy; karbonyl/amino/propylmetyléteru /MG/G = 1,6/18,6/ postupom popísaným v príklade 7 reaguje 0,6 g Jeffaminu M-1000 /Texaco Chemical Co./ so 155,6 mg di-2-pyridylkarbonátu za vzniku polyméru metyloxirán -oxirán -2/2-//(2-pyridinyloxy) karbonyl/amino/propylmetyléter, blok /M0/0 = 1,6/18,6/.

Ten poskytuje zlúčeninu vzorca IIA-3 ? Λ CH₃0ÍC1^0H₂0)₁₈₍₆(0H2CH0)₁₎₆CE₂0H- k- \o

C_Hj CH.

majúcu uvedenú priemernú distribúciu jednotiek polymérneho produktu^-. ¹

PEG-modifikovaný interferón sa pripraví za coužitia tohto činidla spôsobom'lpopísaným v príklade 1.

Antivírusová účinnosť interferónu: Antivírusová účinnosť interferónu a PEG-modifikovaného interferónu sa stanoví /Rubenstein a spol., /1981/ J. Virol. 37:755-758; Familletti a spol., /1981/ Methods Enzymol. 78:387-394/· Všetky skúšky boli štandardizované vzhladom ku kontrole. Tnterferónový štandard po— ο užitý v skúške mal špecifickú aktivitu 2 x 10 jednotiek na mg proteínu.

Podmienky použité na modifikáciu interferónu boli založené na optimalizovaných protokoloch ako je popísané. PEG-modifikácia bola analyzovaná pomocou SDS-PAGE na konverziu interferónu na monoPEG-interferón v rôznych časoch inkubácie /chemickej reaktivity/ a na distribúciu rôznych druhov PEG-interferónových konjugátov /miestna selektivita/. V SDS-PAGE boli PEG-modifikované druhy pozorované ako slabšie migrujúce pruhy na géle. Obidva interferóny, monoPEG aj diPEG, boli získané v dostatočnom výťažku tak, že tieto druhy mohli byť vyčistené z reakčných zmesí hydrofóbnou interakčnou chromatografiou. Čistené PEG-interferóny boli testované na antivírusovú aktivitu a porovnané s nemodifikovanými interferón-a2a štandardmi. Molekulové hmotnosti použitých polymérov i ich antivírusová aktivita u ich pegylovaných derivátov sú uvedené v tabuíke

I.

Tabulka 1

Fyzikálne vlastnosti PEG činidiel a biologické aktivity ich proteínových konjugátov

Zlúčenina	antivírusová	aktivita
z	MCL.HMOTN,	/% kontroly/
príkladu	polyméru	monoPEG	diPEG
4	1000C	25	2
3	5000	40	4
1	5000	40	ND
6	5000	40	ND
5	3000	60	ND
γ	2070	45	ND
2	1300	70	ND
9	1000	100	40

ND = nestanovené

Claims (24)

PATENTOVÉ NÁROKY

1 až 10 pre použitie ako terapeuticky účinnej zlúčeniny pri liečbe alebo profylaxii chorôb.

1,0 až 10,0 a z je 0,0 až 4,0»

1. Interferónový konjugát všeobecného vzorca I kde R je nižší alkyl, R¹, R², R³ a R^{4 5} sú H alebo nižší alkyl, m je vybraté z celých číselní až do čísla dostupných aminoskupín v interferóne, ’V je C alebo NH, x je celé číslo medzi 1 a 1CCC a každé z y a z je celé číslo od 0 do 1CGO a súčet x, y a z je 3 až 10CC, .

v . 1 9 ~ 4. . „ „ , s tou podmienkou, že aspoň jeden z R“, ΡΛ, a R’ je mzsí alkyl.

2. Interferónový konjugát podlá nároku 1, kde x, y a z sú vybraté tak, že molekulová hmotnosť polymérnej jednotky v konjugáte je v rozsahu od asi 30C dalton do asi 30000 dalton.

