SK466390A3 - Purified and isolated dna sequence, construct, vector, transformed cell, peptide or protein having phytase activity, process for its preparation, and its use - Google Patents

Description

Vyčistená a izolovaná sekvencia DNA, konštrukt, vektor, transformovaná bunka, peptid alebo proteín s fytázovou aktivitou, spôsob jeho výroby a použitie

Oblasť techniky

I 'Vynález sa týka vyčistenej a izolovanej sekvencie DNA, kódujúcej peptid alebo proteín vykazujúci fytázovú aktivitu, konštruktu obsahujúceho túto DNA, vektoru na báze tohto konštruktu, bunky transformovanej týmto vektorom, peptidu alebo proteínu s fytázovou aktivitou, spôsob jeho výroby a použitia.

Doterajší stav techniky

Fosfor je esenciálny prvok pre rast všetkých organizmov. Pri chovaní dobytka sa musí do krmiva pridávať anorganický fosfor, aby sa dosiahli dobré prírastky u zvierat s jednoduchým žalúdkom (napríklad ošípaných, hydiny a rýb).

Naopak žiadny anorganický fosfor sa nemusí pridávať do krmiva prežúvavcov. Mikroorganizmy, prítomné v bachore, produkujú enzýmy, ktoré katalyzujú konverziu fytátu (myoinozitolhexakis-fosfátu) n inozitol a anorganický fosfát.

Fytát sa vyskytuje ako rezervný zdroj fosforu prakticky vo všetkých kŕmnych hmotách, ktoré pochádzajú z rastlín (pozri Kyselina fytová, jej chémia a aplikácia, Phytic acid, chemistry and applications. E. Graf (vyd.) Pilatus Press, Minneapolis, MN, USA [1986]). Fytát je obsiahnutý v množstve 1 - 3 % vo všetkých druhoch orechov, obilia, strukovín, olejnatých semenách, spórach a v pele. Komplexné soli kyseliny fytovej sa nazývajú fytín. Kyselina fytová sa pokladá za antinutričný faktor, pretože tvorí cheláty s minerálmi, napr. s vápnikom, zinkom, horčíkom, železom a môže tiež reagovať s proteínmi. Týmto spôsobom kyselina fytová znižuje biologickú dostupnosť proteínov a nutrične dôležitých minerálnych prvkov.

la

Fosfor vo forme fytátu prechádza zažívacím traktom zvierat s jednoduchým žalúdkom a je vylučovaný do mrvy. Hoci v časti hrubého čreva dochádza k istej hydrolýze fytátu, takto uvoľnený anorganický fosfor nemá nutričný význam, pretože sa anorganický fosfor absorbuje iba v tenkom čreve.

V dôsledku toho nie je značné množstvo nutrične dôležitého fosforu zvieratami s jednoduchým žalúdkom využité, napriek tomu, že je v krmivu prítomné.

Vylučovanie fosforu vo forme fytátu do mrvy má ďalšie následky. Intenzívny chov dobytka sa počas posledných desaťročí enormne zvýšil. V dôsledku toho sa zodpovedajúcim spôsobom zvýšilo množstvo mrvy a to spôsobilo ekologické problémy v rôznych častiach sveta. Tie sú čiastočne tiež zavinené hromadením fosfátu, pôvodom z mrvy, v povrchových vodách, čo spôsobuje eutrofizáciu.

Enzýmy, produkované mikroorganizmami, ktoré katalyzujú konverziu fytátu na inozitol a anorganický fosfor, sú všeobecne známe ako fytázy. Mikroorganizmy, ktoré produkujú fytázy, sú baktérie ako napr. Bacillus subtilis [V. K. Paver a V. J. Jagannathan (1982) J. Bacteriol., 151, 1102-1108] a Pseudomonas [D. J. Cosgrove (1970) Austral J. Biol. Sci., 23, 1207-1220]; kvasinky ako napr. Saccharomyces cerevisiae [N. R. Nayini a P. Markakis (1984) Lebensmittel Wissenschaft und Technológie, 17, 24-26]; a plesne ako napr. Aspergillus terreus [K. Yamada, Y. Minoda a S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem., 32, 1275-1282]. Je známe, že aj rôzne iné druhy rodu Aspergillus produkujú fytázu. Bolo zistené, že fytáza, produkovaná druhom Aspergillus ficuum, má jednu z najvyšších hodnôt špecifickej aktivity a tiež má lepšiu termostabilitu ako fytázy, produkované inými mikroorganizmami (nepublikované výsledky).

Pridávanie mikrobiálnej fytázy do krmiva zvierat s jednoduchým žalúdkom bolo už skôr opísané [Ware, J. H., Bluff, L. a Shieh, T. R. (1967) U.S. Patent No. 3,297,548; Nelson, T. S., Shieh, T. R., Wodzinski R. J. a Ware, J. H. (1971) J. Nutrition, 101, 1289-1294]. Avšak až do dnešných čias nebola aplikácia tohto nápadu komerčne uskutočniteľná, s ohľadom na vysoké náklady na produkciu mikrobiálnych enzýmov [Y. W. Han (1989) Animal Feed Sci. Technol., 24, 345350]. Z ekonomických dôvodov sa do krmiva zvierat s jednoduchým žalúdkom stále pridáva anorganický fosfor.

Bolo zistené, že mikrobiálne fytázy majú tiež iné priemyslové použitia. Príkladom takého použitia je priemyslový proces výroby škrobu z obilnín napr. z kukurice a pše3 nice. Odpadné produkty, ktoré obsahujú napr. obilný lepok z mokrého procesu mletia, sa predávajú ako krmivo pre zvieratá. Počas máčania sa môže pridať fytáza. Podmienky (t =

50“C a pH = 5,5) sú pre hubové fytázy ideálne (pozri napr. Európsku patentovú prihlášku č. 0 321 004 firmy Alko Ltd.). Krmivá, vytvorené z odpadných produktov tohto procesu budú s výhodou obsahovať fosfát miesto fytátu.

Tiež sa predpokladá, že fytázy sa môžu využiť pri spracovaní sóji (pozri Fináza™ enzýmy firmy Alko Finase™ Enzymes by Alko, informačná brožúra o produktoch firmy Alko Ltd., Rajamäki, Fínsko). Sójová múka obsahuje velké množstvo antinutričného faktoru, fytátu, ktorý spôsobuje, že tento zdroj bielkovín je nevhodný na použitie v detskej výžive a v krmivách pre ryby, telatá a iné neprežúvavce. Enzymatická úprava tohto cenného zdroja bielkovín zlepšuje nutričnú a komerčnú hodnotu tohto materiálu.

Iní výskumníci sa zaujímali o lepšiu charakterizáciu rôznych fytáz a zlepšenie procedúr produkcie a použitia týchto fytáz. Ullah publikoval postup purifikácie fytázy z divokého kmeňa Aspergillus ficuum a tiež niektoré biochemické parametre produktu, získaného týmto purifikačným postupom [Ullah, A. (1988a) Preparative Biochem., 18, 443458]. Uvedené údaje, zistené Ullahom, sú ukázané v tabulke 1, ďalej.

Sekvencia aminokyselín N-konca fytázy, produkovanej

A. ficuum bola dvakrát zverejnená Ullahom: Ullah, A. (1987) Enzýme and Engineering Conference IX, October 4-8. (1987) Santa Barbara, Kalifornia (uvedené na plagáte); a Ullah, A. (1988b) Prep. Biochem., 18, 459-471. Údaje o sekvencii aminokyselín podlá Ullaha sú uvedené na obr. IA, sekvencia E, ďalej.

Z Ullahových zistení vyplývajú rôzne zaujímavé postrehy. Predovšetkým vyčistený preparát, opísaný Ullahom (1988a, 1988b) poskytuje na SDS-PAGE dva proteínové pásy. My sme však zistili, že vyčistená fytáza z A. ficuum obsahuje kontaminant a že jeden z pásov, nájdený na SDS-PAGE a identifikovaný Ullahom ako fytáza, pochádza z tohto kontaminantu

Tento rozdiel je tiež zrejmý z údajov o sekvencii aminokyselín, publikovaných Ullahom (1987, 1988b; porovnaj obr. IA, sekvenciu A a B so sekvenciou C). My sme vlastne určili, že jedna zo sekvencii aminokyselín vnútorných peptidov fytázy, ktoré opísal Ullah (pozri obr. 1B, sekvencia E), v skutočnosti patrí kontaminujúcemu proteínu s molekulovou hmotnosťou 100 kDa (obr. 1C). Tento proteín je obsiahnutý v preparáte, získanom postupom podía UHaha a na SDS-PAGE je viditeíný ako jeden z dvoch pásov (Ullah, 1988a a 1988b). Ullah nerozpoznal prítomnosť zmieneného kontaminujúceho proteínu a miesto toho ho identifikoval ako ďalšiu formu fytázy. Následkom prítomnosti tejto kontaminácie sa zvyšuje obťažnosť selekcie a izolácie vlastnej sekvencie nukleotidov, ktorá kóduje fytázovú aktivitu. Ďalej prítomnosť kontaminácie znižuje hodnotu špecifickej aktivity testovaného proteínu.

Po ďalšom skúmaní sekvencie, ako ju opísal Ullah, sme s určitosťou zistili pomocou sekvenačných techník pre bielkoviny a DNA, že aminokyselinový zvyšok v polohe 12, ktorý Ullah určil ako glycín, je v skutočnosti cysteín (pozri obr. 6 a 8).

Nakoniec Ullah zverejnil, že fytáza je proteín s molekulovou hmotnosťou 85 kDa, po deglykozylácii 61,7 kDa (Ullah, 1988b). Táto hodnota, ktorá je oveía nižšia ako skôr zverejnená hodnota 76 kDa [Ullah, A. a Gibson, D. (1988) Prep. Biochem., 17(1), 63-91], bola určená na základe relatívneho množstva cukrov, uvoínených pri hydrolýze a zdanlivej molekulovej hmotnosti natívneho proteínu na SDS-PAGE. My sme však zistili, že glykoxylovaná fytáza má jednu hodnotu zdanlivej molekulovej hmotnosti; 85 kDA, avšak deglykozylovaný proteín má molekulovú hmotnosť v rozmedzí 48 až

56,5 kDa v závislosti od stupňa deglykozylácie.

Mullaney a ďalší (Konferencia o vláknitých hubách, apríl 1987, Pacific Grove, Kalifornia) (predvedenie vo forme plagátu) tiež zverejnili charakterizáciu fytázy z A. ficuum. Avšak táto správa tiež obsahu zmienku o dvoch proteínových pásoch na SDS-PAGE, z ktorých jeden má molekulovú hmotnosť 85 kDa a druhý 100 kDa a ktoré sú prítomné vo vyčistenom proteínovom preparáte. Obidva tieto proteínové pásy boli autormi identifikované ako formy fytázy. Metóda transformácie mikrobiálnych hostitelov bola navrhnutá, ale jej uskutočnenie nebolo oznámené. Klonovanie a izolácia sekvencie DNA, ktorá kóduje fytázu, neboli opísané.

Ekonomický spôsob produkcie fytázy prinesie významný úžitok okrem iných v krmivárskom priemysle. Jednou metódou produkcie ekonomickejšej fytázy by bolo použitie techniky rekombinácie DNA na zvýšenie úrovne expresie enzýmu v rôznych mikroorganizmoch, ktoré sú známe tým, že produkujú velké množstvo peptidov a bielkovín. Do dnešného dňa však izolácia a klonovanie sekvencie DNA, ktorá kóduje fytázu, nebolo zverejnené.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je predovšetkým vyčistená a izolovaná sekvencia DNA, kódujúca peptid alebo proteín vykazujúci fytázovú aktivitu, ktorá katalyzuje uvolňovanie aspoň jedného anorganického fosfátu z myoinozitolfosfátu, pričom táto sekvencia DNA je zvolená zo súboru zahŕňajúceho:

a) sekvenciu DNA kódujúcu polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je znázornená na obr. 8 a

b) sekvencie DNA, ktoré sú schopné hybridizovať za podmienok nízkej stringencie (6 x SSC, 50°C cez noc) s próbou zahŕňajúcou nukleotidové polohy 1 až 818 z obr. 8.

Izolácia a klonovanie tejto sekvencie DNA, kódujúcej fytázu, boli vykonané pri použití špecifických, pre tento

5a vynález špeciálne vyvinutých, oligonukleotidových prób. Naj lepšie sekvencie DNA podľa vynálezu je možné získať z hub, najmä vláknitých hub rodu Aspergillus.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je vektor, obsahujúci konštrukt na expresiu a dalej aspoň jednu kópiu · prinajmenšom jednej najlepšie homológnej sekvencie DNA, ktorá kóduje fytázu. Táto sekvencia je operabilne spojená s vhodnou regulátorovou oblasťou, ktorá je schopná riadiť vysokú úroveň expresie peptidov alebo proteínov s fytázovou aktivitou vo vhodnom hostiteľovi.

Konštrukt na expresiu, uvedený v tomto vynáleze, môže byť včlenený do vektoru, najlepšie plazmidu, ktorý je schopný transformovať hostiteľskú mikrobiálnu bunku a integrovať sa do jej genómu.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je transformant, najlepšie mikrobiálneho hostiteľa, ktorý bol transformovaný vektorom, opísaným v predchádzajúcom odseku. Transformovanými hostiteľmi, uvedenými v tomto vynáleze, sú vláknité huby rodu Aspergillus, Trichoderma, Mucor a Penicillium, kvasinky rodu Kluyveromyces a Saccharomyces alebo baktérie rodu Bacillus. Osobitne výhodnými hostiteľmi na expresiu sú vláknité huby rodu Aspergillus. Transformované hostitelia sú schopné produkovať veľké množstvo rekombinantnej fytázy v ekonomickom, priemyslovom meradle.

V iných aspektoch je vynález venovaný rekombinantným peptidom a proteínom s fytázovou aktivitou v glykozylovanej alebo neglykozylovanej forme, spôsobu prípravy uvedených neglykozylovaných peptidov a proteínov, proteínom s fytázovou aktivitou, ktoré sú bez nečistôt a monoklonálnym protilátkam, ktoré sú schopné reagovať s týmito rekombinantnými alebo nečistenými proteínmi.

Porovnanie biochemických parametrov vyčistenej fytázy z divokého kmeňa A. ficuum, ktorú získal Ullah, s ďalšou vyčistenou fytázou z divokého kmeňa A. ficuum, ktorá bola získaná pri tomto vynáleze, je ukázané v tabuľke 1 ďalej. Významné sú údaje o špecifickej aktivite, z ktorých je vidieť, že vyčistený proteín, ktorý sme získali my, má dvojnásobnú aktivitu ako proteín, ktorý uvádza Ullah.

