SK376492A3 - Tnf - muteins and method of their production - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález se týká muteinu humánniho nádorového nekrotického faktoru, zpúsobu jeho výroby, farmaceutického prípravku na jeho bázi, použití tohoto muteinu k léčbé, sekvence DNA, která zahrnuje sekvenci DNA, která kóduje tento mutein, vektoru s touto sekvenci DNA, zejména pro expresi prokaryotických nebo nižších eukaryotických hostitelských bunék a téchto hostitelských bunék.

Dosavadní stav techniky

Nekrotický faktor nádoru či konkrétnej! nádorový nekrotický faktor-alfa (TNF-α) je cytokin, který produkuj í zejména stimulované makroŕágy. TNF-α vykazuje nejen pozoruhodnou cytotoxicitu vuči rúzným nádorovým bunkám [Carswell a další, Procd. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3666 až 3670 (1975)], nýbrž hraje i mnohonásobnou úlohu jako mediátor zánétu a imunitní odpovedi [pŕehled lze nalézt v Beutler a Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7, 625 až 655 (1939); Bonavista a Granger (red.) Tumor Necrosis Factor: Structure, Mechanism of Action, Role in Disease and Therapy Karger, Basilej (1990)]. Primárni štruktúra humánniho nádorového nekrotického faktoru-alfa (hTNF-α) byla dedukována z nukleotidové sekvence cDNA, která byla klonovár.a a exprimována v E. coli [Pennica a další, Náture 312, 724 až 729 (1984); Marmenout a další, Európ. J. Biochem. 152, 515 až 522 (1985); Wang a dalši, Science 228, 149 až 154 (1985); Shirai a další, Náture 313, 803 až 806 (1985)]. Zjistilc se, že existuje pozoruhodná homologie aminokyselinové sekvence (30 %) mezi hTNF-α a humánním lýmfotoxinem, který bývá často označován názvem humánni nádorový nekrotický faktor - beta (hTNF-β). hTNF-β je cytokin, který produkuj í hlavné lymfocyty [Gray a další,

Náture 312, 721 až 724 (1934); Fiers a další Cold Spring Harbour Symp. 51, 587 až 595 (1986)].

V dosavadním stavu techniky jsou také popsány látky hTNF-a s modifikovanou sekvencí aminokyselín, tzv. TNF-a-muteiny (viz napríklad Yamagishi a další Protein Engineering 3, 713 až 719 (1990) nebo Fiers v Tumor Necrosis Factors:

Structure, Function and Mechanisms of Actiori Aggarwal a Vilcek (red.), Marcel Dekker Inc., New York - v tiskú, nebo Fiers a další v Bonavista a Granger, str. 77 až 81 (viz výše)]. TNF-a-muteiny se stály také pŕedmétem nékolika patentových pŕihlášek, napríklad mezinárodních patentových pŕihlášek, publikovaných pod čísly WO 86/02381, wo 86/04606, WO 88/06625, evropských patentových pŕihlášek, publikovaných pod čísly 155 549, 158 286, 168 214, 251 037 a 340 333 a némecké zverejnené patentové prihlášky DE-OS 3 843 534.

V dosavadním stavu techniky jsou také popsány muteiny lymfotoxinu, napríklad v evropských patentových pŕihláškách, publikovaných pod čísly 250 000, 314 094 a 336 333.

Biologické účinky TNF jsou zprostŕedkovány špecifickými receptory, totiž receptcrem, který vykazuje zdánlivou molekulovou hmotnosť 55 kD pri elektroforéze na polyakrylamidovém gélu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) (p55-TNF-R) a receptorem, který vykazuje zdánlivou molekulovou hmotnosť 75 kD na SDS-PAGE (p75-TNF-R). Obé tyto formy receptoru TNF byly klonovány, totiž p55-TNF-R Loetscherem a dalšími [Celí 61, 351 až 359 (1990)] a p75-TNF-R, napríklad Dembicem a dalšími [Cytokine 2, 53 až 53 (1990)] (oba tyto receptory jsou také popsány v evropské patentové pŕihlásce č.90116707.2 ) . Nedávno se zjistilo, že oba tyto receptory vážou s vysokou afinitou nejen TNF-α, nýbž také TNF-β [Shônfeld a další, J. Biol. Chem. 266, 3863 až 3869 (1991)].

Je dobre známo v tomto oboru, že na základé biologických účinností múže být TNF-α cennou sloučeninou pri léčbé rúzných chorob. Tak napríklad se múže TNF-α samotného nebo v kombinaci s interferonem použivat jako účinného protinádorového činidla [Brouckaert a další, Int. J. Cancer 38, 763 až 769 (1986)]. Velkým omezením jeho širšího terapeutického využití je však jeho systemická toxicita (Taguchi T. a Sohmura Y., > Biotherapy 3, 177 až 186 (1991)].

Bylo zjišténo, že u myši je humánni TNF-α (hTMF-a), který se váže pouze k menšímu myšímu TNF-receptoru (murinní p55-TMF-R), mnohem méné toxický než murinní TMF-α (mTNF-a), který se váže jak k p55-TNF-R, tak k p75-TNF-R. Tak napríklad, u myší C57B16 činí hodnota LD₅₀ približné 10 p.g/myš u mTNF-α a 500 μ9/ηιγέ u hTNF-α [Brouckaert a další, Agents and Actions 26, 196 až 198 (1939 ); Everaerdt B. a další Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 373 až 335 (1989); Lewis M. a další, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2830 (1991)]. Zdá se tedy, že p75-TNF-R hraje zvláštni úlohu pri systemické toxicité.

hTNF-α a mTNF-α se vážou približné stejné k humánnímu p55-TNF-R a humánnímu p75-TNF-R. Mutanty hTNF-α, které si zachovalý biologickou účinnosť zprostŕedkovanou hp55-TNF-R, ale které téméŕ ztratily všechnu účinnosť zprostŕedkovanou hp75--TNF-R, jsou však funkčními ekvivalenty hTNF-α v murinním systému a ocekává se, že budou mít sníženou systemickou . toxicitu u primátu.

Muteiny humánniho nádorového nekrotického faktoru, které vykazujú podstatný rozdil mezi svou vazebnou afinitou k humánnímu receptoru p75 nádorového nekrotického faktoru (hp75-TNF-R) a k humánnímu receptoru p55 nádorového nekrotického faktoru (hp55-TNF-R), jsou popsány v evropské patentové pŕihlášce č. 91119123.6.

Podstata vynálezu

Nyní se zj istilo, že muteiny hTNF nebo jejich farmaceutický vhodné soli, které mají aminokyselinovou sekvenci humánního nádorového nekrotického faktoru, zmenenou pŕinejmenším v poloze 86 (kde je místo serinového zbytku pŕítomen threoninový zbytek), si zachovávaj! vazebnou aktivitu k hp55-TNF-R, ale téméŕ úplné ztratily všechnu vazebnou afinitu k hp75-TNF-R. Dále byly také nalezený takové hTNF muteiny, které si zachovalý biologickou účinnost zprostŕedkovanou hp55-TNF-R ale již se nevážou k hp75-TNF-R. Muteiny hTNF podie vynálezu se neomezují na tento typ muteinu. Zahrnuj í také muteiny dalšího typu, které se síce vázou výlučné k hp55-TNF-R, ale které ztratily schopnosť vyvolávať funkční odpoveď bunék.

Pŕedmétem tohoto vynálezu jsou muteiny humánního nekrotického faktoru a jejich farmaceutický vhodné soli, které vykazuj í selektívni vazebnou afinitu k humánnímu receptoru p55 nádorového nekrotického faktoru (hp55-TNF-R) a jejichž aminokyselinová sekvence humánního nádorového nekrotického faktoru je zmenená pŕinejmenším v poloze 36, kde je pŕítomen threoninový zbytek místo serinového zbytku.

Sekvence aminokyselín humánního TNF-α podie autoru Pennica a další (viz výše) a vypadá takto:

x

VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO

VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU

ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA . 50

ASN GLN LEU VAL VAL PRO SER GLU

GLN VAL LEU PHE LYS GLY GLN GLY

LEU THR HIS THR ILE SER ARG ILE

VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS

110

PRO C-LU GLY ALA GLU ALA LYS FRO

GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS

140

ILE ASN ARG FRO ASP TYR LEU AS?

157

TYR PHE GLY ILE ILE ALA LEU

SER AS? LYS PRO VAL ALA HIS

GLY GLN LEU GLN TRP LEU ASN

ASN GLY VAL GLU LEU ARG ASP

GLY LEU TYR LEU ILE TYR SER

CYS PRO SER THR HIS VAL LEU.