3. Interferónový konjugát podía nároku 1, kde m je 1.

4. Interferónový konjugát podlá nároku 1, kde R je metyl.

5 · s tou podmienkou, že, äk je W NH_:, alebo ak je W O a R je H, aspoň jeden z R¹, R², R^ a R⁴ je nižší alkyl.

5. Interferónový konjugát podlá nároku 2, kde x, y a z sú vybraté tak, že molekulová hmotnosť polymérnej jednotky v konjugát e je v rozsahu od asi 1000 dalton do asi 5000 dalton.

6. interferónový konjugát podía nároku 2, kde x, y a z sú vybraté tak, že molekulová hmotnosť polymérnej jednotky v konjugáte je v rozsahu od asi 1000 do 2000 dalton.

7. Interferónový konjugát podlanároku 1, kde x a y sú 5,0 až 500,0 a z je 0,0 až 4,0.

8. Interferónový konjugát podía nároku 1, kde x je 10,0 až 100,0 y je 1,0 až 10,0 a z je 0.

9. interferónový konjugát podlanároku 1, kde interferónom je interferón λ2Α.

10. Interferónový konjugát podlanároku 9, kde Ύ je NH, m je 1, R, R² a R⁴ sú CHy R¹ je H, x je 18,6, y je 1,6 a z je 0.

11. Zlúčenina všeobecného vzorca II

O

II Á J

RC-/0H₂CH0/_x-/CH₂CH0/_y-/CH₂CH0/₂-CH_?CH-'S'-^X\_o/ i 1 ? 't Ή

R R R^J p⁴ kde R je nižší alkyl, R*, R , R-’, R⁴ a sú H alebo nižší alkyl,

’.V je NH alebo O, x je celé číslo medzi 1 a 1000 a každý z y a z je celé číslo od 0^: do 1000 a súčet x, y a z je 3 až 1000,

12. Zlúčenina podlá nároku 11, kde x, y a z sú zvolené tak, že molekulová hmotnosť uvedenej zlúčeniny je v rozmedzí od asi 30C dalton až asi 30C00 dalton.

13. zlúčenina podlá nároku 11, kde R je metyl.

14. zlúčenina podlá nároku 13, kde x je 10,C až 100,0, y je

15. Zlúčenina všeobecného vzorca III

RO-(CH₂CHOL-(CH₂CHOL-(CH₂CHO)_z-CH₂CHO — c=o A¹ A² r³ A^{4 J}2 /111/ kde R je nižší alkyl, R , R^z , R^J a R⁴ sú H alebo metyl, x je celé číslo od 1 do 1000 a každý z y a z je celé číslo od 0 do 1000 a súčet x, y a z je 3 až 1000.

16. zlúčenina podlanároku 15, kde x, y a z sú vybraté tak, že molekulová hmotnosť uvedenej zlúčeniny je v rozsahu ód asi 300 dalton do asi 30000 dalton.

„ v 12 7

17. Zlúčenina podlá nároku 15, kde aspoň jeden z R , R , Rj a R^ je nižší alkyl.

18· Zlúčenina podľa nároku 15, kde R je metyl.

lo.

Interferónové konjugáty podľa Ktoréhokoľvek z nárokov

20· Spôsob prípravy interferónového konjugátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov lažlO, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa reakciu zlúčeniny podľa nárokov 11 až 18 s interferónom alebo jeho solí a izoláciu interferónového konjugátu z reakčnej zmesi.

21. Farmaceutické prípravky, vyznačujúce sa t ý m, že obsahujú interfercnový konjugát podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 1C a terapeuticky prijatelný inertný nosič.

22· Farmaceutické prípravky na liečenie alebo crofylaxiu imunomodulačných chorôb, ako sú neoplastické choroby alebo infekčné choroby, vyznačujúce sa tým, že obsahujú interferónový konjugát podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 10 a terapeuticky inertný nosič.

23· Použitie interferónových konjugátov podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 10 na liečbu alebo profylaxiu chorôb iných než ludských.

24· Použitie interferónových konjugátov podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 10 na výrobu liečiv, na použitie pri liečení alebo profylaxii chorôb.