Tento vynález ďalej poskytuje nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú bielkoviny s fytázovou aktivitou a tiež aminokyselinové sekvencie týchto bielkovín. Poskytnuté sekvencie sa môžu použiť na zostavenie oligonukleotidových prób

Tieto próby sa môžu ďalej používať pri hybridizačných screening štúdiách na identifikáciu fytázových génov pri iných druhoch, najmä mikrobiálnych, ktoré môžu byť následne izolované a klonované.

Sekvencie, ktoré poskytuje tento vynález, môžu byt tiež použité ako štartovacie materiály, na konštrukciu fytáz druhej generácie. Fytázy druhej generácie sú fytázy, ktoré boli zmenené technikou mutagenézy (napr. mutagenézou, cielenou na určité miesto). Majú vlastnosti, ktoré sú odlišné od vlastností fytáz divokých typov alebo rekombinantných fytáz, ktoré sú produkované postupom podía tohto vynálezu. Napríklad teplotné alebo pH optimum, špecifická aktivita alebo substrátová špecifickosť sa dajú zmeniť tak, aby to lepšie vyhovovalo aplikácii v danom procese.

V kontexte tohto vynálezu termín fytáza zahŕňa skupinu enzýmov, ktoré katalyzujú uvoľňovanie anorganického fosforu z rôznych myoinozitol fosfátov. '

Fytázová aktivita sa môže merať pomocou rôznych stanovení. Voíba stanovenia nemá pri tomto vynáleze rozhodujúcu dôležitosť. Na ilustráciu, fytázová aktivita sa môže stanoviť meraním množstva enzýmu, ktoré uvoíní anorganický fosfor z 1,5 mM fytátu sodného rýchlosťou 1 μιιιοΐ/min pri teplote 37’C a pH 5,5.

Je potrebné poznamenať, že do rozsahu termínu fytáza, ako sa používa v celom texte tohto opisu, spadajú všetky peptidy a proteíny s fytázovou aktivitou. To ukazuje obr.

IA, ktorý porovnáva sekvencie A a B (sekvencie boli získané počas práce na vynáleze) so sekvenciou C (publikovaná Ullahom, 1988b). Tento obrázok ukazuje, že proteíny, získané postupom podía tohto vynálezu, nemusia mať prvé štyri aminokyseliny (proteín so sekvenciou A nemá prvých sedem aminokyselín) zo sekvencie maturovaného fytázového proteínu z A. ficuum. Avšak tieto proteíny si zachovávajú fytázovú aktivitu. Kompletnú sekvenciu aminokyselín fytázového pro8 teínu, ktorá bola odvodená z korešpondujúcej sekvencie nukleotidov, ukazuje obr. 8.

Fytázy, produkované postupom podlá tohto vynálezu, sa môžu aplikovat v rôznych procesoch, ktoré vyžadujú konverziu fytátu na inozitol a anorganický fosfát.

Napríklad výroba fytáz podlá tohto vynálezu zníži výrobné náklady mikrobiálnych fytáz tak, že bude možná ich ekonomická aplikácia v krmivách. To nakoniec povedie k tomu, že pomer ceny a výsledku dosiahnutého s fytázami in vivo bude konkurencie schopný s pomerom dosiahnutým anorganickým fosfátom. Ďalšou výhodou bude značné zníženie obsahu fosforu v mrve.

Aplikácia cenovo dostupných fytáz, ktoré budú schopné konkurovať anorganickému fosfátu, zvýši mieru volnosti priemyslu výroby krmivových zmesí pri výrobe kvalitných krmív. Napríklad kedf sa do krmiva dodá fytáza, prídavok anorganického fosfátu sa môže vynechať a obsah rôznych materiálov, obsahujúcich fytát, sa môže zvýšiť.

Okrem použitia v krmivách a pri spracovaní sóji, ako bolo diskutované hore, sa môže fytáza, získaná postupom podlá tohto vynálezu, tiež použiť v rôznych priemyslových aplikáciách ako napr.

- ako tekuté krmivo pre ošípané a hydinu.

Existuje všeobecná prax máčať krmivo počas niekolkých hodín pred kŕmením. V priebehu tohto času môže enzým konvertovať fytát na inozitol a anorganický fosfát;

- v priemyslovom procese na výrobu inozitolu alebo inozitolfosfátov z fytátu;

- v iných priemyslových procesoch, ktoré používajú substráty, obsahujúce fytát, napr. v škrobárenskom priemysle a fermentačných priemysloch napr. pivovarníctve. Fytát chelátuje kovové ióny a to môže spôsobovať nedostupnosť týchto iónov pre produkčné mikroorganizmy. Enzymatická hydrolýza fytátu odstráni tieto problémy.

Tieto a iné predmety a výhody tohto vynálezu sa stanú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu.

Prehľad obrázkov na výkrese

Obr. IA - Sekveneie N-terminálnych aminokyselín, stanovené pre purifikovanú fytázu. Sekveneie aminokyselín označené A a B, sú podľa tohto vynálezu a pochádzajú z rôznych foriem fytázy. A má izoelektrický bod 5,2, B 5,4. Sekvencia C je sekvencia citovaná Ullahom (1987, 1988b pozri hore). Pri tomto vynáleze bolo stanovené, že aminokyselinový zvyšok, umiestnený v polohe 12 pri sekvenciách A a B, nie je zvyškom glycínu.

(* označuje nejednoznačnú identifikáciu, ** označujú, že žiadny zvyšok nie je detegovaný).

I '

Obr. 1B - Sekveneie N-terminálnych aminokyselín vnútorných fragmentov fytázy po štiepení CNBr. Sekveneie aminokyselín označené A a B, (molekulová hmotnosť peptidu A je približne 2,5 kDa, molekulová hmotnosť peptidu B je približne 36 kDa), sú podľa tohto vynálezu. Sekveneie C a E sú citované v práci Ullaha (1988b, pozri hore).

Obr. 1C - Sekveneie N-terminálnych aminokyselín proteínu s molekulovou hmotnosťou 100 kDa, prítomnosť ktorého bola zistená pri práci na tomto vynáleze v surových vzorkách fytázy.

Obr. 2A - Oligonukleotidové próby vytvorené na základe údajov z obr. IA, peptidy A až E.

Obr. 2B - Oligonukleotidové próby vytvorené na základe údajov z obr. 1B, peptidy A a B.

Obr. 3 - Oligonukleotidové próby, použité na izoláciu génu, ktorý kóduje kyslú fytázu.

Obr. 4 - Reštrikčná mapa bakteriofága lambda AF 201, obsahujúca lokus fytázy z A. ficuum. šípka ukazuje umiestnenie fytázového génu a smer transkripcie. Stĺpec číslo klonu ukazuje subklony, ktoré boli odvodené uvedenými reštrikčnými enzýmami z fágu AF 201 v pAN 8-1 (pre pAF 28-1) a v pUC19 (pre všetky ostatné subklony).

Obr. 5 - Fyzická mapa pAF 1-1. Fragment 10 kb BamHI, vložený do pUC19, obsahuje celý gén, kódujúci kyslú fytázu z A. ficuum.

Obr. 6 - Kompilácia nukleotidových sekvencii plazmidov pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7, zahŕňajúca chromozomálny lokus fytázového génu. Oblasť, kódujúca fytázu, je lokalizovaná na nukleotidových pozíciách 210 až 1713; intrón je prítomný v chromozomálnom géne od pozície 254 až k pozícii 355. Dôležité časti ako sú reštrikčné miesta, štart a stop kodóny pre fytázu a umiestnenie intrónu sú označené.

Obr. 7 - Podrobná fyzická mapa sekvenovaného chromozomálneho lokusu pre fytázu; šípky ukazujú umiestnenie dvoch exónov časti, kódujúcej fytázu.

Obr. 8 - Sekvencie nukleotidov preloženej časti fragmentu cDNA pre fytázu a odvodená sekvencia aminokyselín pre fytázový proteín; začiatok maturovaného fytázového proteínu je označený ako pozícia +1. N-koniec vnútorného proteínového fragmentu s molekulovou hmotnosťou 36 kDa je lokalizovaný na aminokyselinovej pozícii 241, avšak proteínový fragment s molekulovou hmotnosťou 2,5 kDa začína od aminokyselinovej pozície 390.

Obr. 9 - Fyzická mapa kazety pAF 2-2S na expresiu fytázy. Šípky ukazujú smer prepisu génov.

Obr. 10 - Dôkaz o nadprodukcii fytázy v trasformante A.

ficuum NRRL 3135 na IEF-PAGE. Rovnaké objemy supernatantu kultúry A. ficuum (pruh 1) a transformantu pAF 2-2S SP7 (pruh 2), narastené za rovnakých podmienok, boli analyzované v Phast-System (Pharmacia) s gélom IEF-PAGE v pH v rozmedzí 4,5 až 6. Na porovnanie, vzorka fytázy z A. ficuum, purifikovaná do homogénneho stavu, bola analyzovaná buď oddelene (pruh 4) alebo zmiešaná so supernatantom kultúry (pruh 3). Gély boli farbené budí fosfatázovým farbivom, uvedeným v texte (obr. 10A) alebo obvyklým farbivom pre proteíny (Coomassie Brilliant Blue, obr. 10B). Fytázové pásy sú označené hviezdičkou.

Obr. 11 - Dôkaz o nadprodukcii fytázy v transformantoch.

I

A. niger CBS 513.88 na IEF-PAGE. Rovnaké objemy supernatantov kultúry rodičovského kmeňa A. niger (pruh 1) alebo transformantov pAF 2-2S č. 8 (pruh 2), pFYT3 č. 205 (pruh 3) a č. 282 (pruh 4) boli analyzované na IEF-PAGE rovnakým spôsobom, ako je opísané v legende k obr. 10. Gély boli farbené budí obvyklým farbivom pre látky s fosfatázovou aktivitou (obr. 11A) alebo obvyklým spôsobom pre proteíny (obr. 11B). Fytázové pásy sú označené hviezdičkou .

’

Obr. 12 - Fyzická mapa pAB 6-1. Inzert DNA HindlII s molekulovou hmotnosťou 14,5 kb v pUC19 obsahuje celý lokus pre glukoamylázu (AG) z A. niger.

Obr. 13 - Schéma generácie génových fúz AG promótoru s fytázovým génom polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Sekvencie všetkých použitých oligonukleotidových prajmerov sú uvedené v texte.

Obr. 14 - Fyzická mapa fytázovej expresnej kazety pAF 2-2SH.

Obr. 15 - Fyzické mapy intermediárnych konštruktov pXXFYTl, pXXFYT2 a kaziet na expresiu fytázy pXXFYT3, v ktorých XX označuje vedúcu sekvenciu (L). Do pl8FYT je vložená vedúca AG sekvencia 18 aa a do p24FYT vedúca AG sekvencia 24 aa, avšak do pFYT je vložená fytázová vedúca sekvencia.

Obr. 16 - Fyzická mapa plazmidu pFYT3 amdS.

Obr. 17 - Fyzická mapa plazmidu pFYT3INT.

Obr. 18 - Fyzická mapa vektoru pREPFYT3, ktorý nahradil AG vektor.

Obr. 19 - Autorádiogramy chromozómovej DNA, štiepenej Pvu II (obr. a) a BamHI (obr. b) a hybridizovanej s cDNA. Táto cDNA označená ³²P, kóduje fytázu pri

A. ficuum a je próbou mikrobiálnych druhov S. cerevisiae (pruh 2); B. subtilis (pruh 3); K. lactis (pruh 4); P. chrysogenum (pruh 5); P. aeruginosa (pruh 6); S lividans (pruh 7); A. niger 1 gg (pruh 8); A. niger 5 μ5 (pruh 9); blank (pruh 10); C. thermocellum (pruh 11). Pruh 1: markér DNA.

Klonovanie génov, kódujúcich vybrané proteíny, ktoré sú produkované mikroorganizmami, sa môže uskutočňovať rôznymi spôsobmi. Jednou metódou je purifikácia proteínu, o ktorý je záujem, ďalej určenie sekvencie jeho N-koncových aminokyselín a potom screening genómovej knižnice daného mikroorganizmu pri použití DNA oligonukleotidovej próby, ktorá je založená na danej sekvencii N-koncových aminokyselín. Príklady úspešnej aplikácie tohto postupu sú klonovanie génu pre izopenicilín N-syntetázu pri Cephalosporium acremonium [S. M. Samson et al. (1985) Náture, 318, 191194] a izolácia génu, kódujúceho TAKA amylázu pri Aspergillus oryzae [Boel et al. (1986) EP-A-0238023].

Bol vykonaný pokus o izoláciu génu, ktorý kóduje fytázu pri Aspergillus ficuum, týmto postupom. Proteín bol rozsiahle čistený a boli stanovené niektoré jeho biochemické parametre. Získané údaje sú porovnané s údajmi, ktoré publikoval Ullah (1988a). Obidva súbory údajov sú predložené v tabuľke 1, ďalej.

Tabuľka 1

Biochemické parametre purifikovanej fytázy divokého kmeňa

A. ficuum

Parameter	Tento vynález:	Ullah:
Špecifická aktivita*	100 U/mg proteínu	50 U/mg proteínu
čistota: SDS-PAGE	85 kDa	85/100 kDa
IEF-PAGE	3 alebo 4 pásy	nevykonané
Km (afinitná konštanta)	250 μΜ	40 μΜ
Špecifickosť pre:
Inozitol-l-P	neaktívna	neaktívna
Inozitol-2-Ρ	Km = 3,3 mM	5% aktivita
pH optimum	2,5 a 5,5	2,5 a 5,5
Tepl. optimum (’C)	50	58
molekulová hmotnosť
(kDa)**	85	85 a 100
molekulová hmotnosť
(neglykozylovaná)* *	56,5	61,7
izoelektrický bod***	5,0-5,4	4,5

I * Aktivitu fytázy meral Ullah skôr pri 58’C ako pri 37’C. Jednotka aktivity fytázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré uvoľní anorganický fosfor z 1,5 mM fytátu sodného rýchlosťou 1 μπιοί/πιΐη pri 37’C a pH 5,5. Na porovnanie fermentačných výťažkov a špecifických aktivít boli aktivity, zistené Ullahom, korigované s ohľadom na teplotný rozdiel. Korekcia je založená na rozdielu v aktivite fytázy, meranej pri 37’C a pri 58’C, ako ukazuje Ullah (1988b) v tabuľke

III.

** Molekulová hmotnosť určená na SDS-PAGE. *** Stanovené na IEF-PAGE.

Na izoláciu génu, kódujúceho fytázu bola zostavená prvá sada oligonukleotidových prób hore opísanou metódou (obr. 2A). Zostavenie týchto prób je založené na údajoch o sekvencii aminokyselín. Pre kontrolu celého tohto postupu boli podobné kroky urobené pri izolácii génu, kódujúceho kyslú fosfatázu, pričom sa využili údaje, ktoré o tomto proteíne publikovali Ullah a Cummins [(1987) Prep. Biochem., 17, 397-422]. Zodpovedajúci gén pre kyslú fosfatázu bol izolovaný bez problémov. Avšak v prípade fytázy bola situácia odlišná. Hoci bolo vykonaných veía pokusov, v ktorých boli použité próby, odvodené zo sekvencii N-koncových aminokyselín, nepodarilo sa izolovať žiadne fragmenty genómu DNA alebo klony z genómovej knižnice, ktoré by mohli byt pozitívne identifikované, že obsahujú gény, kódujúce fytázu.