ALA VAL SER TYR GLN THR LYS

100

SER FRO CYS GLN AR.G GLU THR

1ZCL

TRP TYR GLU PRO ILE TYR LEĽT

130

GLY ASP ARG LEU SER ALA GLU

150

PHE ALA GLU SER GLY GLN VAL

Tuto sekvenci zverejnili také Marmenout a další (víz vyše), Wang a další (viz výše) a Shirai a další a konkrétnéji je pro maturovaný TNFa kódována nukleotidovou sekvenci vloženého plasmidu pDS56/RBSII, Sphl-TNFct (viz obr. la a lb a príklad I.

Muteiny hTNF, definované výše, mohou mít pozménénu aminokyselinovou sekvenci hTNF v jedné nebo více prídavných polohách, prednostné v jedné nebo dvou prídavných polohách, pŕičemž pŕednostními polohami jsou zejména polohy 29, 31, 32, 29 a 32 nebo 31 a 32. V téchto prídavných polohách se múze použít jakékoliv aminokyseliny, prednostné jakékoliv aminokyseliny, která se vyskytuje v prírode. V prípade substitucí v poloze 29 se dává pŕednost serinu, glycínu nebo tyrosinu, zejména serinu. V pŕípadé substitucí v poloze 31 se dává pŕednost kyseline glutamové nebo asparaginu. V prípade substitucí v poloze 32 se dává pŕednost tyrosinu, tryptofanu nebo threoninu, pŕičemž obzvlášté výhodný je tryptofan a threonin.

hTNF muteiny podie tohoto vynálezu mohou obsahovat další aminokyselinové substituce, pokud takové substiťuce neméní jej ich selektívni vazebnou afinitu vuči p55-TNF-R. Aminokyselinové substituce v proteinech a polypeptidech, které v podstate nemení biologickou aktivitu jsou v tomto oboru známy a jsou napríklad popsány v H. Neurath a R. L.

Hill v The Proteins Academic Press, New York (1979), zejména na obr. 6, str. 14. Mejčastéji pozorované aminokyselinové substituce jsou:

Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr,

Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg,

Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/’val, Ala/Glu, Asp/Gly a naopak. hTNF muteiny podie tohoto vynálezu mohou prídavné obsahovat sekvence nékolika aminokyselín, které jsou kódovány sekvencemi linkeru. Tyto sekvence mohou vzniknout z estpresních vektoru, použitých pro expresi hTNF muteinu,

í.

i

ΙΕ popsaných výše.

hTNF muteiny podie tohoto vynálezu mohou také obsahovat špecifické sekvence, které se prednostné vázou k afinitnímu nosičovému materiálu. Jako príklady takových. sekvencí je možno uvést sekvence obsahující alespoň dva sousední histidinové zbytky (viz Evropská patentová prihláška, publikovaná pod číslem 282042). Tyto sekvence se selektívne vázou k pryskyŕicím s niklovým chelátem nitrilotrioctové kyseliny (Hochuli a Dôbeli, Biol. Chem..Hoppe-Seyler 368, 748 (1987); Evropská patentová prihláška, publikovaná pod číslem 253303). hTNF, které obsahuj! takovou špecifickou sekvenci, mohou být vázány buď k C-konci, nebo N-konci, nebo obou témto koncúm aminokyselinové sekvence hTNF muteinu.

hTNF muteiny podie tohoto vynálezu je také možno spojovat s ruznými tšžkými ŕetézci imunoglobulinu nebo lehkými ŕetézci polypeptidú. Tak vznikaj í chimerické hTNF mutein-imunoglobulinové polypeptidy, které by mohly mít zvýšený poločas životnosti in vivo. Zvýšený poločas životnosti in vivo byl napríklad demonstrován u chimerických polypeptidú, které se skladaj í z prvních dvou domén konstantních oblastí téžkého ŕetézce nebo lehkého ŕetézce savčího imunoglubulinu (viz Traunecker a další, Náture 331, 84 až 86 [1988] a Evropská patentová prihláška, publikovaná pod číslem 394827).

hTNF muteiny je také možno spojovat s polyméry, napríklad polyethylenglykolem nebo polypropylenglykolem o molekulové hmotnosti 500 až 20 000 Dalton. To vede k chránéným hTNF muteinovým látkám, které by mohly být v podstate neimunogenní. K dispozici je a bylo popsáno nékolik zpusobu spojování polyméru s polypeptidem (viz napríklad US patent.

179 337.

Z hTNF muteinú podie vynálezu se dává prednosť zejména témto látkám:

THr⁸⁶-TNFa, Ser²⁹-Thr⁸⁶-TNFa, Glu³¹-Thr⁸⁶-TNFa, Trp³²-Thr⁸⁶TNFa, Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶-TNFa nebo Asn³¹-Thr³²-Thr⁸⁶-TNFa hTNF muteiny podie tohoto vynálezu je možno vyrábét postupy, které jsou o sobé známé v tomto oboru a které jsou nnapŕíklad popsány v Sambrook a dalsí [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA (1989)] nebo v následujících odstavcich. Zda hTNF muteiny jesté vykazuj í selektívni vazebnou afinitu vúči p55-TNF-R, lze zjistit zpúsobem popsaným v následujících pŕíkladech. Alternatívne je také možno hTNF muteiny podie tohoto vynálezu chemicky syntetizovať standardními postupy, které jsou známé v tomto oboru, prednostné postupy v tuhém stavu, jako jsou. postupy popsané v Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 až 2154 [1963]). Pŕedmétem vynálezu jsou také soli téchto muteinú. Tyto soli je možno vyrábét o sobé známymi zpusoby.

Pŕedpokládá se, že stratégie, která spočívá v odŕíznutí prospešných účinností TNFa od nežádoucích účinností, za použití sloučenin, které se špecificky vážou k jednomu nebo drhému TNF-receptoru, jako jsou hTNF muteiny podie tohoto vynálezu, je možno použít obecné i u jiných chorobných stavu, pri nichž hraj e TNF svou roli.

Pŕedmétem vynálezu jsou také sekvence DNA, které obsahuj í sekvenci DNA, kódující vyše popsané hTNF muteiny. Tyto sekvence DNA je možno zkonstruovat z výchozích genomových nebo cDNA-sekvencí, kódujicích hTNF, jak je to posáno v dosavadnim stavu techniky (viz vyše), za použití známych metód nebo mutagenesí in vitro (viz napríklad Sambrook a cialši, ,1989). Tato mutagenese se muže provádét náhodné, za účelem získání velkého počtu mutantu, které lze potom zkoušet na požadované vlastnosti, za použití vhodných zkušebných systému, mistné orientovanou mutagenesi, t. j. mutagenesí, pri níž docházi k mutaci definovaných poloh dané sekvence DNA [viz napríklad Sambrook a další, 1989, 15.51-15.113] nebo mutagenesí za použití ŕetézové reakce probíhající v prítomnosti polymerasy (viz napríklad White a další, Trends in Genetics 5, 185 až 189 [1989]).

Jedním z chemických mutagenú, kterých se často používá pro náhodnou mutagenesi, je hydrogensiričitan sodný, kterým se pŕevádí cytosinový zbytek na uracilový zbytek, čímž docházi k prechodu C na T (štandardní zkratky nukleotidu) [Tento zpúsob je napríklad popsán v publikaci Shortle a Nathans, Procd.

Nat. Acad. Sci. USA 75, 2170 až 2174 (1978) nebo Pine a Huang, Meth. Enzým. 154, 415 až 430 (1987)]. Tento mutagen púsobí výhradné na jednovláknovou DNA, zatímco exprese mutované cílové sekvence DMA se dosahuje za použití dvouvláknového plasmidového vektoru. Jednou možností, jak se vyhnout nutnosti provádét reklonování ve vektorech pro mutagenesi a expresi, je použití tzv. phasmidú. Phasmidy jsou vektory, které kromé plasmidového počátku replikace nesou také počátek replikace pocházejíci z vláknitého fágu. Jako príklady takových phasmidú je možno uvést pMa- a pMcphasmidy, které jsou popsány v publikaci Stanssen a další (Nucleic Acids Pes. 17, 4441 až 4454 (1989)]. Za použití tohoto exprimačního systému je možno zkonstruovat tzv. štruktúry gap-duplex [viz také Kramer a další Nucl.

