SK286359B6

SK286359B6 - Delečné mutanty faktora X a ich analógy

Info

Publication number: SK286359B6
Application number: SK1171-99A
Authority: SK
Inventors: Michele Himmelspach; Uwe Schlokat; Friedrich Dorner; Andreas Fisch; Johann Eibl
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2008-08-05
Also published as: AT405516B; HU225246B1; PL335382A1; NO994139D0; HUP0100652A3; BR9807627A; US20030181381A1; CA2282707A1; EP0966536B1; ATE324454T1; CZ303299A3; DE59813518D1; NO327878B1; WO1998038317A1; AR012034A1; NO994139L; US6573071B1; HUP0100652A1; ES2263199T3; PL190734B1

Abstract

Sú opísané analógy faktora Xdelta s deléciou aminokyselín Arg180 až Arg234 a modifikáciou v oblastiaminokyselinovej sekvencie medzi Gly173 a Arg179,tiež sú opísané preparáty obsahujúce tieto analógy faktora Xdelta a spôsob ich prípravy.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka analógov faktora ΧΔ s jednou deléciou aminokyselín Arg 180 až Arg234 a s jednou modifikáciou v oblasti aminokyselinovej sekvencie medzi Gly 173 až Arg 179, preparátov obsahujúcich analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu alebo analógy faktora Xa a rovnako postupu prípravy analógov faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu.

Doterajší stav techniky

Po inicializácii procesu zrážania krvi prebieha zrážacia kaskáda postupnou aktiváciou rôznych proenzýmov (zymogénov), ktoré sú prítomné v krvi v aktívnej forme serínproteáz, K nim patrí okrem iného faktor XII/XIIa, faktor Xl/XIa, faktor IX/IXa, faktor X/Xa, faktor VlI/VIIa a protrombín/trombín. Väčšina týchto enzýmov je vo svojom fyziologickom stave aktívna iba vtedy, ak sú tieto enzýmy asociované v komplexe na membránovom povrchu. Mnohých týchto procesov sa zúčastňujú i Ca-ióny. Zrážanie krvi prebieha buď vnútornou dráhou, po ktorej sú všetky proteínové komponenty v krvi obsiahnuté, alebo vonkajšou dráhou, pri ktorej má rozhodujúcu úlohu tkanivový faktor. K uzatvoreniu rany nakoniec dôjde rozštiepením fibrinogénu na fibrín pôsobením trombínu.

Aktiváciu protrombínu na trombín spôsobuje protrombinázový komplex. Trombín je dôležitý enzým, ktorý môže pôsobiť ako prokoagulant i ako antikoagulant. Protrombinázový komplex, v ktorom sa uplatňujú okrem iného faktor Va (ako kofaktor) a faktor Xa (ako serínproteáza), spúšťa asociáciu, ktorá je závislá od prítomnosti Ca na povrchu fosfolipidov. Uvádza sa, že faktor Xa pritom pôsobí ako katalytický komponent protrombinázového komplexu.

Faktor X (Stuart - Prowerov faktor) je koagulačný glykoproteín závislý od vitamínu K, ktorý je možné aktivovať vnútornou alebo vonkajšou dráhou kaskády zrážania krvi. Primárny produkt translácie faktora X (pre-pro-FX) obsahuje 488 aminokyselín a je syntetizovaný v pečeni alebo ľudskými pečeňovými bunkami najprv ako 75 kD prekurzorový proteín s jedným reťazcom. V plazme sa faktor X vyskytuje prevažne vo forme molekuly s dvoma reťazcami (Fair a kol., 1984, Blood 64,194 - 204).

V priebehu biosyntézy dôjde po odštiepení pre-sekvencie pôsobením signálnej peptidázy (medzi Ser23/Leu24) a propeptidu (medzi Arg40/Ala41) pri molekule faktora X s jedným reťazcom po premene a odstránení tripeptidu Argl80 - Lysl81 - Argl82 kprechodu na formu s dvoma reťazcami, skladajúcej sa z cca 22 kD ľahkého reťazca a cca 50 kD ťažkého reťazca, ktoré sú navzájom spojené disulfidickým mostíkom a k rozštiepeniu tejto molekuly (obr. 1). Faktor X preto cirkuluje v plazme ako molekula s dvoma reťazcami.