Za účelom vyriešenia tohto problému bola purifikovaná fýtáza štiepená CNBr. Vzniknuté proteínové fragmenty boli izolované. Pri týchto fragmentoch bola stanovená sekvencia N-koncových aminokyselín (obr. 1B). Na základe týchto nových údajov boli zostavené oligonukleotidové próby (obr 2B). Tieto nové oligonukleotidové próby sa prekvapivo dali stotožniť so špecifickými fragmentmi DNA a boli vhodné na jednoznačnú identifikáciu klonov z genómovej knižnice. Nebola pozorovaná žiadna krížová hybridizácia medzi novými klonmi alebo fragmentmi DNA, ktoré z nich boli izolované a prvou sadou oligonukleotidových prób alebo klonmi, ktoré boli izolované pri použití tejto prvej sady prób.

Táto druhá sada prób sa môže tiež použit na identifikáciu sekvencii, kódujúcich významné fytázy.

Novo izolované klony boli použité ako próby v hybridizáciách Northern blot. Diskrétna mRNA mohla byt detegovaná iba vtedy, keď mRNA bola izolovaná z mycélia, produkujúceho fytázu. Ked bola RNA získaná z mycélia, neprodukujúceho fytázu, nebol zistený žiaden hybridizačný signál.

Teoretickým výťažkom mRNA, s hmotnosťou 1800 kDa, je proteín s maximálnou molekulovou hmotnosťou približne 60 kDa. Táto hodnota zodpovedá molekulovej hmotnosti, ktorá bola stanovená pre neglykozylovaný proteín a molekulovej hmotnosti proteínu, ktorá bola odvodená zo sekvencie DNA.

Okrem toho, keď boli tieto próby transformáciou zavedené do hubovej bunky, prejavil sa vzrast fytázovej aktivity. To nezvratné ukazuje, že bola skutočne izolovaná nukleotidová sekvencia, kódujúca fytázu. Sekvencie aminokyselín, ktoré boli stanovené pre purifikovaný fytázový enzým a pre CNBr fragmenty, z nej získané, sa zhodujú s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá bola stanovená pre klonovaný gén. Sekvencie nukleotidov a odvodená sekvencia aminokyselín sú uvedené na obrázkoch 6 a 8 a ďalej opisujú klonovanú sekvenciu, ktorá kóduje fytázu.

Izolácia nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje fytázu, umožňuje ekonomickú produkciu fytázy v priemyslovom meradle pomocou aplikácie moderných techník rekombinácie DNA ako sú génová amplifikácia, výmena regulátorových elementov ako napr. promótorov, sekrečných signálov alebo kombinácií týchto metód.

Preto tento vynález tiež zahŕňa transformovaného hostiteľa, ktorý je schopný účinnej expresie vysokých úrovní peptidov alebo proteínov s fytázovou aktivitou a prípadne tiež účinnej expresie kyslej fosfatázy. Zaujímavými hostiteľmi sú bunky, selektované z vláknitých hub rodu Aspergillus, Trichoderma, Mucor a Penicillium, kvasiniek rodu Kluyveromyces a Saccharomyces a baktérií rodu Bacillus. Prednostne je selektovaný taký hostiteľ, ktorý je schopný efektívnej sekrécie svojich endogénnych proteínov.

Osobitne zaujímavé sú priemyslové kmene Aspergillus, najmä niger, ficuum, awamori alebo oryzae. Je možné tiež použiť Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis alebo Bacillus licheniformis.

Konštrukt na expresiu bude obsahovať sekvencie nukleotidov, ktoré kódujú požadovaný enzýmový produkt, ktorý má byť exprimovaný. Zvyčajne obsahuje signálnu sekvenciu, ktorá funguje v hostiteľskej bunke a umožňuje sekréciu produktu, peptidu alebo proteinu.

Podľa tohto vynálezu sa môžu používať rôzne signálne sekvencie. Môže sa použit signálna sekvencia, ktorá je homológna s klonovanou nukleotidovou sekvenciou, ktorá má byt prepísaná. Alebo sa môže použiť signálna sekvencia, ktorá je homológna alebo čiastočne homológna so signálnou sekven ciou génu v cieľovom lokuse štepu, aby sa uľahčila homológna rekombinácia. Ďalej sa tiež môžu použiť signálne sekvencie, ktoré boli zostavené na umožnenie lepšej sekrécie zo selektovaných hostiteľských buniek. Pozri napríklad Von Heyne (1983) Eur. J. Biochem., 133, 17-21; Perlman a Halverson (1983) J. Mol. Biol., 167, 391-409. Sekvencia DNA, kódujúca signálnu sekvenciu, môže byt pripojená priamo pomocou sekvencie, ktorá kóduje proces signálu (rozštiepenie rozpoznávacieho miesta) k sekvencii kódujúcej požadovaný proteín. Alebo môže byt pripojená pomocou krátkeho mostíka, zvyčajne menej ako 10 kodónov.

Preferované signálne sekvencie na sekréciu, použité podľa tohto vynálezu, sú signálne sekvencie homológne s klonovanou nukleotidovou sekvenciou, ktorá má byt exprimovaná. Ďalej sú to signálne sekvencie pre glukoamylázu (AG) obsahujúcu 18 aminokyselín a signálne sekvencie pre glukoamylázu (AG) obsahujúcu 24 aminokyselín, pričom tieto dve sekvencie sú bučí homológne alebo heterológne s nukleotidovou sekvenciou, ktorá má byt exprimovaná.

Produkt expresie alebo významná sekvencia nukleotidov môže byť DNA, ktorá je homológna alebo heterológna s expresným hostiteľom.

Homológna DNA je tu definovaná ako DNA, ktorá pochádza z rovnakého rodu. Napr. Aspergillus sa transformuje

DNA z Aspergillus. Takto je možné zlepšiť už existujúce vlastnosti hubového rodu bez zavedenia nových vlastností, skôr v tomto rode prítomných.

Heterológna DNA je tu definovaná ako DNA, ktorá pochádza z viac ako jedného rodu, tzn. ako vyplýva z príkladu, uvedeného v predchádzajúcom odseku, DNA, pochádzajúca z iného rodu ako Aspergillus, ktorá sa dalej exprimuje v Aspergille.

Nukleotidovými sekvenciami, kódujúcimi fytázovú aktivitu sú prednostne sekvencie získané z hubového zdroja. Viac cenené sú nukleotidové sekvencie, kódujúce fytázu, ktoré boli získané z rodu Aspergillus. Najviac cenené sekvencie sú získané z druhov Aspergillus ficuum alebo Aspergillus niger.

Oblasť od 5' k počiatku otvorenej konštrukcie pre čítanie v nukleotidovej sekvencii, ktorá je pre vynález významná, obsahuje regulačný úsek na iniciáciu transkripcie (alebo promótor). Ktorýkoľvek funkčný úsek v hostiteľskej bunke, vrátane promotoru, ktorý je homológny s nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou fytázu, ktorá má byť exprimovaná, môže byt využitý. Avšak väčšinou je využitý úsek úsek homológny s oblasťou cieľového lokusu. Uvedené skutočnosti majú vplyv na substitúciu produktu expresie cieľového lokusu, za požadovaný produkt expresie. Pokiaľ úroveň expresie a sekrécie proteínu, kódujúceho cieľový lokus, bude zaisťovať efektívnu produkciu, bude zvyčajne regulačný úsek pre iniciáciu transkripcie považovaný za uspokojivý. Avšak v niektorých prípadoch je požadovaná vyššia úroveň transkripcie ako má gén cieľového lokusu. Niekedy tiež chceme mať induktívnu expresiu, ktorú spôsobuje osobitné indukčné činidlo. V týchto prípadoch sa používa regulačný úsek na iniciáciu transkripcie, ktorý je odlišný od úseku v géne cieľového lokusu. Je známy veľký počet regulačných úsekov na iniciáciu transkripcie, ktoré sú funkčné vo vláknitých hubách. Tieto úseky sú z génov, ktoré kódujú glukoamylázu (AG), hubovú amylázu, kyslú fosfatázu, GAPDH, TrpC, AmdS, AlcA, AldA, histón H2A, Pyr4,

PyrG, izopenicilín N-syntetázu, PGK, kyslú proteázu, acyl transferázu a podobne.

Cieľovým lokusom je najlepšie gén s vysokou úrovňou expresného proteínu, tzn. gén, ktorý spôsobí, že koncentrácia prečítaného produktu na konci fermentačného procesu je aspoň 0,1 g/1. Trvanie tohto procesu sa môže meniť okrem iného v závislosti od požadovaného proteínového produktu. Príkladom takého génu je gén, kódujúci glukoamylázu (AG).

Iné zaujímavé gény sú pre hubovú α-amylázu, kyslú fosfatázu, proteázu, kyslú proteázu, lipázu, fytázu a celobiohydroxylázu. Osobitne cenenými cieľovými lokusmi sú gén pre glukoamylázu z A. niger, gén pre hubovú amylázu z A. oryzae, gény pre celobiohydroxylázu z T. reesei, gén pre kyslú proteázu z Mucor miehei, gén pre laktázu z Kluyveromyces lactis alebo gén pre invertázu zo Saccharomyces cerevisiae.

Regulačný úsek na termináciu transkripcie môže byt z požadovaného génu z cieľového lokusu alebo z inej vhodnej sekvencie. Ked konštrukt obsahuje ďalšie dôležité sekvencie za (v smere transkripcie) požadovaným génom, tak by regulačný úsek na termináciu transkripcie, v prípade že je homológny s cieľovým lokusom, mal byt podstatne menší ako homológny zdvojený úsek.

Zvyčajne sa používa selekčný markér, ktorý môže byt častou konštrukcie na expresiu alebo môže byt oddelený od tohto konštruktu, tak aby sa mohol integrovať na odlišné miesto ako zaujíma požadovaný gén. Pretože rekombinantné molekuly podľa vynálezu sa s výhodou transformujú do hostiteľského kmeňa, ktorý sa môže použiť na priemyslovú výrobu, selekčné markéry na sledovanie transformácie sú dominantné selekčné markéry, čo znamená, že do hostiteľského kmeňa nesmú byt zavedené žiadne mutácie, aby sa mohli tieto selekčné markéry použiť. Príkladom sú markéry, ktoré umožňujú transformantom rásť na definovaných zdrojoch živín (napr. gén amdS z A. nidulans umožňuje transformantom z A. niger rást na acetamide ako jedinom zdroji dusíka) alebo markéry, ktoré udeľujú rezistenciu voči antibiotikám (napr. gén ble spôso19 buje rezistenciu k pleomycínu alebo gén hph spôsobuje rezistenciu k hygromycínu B).

Selekčné gény majú svoje vlastné regulačné úseky na iniciáciu a termináčiu transkripcie a translácie, ktoré dovoľujú nezávislú expresiu markéru. Ako bolo opísané skôr, je známy veľký počet regulačných úsekov na iniciáciu transkripcie a tie môžu byt použité v spojení s markérovými génmi Keď selekčné markéry spôsobujú rezistenciu k antibiotikám, koncentrácia antibiotika na selekciu sa mení v závislosti od antibiotika. Zvyčajne sa pohybuje v rozmedzí od 30 do 300 μς/1.

Rôzne sekveneie môžu byt pripojené známymi technikami ako je reštrikcia, pripojenie komplementárnych reštrikčných miest a ligácia, zakončenie natupo vyplnením prekryvov a ligácia natupo, Bal 31 resekcia, oprava prajmeru, mutagenéza in vitro a podobne. Keď je to vhodné, môžu sa použiť polylinkery a adaptéry, ktoré sa môžu zaviesť alebo odstrániť známymi technikami, aby sa uľahčilo zostavenie konštruktu na expresiu. V každom stupni syntézy konštruktu sa fragment môže klonovať, analyzovať pomocou reštrikčných enzýmov, sekvenovať alebo hybridizovat a podobne. Na klonovanie je použiteľný veľký počet vektorov, ale presná voľba nemá rozhodujúci význam pri uskutočňovaní tohto vynálezu. Normálne sa klonovanie vykonáva v E. coli.

Flanking úseky môžu obsahovať aspoň časť otvorenej čítanej konštrukcie cieľového lokusu, najmä signálnu sekvenciu, regulačné úseky pre 5' a 3' oblasti génu cieľového lokusu. Tiež môžu byť umiestnené za regulačné úseky. Normálny flanking úsek obsahuje aspoň 100 párov báz, zvyčajne 200 bp a môže obsahovať 500 bp alebo viacej. Flanking úseky sa volia tak, aby roztrhli cieľový gén a zabránili jeho expresii. To môže byt dosiahnuté vložením kazety na expresiu (obsahujúcej sekvenciu nukleotidov, ktorá má byť prepísaná a prípadne obsahujúcej prídavné prvky ako signálnu sekvenciu, sekvenciu regulačného úseku na iniciáciu transkripcie a/alebo sekvenciu regulačného úseku na termináciu transkripcie) do otvorenej čítanej konštrukcie blízko úseku 5'. Vloženie sa vykonáva substitúciou celého cieľového génu alebo jeho časti za konštrukt na expresiu alebo intervenciou konštruktu na expresiu medzi regulačným úsekom na iniciáciu transkripcie v cieľovom lokuse a otvorenou čítanou konštrukciou. Ako už

I bolo povedané, ked je regulačný úsek na termináciu homológny s úsekom v cieľovom lokuse, 3' flanking úsek by mal byt podstatne väčší ako regulačný úsek na termináciu, prítomný v konštrukte.

Tento vynález tiež poskytuje štartovací materiál na konštrukciu fytáz druhej generácie tzn. fytáz s vlastnosťami, ktoré sa líšia od vlastností enzýmov, ktoré tu boli izolované. Fytázy druhej generácie môžu mať zmenené teplotné alebo pH optimum, zmenenú špecifickú aktivitu alebo afinitu k svojim substrátom alebo majú zmenenú hocijakú inú kvalitatívnu vlastnosť, ktorá spôsobuje, že enzým je vhodnejší na aplikáciu v danom procese. E. coli je najlepší hostiteľ na takú mutagenézu (napr. na mutagenézu cielenú na určité miesto) . Pretože pri E. coli chýba štiepiaci proces na odstránenie intrónov, ktoré by mohli byt vo fytázovom géne prítomné, je kloň cDNA pre fytázu zvolenou sekvenciou, ktorá sa má prepísať v E. coli. Táto sekvencia cDNA môže byt ľahko mutovaná pomocou bežne známych postupov. Po mutácii môže byt mutovaný gén zavedený do žiadaných konštruktov na expresiu.