Acids Res. 12, 9441 až 9456 (1984)], v nichž je pouze sekvence kódující TNF (viz výše) v jednovláknové konfiguraci, a proto je dosažitelná pro špecifický chemický mutagen. Štruktúry gap-duplex, kterých se má použít pro náhodnou mutagenesi, je možno konštruovať zpúsobem popsaným pro výrobu takových struktur, které jsou určený pro mistné špecifickou mxítagenesi (Stanssen a další, viz výše) pouze s tím rozdílem, :7.ľ-?.Vr’ že (-) vlákno obsahuje stejný gen aktivní odolnosti proti antibiotiku, jako (+) vlákno. Za použití rúzných restrikčních míst v sekvenci DNA, která kóduje hTNFa, je možno ménit šírku mezery (gap). Jako príklady takových restrikčních míst je možno uvést místa Clal-Sall (470 nukleotidu), BstXl-BstXl (237 nukleotidu) nebo Styl-Styl (68 nukleotidu). Na takové konštrukty gap-duplex se potom múže pusobit rostoucími koncentracemi (až do 4M) siŕičitanu, načež se provede nékolik dialyzačních stupňu (Shortle a Natans, viz vyše). Pomoci takových phasmidových konstruktú lze potom transformovat vhodnou prokaryotickou hostitelskou bunku zpúsoby, které jsou o sobé známe (napríklad Sambrook a dalsí, viz výše uvedená publikace). Pod výrazem vhodná prokaryotická hostitelská bunka se v tomto kontextu rozumí hostitelská bunka, která nemá špecifickou párovací funkci, takže uracilový zbytek zústává v DNA zachován v prubéhu replikace, pŕičemž tato hostitelská bunka je schopná exprimovat odpovídající mutovaný TNF. Takové špecifické hostitelské kmeny jsou v tomto oboru známy; z kmeňu E. coli se napríklad jedná o E. coli BW 313 [Kunkel, T. A., Procd. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 až 492 (1985)]. Pomoci vhodných zkušebních systému se potom provede skrining, za účelem nalezení klonu, které exprimují požadovaný hTNF mutein. Tak napríklad je možno každou kolonii na mikrotitrové plotné inokulovat do vhodného média obsahujícího relevantní antibiotikum. Bunky je možno podrobit lysi pŕídavkem lysosymu, po níž se provede nékolik cyklu zmrazování a tání. Po vysrážení nukleových kyselín a centrifugaci se múže supernatantu každé kolonie pŕímo použit pri vhodných zkouškách, které jsou napríklad popsány v príkladu Ila a Ilb nebo príkladu VIII, pri nichž se méŕí vazba k p75-TNF-R a p55-TNF-R na povrchu živých bunék nebo t

v prečistené formé.

Je-li to žádoucí, mohou se špecifická místa mutacé stanovit napŕklad analýzou restrikčních fragmentu (viz napríklad Sambrook a další, vyše uvedená citace). Stanovením sekvence DMA téchto fragmentu je možno určit presnou polohu mutace a pokud taková mutace vede k náhrade aminokyseliny, je možno novou aminokyselinu odvodit ze stanovené sekvence DMA. DNA-sekvenování se múže provádét zpusoby, které jsou o sobé známy v tomto oboru, napríklad za použití T7 polymerasy na superhelix DNA, pomoci obchodné dostupné soupravy pro sekvsnování (Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

Jak již bylo uvedeno vyše, další možností mutace dané sekvence DNA je místné orientovaná rautagenese. V širokém rozsahu používaná stratégie pro tento typ mutagenese byla puvodné navržena Hutchinsonem a Edgellem (J. Virol. 8, 181 [1971]) a zahrnuje hybridizaci syntetického oligonukleotidu, nesoucího požadovanou substituci nukleotidu, k cilové oblasti jednovláknové sekvence DMA, do níž má být mutace zavedená [pŕehled je uveden napríklad v Smith, Annual Rev. Genet. 19, 423 (1985)]. Zlepšené metódy jsou uvedený ve druhé až šesté citaci Stanssena a dalších (1989).

Jednou takovou prednostní metodou je metóda Stanssena a dalších (1989), pri níž se používa gapped duplex DNA, kterou puvodné popsali Kramer a další roku 1984 [viz výše uvedená citace a citacé Kramer a Fritz, Methods in Enzymology, (1987), Academic Press Inc., USA], s tím rozdílem, že se pro selekci vlákna obsahujícího rautaci používá génu odolnosti proti antibiotikum místo funkčních t - . t,.. 1 génu M13, kromé phasmidové technológie, kterou také popsali Stanssen a další (1989) (viz výše uvedená citace). Výhodou tohoto postupu je také možnost provádét následné cykly mutagenese, aniž by bylo nutno pŕenášet gen do nového vektoru pro mutagenesi; druhé kolo mutagenese se liši pouze v selekci na jiný antibiotický marker (Stanssen a další, viz výše). Pro kontrolu lze použít místné špecifické zpétné mutagenese mutantu na TNF divokého typu. Kromé toho, použití oligonukleotidu, který vytváŕí nebo ničí reštrikční místo génu TNF, umožňuje kontrolovať mutant nejen hybridizací k oligonukleotidu, použitému pro místné orientovanou mutagenesi, nýbrž také na základé prítomnosti nebo nepŕítomnsti restrikčního mista. Pro vytvorení série hTNF muteinú, v nichž je v definované poloze jejich aminokyselinové sekvence aminokyselina divokého typu nahrazena jakoukoliv aminokyselinou vyskytující se v prírode, se používá série oligonukleotidú se všemi možnými kodony v definované poloze.

Jak již bylo uvedeno vyše, další možností, jak mutovať danou sekvenci DNA, je mutagenese za použití ŕetézové reakce s polymerasou (PCR). Základy této metódy jsou popsány v publikaci Whitea a dalších (1989), pŕičemž zlepšené postupy jsou napríklad popsány v publikaci Innis a další (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., (1990)).

PCR je metóda in vitro, která se hodí pro výrobu velkých množství špecifických fragmentú DNA o definované délce a sekvenci z malých množství templátové DNA. PCR je založená na enzymatické amplifikaci fragmentu DNA, lemovaného dvéma oligonukleotidovými priméry, které se hybridizují k opačným vláknúm cílové sekvence. Priméry jsou orientovány tak, že jejich 3' konce smeruj í k sobé. Opakované cykly tepelné denaturace templátu, tepelné hybridizace priméru ke komplementárním sekvencím a prodluž'ování hybridizovaných > primerú pomoci DNA polymerasy vedou k amplifikaci segmentu • mezi 5' konce primerú PCR. Vzhledem k tomu, že produkt ; prodlužováni každého primerú múže sloužit jako templát pro ' další primer, v každém cyklu se v podstate zdvojnásobí • množství fragmentu DNA, produkovaného v pŕedchozim cyklu.

: Vzhledem k tomu, že priméry jsou fyzicky zabudovány do s amplifikovaného produktu a chyby mezi 5' koncern primerú a i

j templátem podstatné neoviivňují účinnosť amplifikace, je i

i j

•I v

J

J

- 13 možno pozmeňovať amplifikovanou sekvenci zavádéním požadované mutace do amplifikované DNA. Za použití tepelné stále Taq DNA polymerasy, izolované z termofilní baktérie Thermus aquaticus, je možno se vyhnout denaturaci polymerasy, která j inak vyžaduje pŕídavek enzýmu po každém stupni tepelné denaturace. Tento vývoj vedl k automatizaci PCR za použití ruzných zaŕízení pro jednoduché cyklování teploty. Kromé toho, špecifičnosť amplifikační reakce se zvýši tím, že se použije vyšších teplôt pro hybridizaci primeru a prodlužování. Zvýšení špecifičnosti zlepšuje celkový výtéžek amplifikovaných produktu tím, že se minimalizuje konkurence necílových fragmentu o enzým a primery.

Navrhování a syntéza oligonukleotidú se mohou provádét zpúsobem známým v tomto oboru, který je napríklad popsán v publikaci Sambrook a dalšjl· (1989) nebo v nékteré z publikací, které byly uvedený výše, v souvislosti s místné orientovanou mutagenesí.

Jakmile se vytvorí sekvence DNA kódující hTNF mutein podie tohoto vynálezu, je možno pŕistoupit k expresi pomoci phasmidové technológie, popsané výše, nebo pomoci jakéhokoliv j iného vhodného pro- nebo eukaryotického expresného systému, dobre známého v tomto oboru (viz napríklad Sambrook a další, výše uvedená citace).