Pri procese zrážania krvi sa faktor X konvertuje z inaktívneho zymogénu na aktívny proteázový faktor Xa pôsobením limitovanej proteolýzy, pričom aktivácia faktora X na faktor Xa môže prebiehať v jednom z dvoch komplexov viazaných na membránu: vo vonkajšom komplexe faktor Vlla/tkanivový faktor alebo vo vnútornom komplexe faktor VlIIa - faktor IXa - fosfolipid-Ca, tzv. „tenázovom komplexe,, (Mertens a kol., 1980, Biochem. J., 185, 647 - 658). Proteolytické štiepenie medzi aminokyselinami Arg234/Ile235 vedie k uvoľneniu aktivačného peptidu s dĺžkou 52 aminokyselín z Ν'-konca ťažkého reťazca, a tým k tvorbe aktívneho enzýmu, faktora Xa. Katalytické centrum faktora Xa je umiestnené v ťažkom reťazci.

Aktivácia prostredníctvom vonkajšieho komplexu faktor VIIa-TF vedie k tvorbe faktora Xaa (35 kD) a faktora Xafl (31 kD), pričom okrem nepatrných koncentrácií faktora Vila v komplexe sa vyskytuje i polypeptid 42 (kD). Pri tvorbe faktora Xaa dochádza k štiepeniu pri Arg234/IIe235 v ťažkom reťazci, čo znamená aktiváciu faktora X na faktor Xa. Výskyt faktora Xafl je zrejme spôsobený autokatalytickým štiepením pri Arg469/Gly470 na C-konci ťažkého reťazca faktora Xaa a odštiepením 4,5 kD-peptidu. Faktor Xafl má rovnako ako faktor Xaa katalytickú aktivitu. Preukázalo sa však, že štiepením faktora Xaa na faktor Xafl vzniká plazminogén - receptorové väzbové miesto a že faktor Xafl má pripadne i fibrinolytickú aktivitu, resp. že sa podieľa na fíbrinolýze ako kofaktor. Premena faktora Xaa na faktor Xaf> je však pomalší ako tvorba trombínu, čo bráni iniciácii fibrinolýzy pred vytvorením krvnej zrazeniny (Pryzdial a koľ, 1996, J. Biol. Chem., 271, 16614 - 16620, Pryzdial a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271, 16621 - 16626).

Pri premene na C-konci ťažkého reťazca medzi Arg469/Gly470 bez predchádzajúcej úpravy medzi Arg234/IIe235 vzniká 42 kD-polypeptid. Tento medziprodukt nemá žiadnu katalytickú aktivitu rovnako ako fragment faktora Xar, ktorý vzniká proteolýzou pri Lys370 (Mertens a kol., 1980, J. Biol. Chem., 185, 647 - 658, Pryzdial a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271, 16614 - 16620).

Aktivácia faktora X vnútornou dráhou je katalyzovaná komplexom faktor IXa - faktor VlIIa. Pri tejto aktivácii sa získajú rovnaké reakčné produkty, faktor Xap sa však získa vo vyššom množstve ako ostatné procesné produkty faktora X (Jesty a kol., 1974, J. Biol. Chem., 249 : 5614).

In vitro je možné faktor X aktivovať napríklad pôsobením Russelovho Viper Venomu (RVV) alebo pôsobením trypsínu (Bajaj a kol., 1973, J. Biol. Chem. 248, 7729 - 7741), alebo pomocou čistených fyziologic kých aktivátorov, ako sú komplex FVIIa/TF alebo komplex faktor IXa/faktor VHIa (Mertens a kol., 1980, J. Biol. Chem., 185, 647 - 658).