Konštrukt môže byt transformáciou včlenený do hostiteľa ako klonujúci vektor bud lineárny alebo cirkulárny alebo môže byt z klonujúceho vektoru odstránený, podlá želania. Klonujúcim vektorom je najlepšie plazmid. Plazmid sa zvyčajne linerizuje v rozsahu asi 1 kbp génu, o ktorý ide. Prednostne sa konštrukt na expresiu pri produkcii fytáz postupom podľa tohto vynálezu začleňuje do genómu hostiteľa vybraného na expresiu.

Na transformáciu vláknitých hub existuje veľké množstvo techník. Tieto techniky zahŕňajú fúziu alebo transformáciu protoplastov, elektroporáciu a microprojectile firing do buniek. Bolo zistené, že transformácia protoplastov je úspešná a môže byť s výhodou použitá.

Mycélium hubového kmeňa, s ktorým pracujeme, je najskôr prevedené na protoplasty enzymatickým štiepením

I _t · bunkovej steny v prítomnosti osmotického stabilizátoru ako napr. KC1 alebo sorbitolu. Zadržanie DNA v protoplastoch je spôsobené prídavkom CaCl₂ a koncentrovaného roztoku polyetylénglykolu. Polyetylénglykol spôsobu agregáciu protoplastov, pri ktorej dochádza k transformácii DNA v agregátoch a k zadržaniu DNA v protoplastoch. Ďalej sú protoplasty nechané regenerovať na tuhom médie, ktoré obsahuje osmotický stabilizátor a, keď je to výhodné, selekčné činidlo, proti ktorému je zakódovaná rezistencia pomocou transformujúcej DNA.

Po selekcii transformantov môže byť prítomnosť požadovaného génu určená rôznymi spôsobmi. Keď je produkt expresie heterológny k hostiteľovi, môže sa expresia požadovaného génu zistiť pomocou protilátok. Alebo sa môže použiť metóda Southern alebo Northern blot na určenie prítomnosti integrovaného génu alebo jeho transkripčného produktu .

Amplifikácia sekvencie nukleotidov alebo konštruktu na expresiu môže byť dosiahnutá štandardnými postupmi ako je zavedenie mnohonásobných kópií konštruktu do transformujúceho vektoru alebo použitie génu amdS ako selekčného markéru. Pozri nap. Weinans et al. (1985) Current Genetics, 361-368. Sekvencia DNA, ktorá má byť rozšírená, môže obsahovať DNA, ktorá je buď homológna alebo heterológna k hostiteľovi na expresiu, ako to bolo diskutované hore.

Bunky sa potom môžu nechať rásť na vhodnom živnom médiu. Môžu sa použiť nízke koncentrácie inhibítoru proteázy ako sú fenylmetylsulfonylfluorid, a2-makroglobulíny, pepstatín a podobne. Zvyčajne je táto koncentrácia v rozmedzí od 1 μg/l do 1 mg/1. Gén (gény) pre proteázu môžu byt in22 aktivované, aby sa zabránilo degradácii alebo aby sa znížila degradácia požadovaného proteínu.

Transformanty sa môžu nechať rásť bud vo vsádzkovom alebo v kontinuálnom fermentore, pričom sa izoluje živné prostredie a požadovaný produkt sa získa extrakciou.

Na čistenie produktu sa môžu použiť, keď je to nezbytné, rôzne metódy ako je chromatografia (napr. HPLC), extrakcia medzi dve rozpúšťadlá, elektroforéza, kombinácia uvedených metód a podobne.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob ďalšieho spracovania fermentačného média. Pri tomto spôsobe sa fermentačné médium (prípadne purifikované) prefiltruje, ďalej nasleduje druhá filtrácia na odstránenie mikroorganizmov a potom sa prefiltrovaný roztok zahustí. Takto získaný kvapalný koncentrát sa môže spracovať nasledujúcimi spôsobmi na rôzne prípravky :

a) Fytáza a iné proteíny môžu byť vyzrážané z kvapalného koncentrátu pridaním acetónu až na koncentráciu 60 % obj. za stáleho miešania. Precipitát sa vysuší za vákua pri 35’C. Enzýmový produkt sa môže použiť na ďalšiu aplikáciu po rozdrvení na suchý prášok. Výťažnosť je približne 90 %.

b) Kvapalný koncentrát sa môže sušiť rozprašovaním pri použití obvyklých spôsobov rozprašovacieho sušenia. Výťažnosť sa pohybuje od 80 do 99 %.

c) Kvapalný koncentrát sa môže zmiešať s nosičovými materiálmi napr. s pšeničnými otrubami. Takto získaná zmes sa suší v rozprašovacej vežovej sušiarni alebo v sušiarni s fluidným lôžkom.

d) Kvapalný koncentrát sa môže osmoticky stabilizovať napr. prídavkom sorbitolu. Ďalej sa pridá konzervačné činidlo napr. kyselina benzoová, aby sa zabránilo mikrobiálnej kontaminácii.

Všetky štyri prípravky sa môžu predávať výrobcom premixov, kŕmnych zmesí, iným distribútorom a farmárom.

Tu uvedené príklady slúžia na ilustráciu a nie sú v žiadnom smere zamýšlané ako obmedzenie rozsahu vynálezu. Odborníkom v tomto odbore bude jasné, že gén pre fytázu podlá vynálezu sa môže použiť pri heterológnych hybridizačných pokusoch, zameraných na izoláciou génov, ktoré kódujú fytázu, z iných mikroorganizmov.

Príklady rozpracovania vynálezu

Príklad 1

Fermentácia A. ficuum NRRL 3135

I

Aspergillus ficuum kmeň NRRL 3135 bol. získaný z Northern Región Research Lab. USDA, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, USA. Preparáty spór boli pripravené pomocou štandardných metód.

Spóry a následne bunky boli premiestnené sériou vsádzkových fermentácií v Erlenmeyrových bankách do 10 1 fermentoru. Po náraste vo vsádzkovej kultivácii bol obsah tohto fermentoru použitý ako inokulum na finálnu vsádzkovú fermentáciu v objeme 500 1.

Použité médium obsahovalo: 91 g/1 kukuričného škrobu (BDH Chemicals Ltd.); 38 g/1 glukóza.H₂0; 0,6 g/1 MgSO₄.7H₂O; 0,6 g/1 KC1; 0,2 g/1 FeSO₄.7H₂O a 12 g/1 KN0₃. pH bolo udržované na hodnote 4,6 ± 0,3 automatickou titráciou buď 4N NaOH alebo 4N H₂SO₄.

Bunky rástli pri 28*C za automatickej regulácie koncentrácie rozpusteného kyslíka, ktorá bola udržovaná na % nasýtenia vzduchom. Produkcia fytázy dosiahla maximálnu úroveň 5-10 U/ml po 10 dňoch fermentácie.

Príklad 2

Purifikácia a charakterizácia fytázy z A. ficuum

A. Stanovenie aktivity fytázy

100 μΐ filtrátu média (zriedeného, keď je to nutné) alebo 100 μΐ supernatantu alebo 100 μΐ demineralizovanej vody pri slepom pokuse sa pridá k inkubačnej zmesi, ktorá má nasledujúce zloženie:

- 0,25 M octanu sodného, tlmivý roztok pH 5,5 alebo

- glycín - HCl, tlmivý roztok pH 2,5

- lmM sodnej soli kyseliny fytovej

- demineralizovaná voda do 900 μΐ

Výsledná zmes sa 30 minút inkubuje pri 37’C. Reakcia sa zastaví pridaním 1 ml 10% TCA (kyselina trichlóroctová). Po skončení reakcie sa pridajú 2 ml reakčného činidla, 3,66 g FeSO₄.7H₂O v 50 ml roztoku molybdénanu amónneho [2,5 g (NH₄)₆Mo₇0₂₄.4H₂0 a 8 ml H₂S0₄, zriedené na 250 ml demineralizovanou vodou].

Intenzita modrého zafarbenia sa merí spektrofotometricky pri 750 nm. Namerané hodnoty ukazujú množstvo uvolneného fosfátu, ktoré sa odčíta z kalibračnej krivky pre fosfát v koncentračnom rozmedzí 0 až 1 mmol/1.

Farbivo pre fosfatázu

Komponenty s fosfatázovou aktivitou boli stanovené pomocou izoelektrickej fokuzácie pri použití obvyklého farbiva pre fosfatázu. Gél bol inkubovaný s roztokom a-naftylf osf átu (Sigma 1 g/1) a soli Fast Garnet GBC (Sigma 2 g/1) v tlmivom roztoku (0,6 M octan sodný, pH 5,5). Reakcia, kto25 rej výsledkom je vznik čierneho precipitátu, sa zastaví buď zmesou metanol : kyselina octová (30 : 10 % obj.) alebo pretrepávaním s destilovanou vodou, keď sa ďalej požaduje protein s fytázovou aktivitou.

I · *

B. Purifikácia fytázy z A. ficuum

Fytáza z kultivačného média kmeňa A. ficuum NRRL 3135 sa čistí až do homogénneho stavu. Najskôr sa médium zbaví filtráciou mikroorganizmov. Výsledný filtrát sa ďalej koncentruje v ultrafiltračnej jednotke Filtron s filtrami oddeľujúcimi produkt s molekulovou hmotnosťou 30 kD. pH a iónová sila vzorky sa upraví pre purifikačný proces premytím vzorky tlmivým roztokom 10 mM acetát sodný pH 4,5. V tomto ultrafiltračnom procese sa vzorka približne 20 krát skoncentruj e.

Potom sa vzorka nastrieka na menič katiónov (SSepharose Fast-Flow v kolóne HR 16/10 20 ml, obidve zariadenia získané od firmy Pharmacia v systéme Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System). Naviazané proteíny sa eluujú gradientom chloridu sodného od 0 do 1 M v tlmivom roztoku z octanu sodného. Fytáza sa eluuje približne pri koncentrácii 250 ml NaCl. Frakcie s fytázovou aktivitou sa spoja, skoncentrujú a ultrafiltráciou odsolia. Získaný roztok sa nastrieka na menič aniónov (Q-Sepharose Fast-Flow v kolóne HR 16/10 20 ml, Pharmacia). Proteíny sa opäť eluujú gradientom chloridu sodného od 0 do 1 M v tlmivom roztoku z octanu sodného, ako je to opísané hore. Fytáza sa eluuje z tejto kolóny približne pri 200 mM NaCl.

Výsledkom týchto purifikačných krokov je čiastočne vyčistená fytáza so špecifickou aktivitou približne 40-50 U/mg proteinu. To značí 25-násobné vyčistenie.

Analýza čistoty tejto čiastočne vyčistenej fytázy ukázala, že je prítomná hlavná nečistota s molekulovou hmotnosťou približne 100 kDa (obr. 1B, sekvencia E). Pri izoelektrickej fokuzácii sa zistilo, že je prítomné množstvo enzýmov s fosfatázovou aktivitou vrátane 3-4 subforiem fytázy (ich izoelektrické body sa pohybujú od 5,0 do 5,4) (obr. IA, sekvencia A a B).

Aby sa získal homogénny preparát fytázy, bola vykonaná ďalšia dvojnásobná purifikácia a následná separácia zložiek čiastočne vyčistenej fytázy pomocou izolektrickej fokuzácie v systéme LKB Multiphor na doskách Ampholine PAG (pH rozsah 4 - 6,5). Proteíny s fytázovou aktivitou (vrátane fytázy) boli stanovené pomocou všeobecného postupu farbenia fosfatázy, ktorý je opísaný hore. Požadované pásy boli vyrezané z gélu. Aktívny proteín bol eluovaný 16 hodín inkubáciou gélových prúžkov v tlmivom roztoku tvorenom 10 mM octanom sodným, pH 5,5. Proteínové frakcie boli analyzované pomocou postupu na stanovenie špecifickej aktivity fytázy, ktorý je opísaný v príklade 2. Týmto spôsobom boli rozlíšené fytázové frakcie od iných kyslých fosfatáz. Konečný faktor purifikácie pre fytázu bol približne 60 (špecifická aktivita finálneho preparátu 100 u/mg proteínu). V tomto poslednom purifikačnom kroku je tiež možné izolovať rôzne subformy fytázy (obr. IA, sekvencia A a B).

Na efektívny purifikačný postup boli pripravené monoklonálne protilátky proti fytáze z A. ficuum. Protilátka sa naviaže na gél Sepharose 4B, aktivovaný brómkyánom (5 mg/ml gélu). Táto matrica sa použije v imunoafinitnej kolóne. Matrica je schopná naviazať približne 1 mg fytázy na ml. Fytáza sa môže z afinitnej kolóny eluovať tlmivým roztokom (100 mM glycín-HCl, 500 mM NaCl) pri pH 2,5 bez akejkoľvek straty aktivity. Tento postup sa môže použiť na izoláciu homogénnej fytázy zo surového filtrátu média. Izolácia prebehne v jedinom stupni s 80% výťažnosťou a 60 násobnou purifikáciou.

C. Deglykozylácia fytázy

Fytáza z A. ficuum (70 μg proteínu) bola inkubovaná s 2,5 U N-Glycanase (Genzyme) v tlmivom roztoku tvorenom 0,2

M fosforečnanom sodným pH 8,6 a 10 mM 1,10 - fenantrolínom v celkovom objeme 30 μΐ.

Po 16 hodinovej inkubácii pri 37’C bol skúmaný rozsah deglykozylácie pomocou elektroforézy (Phast-System Pharmacia). Bolo zistené, že zdanlivá molekulová hmotnosť fytázy sa znížila z 85 kDa na približne 56,5 kDa. Pri farbení cukrov podlá Schiffa kyselinou jodistou, pri ktorom bola fytáza identifikovaná ako glykoprotexn, sa nepodarilo stanoviť žiadny zvyšok cukru, naviazaný na protein. Kompletné odstránenie cukrov bolo ďalej dokázané citlivou lectin-blotting metódou. Natívna a deglykozylová fytáza (obidve v množstve 1,5 μg) boli nanesené na štandardný gél SDS-PAGE a elektroforeticky prevádzané počas 16 hodín pri 30 V na membránu PVDF (Immobilon, Millipore) v tlmivom roztoku 25 mM TRIS-glycín, pH 8,3 a v metanole (20 % obj.).

Membrána bola ďalej inkubovaná s hovädzím sérum albumínom (1Ô g/1) vo fyziologickom roztoku, tlmenom fosforečnanovým tlmivým roztokom s konkavalín A-peroxidázou (Sigma, 10 μg/ml vo fyziologickom roztoku, tlmenom fosforečnanovým tlmivým roztokom). Peroxidáza bola potom ofarbená

4-chloro-l-naftolom (Sigma).