Exprese se prednostné provádí v prokaryotických bunkách, napríklad E. coli, Bacillus subtilis apod., pričemž prednosť se dává E. coli, zejména kmenúm E. coli K12 napríklad M15 [popsaným jako DZ 291, Villarejo a další v J. Bacteriol 120, 466-474 (1974)], HB 101 [ATCC č. 33694] WK6 (Stranssens a další, viz výše) nebo E. coli SG13009 [Gottesman a další J. Bacteriol 148, 265 až 273 (1981)] Exprese hTNF muteinu podie tohoto vynálezu se také múže provádét v nižších nebo vyššíchh ^ukaryotických bunkách, jako jsou napríklad kvasinkové bunky (jako Saccharomyces nebo Pichia atd.) vláknité houby (jako Aspergillus atd.) nebo bunečných liniích (jako jsou vaječníkové bunečné línie čínskeho kŕečka atd.), pŕičemž expresi v kvasinkových bunkách se dává pŕednost [viz Sreekrishna a další, Biochem. 28, 4117-4125 (1989); Hitzeman a další, Náture 293, 717 až 722 (1981); Evropská patentová prihláška publikovaná pod číslem 263311]. Exprese hTNF muteinú podie tohoto vynálezu se v takových systémech muže provádét buď intracelulárné nebo po vhodné adaptaci génu také extracelulárné (viz Leemans a další, Gene 85, 99 až 108,

1989 ) .

Vhodnými vektory pro použití pri expresi v E. coli jsou napríklad vektory, které uvádéjí Sambrook a další ve výše uvedené citaci nebo Fiers a další v Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium [Soc. Franc. de Microbiol., Paríž (Durandt a další red.), str. 680 až 697 (1988)] nebo konkrétnéji vektory ze skupiny pDS [Bujard a další Methods in Enzymology, red. Wu a Grossmann, Academic Press, Inc. sv.

155, 416 až 433 (1987); Stuber a další, Immunological Methods, red. Lefkovits a Pernis, Academic Press, Inc., sv.

IV 121 až 152 (1990)], jako napríklad pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Thr86) (viz príklad I) nebo pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Trp32Thr86) (viz príklad III) nebo pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Ser29Thr86) ,

PDS56/RBSII, SphI-TNFa(Ser29Trp32Thr86 ), pDS56/RBSII, Sphl-TNFa (Asn3lThr3 2Thr8 6 ) nebo pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Glu31Thr86) (viz príklad IV).

Jelikož lze s témito špecifickými pDS56/RBSII-plasmidy, díky jejich špecifickým prvkum promotor/operátor a ribosomálnim vazebným místúm, dosáhnout vysoké úrovne exprese, je možno tyto plasmidy udržovať v bunkách E. coli pouze za predpokladu, že je aktivita prvku promotor/operátor potlačená väzbou lac represoru k operátoru. Aktivitu promotoru je možno reštaurovať pri požadované hustoté bunék pŕídavkem IPTG, který inaktivuje represor a uvolňuje promótor. Jelikož vétšina kmeňu E. coli neposkytuje dostatek represorových molekúl pro úplné potlačení funkce promótorových sekvencí, prítomných v techto plasmidech s vysokým počtem kópií, takové kmeny E. coli, jako je E. coli M15 nebo SG13009, je treba transformovať nejprve plasmidem, jako je pREP4 (viz obr. 2a a 2b), kódujícím lac represor, pred tím, než se provede jejich transformace špecifickými pDS56/RBSIlplasmidy podie vynálezu. Teprve potom lze tyto plasmidy stabilné udržet v bunkách E. coli. Kromé toho, že pREP4 kóduje lac represor, obsahuje také oblasť plasmidu pACYC184 [Chang a Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141 až 1156 (1978)], která obsahuje všechny informace potrebné pro replikaci a stabilní transmisi na dceŕiné bunky [dalši informace lze také nalézt v System for high level production in E. coli and rapid purification of recombinant proteins: Application to epitope mapping, preparation of antibodies and structure function analysis Stuber a další v Immunological Methods, sv. IV, str. 121 až 152, Lefkovitz a Pernis (red.), Academic Press, New York (1990)].

Transformace hostitelských bunék výše popsanými vektory se muže provádét jakýmkoliv konvenčním postúpení (viz napríklad Sambrook a dalši, výše uvedená citace). Pokud je hostitelská bunka prokaryotická, jako napríklad E. coli, pripravuj í se Jfompetentni bunky, které jsou schopný pŕijmout DNA z bunék, sklizených po exponenciálni fázi rustu a potom se zpracováváj í známou metodou s chloridem vápenatým.

Transformace se také muže provést po vytvorení protoplastu hostitelské bunky nebo j inými metódami známymi v tomto oboru, které jsou napríklad popsány v publikaci Sambrooka a dalších (viz výše). Pŕedmétem vynálezu je proto také vektor, zejména pro expresi v prokaryotické nebo nižší eukaryotické hostitelské buňce, který obsahuje sekvencí DNA kódující hTNF mutein, popsaný výše a hostitelská bunka, zejména prokaryotická hostitelská bunka, napríklad E. coli nebo nižší eukaryotická hostitelská bunka, transformovaná takovým vektorem.

Hostitelské organismy, které obsahují požadovaný expresní vektor, se obvykle nechaj í rúst za podmínek, které jsou pro jejich rúst optimálni. V pripadá prokaryotického hostitele se na konci exponenciálního rústu, kdy poklesne nárust počtu bunék za časovou jednotku, vyvolá exprese požadovaného hTNF muteinu, t.j. DNA, která kóduje požadovaný hTNF mutein se transkribuje a provede se translace transkribované mRNA. Indukce se múze provést pridaním induceru nebo derepresoru k rústovému médiu nebo zmenou fyzikálního parametru, napríklad zmenou teploty. V expresnich vektorech, kterých se používá v pŕednostních provedení tohoto vynálezu, se exprese kontroluje lac represorem. Pŕídavkem isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) dôjde k derepresi sekvence kontrolující expresi a tím se indukuje syntéza požadovaného hTNF muteinu.

hTNF muteiny podie tohoto vynálezu, produkované transformovanými hostitelskými bunkami, popsanými výše, se mohou izolovať z kultivačního média pred nebo po otevŕení bunék a/nebo extrakci jakoukoliv vhodnou metodou, která je známa v chémii proteínu a peptidu, jako je napríklad srážení síranem amonným, dialýza, ultrafiltrace, gelová filtrace nebo ionexová chromatografie, gelová elektroforéza, isoelektrická fokusace, afinitní chromatografie, jako je imunoafinitní chromatografie, HPLC apod. Jako konkrétni prednostní metódy je možno uvést srážení siranem amonným a/nebo polyethyleniminem, dialýzu, afinitní chromatografii, napríklad na fenylagarose, konkrétne fenyl-sepharose nebo ionexovou chromatografii, konkrétne na MONO-Q- a/nebo MONO-Smatrici (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Zvlášté vhodnými jsou metódy popsané v Tavernier a další, J. Mol. Biol. 211 , 493 až

501 (1990) a metódy popsané v príkladu V.

Pŕedmétem vynálezu je tedy také zpusob výroby hTNF muteinu, definovaných výše, který se vyznačuje tím, že se transformovaná hostiteľská bunka, posaná výše, kultivuje ve vhodném médiu a ze supernatantu kultury nebo samotné hostiteľské bunky se izoluje mutein, načež ;se tento mutein poprípade pŕevádí na farmaceutický vhodnou súl. Pŕedmétem vynálezu jsou také všechny sloučeniny vyrobené tímto zpusobem.

hTNF muteiny podie vynálezu jsou charakteristické tím, že vykazuj í selektívni vazebnou afinitu vúči humánnímu p55-TNF-R. Tuto vlastnosť lze stanoviť jakoukoliv zkušební metodou, známou v tomto oboru, která se hodí pro méŕení vazebných afinít. Tak napríklad, väzbu samotného TNF a muteinu podie tohoto vynálezu je možno méŕit za použití bunék v bunečné kultuŕe, které exprimuji oba typy TNF-receptoru v odlišném stupni, jako jsou napríklad bunky Hep-2, které výlučné exprimuji humánni p55-TNF-R a bunky U937 nebo HL60, které kromé toho exprimuji také humánni p75-TNF-R [víz Brockhaus a další, Procd. Nat. Acad. Sci. USA 87, 3127 až 3131 (1990); Hohmann a další, J. Biol. Chem. 264, 14927 až 14934, (1989); Loetscher a další (1990); Dembic a další (1990)]. Vazebné afinity je také možno stanovovať pŕímo za použití purifikovaného nativního nebo rekombinantního p55-TNF-R a p75-TNF-R, jak je to konkrétne popsáno v pŕíkladech nebo za použití odpovídajících rozpustných analogú techto receptoru.