Komerčne dostupné produkty faktora X z plazmy obsahujú väčšinou zmes faktora Xaa a faktora XaP, pričom po aktivácii faktora X na faktor Xa vzniká predovšetkým faktor Xaa, ktorý sa pri autokatalytickom procese opäť štiepi na faktor Xap,

Aby bolo možné získať jednotný produkt faktora Xa s vyššou molekulárnou integritou, bola v patente EP 0 651 054 navrhnutá aktivácia faktora X pôsobením RVV po dlhší čas tak, aby vzniknutý konečný produkt obsahoval v podstate iba faktor Xap. Vedľajšie produkty, a to napr. faktor Xaa alebo proteáza boli nakoniec odstránené niekoľkonásobnou chromatografiou.

Bola vykonaná izolácia a charakterizácia cDNA faktora X (Leytus a kol., 1984, Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 82, 3699 - 3702, Fung a kol., 1985, Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 82, 3591 - 3595). Ľudský faktor X bol exprimovaný in vitro v rôznych typoch buniek, ako napr. v ľudských embryonálnych ľadvinových bunkách alebo v CHO-bunkách (Rudolph a koľ, 1997, Prot. Expr. Purif. 10, 373 - 378, Wolf a kol., 1991, J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730). Zistilo sa však, že pri rekombinantnej expresii ľudského faktora X bola úprava na pozícii Arg40/Ala41 na rozdiel od vykonania in vivo neúčinná a že vznikali rôzne N-konce na ľahkom reťazci faktora X (Wolf a kol., 1991, J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730). Rekombinovaný faktor X (rFX) bol pomocou RVV aktivovaný in vitro na rFaktor Xa (rFXa) alebo bol rFXa priamo exprimovaný, pričom bol aktivačný peptid deletovaný v oblasti aminokyseliny 183 až aminokyseliny 234 a nahradený tripeptidom, aby bolo možné vykonať premenu bezprostredne v rFXa-forme s dvojitým reťazcom. Vyčistený rFX bol premenený asi zo 70 % na ľahký a ťažký reťazec, zatiaľ čo zvyšných 30 % tvoril rFX s jedným reťazcom so 75 kD. Priama expresia rFXa síce viedla k tvorbe aktívneho faktora Xa, ale zároveň vznikali i inaktivne intermediáty. Wolf a kol. (1991, J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730) zistili okrem toho i zníženú aktivitu rekombinovaného faktora X, ktorá bola spôsobená horšou aktivovateľnosťou rFX pôsobením RVV a rovnako populáciou inaktívnych proteínov a polypeptidov z molekúl prekurzorov s jedným reťazcom. Títo autori zistili hlavne vysokú nestabilitu rFXa pri expresii rekombinovanými bunkami, čo vysvetľujú vysokou rýchlosťou autoproteolýzy.

Aby bolo možné sledovať funkciu C-terminálnych polypeptidov faktora Xaa, zaviedli Eby a kol. (1992, Blood 80 (Suppl. 1): 1214A) stop-kodón do sekvencie faktora X na pozícii Gly430. Nezistili však žiaden rozdiel medzi rýchlosťou aktivácie faktora Xa (FXaa) s β-peptidom alebo delečného mutantu bez β-peptidu (FXap).

Faktor Xa je dôležitá súčasť protrombinázového komplexu, a preto sa uvádza ako primárny mediátor rýchleho zastavenia krvácania, ktorý by bol vhodný na liečenie pacientov s poruchami zrážania krvi, ako napr. pri výskyte hemofílie.