Ani touto citlivou metódou sa nepodarilo stanoviť žiadne zvyšky cukrov, naviazané na deglykozylovanú fytázu.

Po deglykozylácii fytáza úplne stratila svoju aktivitu, možná vzhľadom na agregáciu enzýmu.

Príklad 3

Stanovenie sekvencie aminokyselín fytázy a zostavenie oligonukleotidových prób

A. Stanovenie N-koncovej sekvencie aminokyselín

Fytáza bola elektroforeticky prevedená z SDS-PAGE alebo IEF-PAGE na PVDF blotting membránu (Immobilon, Milli28 póre). Elektroblottig bol uskutočnený v tlmivom roztoku 10 mM CAPS (3-cyklohexylamín-propánsulfónová kyselina) pH 11,0 s metanolom (10 % obj.) počas 16 hodín pri 30 V a 4^eC.

Proteín bol lokalizovaný ofarbením modrosťou Coomassie Brilliant Blue. Ofarbený pás bol vyrezaný, dalej ofarbený v metanole a podrobený sekvenovaniu v plynnej fáze. Postup bol vykonávaný niekolkokrát pri použití niekolkých jednotlivých preparátov. Získané výsledky uvádza obr. 1A (sekvencie A až D).

Bola tiež stanovená sekvencia aminokyselín pre proteín s molekulovou hmotnosťou 100 kDa, ktorý je prítomný v surových preparátoch. Údaje, získané pre tento proteín, udáva obr. 1C. Táto sekvencia vykazuje značnú podobnosť s kyslou fosfatázou, ktorá bola izolovaná z Aspergillus niger [McRae et al. (1988) Gene, 71, 339-348].

B. Stanovenie vnútorných sekvencii aminokyselín

Fragmentácia proteínu brómkyánom

Vyčistená homogénna fýtáza bola prevedená do 100 mM NaHCOg ultrafiltráciou (Microconcentrator Centricon 30, Amicon). Ďalej bol proteín lyofilizovaný, rozpustený v kyseline trifluóroctovej (70 % obj.) a inkubovaný 6 hodín s približne 300 násobným molárnym prebytkom brómkyánu. Reakcia bola ukončená zriedením zmesi vodou. Získané fragmenty boli opäť lyofilizované. Potom bola vzorka rozpustená v tlmivom roztoku pre vzorky SDS-PAGE, obsahujúcom DTT (ditiotreitol). Rozsah fragmentácie bol stanovený pomocou PAGE. Analytické PAGE bolo vykonané vo Pharmacia Phast-System Unit, na 20% SDSPAGE géloch. Gély boli upravené tak, aby tvorili kontinuálny tlmiaci systém na zlepšenie separácie malých peptidov (podlá návodu). Peptidy boli stanovené pomocou techniky farbenia striebrom, známej v tomto odbore. Farbením modrosťou Coomassie Brilliant Blue sa totiž nepodarilo stanoviť najmenší peptid. Výsledkom tohto postupu je kompletná degradácia fy29 tázy na peptidy s molekulovými hmotnosťami menšími ako 2,5 kDa, 36 kDa, 57 kDa a 80 kDa.

Peptidy boli izolované na sekvenovanie v plynnej fáze pomocou SDS-Tricine-PAGE ako je to opísané v Schagger a Jagow (1987) Anál. Biochem., 166, 368-379. Nasledoval elektroblotting, ako je opísaný hore.

N-koniec 57 kDa fragmentu je rovnaký ako N-koniec fytázy, ktorú stanovil Ullah (1988b, pozri hore), s výnimkou prvých štyroch aminokyselín, ktoré chýbajú (obr. IA, sekvencia D). N-konce sekvencií 2,5 kDa a 36 kDa peptidov sú uvedené na obr. IB ako sekvencie A a B.

C. Oligonukleotidové próby

Oligonukleotidové próby boli zostavené na základe sekvencií aminokyselín, uvedených na obr. IA a IB. Boli pripravené pri použití DNA syntetizátora Applied Biosystems ABI 380B DNA synthesizer. Tieto oligonukleotidy sú uvedené na obr. 2A a 2B.

Príklad 4

Hybridizácia genómových blokov a genómových knižníc s prvou sadou oligonukleotidových prób

Genómová DNA z A. ficuum bola izolovaná mletím mycélia v kvapalnom dusíku pri použití štandardných postupov napr. Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 1470-1474. Genómová knižnica bola skonštruovaná v bakteriofágovom vektore lambda EMBL3 pri použití neúplného štepu Sau3A chromozomálnej DNA z A. ficuum NRRL 3135 podľa štandardných techník [Maniatis et al. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. Takto vytvorená genómová knižnica obsahovala 60 až 70 krát genóm A. ficuum. Knižnica bola testovaná na výskyt povlakov bez inzertu, ktorý by vznikol hybridizáciou s priloženým fragmentom lambda EMBL3. Bolo pozorované, že s pró30 bou lambda EMBL3 hybridizuje menej ako 1 % povlakov. Veľkosť inzertu robila 13 až 17 kb.

Aby sa zistili podmienky a próby, ktoré sú vhodné na screening genómovej knižnice, bola genómová DNA rozštiepená niekoľkými reštrikčnými enzýmami. Ďalej bola separovaná na agarózových géloch a rozdelená na bloky na Genescreen plus, podľa pokynov výrobca. Bloky boli hybridizované so všetkými oligonukleotidovými próbami. Hybridizácia bola vykonávaná pri rôzne ostrých podmienkach (6 x SSC, 40 až 60’C pre hybridizáciu, viac ako 0,2 x SSC, 65“C pre premývanie). Na screening genómovej knižnice boli vybrané próby 1068 a 1024 (obr. 2A), napriek tomu, že neboli zistené žiadne spoločné fragmenty DNA, ktoré by špecificky hybridizovali s obidvoma próbami. Próba 1025 (obr. 3) pre kyslú fosfatázu dáva špecifický a diskrétny hybridizačný signál a preto bola táto próba vybraná na screening genómovej knižnice pre gén kyslej fosfatázy.

Hybridizačné povlaky boli zistené v genómovej knižnici pri použití všetkých troch prób. Hybridizačný signál, zodpovedajúci próbe 1025 (kyslá fosfatáza) bol silný a reprodukovateľný. Pri použití prób 1024 a 1068 (fytáza) boli pozorované hybridizačné signály rôznej intenzity. Medzi dvoma sadami nebola pozorovaná žiadna krížová hybridizácia. Všetky tri série povlakov boli opäť podrobené screeningu a DNA bola izolovaná z ôsmych jednotlivých pozitívnych hybridizačných povlakov (Maniatis et al., pozri hore). V každej sérii môžu byť určené klony, ktoré obsahujú identické hybridizačné fragmenty. To znamená, že inzerty týchto klonov sú príbuzné a pravdepodobne prekrývajú rovnakú oblasť genómovej DNA. Opäť sa neukázala žiadna krížová hybridizácia pri použití dvoch špecifických sérií pre fytázu (próby 1024 a 1086). To znamená, že hoci obidve próby, použité na izoláciu dvoch sérií klonov, boli získané z N-koncovej sekvencie aminokyselín daného proteínu, boli identifikované a klonované odlišné fragmenty genómovej DNA.

Všetky tri série klonov boli hybridizované s Northern blotmi, obsahujúcimi mRNA, ktorá bola izolovaná z indukovaného a neindukovaného mycélia (príklad 6). Špecifické klony pre kyslú fosfatázu, rovnako ako vnútorný fragment

3,1 kb Sali, izolovaný z týchto klonov sa hybridizovali výhradne s vzorkami s indukovanou mRNA. mRNA, stanovená pomocou špecifických prób pre kyslú fosfatázu, je dlhá asi 1800 b, čo súhlasí so známou veíkosťou proteínu [68 kDa, Ullah a Cummins (1987) Prep. Biochem., 17, 397-422]. Neukázala sa žiadna hybridizácia špecifických pre fytázu so špecifickými mRNA. Z toho sa usudzuje, že hore opísaná metóda je neúspešná pre klovonanie génu, kódujúceho fytázu. Ďalej z toho vyplýva, že tento neúspech nie je spôsobený neúspešnosťou použitej metódy, pretože táto metóda bola s úspechom použitá na identifikáciu génu, ktorý kóduje kyslú fosfatázu. Kloň lambda, obsahujúci gén pre kyslú fosfatázu, bol uložený 24. apríla 1989 v Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands a bolo mu pridelené prírastkové číslo CBS 214,89. Fragment 10 kb BamHI bol izolovaný z fágu a klonovaný do pUC19. Tento subklon obsahuje celý gén, kódujúci kyslú fosfatázu. Subklon pAF 1-1 (obr. 5) bol uložený 24. apríla pod číslom CBS 213,89.

Príklad 5

Izolácia génu kódujúceho fytázu, pri použití druhej sady oligonuleotidových prób

Próby boli zostavené pri použití N-koncovej sekvenI cie aminokyselín fragmentov, ktoré vznikli štiepením CNBr. (obr. 2B, próby 1295, 1296 a 1297). Boli hybridizované s genómovou DNA, ako je opísané hore. Vhodnosť použitia týchto prób na izoláciu génu, kódujúceho fytázu, bola opäť študovaná pomocou Southern hybridizácie genómových blotov s týmito próbami. Tentokrát bolo možné pri použití všetkých troch prób určiť hybridizované fragmenty zodpovedajúcich dĺžiek, a to napriek tomu, že próby boli odvodené z neprekrývajúcich sa úsekov. Nebola zistená žiadna hybridizácia medzi novou sadou prób a klonmi, ktoré boli izolované pri použití prvej sady prób (príklad 4). Preto bola genómová knižnica podrobená screeningu pri použití všetkých troch prób v oddelených experimentoch. Subsada klonov (lambda AF 201, 219, 241 a 243), izolovaná z každej jednotlivej próby, tiež hybridizovala s obidvoma zvyšnými próbami. To znamená, že v tomto prípade pri použití troch odlišných prób boli klony izolované z jedinej genómovej oblasti. Boli urobené pokusy hybridizovať novo izolované klony s próbami 1024 a 1068. V obidvoch prípadoch nebola pozorovaná žiadna hybridizácia s novo izolovanými klonmi za podmienok, ked obidve próby boli úspešne hybridizované s klonmi, ktoré boli izolované pri použití týchto prób (pozri príklad 4). To ukazuje, že novo izolované klony nie sú homológne s próbami, ktoré boli odvodené z N-konca purifikovanej fytázy.

Kloň lambda EMBL-3, ktorý hybridizuje so všetkými tromi próbami (1295-1297) bol pomenovaný lambda AF 201 (obr. 4) a bol uložený 9. marca 1989 pod číslom CBS 155,89.

5,1 kb BamHI fragment z lambda AF 201 (klonovaný v pUC19 a označený pAF 2-3, pozri obr. 4), ktorý hybridizuje s všetkými tromi oligonukleotidovými próbami, bol použitý na testovanie Northern blotu. V tomto prípade bola zistená diskrétna mRNA s veľkosťou 1800 báz. Táto mRNA bola nájdená len v indukovanom mycéliu. Podobné výsledky boli získané, ked boli ako próby použité oligonukleotidy. Preto bol pri použití novej sady prób identifikovaný spoločný fragment DNA, ktorý hybridizuje špecificky s indukovanou mRNA. DÍžka tejto mRNA (1800 b) je dostatočná na kódovanie proteinu s veľkosťou asi 60 kDa, čo je asi veľkosť neglykozylovaného enzýmu. z toho vyplýva, že izolované fragmenty obsahujú aspoň časť génu, ktorý kóduje fytázu.

Príklad 6

Izolácia indukovanej a neindukovanej mRNA

Z literatúry je známe, že syntéza fytázy v A. ficuum je podrobená prísnej regulácii v závislosti od fosfátu (Han a Callagher [1987] J. Indust. Microbiol., 1, 295-301). Preto ukážka toho, že Izolovaný gén sa podrobuje podobnej regulácii, môže byť považovaná za podporu tvrdenia, že je klonovaný požadovaný gén.

Na izoláciu mRNA, ktorá bola syntetizovaná ako za produkčných, tak za neprodukčných podmienok bol pestovaný A. ficuum NRRL 3135 nasledujúcim spôsobom. Najskôr boli cez noc vypestované spóry v neprodukčnom médie. Ďalší deň bolo zobrané mycélium, premyté sterilnou vodou a naočkované bud do indukčného alebo do neindukčného média. Použité médium obsahovalo (v litre): 20 g kukuričného škrobu; 7,5 g glukózy;

0,5 g MgSO₄.7H₂O; 0,2 g FeSO₄.7H₂O a 7,2 g KN0₃. Na indukciu fytázy bolo do média pridaných viac ako 2 g/1 coru steep liquor, avšak neindukčné médium obsahovalo 2 g/1 K₂HPO₄. Mycélium bolo pestované aspoň 100 hodín. Vzorky boli odoberané v zvolených intervaloch. Produkcia fytázy bola sledovaná stanovením fytázy, spôsobom opísaným v príklade 2A. Denaturovaná mRNA bola oddelená elektroforézou a blotovaná na Genescreen plus. Bloty boli hybridizované s pAF 2-3, . ktorý bol značený ³²P alebo s fragmentom 3,1 kb Sali, izolovaným z pAF 1-1 (kyslá fosfatáza) z príkladu 4. Výsledky ukazuje tabulka 2.

Pozitívna hybridizácia špecifického fragmentu fytázy 5,1 BamHI a špecifického fragmentu kyslej fosfatázy

3,1 kb Sali s izolovanou mRNA sa dá pozorovať len, keď sa bunky pestujú za podmienok, známych pre indukciu syntézy fytázy a kyslých fosfatáz. Z týchto výsledkov vyvodzujeme, že izolované gény podliehajú regulácii, ako bolo očakávané pre fytázu a kyslé fosfatázy.

Tabulka 2

Hybridizácia Northern blotov pri použití špecifického fragmentu fytázy 5,1 kb BamHI (A) alebo špecifického fragmentu kyslej fosfatázy 3,1 Sali (B) ako próby;

+ znamená prítomnosť 1800 b mRNA pre fytázu alebo 1880 b mRNA pre kyslú fosfatázu. Relatívna aktivita fytázy bola stanovená vo vzorkách, odobraných po 24 h: indukované kultúry majú 10 krát väčšiu aktivitu fytázy ako neindukované kultúry.