Pod označením selektívni vazebná afinita pro receptor p55 humánního nekrotického nádorového faktoru se v kontextu predloženého vynálezu rozumí rozdíl ve vazebné afinité ke dvema typum receptoru TNF, který je vzhledem k použitému zjcušebnímu systému dostatečné signif ikantní, aby bylo možno konštatovať, že se mutein podie vynálezu selektivné váze k p55~TNF-receptorúm, podobné jako TNF divokého typu, pŕičemž však tento mutein v podstate ztratil schopnosť funkčné relevantní väzby k hp75-TNF-R. V kontextu zkušebního systému, kterého se používá v pŕíkladech, toto označení konkrétnej i znamená, že hodnota K_D špecifického hTNF muteinu podie vynálezu je lOx nebo víckrát (s výhodou alespoň asi lOOx) vyšší než hodnota K_D TNFa divokého typu, pri. stanovení zkouškou väzby in vitro s rekombinantním rozpustným hp75-TNF-R, zatímco jeho hodnota K_D, stanovená zkouškou väzby in vitro s rekombinantním rozpustným hp55-TNF-R se neliší o více než dvojnásobek, ve srovnání s TNFa divokého typu. Je samozrejmé, že uvádéné konkrétni hodnoty K_D mají sloužit pouze pro ilustrativní účely a v žádném rozsahu neomezují vynález.

hTNF muteiny podie tohoto vynálezu vykazuj í protinádorovou účinnost, kterou. lze prokázat metódami známými v tomto oboru.

hTNF muteiny je možno podávat samotné nebo v kombinaci s jednou nebo více prídavnými sloučeninami podie vynálezu ve forme farmaceutický vhodných orálních, injekčních nebo topických prípravku. Pri podávání se bude používať takových dávek, aby se u pacienta dosáhlo množství účinné sloučeniny, které je schopno účinné modifikovať biologickou funkci, kterou hTNF muteiny mají.

Ďalším pŕedmetem tohoto vynálezu jsou proto prípravky obsahující hTNF muteiny podie tohoto vynálezu ve spojení s kompatibilními farmaceutický vhodnými nosičovými látkami.

Múže se používať jakýchkoliv vhodných nosičových látek. Jako nosičove látky pŕicházejí v úvahu organické nebo anorganické látky, které se hodí pro enterální, perkutánní nebo parenterální podávání. Jako vhodné nosiče je možno uvést vedu, želatínu, arabskou gumu, laktózu, škrob, stearan horečnatý, mastek, rostlinné oleje, polyalkylenglykoly, vazelínu apod. Farmaceutické prípravky mohou kromé toho obsahovať také jiné farmaceutický účinné látky. V souladu s obvyklou praxi výroby farmaceutických pŕípravkú je také možno pridávať další prísady, jako jsou ochucovadla, konzervační látky, stabilizátory, emulgátory, pufry apod.

Farmaceutické prípravky je možno upravovať na jakékoliv obvyklé formy, včetné a) pevných forem pro orálni podávání, jako jsou tablety, kapsle, pilule, prášky, granule apod.; b) kapalných forem pro orálni podávání, jako jsou roztoky, sirupy, suspenze, elixíry apod.; c) pŕípravkú pro parenterální podávání, jako jsou sterilní roztoky, suspenze nebo emulze; a d) pŕípravkú pro topické podávání, jako jsou roztoky, suspenze, masti, krémy, gély, mikronizované prášky, aerosóly apod. Farmaceutické prípravky je možno sterilizovať a/nebo mohou obsahovať pomocné prísady, jako jsou konzervační látky, stabilizátory, smáčedla, emulgátory, soli pro zménu osmotického tlaku a/nebo pufry.

Z parenterálních dávkovacích forem pŕicházejí v úvahu infusní roztoky nebo injekční roztoky. Injekce je možno podávať intravenózné nebo intramuskulárné. Prípravky podie vynálezu mohou také obsahovať jiné terapeuticky účinné látky. V souladu s bežnou praxi farmaceutické výroby je také možno k nim pridávať konzervační látky, stabilizátory, emulgátory, pufry apod.

Proti hTNF muteinum podie vynálezu je konečné možno vypestovať protilátky. Téchto protilátek se muže používať dobre známým zpúsobem k diagnostickým nebo terapeutickým účelum, jakož i k purifikačním účelum. Protilátky je možno získať tak, že se savcúm nebo ptákúm injikuje dostatečné množství vakcinového prípravku obsahuj ícího hTNF mutein podie vynálezu a kompatibilní farmaceutický nosič,, aby se vyvolala produkce protilátek proti tomuto hTNF muteinu. Vhodné množství hTNF muteinu, kterého je v tomto pŕípadé zapotŕebí, je odborníkúm v tomto oboru známé, nebo je lze stanoviť rutinním experimentovaním. Pod označením farmaceutický nosič, jak se ho používá v kontextu tohoto vynálezu, se rozuméjí štandardní látky, které je možno podávať lidem nebo typické pomocné látky používané v očkovacích látkách pro zvíŕata.

TNF je silným pleiotropickým cytokinem. Jeho četné ruzné účinnosti, jako je napríklad účinnosť rustového faktoru na imúnni bunky, účinnosť mediátoru pri zánétech nebo účinnosť induktoru špecifických génu v endotheliu, je možno spatŕovat v kontextu obrany hostitele vuči infekci a poranéní. TNF také vykazuje vysokou systemickou toxicitu. Škodlivé účinky bakteriemie a septického šoku nebo bakteriálni meningitis jsou do značné míry mediovány endogenními cytokiny, mezi nimiž hraje TNF časnou a dúležitou úlohu. Kromé toho, mnohé bunky a bunečné linie jsou citlivé vuči pŕímé cytotoxické účinnosti TNF. V protinádorové účinnosti TNF, jak vyplývá ze štúdií na zvíŕatech, se pravdepodobné spojují ruzné systemické účinky s celulární toxicitou.

Tato fakta tvorí racionálni základ pro vývoj nových terapeutických stratégii za použití hTNF muteinu podie tohoto vynálezu. Pri téchto strategiích se zejména plné využívá možnosti rozdelení mnohá rúzných účinností hTNF na žádoucí a nežádoucí. Jednim pŕíkladem je použití hTNF muteinu podie tohoto vynálezu ve vysokých dávkach, jako protinádorových činidel, což je umožnéno sníženou systemickou toxicitou téchto látek. Tak lze obejít striktní omezení dávky hTNF divokého typu pri léčbé pacientu trpících rakovinou, které je vnuceno vysokou toxicitou hTNF. Potenciálni použití hTNF muteinu podie tohoto vynálezu se však neomezuje na léčbu oakoviny. Pri léčbé jakékoliv choroby, pri níž hraje TNF prospešnou úlohu jako obranný faktor hostitele proti bakteriálni infekci [viz napríklad Kindler V. a další Celí 56, 731 až 740 (1989); Nakano Y. a další J. Immunol. 144,

1935 (1990)] nebo jako mediátor pri zánétech, se múze dosáhnout užitku za použití léčiva, které je špecifické vuči . receptorum 55kDa TNF typu, jako jsou hTNF muteiny podie tohoto vynálezu. Bylo již také ukázáno, že TNF má svou úlohu pri kachexii [napríklad Beutler B. a Cerami, viz výše uvedená publikace] a TNF muteinu podie tohoto vynálezu, které máji nízkou systemickou toxicitu, by bylo možno používat pro antiobezitní terapii. I pri léčbé chorob, které jsou charakteristické toxickými účinnostmi nadmerného uvolňování TNF, které vedou k septickému šoku nebo bakteriálni meningitis, se muže dosáhnout užitku za použití 55kDa TNF receptor-specifických agonistú, jako jsou muteiny pole tohoto vynálezu, poprípade v kombinaci s antagonisty TNF.