Najmä liečenie hemofilikov s deficitom faktora VIII alebo faktora IX, vykonávané koncentrátmi faktorov vyrobených z plazmy, by mohlo byť pri dlhodobej terapii komplikované tvorbou inhibujúcich protilátok proti týmto ťaktorom. Preto bol na liečenie pacientov trpiacich na hemofíliu vyvinutý rad alternatív s použitím faktorov s bypassovou aktivitou. Navrhlo sa použitie koncentrátov protrombínového komplexu, čiastočne aktivovaného protrombinázového komplexu (APPC), faktora Vila alebo FEIBA. Komerčnými preparátmi s faktor VlII-bypassovou aktivitou (FEIBA) sú napríklad FEIBA alebo Autoplex. Preparát FEIBA obsahuje približne rovnaké jednotky faktora II, faktora VII, faktora IX, faktora X a FEIBA, nepatrné množstvá faktora VIII a faktora V a ďalej stopové množstvo aktivovaných koagulačných faktorov, ako sú trombín a faktor Xa, resp. faktor s aktivitou zodpovedajúcou faktoru X (Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Complex Concentrates, Ed. Maruiani, Ruso, Mandelli, str. 77 - 87). Elsinger poukazuje hlavne na význam aktivity FEIBA, ktorá je podobná aktivite faktora Xa. Bypassová aktivita faktora VIII bola preukázaná Gilesom a kol. (1988, British J. Haematology, 9, 491 - 497) pri kombinácii čisteného faktora Xa a fosfolipidov v modeli na zvieratách.

V rade aplikačných oblastí je preto veľmi potrebný faktor X/Xa alebo proteíny podobné faktoru X/Xa buď samotné, alebo ako súčasť koagulačných komplexov na zastavenie krvácania.

Doba polčasu účinnosti (Halbwertszeit) faktora Xa je v porovnaní so zymogénom tak v prostredí in vivo, ako i in vitro silne znížená. Tak napr. je možné faktor X v glycerole prechovávať počas 18 mesiacov v stabilnom stave, zatiaľ čo ťaktor Xa je za rovnakých podmienok stály iba 5 mesiacov (Bajaj a kol., 1973, J. Biol. Chem. 248, 7729 - 2241), resp. v glycerole pri 4 °C dôjde po 8 mesiacoch k zníženiu aktivity o viac ako 60 % (Teng a kol., 1981, Thrombosis Res., 22, 213 - 220). Doba polčasu účinnosti faktora Xa v sére je iba 30 sekúnd.

Vzhľadom na nestálosť ťaktora Xa bolo navrhnuté podávanie preparátov obsahujúcich faktor X (US 4,501,731). Pri krvácaniach ohrozujúcich život, hlavne u hemofilikov, je však podávanie faktora X neúčinné, pretože pri nedostatku účinného „tenázového komplexu,, pri vnútornom zrážaní krvi nedôjde k dostatočnej aktivácii faktora X na faktor Xa a aktivácia cez vonkajšiu dráhu prebieha často príliš pomaly, takže nemožno dosiahnuť rýchle pôsobenie. Okrem toho hemofilici majú dostatok faktora X, ten však má v porovnaní s faktorom Xa tisíckrát menšiu protrombinázovú aktivitu. V týchto prípadoch je žiaduce podávať aktivovaný faktor Xa priamo, prípadne v kombinácii s fosfolipidmi, ako uviedli Giles a kol. (1988, British J. Haematology, 9, 491 - 497) alebo s inými koagulačnými činidlami, prípadne s Činidlami s faktor VIIIbypassovou aktivitou.

Pri príprave faktora Xa z faktora X sa aktivácia doteraz vykonáva prevažne nefyziologickými aktivátormi živočíšneho pôvodu, ako sú RVV alebo trypsín, pričom však musí byť absolútne zaistené, aby konečný produkt neobsahoval žiadnu z týchto proteáz. Ako bolo už uvedené, vzniká pri aktivácii faktora X na faktor Xa rad intermediátov, z ktorých niektoré sú inaktívne (Bajaj a kol., 1973, J. Biol. Chem., 248, 7729 - 7741, Mertens a kol., 1980, J. Biol. Chem., 185, 647 - 658). Prítomnosť týchto intermediátov spôsobuje zníženie špecifickej aktivity tohto produktu, niektoré intermediáty môžu dokonca na aktívne serínproteázy pôsobiť antagonistický. Príprava jednotného čistého produktu s vysokou špecifickou aktivitou preto pri použití bežných metód vyžaduje nákladné postupy aktivácíe a zdĺhavé chromatografické čistenie.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu je preto získanie takého preparátu, ktorý by obsahoval polypeptid s aktivitou faktora X/Xa, ktorý by mal vysokú stabilitu a pri ktorého získavaní by sa pri aktivácii na faktor Xa nemuseli používať bežné proteázy, najmä živočíšneho pôvodu, ako sú napr. RVV alebo trypsín. Ďalším predmetom je príprava farmaceutického preparátu s faktor VlII-bypassovou aktivitou.