Čas po očkovaní (h) Indukované Neindukované

A 24 +

B 24 +

Príklad 7

Dôkaz skutočnosti, že klonovaný gén je génom pre fytázu

Na získanie definitívneho dôkazu o úspešnosti izolácie génu, kódujúceho fytázu a na štúdium možnosti zvyšovania expresie klonovaného génu, bol gén pre fytázu klonovaný do vhodného vektoru. Vzniknutý vektor bol transformáciou

I prevedený do A. niger 402 (ATCC 9092). Gén pre fytázu bol izolovaný z klonu AF 201 ako 10 kb Nrul fragment a klonovaný do miesta Stul vektoru pAN 8-1 (Mattern, I. E. a Punt, P. J. [1988] Fungal Genetics Newsletter, 35, 25). Tento vektor obsahuje gén ble (spôsobujúci rezistenciu k pleomycínu) ako selekčný markér. Výsledný konštrukt bol nazvaný pAF 28-1 (obr. 4). Ďalej bol transformovaný do A. niger 402 postupom, opísaným v príklade 9 s výnimkou toho, že protoplasty boli naočkované na minimálne médium pre Aspergillus. Toto médium bolo doplnené 30 μg pleomycínu/ml a stužené 0,75 % agarom. Jednotlivé transformanty boli vyčistené a izolované. Potom boli testované na produkciu v trepaných bankách, ako je to opísané v príklade 1 a 2. Na kontrolu boli testované tiež transformanty, ktoré mali iba vektor a tiež netransformované bunky hostiteľa (tabuľka 3). Iba A. niger 402, obsahujúci pAF 28-1, produkuje fytázu a reaguje so špecifickou monoklonálnou protilátkou, ktorá bola vyvinutá pre fytázu z A. ficuum. Fytáza, reagujúca s touto monoklonálnou protilátkou, môže byť eluovaná z imunoafinitnej kolóny pri pH 2,5. Ukázalo sa, že táto fytáza má rovnakú molekulovú hmotnosť, stupeň deglykozylácie, izoelektrický bod a špecifickú aktivitu ako fytáza z A. ficuum. Toto zistenie poskytuje jasný dôkaz skutočnosti, že bunky A. niger 402, transformované pAF 28-1, produkujú fytázu, ktorá je skutočne totožná s fytázou z A. ficuum. Podobná produkcia nebola pozorovaná v žiadnom inom type sledovaných buniek.

Tabuľka 3

Kmeň	aktivita fytázy	% aktivity fytázy, ktorá sa adsorbovala v imunoafinitnej kolóne
A. niger 402	0,5	0
A. niger 402	0,7	10
pAF 28-1
A. niger 402	0,5	0
pAN 8-1		*

Kmene boli pestované za podmienok indukcie (príklad 6). Vzorky boli odoberané po 96 hodinách rastu.

Príklad 8

Charakterizácia génu pre fytázu

Klony lambda, obsahujúce fytázu boli analyzované štiepením rôznymi reštrikčnými enzýmami. Mapa oblasti genómu, ktorá obsahuje gén pre fytázu, je uvedená na obr. 4. Definované reštrikčné fragmenty boli klonované ako súčasť klonovacieho vektoru pUC19, ako ukazuje obr. 4.

Už bolo ukázané (príklad 5), že 5,1 kb BamHI fragment, prítomný v pAF 2-3, obsahuje aspoň časť génu pre fytázu. Okrem toho bolo ukázané, že oligonukleotidové próby 1295 a 1297 (obr. 2B) hybridizujú s inzertom Sali pAF 2-7 (umiestnenie klonov pAF 2 je uvedené na obr. 4). Próba 1296 pravdepodobne zaujíma miesto Sali medzi fragmentmi v pAF

2-6 a pAF 2-7. Výsledky týchto pokusov ukazujú, že sekvencia kódujúce fytázu, je umiestnená na lávej strane časti inzertu BamHI v pAF 2-3.

Ďalej boli v celom rozsahu stanovené nukleotidové sekvencie inzertov plazmidov pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7 pomocou terminačnej reťazovej dideoxymetódy (Sanger et al. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467) a postupov shotgun, ktoré opísali Messing et al. (1981, Nucl. Acids Res., 2, 309-321). Ďalej boli syntetizované špecifické oligonukleotidy. Ich syntéza je založená na informáciách, získaných pri procese sekvenovania.

Kompletná sekvencia nukleotidov klonov pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7, ktorá zahŕňa chromozomálny lokus génu pre fytázu, je uvedená na obr. 6. Grafické zobrazenie uvádza obr. 7.

Analýza kompletnej sekvencie na schopnosť kódovať daný proteín ukázala, že N-koncová sekvencia aminokyselín maturovaného proteínu je kódovaná, so začiatkom od nukleotidovej pozície 381 (podlá Ullaha je kódovacia pozícia pre N-koniec 369). Ďalej bolo zistené, že N-koncová sekvencia aminokyselín 36 kDa vnútorného peptidového fragmentu je zakódovaná na nukleotidovej pozícii 1101 (pozri obr. 1B, sekvencia B). Pre N-koncovú sekvenciu aminokyselín 2,5 kDa vnútorného peptidového fragmentu ide o pozíciu 1548 (pozri obr. 1B, sekvencia A). Otvorená čítaná konštrukcia končí na nukleotidovej pozícii 1713.

Tieto zistenia jasne dokazujú, že charakterizovaný chromozomálny lokus obsahuje sekvenciu DNA, ktorá kóduje fytázu.

Ked sa postupuje smerom proti prepisu pri chromozomálnej sekvencii, kódujúcej maturovaný proteín, nie je možné nájsť žiadny štartovací kodón v čítanej konštrukcii, ktorá susedí s otvorenou čítanou konštrukciou maturovaného proteínu. Avšak na základe intrón-exón hraničných charakteristík je možné predpokladať, že intrón leží medzi nukleotidovými pozíciami 254 a 355. Potom teda kodón leží na nukleotidovej pozícii 210 v konštrukcii spoločne s otvorenou čítanou konštrukciou, ktorá kóduje maturovanú fytázu. Odvodená sekvencia aminokyselín tohto predĺženia N-konca je

I ‘ v dobrom súhlase s pravidlami pre signálnu sekvenciu pre sekréciu, ktorú publikoval von Heyne (1983, Eur. J. Biochem., 133, 17-21).

Na potvrdenie týchto hypotéz bola izolovaná cDNA pre fytázu pomocou PCR-amplifikácie so špecifickými prajmermi pre fytázu. Tiež bol izolovaný celkový komplex mRNA/ cDNA, ako matrica, podía postupov, ktoré sú opísané ďalej.

Izolácia poly A⁺ RNA z Aspergillus ficuum

Všetka RNA bola izolovaná z kmeňa A. ficuum NRRL 3135, ktorý bol pestovaný za podmienok indukcie (pozri priI klad 6). Suché mycélium holo zmrazené kvapalným dusíkom a rozmleté. Potom bol prášok homogenizovaný v zariadení Ultra-Turrax (plná rýchlosť počas 1 minúty) v 3M LiCl, 6M močovine pri O’C a homogenát bol udržovaný cez noc pri 4’C, ako opísali Auffrey a Rougeon (Eur. J. Biochem., 107, 303314, 1980). Všetka bunková RNA bola získaná po centrifugácii pri 16000 g počas 30 minút a dvoch následných extrakciách zmesou fenol:chloroform:izoamylalkohol (50:48:2). RNA bola zrážaná etanolom a rozpustená v 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,5 % SDS. Na selekciu poly A⁺ RNA bola vzorka s celkovým množstvom RNA zahrievaná 5 minút pri 60’C, ďalej bola upravená 0,5 M NaCl. Potom bola nastrieknutá do kolóny s oligo (dT) - celulózou. Po niekoľkom premytí roztokom, ktorý obsahoval 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5 % SDS a 0,1 M NaCl, bola poly A⁺ RNA eluovaná roztokom 10 mM Tris-HCl pH

7,4 a 0,5 % SDS.

Príprava komplexu mRNA/cDNA

Na syntézu prvého vlákna cDNA bolo 5 gg poly A⁺ RNA rozpustených v 16,5 μΐ vody a dalej bolo pridaných: 2,5 μΐ RNasin (30 U/μΙ); 10 μΐ tlmivého roztoku, ktorý obsahoval 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCl2 a 40 mM KC1; 2 μΐ 1 M KCl; 5 μΐ 0,1 M DTT; 0,5 μΐ oligo (ÚT)12_18 (2,5 mg/ml); 5 μΐ 8 mM dNTP-mix; 5 μΐ BSA (1 mg/ml) a 2,5 μΐ Moloney MĹV reverznej transkriptázy (200 U/ml). Zmes bola inkubovaná 30 minút pri 37^eC a reakcia bola zastavená pridaním 10 μΐ 0,2 M EDTA a 50 μΐ H2O. Extrakcia bola uskutočnená chloroformom a po centrifugácii bolo k supernatantu postupne pridaných 110 μΐ 5 M NH^Ac a 440 μΐ etanolu. Komplex mRNA/cDnA bol odseparovaný centrifugáciou. Ďalej bol premytý 70% ľadovým etanolom a rozpustený v 20 μΐ H₂0.

Klonovanie fragmentov cDNA pre fytázu

Izolácia sekvencii cDNA, kódujúcich fytázu bola vykonaná pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v dvoch fragmentoch. Na základe genómovej sekveneie pre fytázu (pozri obr. 6) boli zostavené štyri syntetické oligonukleotidové prajmery.

Oligo 1: 5 ' -GGG.TAG. AAT.TCA. AAA. ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.CTA-3 Oligo 2: 5 '-AGT.GAC.GAA.TTC.GTC.CTG.GTC.GAG.ATG.GTC.TCG-3 ' Oligo 3: 5 '-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC-3 '

Oligo 4: 5 ' -AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG. ATT.GTT.TAA. AGG.G. 3 '

Oligo 1 obsahuje sekvenciu nukleotidov za ATG štartkodónom, smerom po prepise, (pozícia 210 až 231), pripojenú k 5' koncu pomocou EcoRI miesta.. Oligo 2 obsahuje bezprostredne pred Sali miestom smerom proti prepisu (pozícia 1 129 až 1 109) nukleotidovú sekvenciu, tiež pripojenú pomocou prídavného EcoRI miesta. Oligo 3 obsahuje sekvenciu nukleotidov vôkol BamHI miesta (pozícia 845 až 865). Oligo 4 obsahuje sekvenciu nukleotidov, umiestnenú za stopkodónom pre fytázu, smerom po prepise (pozícia 1890 až 1867), pripojenú pomocou prídavného PstI miesta.

Polymerázové reťazové reakcie sa vykonávajú podľa predpisu dodávateľa Taq - polymerázy (Cetus). Ako templát sa používa roztok (1,5 μΐ), obsahujúci hybridy mRNA/cDNA (opísané hore). V reakcii, vedúcej k rozšíreniu časti cDNA pre N-koniec fytázy, sa ako prajmery používajú oligo 1 a 2 (každé v množstve 0,3 μg) (pozri obr. 8). V reakcii, vedúcej k rozšíreniu časti cDNA pre C-koniec fytázy, sa ako prajmery používajú oligo 3 a 4 (každé v množstve 0,3 μg) (pozri obr. 8). Po denaturácii (7 minút pri 100’C) a po prídavku Taq - polymerázy sa reakčné zmesi podrobia 25 rozširovacím cyklom (každá 2' pri 55’C, 3' pri 72’C, ľ pri 94’C) v DNAamplifikátore Perkin-Elmer/Cetus. V poslednom cykle sa vynechá denaturačný krok. Po rozštiepení (EcoRI pre časť cDNA, kódujúcu N-koniec a BamHI a PstI pre časť cDNA, kódujúcu Ckoniec) sa obidva fragmenty cDNA klonujú do vhodných miest pTZ18R (Promega).

Nukleotidové sekvencie obidvoch fragmentov, získaných PCR reakciou, boli stanovené pomocou terminačnej reťazovej dideoxyreakcie (Sanger, pozri hore). Pritom boli použité ako prajmery syntetické oligonukleotidy, zostavené podľa chromozomálnej sekvencie génu pre fytázu. Ako templát bola použitá celá rozšírená DNA a tiež klonované fragmenty cDNA. Sekvencia oblasti cDNA, ktorá kóduje fytázu a odvodená sekvencia aminokyselín pre fytázový proteín sú zobrazené na obr. 8.

Sekvencia cDNA potvrdila hypotézu o umiestnení intrónu, uvedenú hore. Ukázala tiež, že v chromozomálnej sekvencii génu nie sú obsiahnuté žiadne iné intróny.

Gén pre fytázu kóduje primárny translačný produkt s dĺžkou 467 aminokyselín (molekulová hmotnosť 51091). Spracovaním primárneho translačného produktu, pomocou odštiepenia signálneho peptidu sa získa maturovaný proteín s dĺžkou 444 aminokyselín (m. h. 48851) alebo 448 aminokyselín (obsahujúci prvé štyri N-koncové aminokyseliny, ako publikoval Ullah, m. h. 49232).

Príklad 9

Nadprodukcia fytázy pri rode Aspergillus pomocou zavedenia prídavných genómových kópií DNA pre fytázu

Konštrukcia vektoru na expresiu pAF 2-2S

Všetky konštrukty boli vytvorené pomocou štandardných molekulárne biologických postupov, ako sú opísané v Ma niatis et al. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y..

Vektor na expresiu pAF 2-2S bol vytvorený klonovaním 6 kb PvuII fragmentu DNA v genómovom klone lambda AF 201 pre fytázu na Smal mieste pUC19. Odvodený plazmid bol nazvaný pAF 2-2 (obr. 4). Ako selekčný markér na transformá ciu do Aspergilla bol na EcoRI/KnpI miesta pAF 2-2 včlenený EcoRl/KnpI fragment DNA plazmidu pGW325 (Wernars K. [1986], diplomová práca na polnohospodárskej univerzite, Wageningen Holandsko), obsahujúci homológny Aspergillus nidulans amdS gén. Výsledný vektor na expresiu bol nazvaný pAF 2-2S a je uvedený na obr. 9.

A. Nadprodukcia fytázy pri kmeni A. ficuum NRRL 3135

Plazmid pAF 2-2S bol zavedený do A. ficuum NRRL 3135 pri použití transformačných postupov, ktoré opísali Tilburn, J. et al. (1983) Gene, 26, 205-2221 a Kelly, J. a Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 s nasledujúcimi modifikáciami:

- mycélium bolo pestované na minimálnom médiu pre

Aspergillus (Cove, D. [1966] Biochem. Biophys.

Acta, 113, 51-56), doplnenom 10 mM arginínu a mM prolínu počas 16 hodín pri 30°C na rotačnej trepačke pri otáčkach 300.min .

- pridaný iba Novozym 234 (NOVO Industry), helikáza nebola použitá pri tvorbe protoplastov.

- po 90 minútach tvorby protoplastov bol pridaný 1 objem STC tlmivého roztoku (1,2 M sorbitol, 10 mM

Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM CaCl₂) k suspenzii protoplastov a suspenzia bola odstreďovaná pri 2500 g, pri 4^eC počas 10 minút v rotačnej kývavej nádobkovej odstredivke. Protoplasty boli premyté a resuspendované v STC-tlmivom roztoku na koncentráciu 10⁸ buniek/ml.