Obšírny pŕehled nové se objevující role TNF, pri nových terapiích, pri nichž je možno očekávat že bude velmi výhodný špecifický charakter TNF agonistú p55-receptorového typu, které máji sníženou systemickou toxicitu a jsou schopný spustit pouze nékteré z mnohá rúzných účinností TNF, ve srovnání s TNF divokého typu, byl publikován v Tumor Necrosis Factors, The Molecules and their Emerging Role in Medicíne,

B. Beutler red. Raven Press, 1992, ISBN 0-88167-852-X. Tento pŕehled zahrnuje také využití účinnosti TNF pri modulaci endotheliálních bunéčnvch homostatických vlastností a neurofilní adhese, ischemii tkáni a poškození reperfusí, pri pusobení na osteoblasty a osteoklasty pri resorpci kostí, pri púsobení jako rustového faktoru, obecné na mnohé tkáné a pri hematopoiesi, jakož i pri púsobení na metabolismus a výživu. Indukce špecifických genú zajišíujících mechanismy bunečné ochrany, jako je indukce Mn₂O₇~dismutasy, o níž je známo, že je pod kontrolou p55-TNF-R [Lewis a další Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2830 (1991); Tartaglia a další Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 88, 9292 (1991)] nebo primá cytotoxicita TNF u nékterých bunék, to všechno poskytuje racionálni základ pro nové možnosti terapeutických stratégií za použití TNF agonistú které špecificky púsobí na určité receptory. Vlastnosti TNF, jakožto faktoru rústu/diferenciace pri vytváŕení lymfokinem aktivovaných zabiječských bunék (LAK) zrejmé pŕispívají k protinádorovým účinnostem TNF.

Duležitým aspektem je, že všechny tyto účinnosti je možno posílit nebo modulovat kombinací s j inými rekombinantními cytokiny, jako je napríklad interferon-gamma.

Vynález je podrobnéj i popsán v následujících príkladech provedení. Tyto príklady máji výhradné ilustrativní charakter a v žádném smeru neomezují rozsah vynálezu. V príkladech se používa odkazu na pripojené obrázky.

Jsou zavedený následující zkratky: Symboly B, E, H, S, Xb a X označuj í štépící místa pro reštrikční enzymy BglI, EcoRI, HindlII, Sali, Xbal a Xhol.

predstavuje regulovatelný prvek promotor/operátor N25OPSN25OP29, predstavuje syntetické ribosomální vazebné místo RBSII,SphI, predstavuje gény pro TNFa (TNFa), β-laktamasu (bla), chloramfenikol acetyltransferasu (cat), lac represor (lacl).a neomycin fosfotransferasu (neo), í predstavuje transkripčňí terminátory t_Q fágu lambda (t_Q ) a TI rrnB operenú E. coli (Tl), predstavuje replikační oblasti plasmidú pBR322 a pREP4 (repl.) predstavuje kódovací oblast pod kontrolou

N25OPSN25OP29 a RBSII,SphI.

Pŕehled obrázku na výkrese

Na obr. la je znázornená schematická kresba plasmidú pDS56/RBSII,Sphl-TNFa.

Na obr. lb je uvedená úplná nukleotidová sekvence plasmidú pDS56/RBSII,Sphl-TNFa. V táto sekvenci jsou označený sekvence rozpoznané restrikčními enzymy z obr. la. Znázornená aminokyselinová sekvence predstavuje ve tŕípísmenovém kódu sekvenci maturovaného THFa (157 aminokyselín).

Na obr. 2a je uvedená schematická kresba plasmidú pREP4.

Na obr. 2b je uvedená úplná nukleotidová sekvence plasmidú ’ pREP4. V této sekvenci jsou označený sekvence rozpoznané restrikčními enzymy z obr. 2a.

··

Na obr. 3 je znázornér.a príprava fragmentu EcoRI-HindlII, kódujícího TNFa muteiny Thr^o<5-TNFa.

Na obr. 4 je znázornená nukleotidová sekvence fragmentu 1 plasmidú pDS5ó/RBSII,Sphl-TNFa(Trp32) .

Na obr. 5 je znázornená nukleotidová sekvence fragmentu 1

SI plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Ser29).

Na obr. 6 je znázornéna nukleotidová sekvence fragmentu 1 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Ser29Trp32).

Na obr. 7 je znázornéna kompetitivní vazba humánního TNFa divokého typu a Thr⁸⁶, Trp³²-Thr⁸⁶a Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶ muteinú k rekombinantním humánním TNF receptorum p-75 a p-55.

Mikrotitrové plotny povlečené.rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-75TNF~R-IgGgamma3 (okénko A) a rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-55TNF-R-IgGgamma3 (okénko B) se inkubují s radioznačeným humánním TNFa za prítomnosti rúzných koncentrací TNFa divokého typu (plné kroužky), Thr⁸⁶ muteinu (prázdné kroužky), Trp³²-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné čtverečky) a Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné trojúhleníčky). Po 3 hodinách pri teplote místnosti se stanovuje vázaná rádioaktivita v počítači gamma rozpadu.

Na obr. 8 je znázornéna kompetitivní vazba humánního TNFa divokého typu a Ser²⁹-Thr⁸⁶, Glu³¹-Thr⁸⁶ a Asn³¹-Thr³²-Thr⁸⁶ muteinú k rekombinantním TNF receptorum p-75 a p-55.

Mikrotitrové plotny povlečené rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-75TMF-R-IgGgamma3 (okénko A) a rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-55TNF-R-IgGgamma3 (okénko B) se inkubují s radioznačeným humánním TNFa za prítomnosti rúzných koncentrací TNFa divokého typu (plné kroužky), Ser²⁹- Thr⁸⁶ muteinu (prázdné kroužky), Asn³³--Thr³²-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné čtverečky) a Glu³¹-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné trojúhleníčky). Po 3 hodinách pri teplote místnosti se stanovuje vázaná rádioaktivita v počítači gamma rozpadu.

Pokud není uvedeno j inak, rozumí se pod procentickými údaji u pevných látek v pevných smésích, údaje hmotnostní, u kapalných látek v kapalných smésích, údaje objemové a u pevných látek v kapalných smésích údaje typu hmotnost/objem, které lze vynásobením deseti prepočítať na údaje g/1.

Príklady provedení vynálezu

Príklad I

Výroba Thr⁸⁶-TNFa

Plasmid pDS56/RBSII,Sphl-TNFa

Humánni TNFa expresní plasmid pDS56/RBSII,Sphl-TNFa (viz obr. 1) je zdrojem TNFa génu pro prípravu runých TNFa muteinú podie tohoto vynálezu. Transformovaný kmeň E. coli M15 [pREP4;DS56/RBSII,Sphl-TNFa] byl v souladu s Budapešťskou dohodou o ukládání mikroorganismu pro patentové účely uložen ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH (DSM) v Branschweigu, SRN,. dne 8. záŕí 1991 pod pŕírustkovým čislem DSM 6713.

Mutagenese TNFa génu za použití PCR

Provedou se dve PCR reakce s plasmidem pDS56/RBSII, Sphl-TNFa (obr. 1), jako templátovou DNA za použití soupravy Perkin-Elmer Cetus GeneAmp^^ DNA Amplification Reagent Kit s AmpliTaq(^R) Recombinant Taq DNA Polymerase [viz obr. 3].

..4

- 26 Reakce se provádí s priméry 17/F (5’-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3' ; primer 17/F obsahuje nukleotidy 3949-3970 plasmidu pDS56/RBSII,SpHI-TNFa) a 29/M22 (5-GTAGGTGACGGCGATGCGGCTGATGGT-3' ; primer 29/M22 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementárni vuči nukleotidum 378-352 plasmidu pDS56/RBSII,Sphl-TNFa mutovaná báze je podtržena).

Reakce II se provádí s priméry 29/MR1 (5'-CAGACCAAGGTCAACCTCCTC-3'; primer 29/MR1 obsahuje nukleotidy 379-399 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNFa) a 17/0 (5'-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3 ¹ ; primer 17/0 obsahuje nukleotidy které jsou komplementárni vúči nukleotidum 748-727 plasmidu pDS56/RBSII,Sphl-TNFa) .

Pri typickém experimentu 10 μΐ templátu DNA (lOng), 5 μΐ jednoho a 5 μΐ druhého primerú (vždy 100 pmol), 16. μΐ dNTP smési (1,25 mM dATP, dGTP, dCTP a dTTP), 10 μΐ lOx reakčního pufru (100 mM Tris-Hcl o pH 3,3, 500 mM chloridu draselného, 15 mM chloridu hoŕečnatého a 0,1 % želatiny), 1 μΐ (5 jednotek), ÄmpliTaq(^R)DNA polymerasy a 53 μΐ vody smíchá v Eppendorfové trubici a prekryje 80 ml minerálního oleje (Perkin-Elmer Cetus). Trubice se pŕenesou do thermálního cyklovače pro DNA (TRIO-Thermoblock, Biometra), udržuj í 1 munutu pri 94 °C, potom se provede 35 cyklu tavení DNA (1 minutá pri 9'4 °C) , hybridizace primerú (1 minúta pri 50 °C) a prodlužováni primerú (3 minutý pri 72 °C). Po dalších dvou minutách pri 72 °C se reakční smési ochladí na teplotu místnosti a extrahuj í chloroformem. DNA, která je prítomna ve vodné fázi se srazí ethanolem a podrobí elektroforéze na 6% polyakrylamidovém gélu (Sambrook a další, 1989).. Po obarvení DNA ethidiumbromidem se z gélu izoluj í fragmenty I a II (víz obr. 3) a prečistí (Sambrook a další, 1989).