Táto úloha bola podľa predloženého vynálezu vyriešená tak, že sa získal analóg faktora X s deléciou aminokyselín Arg 180 až Arg234 z aminokyselinovej sekvencie faktora X a ďalej bola vykonaná modifikácia tohto delečného mutantu faktora X v oblasti aminokyselinovej sekvencie medzi Gly 173 a Arg 179. Deléciou aminokyselinovej sekvencie Argl82 až Arg234 bol deletovaný tak tripeptid Argl80 až Argl82, ako i aktivačný peptid Serl 83 až Arg234, a došlo tak k priamemu spojeniu medzi ľahkým a ťažkým reťazcom faktora X a aminokyselinami Argl79 a Ile235. Takto získaná sekvencia však neobsahuje žiadne miesto prirodzeného štiepenia pre proteázy. Modifikáciou v oblasti aminokyselinovej sekvencie faktora X medzi aminokyselinami Gly 173 a Argl79 a prípadne Ue235 sa získa delečný mutant faktora X podľa vynálezu, ktorý obsahuje nové rozpoznávacie, resp. reakčné miesto (Prozessierungsstelle), ktoré sa doteraz v tejto pozícii na polypeptide nevyskytovalo, kvôli pôsobeniu proteázy, ktorá v tomto mieste polypeptid bežne neštiepi. Táto modifikácia zahŕňa pritom aspoň výmenu minimálne jednej aminokyseliny medzi pozíciami Glyl73 a Argl79 a prípadne Ue235 v aminokyselinovej sekvencii faktora X. Pozícia jednotlivých aminokyselín sa pritom vzťahuje na číslovanie podľa sekvencie uvedenej na obr. 1, ktorá začína Metl a končí Lys488. Pri modifikovanom delečnom mutante faktora X podľa tohto vynálezu sa kvôli zjednodušeniu nomenklatúry nechalo číslovanie aminokyselín kompletnej sekvencie faktora X, ďalej však je tento modifikovaný delečný mutant faktora X označovaný ako analóg faktora ΧΔ.

Táto modifikácia spočíva v substitúcii aspoň jednej aminokyseliny alebo v jednej inzercii peptidovej sekvencie obsahujúcej špecifické rozpoznávacie miesto pre proteázy (Proteaseerkennungsstelle), resp. špecifické miesto štiepenia. Táto modifikácia v analógu faktora ΧΔ je pritom prednostne taká, že rozpoznávacie miesto pre proteázy, resp. miesto štiepenia predstavuje proteáza zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 (ako uvádzajú Barr a kol., 1991, Celí, 66, 1 - 3 alebo v US patente US 5,460,950), zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ila, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X alebo kalikreín, alebo deriváty uvedených proteáz.

Táto modifikácia sa volí prednostne tak, aby pôsobením jednej z týchto proteáz sa získal polypeptid, ktorého biologická aktivita zodpovedá natívnemu faktoru Xa a ktorého aktivita je rovnaká ako aktivita faktora Xa. Kvôli dosiahnutiu optimálnej úpravy môže byť v niektorých prípadoch nevyhnutné vymeniť navyše aminokyselinu Ile235. NH₂-terminálna aminokyselina izoleucín na ťažkom reťazci by mala však byť pokiaľ možno po aktivácii zachovaná, pretože izoleucín je zástupca aminokyselín, ktoré majú pri tvorbe miest na viazanie substrátu (Substratbindungstasche) dôležitú funkciu (Watzke a kol., 1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, ed. Katherina High and Harold Roberts). Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu majú v porovnaní s natívnou sekvenciou faktora X určitý štrukturálny rozdiel hlavne v zložení aminokyselín, po aktivácii však majú aktivitu porovnateľnú s aktivitou prírodného faktora X, resp. faktor Xa.