- plazmid DNA bol pridaný v objeme 10 μΐ v TE tlmivom roztoku (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) k 100 μΐ suspenzie protoplastov.

- po inkubácii suspenzie DNA-protoplasty pri 0°C počas 25 minút bolo po kvapkách pridaných 200 μΐ PEG roztoku (25 % PEG 4000 [Merck], 10 mM Tris-HCl, pH

7,5, 50 mM CaCl₂). Ďalej bol pomaly pridaný 1 ml PEG roztoku (60 % PEG 4000 v 10 mM Tris-HCl, pH

7,5, 50 mM CaCl₂) za opakovaného miešania skúmaviek. Po inkubácii pri laboratórnej teplote boli suspenzie zriedené STC tlmivým roztokom, premiešané prevrátením a odstredené pri 2000 g, 4’C, 10 minút. Protoplasty boli opatrne resuspendované v 200 μΐ STC tlmivého roztoku a naočkované na minimálne médium pre Aspergillus. Minimálne médium obsahovalo 10 mM acetamidu ako jediný zdroj dusíka, 15 mM CaCl, 1 M sacharózy a bolo stužené 0,75 % bakteriologickým agarom č. 1 (Oxoid). Nárast tvral 6-10 dní pri 33^eC.

Jednotlivé transformanty, označené SP4, SP7 a SP8 boli izolované, vyčistené a testované v trepaných bankách na produkciu fytázy. Pritom bol použitý postup, opísaný v príkladoch 1 a 2. Na kontrolu boli testované transformanty, obsahujúce len vektor (amdS gén v pUC19) a netransformované bunky hostitela.

Kmene boli pestované za podmienok indukcie (pozri obr. 6) a vzorky boli odobrané po 96 hodinách rastu. Analýzy boli vykonané meraním aktivity fytázy (tabulka 4) a pomocou izoelektrickej fokuzácie na polyakrylamidovom géli (IEF-PAGE).

Vzorky rovnakého objemu boli odobrané z fermentácií s A. ficuum a A. ficuum pAF 2-2S SP7, pestovaných za rovnakých podmienok a boli aplikované na IEF-PAGE gél (pH rozsah

4,6-6, Phast-System, Pharmacia). Elektroforéza bola vykonávaná podía pokynov výrobca. Ďalej boli gény ofarbené buď všeobecným farbivom pre proteíny Coomassie Brilliant Blue (obr. 10B) alebo všeobecným farbivom na stanovenie aktivity fosfatázy (obr. 10A), ktoré je opísané v príklade 2.

Vzorka fytázy z A. ficuum, vyčistená na homogénny preparát (pomocou imunoafinitnej chromatografie, ako je opísané v príklade 7) bola tiež aplikovaná na IEF-PAGE buď samotná alebo zmiešaná so supernatantom kultúry.

Ako už bolo uvedené, fytáza je v rôznych vzorkách prítomná v početných izoformách (ktoré sú označené na obr.

hviezdičkou). Dva hlavné izoenzýmy sú v purifikovanej fytáze jasne viditeľné v pruhoch 3 a 4 pri použití obidvoch farbiacich postupov (obr. 10A a B). Fytázové pásy sú pri rodičovskom kmeni A. ficuum ťažko viditeľné, ale pri transformovanom kmeni pAF 2-2S SP7 sú zreteíne mohutnejšie.

Tabuíka 4

Zvýšenie produkcie fytázy transformáciou kmeňa A. ficuum NRRL 3135

Kmeň Aktivita fytázy (U/ml)

A. ficuum 0,6 A. ficuum + kontrolný plazmid 0,6 A. ficuum pAF 2-2S SP8 7,6 A. ficuum pAF 2-2S SP7 6,7 A. ficuum pAF 2-2S SP4 4,3

B. Nadprodukcia fytázy pri kmeni A. niger CBS 513.88

Vektor na expresiu pAF 2-2S bol tiež transformačnými postupmi opísanými pre A. ficuum zavedený do A. niger CBS 513.88. Jednotlivé transformanty boli izolované, vyčistené a testované na produkciu fytázy. Testovanie bolo vykonané v trepaných bankách za rastových,podmienok indukcie, ako je to opísané v príklade 6.

Podlá postupu z príkladu 9A boli vykonané stanovenia úrovne expresie fytázy niektorých transformantov (označených ako A. niger pAF 2-2S č. 8, č. 20 a č. 33) a pri kontrolných kmeňoch. Výsledky ukazuje tabulka 5.

Transformanty A. niger vykazujú porovnatelnú úroveň expresie pre fytázu ako transformanty A. ficuum. To okrem iného znamená, že promótor pre fytázu z A. ficuum je aktívny v A. niger.

Ďalšia analýza bola vykonaná s kultivačným médiom transformantu pAF 2-2S č. 8 pomocou elektroforézy na IEF-PAGE géli v pH rozsahu 4,5-6 v Phast-System (Pharmacia) ako je opísané hore. Rovnaké objemy supernatantov kultivačných médií rodičovského kmeňa A. niger a transformantu pAF

2-2S č. 8, pestovaných za rovnakých podmienok, boli nanesené na gél. Po prebehnutí analýzy boli gély ofarbené, ako je uvedené hore.

Bolo stanovených niekolko izoforiem fytázy (sú označené hviezdičkou na obr. 11). Obvyklé vyfarbenie proteínu ukázalo, že intenzita fytázóvých pásov je výrazne zvýšená, pričom sa neukázali žiadne iné hlavné proteínové pásy.

Tabulka 5

Produkcia fytázy kmeňa A. niger CBS 513.88, transformovaného vektorom pAF 2-2S

Kmeň Aktivita fytázy (U/ml)

A. niger	0,2
A. niger + kontrolný plazmid	0,2
A. niger pAF 2-2S č. 8	14
A. niger pAF 2-2S č. 33	5
A. niger pAF 2-2S č. 20	4

Príklad 10

Expresia fytázy v kmeni A. niger, transformovaného vektormi na expresiu, ktoré obsahovali gén pre fytázu z A. ficuum fúzovaný s promótorom a/alebo so signálnymi sekvenciami génu pre amyloglukozidázu (AG) z A. niger

Konštrukcia vektorov na expresiu

Na získanie nadprodukcie fytázy v A. niger boli pripravené odvodené prídavné kazety na expresiu. V týchto kazetách je gén pre fytázu z A. ficuum riadený promótorom pre amyloglukozidázu (AG) z A. niger v kombinácii s rôznymi signálnymi sekvenciami: v pl8FYT3 je aminokyselín (aa) a v p24FYT3 je aminokyselín (aa) z vedúcich sekvencii génu AG z A. niger fúzovaných s fragmentom génu pre fytázu, ktorý kóduje maturovaný proteín. V kazete na expresiu pFYT3 je sekvencia promótoru AG fúzovaná so sekvenciou, kódujúcou fytázu, ktorá obsahuje vedúcu sekvenciu pre fytázu.

Konštrukcia pl8FYT3

Fúzia AG-promótoru a 188 aa AG - vedúcej sekvencie so sekvenciou pre fytázu, ktorá kóduje maturovaný proteín, sa vykonáva pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. V PCR reakciách boli použité dva rozdielne templáty: pAF 2-2S, obsahujúci celý gén pre fytázu, ako to bolo opísané hore a pAB6-l, plazmid, obsahujúci celý AG-lokus z A. niger; tento lokus bol izolovaný z plazmidovej knižnice A. niger, ktorá obsahuje 13-15 kb HindlII fragmenty v pUC19. Na izoláciu boli použité AG špecifické oligonukleotidy:

AG-1: 5 ' -GACAATGGCTÄCACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC- 3 '

AG-2: 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3' obidva založené na nukleotidovej sekvencií, publikovanej pre A. niger (Boel et al. [1984], EMBO J., 3, 1097-1102; Boel et al. [1984], Mol. and Celí. Biol., 4, 2306-2315). Oligonukleo tidové próby boli odvodené od sekvencie, obklopujúcej intrón

2. Oligo AG-1 je umiestnená na 3' konci intrónu a má totožnú polaritu s AG mRNA. Oligo AG-2 je umiestnená smerom proti prepisu intrónu 2 a je antiparalélna s AG mRNA. Plazmid pAB

6-1 obsahuje gén AG v 14,5 kb HindlII fragmentu (pozri obr. 12).

Ako prajmery na rozšírenie pomocou PCR boli zostavené štyri syntetické oligonukleotidy s nasledujúcimi sekvenciami :

Oligo 1: 5'-CTCTGCAGGATTCAAGCTAG-3' (AG-špecif ická sekvencia vôkol EcoRI miesta približne 250 bp proti smeru prepisu od ATG iniciačného kodónuj

Oligo 18-2: 5 '-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3 ' maturovaná fytáza <—*—> 18 aa Ag-leader

Oligo 18-3: 5 ' -GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3 ' aa AG-leader <—*—> maturovaná fytáza

Oligo 4: 5'-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3' (špecifická sekvencia pre fytázu, lokalizovaná na BamHI mieste na pozícii 861).

PCF bola vykonaná tak, ako to opísali Saiki et al.

[(1988) Science, 239, 487-491] s menšími modifikáciami (pozri obr. 8).

Za účelom fúzie AG sekvencií so sekvenciami, kódujúcimi fytázu, boli vykonané dve oddelené PCR reakcie. Prvá reakcia bola vykonaná s pAB 6-1, ako templátom a oligo 1 a 18-2, ako prajmermi, a viedla k rozšíreniu 300 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahoval 3'-oblasť AG promótoru a 18 aa AG vedúcu sekvenciu, ktorá bola pripojená na 3'-konci pomocou nukleotidov fytázového génu ku génu pre fytázu. Druhá reakcia bola vykonaná s pAF 2-2S, ako templátom a oligo 18-3 a 4 ako prajmermi a viedla k rozšíreniu 600 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahoval 5'-oblasť génu pre fytázu, pripojenú na 5'-konci pomocou 18 nukleotidov AG signálneho peptidu. Schématické znázornenie týchto reakcií ukazuje obr. 13.

Tieto dvaja vytvorené fragmenty DNA boli vyčistené gélovou elektroforézou a etanolovým zrážaním. Potom boli použité ako templáty pri tretej PCR reakcii s oligo 1 a 4 ako prajmermi. Reakcia viedla k fúzii AG-fytáza. Získaný fragment DNA bol rozštiepený pomocou EcoRI a BamHI. Ďalej bol klonovaný ako súčasť pTZ18R. Výsledok fúzie bol sekvenovaný a bol zostavený pl8FYTl.

Zvyšná (3,5 kb) oblasť AG-promótoru, smerom proti prepisu, bola získaná štiepením pAB 6-1 pomocou KpnI a čiastočne tiež EcoRI. Po štiepení nasledovalo pripojenie ligáciou k 1,1 kb EcoRI/BamHI fragmentu plSFYTl a ďalej klonovanie na KpnI/BamHI miestach pTZ18R. Takto získaný plazmid 18FYT2 ukazuje obr. 15.

Prídavné HindlII reštrikčné miesto bolo vytvorené inzerciou syntetického fragmentu:

5'AATTCAAGCTTG 3'

3'_______ GTTCGAACTTAA 5' do EcoRI miesta (pripojenie génu amds) pAF 2-2S. získaný plazmid bol nazvaný ako pAF 2-2SH (obr. 14). Používa sa ako počiatočný plazmid na výmenu sekvencii promótoru pre fytázu pomocou fúzie DNA fragmentov AG-fytáza pri PCR reakcii.

Na získanie konečnej konštrukcie boli pl8FYT2 a pAF

2-2SH štiepené KpnI a čiastočne tiež BamHI. 4,6 kb DNA fragment pl8FYT2 a 11 kb DNA fragment pAF 2-2SH boli izolované a čistené gélovou elektroforézou. Ďalej boli podrobené ligácii a prenesené do E. coli. Odvodená kazeta na expresiu sa nazýva pl8FYT3 (obr. 15).

Konštrukcia p24FYT3

Fúzia AG-promótoru a 24 aa AG vedúcej sekvencie so sekvenciou, kódujúcou zrelú fytázu, bola vykonaná pomocou PCR rozširovacej reakcie spôsobom, ktorý je opísaný hore pre konštrukciu pl8FYT3. Výnimkou sú však použité prajmery. Boli syntetizované dva nové prajmery s týmito sekvenciami: Oligo 24-2: 5'-CGAGCCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATT-3' matúrovaná fytáza <—¹—> 24 aa Ag-leader Oligo 24-3: 5 ' -ATTGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3 ' aa AG-leader <—*—> maturovaná fytáza

Boli vykonané dve oddelené PCR reakcie. Prvá reakcia bola vykonaná s pAB 6-1, ako templátom a oligo 1 a 24-2, ako prajmermi, a viedla k rozšíreniu 318 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahuje 3'-oblasť promótoru a 24 aa AG vedúcu sekvenciu, ktorá je doplnená na dvojvlákno na 3'-konci pomocou 18 nukleotidov génu pre fytázu. Druhá reakcia bola bola vykonaná s pAF 2-2S, ako templátom a oligo 24-3 a 4 ako prajmermi a viedla k rozšíreniu fragmentu DNA, ktorý obsahuje 5'-oblasť génu pre fytázu. Táto 5'-oblasť je na 5’-konci doplnená na dvojvlákno pomocou 18 nukleotidov 24 aa AG leaderu. Schématické znázornenie týchto reakcií ukazuje obr. 15.

Konštrukcia pFYT3

Fúzia AG promótoru so sekvenciou génu pre fytázu (vrátane leaderu pre fytázu) bola tiež vykonaná pomocou PCR rozširovacej reakcie, ako je to opísané hore pre konštrukciu pl8FYT3. Boli vytvorené dva prídavné prajmery s týmito sekvenciami :

Oligo fyt-2: 5'-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3 ' leader pre fytázu <—¹—> Ag-promótor

Oligo f y t-3: 5'-CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-3 ' Ag-promótor <—*—> leader pre fytázu

Boli vykonané dve oddelené PCR reakcie. Prvá reakcia s pAB 6-1, ako templátom a oligo 1 a fyt-2, ako prajmermi, viedla k rozšíreniu 282 bp fragmentu DNA. Tento fra48 gment obsahuje 3'-oblasť AG promótoru, ktorá je na 3'-konci doplnená na dvojvlákno pomocou 18 nukleotidov leaderu pre fytázu. Druhá reakcia bola vykonaná s pAF 2-2S, ako templátom, a oligo fyt-3 a 4, ako prajmermi a viedla k rozšíreniu fragmentu DNA, ktorý obsahoval 5'-oblasť génu pre fytázu (vrátane leaderu pre fytázu). Táto 5'-oblasť bola na 5'konci doplnená na dvojvlákno pomocou 18 nukleotidov AG promótoru. Schématické znázornenie týchto reakcií ukazuje obr. 13.