Výroba DNA fragmentu kódujícího Thr⁸⁶-TNF-a

Fragmenty I a XI se enzymaticky fosforylují a potom vzájemné ligují (Sambrook a další, 1989). Provede se tepelná inaktivace ligasy a štepení restrikčními enzymy EcoRi a HindlII a DNA se podrobí elektroforéze na 6% polyakrylamidovém gélu. DNA se obarví ethidiurabromidem a v gélu se izoluje EcoRI-HindlII fragment A (viz obr. 3), který se potom prečistí (viz výše).

Výroba plasmidu kóduj ícího Thr⁸⁶-TNF-a

EcoRI-HindlII fragment A se vsune standardními metódami [Sambrook a další 1989] do EcoRI-HindlII otevŕeného plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α za vzniku plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α(Thr86). Vyrobí se plasmidová DNA (Birnboim a další, 1979) a totžnost kódujicí oblasti pro TNF-α mutein se potvrdí sekvenováním dvouvláknové DNA (Sambrook a další, 1989).

Výroba Thr⁸⁶-TNF-a

Plasmid pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Thr86) se transformuje do bunék M15, které již obsahuj í plasmid pREP34, standardními metódami (viz výše). Transformované bunky se nechaj í rúst pri 37 °C v LB médiu (Sambrook a další, 1989), obsahujícím 100 mg/ml ampicilinu a 25 mg/1 kanamycinu. Pri dôsažení optické hustoty asi 0,7 až 1,0 (pri 600 nm) se pridá IPTG až do finálni koncentrace 2 mM. Po dalších 2,5 až 5 hodinách pri 37 °C se bunky sklidí odstŕedéním.

Príklad II

Výroba Glu³¹TNF-a a Asn³¹Thr³²-TNF-a

Princípy

TNF-α muteiny Glu³¹-TNF-a a Asn³¹Thr³²-TNF-a se vyrobí postupem, který podrobne popsán v príkladu I pro prípad

Q <

výroby Thr -TNF-α. Proto jsou v popisu výroby TNF-α muteinu uvedených výše, specifikovány pouze primery použité pri PCR reakci I a II. Kromé toho jjsou uvedený názvy expresních plasmidú kódujících ruzné TNF-α muteiny.

Výroba Glu³¹-TNF-a

PCR reakce se provádí s primery 17/F (5'-GGCGTATCACGAGCCCTTTCG-3 ' ; primér 17/F obsahuje nukleotidy 3949 plasmidú pDS56/RBSII,SphI-TNF-α) a 21/M5 (5-ATTGGCCCGCTCGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3 ' ; primér 21/M5 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementárni vuči nukleotidum 219-184 plasmidú pDS56/RBSII,SphI-TNF-α, mutované báze jsou podtrženy. PCR reakce II se provádí s primery 21/MR ( 5'-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3' ; primér 21/MR obsahuje nukleotidy 220-241 plasmidú pDS56/RBSII,SpHI-TNF-a) a 17/0 (5'-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3' ; primér 17/0 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementárni vuči nukleotidúm 748-727 plasmidú pDS56/RESII,SphI-TNF-α).

Výsledného expresního plasmidú pD556/RBSII,SphI-TNF-α(Glu31) se použije pro produkci Glu³¹-TNF-a a pri konstrukci plasmidú pDS56/RBSII,SphI-TMF-a(Glu31Thr86) (viz príklad IV)

Výroba Asn³¹Thr³²-TNF-a

PCR reakce se provádí s primery 17/F (5'-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3'; primer 17/F obsahuje nukleotidy 3949-3970 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α) a 21/M6 (5-ATTGGCAGTGTTGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3 ' ; primer 21/M6 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementárni vuči nukleotidúm 219-184 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α, mutované báze jsou podtrženy. PCR reakce se provádí s primery 21/MR (5'-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3'; primer 21/MR obsahuje nukleotidy 220-241 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α) a 17/0 (5’-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3' ; primer 17/0 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementárni vuči ukleotidúm 748-727 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α.

Výsledného expresního plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Asn31Thr32) se použije na produkci Asn³¹-Thr³²-TNF-a a pri konstrukci plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Asn31Thr32Thr86) (viz príklad IV)

Príklad III

Výroba Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a

Princípy

Pro výrobu Trp^{3 2}Thr^86-TNF-a. se zkonstruuje expresní plasmid pDS56/RBSII,SphI-TNF-α(Trp32Thr86), kterého se potom použije pro Trp³²-Thr⁸⁶-TNF-a v E. coli.

Konstrukce plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Trp32Thr86)

Všechny expresní plasmidy popsané v pŕíkladech I á II obsahuj í stejná dve místa pro reštrikční enzým BglI, jako plasmid pDS56/RBSII,SphI-TNF-α (viz obrázek 1). Jedno z téchto míst je umísténo v β-laktamázovém génu, zatímco druhé je umísténo v TNF-α génu. Toto druhé místo rozdéluje kóduj ící oblast pro TNF-α na dve části: jedna část kóduje aminokyseliny 1 až 36 TNF-α, zatímco druhá část kóduje aminokyseliny 37 až 157 TNF-α (viz obr. lb) .

Pri konstrukci plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Trp32Thr86) se standardními metódami (Sambrook a další, 1989) vyrobí fragmenty DNA 1 a 2. Fragment 1 (sekvence jsou uvedený na obr. 4) je malý BglI fragment plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α(Trp32) s regulovatelnou promotorovou a kóduj ιοί oblasti pro Trp'^-TNF-a až do aminokyseliny 36. Fragment 2 je velký BglI fragment plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Thr86) s kódující oblastí pro

Thr⁸⁶-TNF-a počínaje aminokyselinou 37 a replikační oblastí plasmidu. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (Sambrook a další, 1989), za vzniku plasmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-α (Trp3 2Thr8 6 ) .

M15 (pREP4 ;pDS56/RBSII, SphI-TNF-α (Trp32 ) bunky byly uložený v souladu s Budapeštskou dohodou o ukládání mikroorganismu pro účely patentového ŕízení ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) v Braunschweigu, SRN, 19. listopadu 1990 pod pŕírustkovým číslem DSM 6241.

Produkce Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a

Plasmid pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Trp32Thr86) se transformuje do bunék E. coli M15, které již obsahuj! plasmid pREP4, standardními metódami. Transformované bunky se nechaj í rúst pri 37 °C v LB médiu (Sambrook a dalši, 1989), obsahujícím 100 mg/ml ampicilinu a 25 mg/1 kanamycinu. Pri dosažení optické hustoty asi 0,7 až 1,0 (pri 600 nm) se pridá IPTG až do finálni koncentrace 2 mM. Po dalších 2,5 až 5 hodinách pri 37 °C se bunky sklidí odstŕedéním.

Príklad IV

Výroba Ser²⁹Thr⁸⁶-TNF-a, Ser²⁹Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a, Glu³¹Thr⁸⁶TNF-α a Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶-TNF-a

Princípy

TNF-α muteiny Ser²⁹Thr⁸⁶TNF-a, Ser²⁹Trp³²Thr^86-TNF-a, Glu³³-Thr⁸⁶-TNF--a a Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶-TNF-a se vyrobí zpusobem, který je podrobné popsán v príkladu III pro prípad výroby Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a. Proto jsou v popisu výroby TNF-α muteinu uvedených výše specifikovány pouze fragmenty DNA odpovídající fragmentu 1 z príkladu III. Dále jsou zde uvedený názvy expresních plasmidú kódujících ruzné TNF-α muteiny.

Výroba Ser²⁹Thr⁸⁶-TNF-a

Fragment 1 (sekvence jsou na obr. 5) je malý BglI fragment plasmidú pDS56/RBSII,SphI-TNF-α(Ser29) s regulovatelnou promotorovou a kódujíci oblasti pro Ser^-TNF-α· az do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (viz príklad 3) (Sambrook a další, 1989), za vzniku plasmidú pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Ser29Thr86), kterého se potom použije pro produkci Ser²⁹Thr⁸®-TNF-a v E. coli.