V tomto vynáleze sú uvedené príklady radu analógov faktora ΧΔ, pri ktorých sa vykonala delécia a okrem toho modifikácia medzi Glyl73 a Argl79, pripadne Ile235. Tieto modifikácie môžu byť vykonané na jednom alebo niekoľkých miestach v oblasti medzi aminokyselinami Gly 173 a Argl79, prípadne Ile235, vztiahnuté na sekvenciu faktora X s číslovaním Metl až Lys488 podľa obr. 1. Substitúcie aminokyselín môžu byť vykonané v mieste Ile235 (Rl), Argl79, Glul78 (R2), Leul77 (R3), Thrl76 (R4), Glnl75 (R5) a Lysl74 (R6), pričom však prednostne zostáva Argl 79 nezmenený.

Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu obsahujú prednostne sekvenciu faktora X

Glyl73 - R6 - R5 - R4 - R3 - R2 - Argl79 - Rl, kde Rl = Ilc, Val, Ala, Ser alebo Thr, R2 = Glu, Thr, Pro, Gly, Lys alebo Arg; R3 = Leu, Phe, Lys, Met, Gin, Ser, Val, Arg alebo Pro; R4 = Thr, Asn, Asp, íle, Ser,

Pro, Arg alebo Lys; R5 = Asn, Lys, Ser, Glu, Gin, Ala, His alebo Arg a R6 = Arg, Asp, Phe, Thr, Leu alebo Ser.

Výhodné formy vyhotovenia analógov faktora X podľa tohto vynálezu sú analógy faktora X s modifikáciou

a) R1 = íle, R2 = Thr, R3 = Leu, R4 = Asn a prípadne R5 = Asn a/alebo R6 = Asp, a upravené (prozessiert) faktorom Vila alebo faktorom IXa;

b) R1 = Val, R2 = Thr, R3 = Phe, R4 = Asp a prípadne R5 = Asn a/alebo R6 = Phe, a/alebo R1 = íle, alebo Val (obr. 2A) a upravené faktorom Xla;

c) R1 = íle alebo Val, R2 = Phe, R3 = Lys, R4 = íle a prípadne R5 = Lys a/alebo R6 = Thr (obr. 2C), alebo R1 = íle, R2 = Thr, R3 = Ser, R4 = Thr a prípadne R5 = Lys a/alebo R6 = Thr (obr. 21) a upravené faktorom Xlla;

d) R1 = íle alebo Val, R2 = Thr, R3 = Met, R4 = Ser a prípadne R5 = Ser a/alebo R6 = Leu (obr. 2D) a upravené kalikreínom;

e) R1 = íle, R2 = Gly, R3 = Gin, R4 = Pro a prípadne R5 = Lys a/alebo R6 = Ser (obr. 2H), alebo R1 = íle, R2 = Gly, R3 = Glu, R4 = íle (obr. 2F) alebo R1 = íle, R2 = Thr, R3 = Lys, R4 = Met (obr. 2E) a upravené faktorom Xa;