Na konštrukciu výslednej kazety pre expresiu pFYT3 pozdĺž intermediárnych plazmidov pFYTl a pFYT2 bol použitý rovnaký postup klonovania, aký je opísaný pre pFYTl a pFYT2. Tak sa odvodí aj kazeta pre expresiu pl8FYT3 (obr. 15).

Expresia génu pre fytázu za riadenia AG promótoru v A. niger

Sekvencie E. coli boli odstránené z kaziet pre expresiu fytázy hore opísaným štiepením pomocou HindlII. Potom bol kmeň A. niger CBS 513.88 (uložený 10. októbra, 1988) transformovaný 10 μg fragmentu DNA pomocou postupov, opísaných v príklade 9. Jednotlivé transformanty z každej kazety na expresiu boli izolované. Spóry boli načiarkované na selektívne platne s acetamidovým agarom. Spóry každého transformantu boli zobrané z buniek, které rástli 3 dni pri 37’C na agarových platniach s 0,4 % zemiakovo-dextrózovým médiom (Oxoid, Anglicko). Produkcia fytázy bola testovaná v trepaných bankách za týchto rastových podmienok:

Približne 1 x 10⁸ spór bolo naočkovaných do 100 ml inokulačného média, ktoré obsahovalo (na liter): 1 g KH₂PO₄; 30 g maltózy; 5 g kvasničného extraktu; 10 g kazeínového hydrolyzátu; 0,5 g MgSO₄.7H₂O a 3 g Tween 80. pH bolo upravené na 5,5.

Po 24 hodinovom raste cez noc pri 34’C na rotačnej trepačke, bol 1 ml rastúcej kultúry zaočkovaný do 100 ml kul tivačného média, ktoré obsahovalo (na liter): 2 g KH₂PO₄;

g maltodextrínu (Maldex MD0₃, Amylum); 12,5 g kvasničného extraktu; 25 g kazeínového hydrolyzátu; 2 g K₂SO₄; 0,5 g MgSO₄.7H₂O; 0,03 g ZnCl₂; 0,02 g CaCl₂; 0,05 g MnSO₄.4H₂O a FeSO₄. pH bolo upravené na 5,6.

Mycélium bolo pestované aspoň 140 hodín. Produkcia fytázy bola meraná spôsobom, opísaným v príklade 2. Výsledky produkcie niekoľkých náhodných transformantov, získaných z každej kazety na expresiu, ukazuje tabuľka 6.

Tabuľka 6

Produkcia fytázy niekoľkých kmeňov A. niger CBS 513.88, ktoré boli transformované plazmidmi, obsahujúcimi gén pre fytázu z A. ficuum riadeným promótorom z A. niger a kombinovaný s rôznymi vedúcimi sekvenciami

Kazeta na expresiu Transformant č. Aktivita fytázy (U/ml)

	P18FYT3	240	82
pl8FYT3	P18FYT3	242	84
(AG-promótor	P18FYT3	243	62
18 aa AG-leader)	P18FYT3	244	43
	P18FYT3	245	80
	pl8FYT2	246	82
	P18FYT3	250	110
	P24FYT3	256	8
P24FYT3	p24FYT3	257	30
(AG-promótor	P24FYT3	258	13
24 aa AG-leader)	p24FYT3	259	33
	P24FYT3	260	17
	P24FYT3	261	28
	P24FYT3	262	18
	p24FYT3	265	12
	pFYT3	205	50
pFYT3	pFYT3	282	280
(AG-promótor	pFYT3	299	96
leader pre fytázu)	pFYT3	302	220
	pFYT3	303	175
	pFYT3	304	150
	pFYT3	305	150
	pFYT3	312	140

Tieto údaje jasne ukazujú vysoké úrovne expresie fytázy v transformantoch A. niger, ktoré obsahujú gén pre fytázu, riadený AG promótorom z A. niger. Ďalej tieto údaje ukazujú, že najvyššia produkcia fytázy sa získa pri použití pFYT3 vektoru na expresiu, ktorý obsahuje vedúcu sekvenciu pre fytázu.

Podobné vektory na expresiu, obsahujúce gén pre fytázu, bez intrónu, poskytujú po transformácii do A. niger porovnatelné výsledky, pokial sa týka úrovní fytázy, ako pFYT3 transformanty A. niger.

Okrem toho bola vykonaná elektroforéza na IEF-PAGE géli v pH rozmedzí 4,5 až 6 so supernatantmi kultúry transformantov pFYT3 č. 205 a č. 282. Na gél boli nastrieknuté rovnaké objemy supernatantov kultúr rodičovského kmeňa A. niger a obidvoch transformantov, ktoré boli pestované za rovnakých podmienok. Po uskutočnení elektroforézy boli vzorky ofarbené tak, ako je opísané v príklade 9. Rodičovský kmeň A. niger produkuje velmi malé množstvo fytázy, ktoré sa nedá týmto pokusom stanoviť. Kmeň pFYT3 č. 205 produkuje približne ,250 krát viac fytázy, kmeň pFYT3 č. 282 zhruba 1400 krát viac fytázy (porovnaj množstvo fytázy v tabulkách 4 a 5). Tento rozdiel je zretelne vidieť na obr.

11. Bolo tiež stanovených niekoiko izoforiem enzýmu fytázy (označené hviezdičkou). Farbenie obvyklým farbivom pre proteíny ukázalo, že intenzita fytázových proteínových pásov sa výrazne zvýšila, pričom sa neobjavili žiadne iné hlavné proteínové pásy.

Príklad 11

Nadprodukcia fytázy pri A. ficuum a A. niger, pestovaných v priemyslovom meradle

A. A. ficuum

Kmeň A. ficuum pAF 2-2S č. 4 a A. ficuum NRRL 3135 boli pestované za podmienok, udaných v príklade 1. Transformant produkoval v porovnaní s kmeňom divokého typu 50 krát viac fytázy.

Tabulka 7

Nadprodukcia fytázy pri transformante A. ficuum, ktorý obsahoval znásobené gény pre fytázu. Bunky boli pestované za podmienok, opísaných v príklade 1.

' I

Hodiny po Aktivita fytázy (U/ml fermentačného inokulácii média A. ficuum pAF

2-2S č. 4

0 0

0 0

2 142

141 5 270

B. A. niger

Kmeň A. niger pAF 2-2S 8 a transformant kmeňa A. niger CBS 513.88 a samotný rodičovský kmeň A. niger boli pestované podlá príkladu 1. Transformant produkoval zhruba 1000 krát viac fytázy v porovnaní s pôvodným rodičovským kmeňom A. niger (tabulka 8).

Tabulka 8

Nadprodukcia fytázy pri transformante A. niger (CBS 513.88), ktorý obsahoval znásobené gény pre fytázu. Bunky rástli za podmienok, opísaných v príklade 1.

Hodiny po Aktivita fytázy (U/ml fermentačného inokulácii média A. niger pAF

2-2S č. 8

0 0

0 5

0,1 65

141 0,1 95

Príklad 12

Na vytvorenie vektoru pREPFYT3, s ktorým sa dosahuje súčasne expresia fytázy a náhrada AG génu sa rozštiepi pFYT3 pomocou KpnI. Získaný lineárny KpnI fragment DNA sa podrobí dvom oddeleným ligáciám.

Ligácia 1 s KpnI-HindlII adaptorom:

5'- CGGGGA -3'

3'- CATGGCCCCTTCGA-5'

KpnI HindlII

Ligácia 2 s KpnI-HindlII* adaptorom, v ktorom HindlII reštrikčné miesto nie je po ligácii obnovené:

5'- CGGGGG -3'

3'- CTAGGCCCCCTCGÄ-5'

KpnI HindlII*

Ďalej je produkt ligácie 1 čiastočne štiepený pomocou HindlII. Po odstránení fragmentu, ktorý obsahuje amdS pomocou gélovej elektroforézy sa zvyšný fragment DNA recykluje pomocou ligácie a transformuje sa do E. coli. Získaný plazmid sa nazýva pFYT3 amdS (pozri obr. 16).

Produkt ligácie 2 sa tiež štiepi pomocou HindlII. Fragment DNA 4 kb HindlII/HindlII*, ktorý obsahuje gén amdS sa izoluje gélovou elektroforézou. Ďalej sa ligáciou spojí s digestom pFYT3 amdS, štiepeným čiastočne pomocou HindlII. Nakoniec sa transformuje do E. coli. Tento plazmid, ktorý obsahuje amdS gén na 3'-konci génu pre fytázu, sa nazýva PFYT3INT (pozri obr. 17).

Cieľom ďalšieho postupu je vytvoriť približne 6 kb Sall/HindlII fragment DNA z pAB 6-1, ktorý obsahuje 3' flan king AG sekvenciu. Preto je pFYT3INT čiastočne štepený porno cou HindlII. Najskôr je však ligáciou spojený s adaptorom:

5'- AGCTAGGGG -3'

3'- TCCCCCAGCT -5'

HindlII* Sali (po tejto llgácii nie je HindlII* reštrikčné miesto' opäť obnovené). Nasleduje ligácia s Sall/HindlII fragmentom pAB 6-1. Po transformácii do E. coli sa získa požadovaný plazmid pREPFYT3 (obr. 18), ktorý obsahuje 3'AG flanking sekvenciu na správnom mieste.

Expresia fytázy v A. niger nahradením AG génu

Pred transformáciou A. niger pREPFYT3 sa sekvencia plazmidu z E. coli odstráni štiepením HindlII a gélovou elektroforézou. Kmeň A. niger CBS 513.88 sa transformuje 10 μg DNA fragmentom podlá postupov z príkladu 9. Selekcia a rast transformantov sa vykonáva podlá postupov z príkladu

9. Len menšina vybraných trasformantov stráca AG aktivitu (približne 20 %). Bola uskutočnená Southern analýza chromozomálnej DNA s AG negatívnymi a AG pozitívnymi transformantmi aby sa overilo, že AG gén je skutočne nahradený génom pre fytázu.

Príklad 13

Konzervácia génu pre fytázu v rôznych mikrobiálnych druhoch

Southern analýzy desiatich rôznych druhov boli vykonané s cDNA pre fytázu z A. ficuum ako próbou, aby sa zistilo, ako je gén pre fytázu v rôznych mikrobiálnych druhoch konzervovaný.

Tieto analýzy chromozomálnej DNA boli uskutočnené pri mikrobiálnych druhoch vláknitých hub, kvasiniek a baktérií. Z každej skupiny bol vyberaný len obmedzený počet zástupcov ako príklad: pre vláknité huby: Penicillium chrysogenum a Aspergillus niger; pre kvasinky: Saccharomyces cerevisiae a Kluyveromyces lactis a pre prokaryntné organizmy

Gram-ροζitívne druhy, ako Bacillus subtilis, Clostridium thermocellum a Streptomyces lividans a Gram-negatívne baktérie, ako Pseudomonas aeruginosa.

Chromozomálna DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou z týchto druhov bola oddelene štiepená pomocou PvuII a BamHI. Ďalej bola podrobená elektroforéze na 0,7% agarózovom géli.

Po prenesení na nitrocelulózové filtre bola vykonaná hybridizácia s 5' fytázovým cDNA fragmentu (opísaný v príklade 8), ktorý bol značený ³²P. Hybridizácia bola uskutočňovaná počas 24 hodín za miernych podmienok (6 x SSC, 50^eC). Bloty boli premyté v 6 x SSC roztoku pri laboratórnej teplote. Ďalej boli počas 18 hodín vystavené X-žiareniu.

Ako ukazujú obr. 19a a 19b, objavili sa v takmer každom pruhu diskrétne pásy, ktoré značia vysoký stupeň homológie génu pre fytázu medzi mikrobiálnymi druhmi.

Claims (7)

1. Vyčistená a izolovaná sekvencia DNA, kódujúca peptid alebo proteín vykazujúci fytázovú aktivitu, ktorá katalyzuje uvoľňovanie aspoň jedného anorganického'fosfátu

I z myoinozitolfosfátu, pričom táto sekvencia DNA je zvolená zo súboru zahŕňajúceho:

a) sekvenciu DNA kódujúcu polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je znázornená na obr. 8 a

b) sekvencie DNA, ktoré sú schopné hybridizovat za podmienok nízkej stringencie, 6 x SSC, 50’C cez noc, s próst acJL bou zahŕňajúcou nukleotid$vevpolohy 1 až 818 z obr. 8.

2. Vyčistená a izolovaná sekvencia DNA podlá nároku 1, pochádzajúca z mikrobiálneho zdroja.

3. Vyčistená a izolovaná sekvencia DNA podlá nároku 1 alebo 2, pochádzajúca z fungálneho zdroja.

4. Vyčistená a izolovaná sekvencia DNA podlá niektorého z nárokov 1 až 3, pochádzajúca zo zdroja z rodu Aspergillus.

5. Vyčistená a izolovaná sekvencia DNA podlá niektorého z nárokov 1 až 4, pochádzajúca zo zdroja Aspergillus ficuum alebo Aspergillus niger.

6. Vyčistená a izolovaná sekvencia DNA podlá niektorého z nárokov 1 až 5, kódujúca fytázu, vykazujúca nasledujúce vlastnosti:

roefa

a) ked je exprimovaná v hostiteiovlYAspergillus, poskytuje na SDS-PAGE jediný pás pri 85 kDa;

φν

N-TERMINÁLNE AMINOKYSELINOVÉ SEKVENCIE ABC

POZÍCIA 01 LEU 02 ALA 03 VAL 04 PRO 05 ALA ALA 06 SER SER 07 — ARG 08 ---** — ASN 09 GLN GLN GLN 10 SER SER SER 11 SER SER SER 12 - - - --- GLY 13 ASP ASP ASP 14 THR THR THR 16 VAL VAL VAL 16 ASP ASP ASP 17 GLN GLN 18 GLY 19 TYR 20 GLN 21 ARG 22 PHE 23 SER 24 GLU 26 THR 26 SER 27 HIS 28 LEU 29 ARG 30 1 (GLY)* 31 GLN 32 TYR 33 ALA 34 PRO 36 PHE 36 PHE 37 (ASP) 38 LEU 39 ALA

Obr. 1A

7 V ΚΟΛ-ΊΟ

AMINOKYSELINOVÉ SEKVENCIE PEPTIDD

A B c ŕ’ D E GLN (TRP)* MET ALA VAL M M M** SER MET SER VAL GLN PHE GLN SER ASP ALA ASP CYS ALA — GLU THR GLN GLU ARG GLN ILE ALA LYS PHE GLU SER GLU GLY PRO PRO THR GLN TYR TYR LEU SER GLU ASP THR VAL THR PRO LEU GLY (ARG) VAL LEU VAL — VAL LEU VAL ASN (ASP) (ARG) (VAL) VAL PRO ASP THR LYS LEU SER PRO PHE (CYS) (ASP) LEU PHE THR VAL ARG VAL LEU VAL ASN ASP ARG VAL ALA

Obr. 1B