M15 (pREP4;pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(Ser29)) bunky byly uložený v souladu s Budapešŕskou dohodou o ukládání mikroorganismú pro účely patentového ŕízení ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) v Brauns'chweigu, SRN,19. listopadu 1990 pod prírustkovým číslem DSM 6240.

Výroba Ser²⁹Trp³²Thr⁸⁶-TNFa

Fragment 1 (sekvence jsou na obr. 6) je malý bgll fragment plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Ser29Trp32) s regulovatelnou promotorovou a kóduj lei oblasti pro Ser ^Trp ^-TNFa až do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (viz príklad III) (Sambrook a další, 1989), za vzniku plasmidu pDS56/RBSII,SphlTNFa(Ser29Trp32Thr86), kterého se potom použije pro produkci Ser²⁹Trp³² Thr⁸⁶-TNFa v E. coli.

Výroba Glu³¹Thr⁸⁶-TNFa

Fragment 1 je malý Bgll fragment plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Glu31) s regulovatelnou promotorovou a kódující oblastí pro Glu³¹-TNFa až do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (viz príklad III) (Sambrook a další, 1989), za vzniku plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNFa(Glu31Thr86), kterého se potom použije pro produkci Glu³¹Thr⁸⁶-TNFa v E. coli.

Výroba Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶~TNFa

Fragment 1 je malý Bgll fragment plasmidu pDS56/RBSII,Sphl-TNFa(Asn3lThr32) s regulovatelnou promotorovou a kódující oblastí pro Asn³¹Thr³²-TNFa až do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky def osforylovaným fragmentem 2 (Sambrook a další, 1989 ), za vzniku plasmidu pDS56/RBSII,Sphl-TNFa(Asn31Thr32Thr86), kterého se potom použije pro produkci Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶-TNFa v E. coli.

Príklad V

Purifikace humánních TNFa muteinu

Jeden litr noční kultury bunék E. coli, které byly transformovány a indukovaný výše popsaným zpúsobem se izoluje centrifugací a potom resuspenduje ve 20 ml 50mM Tris, ph 7,2, 200mM chloridu draselného, 50mM chloridu horečnatého a 5% glycerolu. Bunky se rozbíjí ve Francouzském lisu za tlaku 137,4 MPa. Po vyčeŕení centrifugací (70 000 x g, 30 min, 4 °C) se pridá pevný síran amonný, až do výsledné koncentrace 30 %. Roztok se 1 hodinu míchá pri teploté místnosti a potom se 20 minút odstŕeduje pri 10 000 x g a teploté 4 °c. Supernatant se prefiltruje pŕes filtr s póry 0,45 μτη a koncentrace síranu amonného v ném se upraví na 70 %.

Vysrážené proteiny se odstredí, rozpustí ve 20 ml 20mM Tris o pH 9,0 a roztok se dialýzuje proti stejnému pufru pŕes noc pri 4 °C. Vzorek dialýzovaného produktu'o objemu 1 ml se nanese na sloupec MonoQ (HR 5/5, LKB-Pharmacia), který je ekvilibrován ve 20mM Tris o pH 9,0. Eluce se provádí lineárním gradientem chloridu sodného (0 až 400mM ve 20mM Tris o pH 9,0) pri prutokové rýchlosti 0,5 ml/min. Zachycené frakce o objemu 0,5 ml se analyzují na prítomnosť TNFa muteinu elektroforézou na polyakrylamidovém gélu s dodecylsul fátem sodným (SDS-PAGE). Pozitívni frakce se spojí, dialýzují proti 20mM 2-morfolinethansulfonové kyseline (MES) o pH 6,0 a nanesou na sloupec MonoS (HR 5/5, LKB-Pharmacia) ekvilibrovaný ve 20mM MES o pH 6,0. Proteiny se eluují lineárním gradientem chloridu sodného (0 až 400mM ve 20mM MES o pH 6,0) pri prutokové rýchlosti 0,5 ml/min. V rozmezi od 250mM do 350mM roztoku chloridu sodného se eluují ruzné TNFa muteiny ve forme elektroforeticky čistých proteínu. Po dialýze proti roztoku chloridu sodného pufrovanému fosfátem (PBS) se stanoví koncentrace proteínu pomoci stanovení proteínu BCA (Pierce Chemical Company) za použití humánního TNFa divokého typu, jako štandardu.

Príklad 6

Kompetitivní vazba humánního TNFa a muteinu k rekombinantním humánním receptorum p75-TNF-R a p55-TNF-R

Pro zkoušku kompetitivní väzby se mikrotitrové plotny povlečou rekombinantními fúzovanými proteíny humánni p75-TNFR-humánní IgGgamma3 a humánni p55-TNF-R-humánní IgGgamma3, rozpušté- nými v PBS na koncentraci 0,3 μ9/ιη1 a 0,1 μg/ml (ΙΟΟμΙ/jamka, pŕes noc pri 4 °C) [Loetscher H. a další J. Biol. Chem. 266, 18324 až 18329 (1991); Lesslauer W. a další, Eur. J. Imrnunol. 21, 2883 až 2886 (1991)]. Po blokováni blokovacím pufrem (50mM Tris, pH 7,4; 140mM chlorid sodný; 5mM kyselina ethylendi- amintetraoctová, 0,02% azid sodný, 1% netučné sušené mléko) se mikrotitirové plotny opláchnou PBS a inkubují s 10 ng/ml humánního ¹²⁵I-TNFa, značeného

Iodogenovou metodou (Pierce Chemical Company), až do dosažení aktivity asi 30 μθί/μ9, za prítomnosti ruzných koncentraci muteinu. Objem činí 100 μΙ/jamka a každá koncentrace se zkouší 3 x. Po 3 hodinách pri teplote místnosti se jamky dúkladné' opláchnou PBS a stanoví se rádioaktivita v počítači gamma rozpadu.

Claims (11)

1. Muteiny humánního nekrotického faktoru a jejich farmaceutický vhodné soli, které vykazuj í selektívni vazebnou afinitu k humánnímu receptoru p55 nádorového nekrotického faktoru a jejichž aminokyselinová sekvence humánního t nádorového nekrotického faktoru je zménéna pŕinejmenším é* v poloze 86, kde je pŕítomen threoninový zbytek místo * serinového zbytku.

2. Muteiny podie nároku 1 a jejich farmaceutický vhodné soli, v nichž je sekvence aminokyselín zménéna v jedné nebo vice prídavných polohách, prednostné v jedné nebo dvou prídavných polohách.

3. Muteiny podie nároku 2 a jejich farmaceutický vhodné soli, v nichž je sekvence aminokyselín zménéna v polohách 29 a 86; 31 a 86; 32 a 86; 29; 32 a 86; a 31, 32 a 86.

4. Muteiny podie nároku 1 až 3 a jejich farmaceutický , O β vhodné soli, zvolene ze souboru zahrnujíciho THr -TNFa, Ser^2?'-Thr⁸⁶-TNFa, Glu³¹-Thr⁸⁶-TNFa, Trp³²-Thr⁸⁶- TNFa, Ser²⁹-Trp³²-Thr^8,5-TNFa nebo Asn³¹-Thr³²-Thr⁸⁽⁵-TNFa.

5. Sekvence DNA, která zahrnuje sekvenci DNA kódujíci e mutein podie nékterého z nároku 1 až 4. ^; •

S. Vektor, zejména pro expresi v prokaryotických nebo nižších eukaryotických hostitelských bunkách, obsahujicí sekvenci DNA podie nároku 5.

7. Hostitelská bunka, zejména prokaryotická nebo nižší eukaryotická hostitelská bunka, která je transformovaná vektorem podie nároku 6.

t

8. Hostitelská bunka podie nároku 7, kterou je E. Coli.

9. SlouČeniny podie nékteréhô z nárokú 1 až 4 pro léčbu chorob.

10. Zpúsob výroby sloučenin podie nékteréhô z nárokú 1 až _t 4, vyznačuj ící se tím, žese kultivuj í hosI titelské buňky podie nároku 7 nebo 8 ve vhodném médiu a ze * supernatantu kultúry nebo samotných hostitelských bunék se izoluj í muteiny a tyto muteiny se poprípade pŕevedou na své farmaceutický vhodné soli.

11. Farmaceutický pŕípravek, vyznačujúci se t í m, že obsahuje jednu nebo více sloučenin podie nékteréhô z nárokú 1 až 4, poprípade v kombinaci s prídavnými farmaceutický vhodnými látkami a/nebo netoxickými, inertními, terapeuticky vhodnými nosičovými látkami.

12. SlouČeniny podie nékteréhô z nárokú 1 až 4, vyrobitelné zpúsobem podie nároku 10.