f) R1 = íle, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Arg a prípadne R5 = Glu a/alebo R6 = Leu, alebo R1 = íle, R2 = Thr, R3 = Val, R4 = Arg a prípadne R5 = Ala a/alebo R6 = Leu, alebo R1 = íle, R2 = Arg, R3 = Val, R4 = Arg a prípadne R5 = Gin a/alebo R6 = Leu, alebo R1 = íle, R2 = Arg, R3 = Arg, R4 = Arg a prípadne R5 = His a/alebo R6 = Leu, alebo R1 = íle, R2 = Lys, R3 = Pro, R4 = Arg a prípadne R5 = Asn a/alebo R6 = Leu, alebo R1 = íle, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = íle a prípadne R5 = Arg a/alebo R6 = Leu, alebo R1 = íle, R2 = Lys, R3 = Ser a R4 = Arg alebo R1 = íle, R2 = Thr, R3 = Val a R4 = Arg alebo R1 = íle, R2 = Lys, R3 = Leu a R4 = Arg (pozri obr. 2G), pričom sekvencie uvedené pod f) sú upravované bibázickými endoproteázami, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 alebo derivátom týchto proteáz.

Možný výber modifikácií a zložiek zamieňajúcich aminokyseliny (Aminosäure-austauscher), ktoré vedú k zmenenej proteázovej špecifite, je uvedený na obr. 2.

Tieto modifikácie môžu byť vykonávané napríklad riadenou mutagenézou in vitro alebo PCR, alebo inými génovo-technickými metódami podľa súčasného stavu techniky, ktoré sú vhodné na vykonávanie špecifických zmien DNA - sekvencie kvôli dosiahnutiu požadovanej výmeny aminokyselín.

Aktivácia analógov faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu na analógy faktora Xa sa vykonáva podľa tohto vynálezu výhodne proteázou zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X alebo kalikreín, alebo deriváty týchto proteáz.

Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu sú polypeptidy s jednoduchým reťazcom v enzymaticky inaktívnej forme. Aktívne analógy faktora ΧΔ sa získajú až po rozštiepení proteázou na formu s dvoma reťazcami. Táto modifikácia teda umožňuje aktiváciu inaktívneho polypeptidického analógu faktora ΧΔ na aktívnu formu s dvoma reťazcami.

Jedným z problémov pri príprave aktívneho faktora Xa je nestabilita tohto faktora, pretože pri autokatalýze vznikajú okrem faktora Xaa a faktora XaP i iné neaktívne intermediáty.

Na prípravu v podstate intaktných molekúl aktívneho faktora X/Xa, resp. molekúl podobných aktívnemu faktoru X/Xa je preto žiaduce získavať iba také proteíny, ktoré by viedli k stabilným konečným produktom.

Je známe, že preferované miesto štiepenia na premenu faktora Xaa (FXaa) na faktor Xap (FXap) je medzi Arg469/Gly470. Ako uvádzajú Eby a kol. (1992, Blood, Vol. 80, Suppl. 1, 1214) bol okrem prominentného karboxyterminálneho peptidu (aminokyselinové zvyšky 476 - 487) faktora X nájdený i ďalší kratší peptid (aminokyselinové zvyšky 464 až 477), ktorý vzniká autokatalýzou z faktora Xaa. Aby bolo možné vykonať požadovanú úpravu intaktného faktora X na v podstate aktívny faktor Xa bez vzniku inaktívnych intermediátov pri tejto úprave, majú analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu prípadné ďalšie modifikácie.

Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu sa vyznačujú tým, že majú vo zvláštnej forme svojho vyhotovenia i ďalšiu modifikáciu v C-koncovej časti aminokyselinovej sekvencie faktora X.

Jedna z foriem vyhotovenia sa vyznačuje tým, že analóg faktora ΧΔ opísaného druhu je intaktný β-peptid (FXAa). Analógy faktora XA podľa tohto vynálezu majú pritom vykonanú modifikáciu hlavne v oblasti C-koncového β-peptidického miesta štiepenia (β-peptidspaltstelle), ktorá bráni tomu, aby po aktivácii faktora ΧΔ na analóg faktora Xa došlo k odštiepeniu β-peptidu z faktora X. Tak sa získal faktor Xa, ktorý je možné izolovať až zo 100 % vo forme intaktnej molekuly faktora Xaa.

Túto modifikáciu je možné vykonať mutáciou, deléciou alebo inzerciou v oblasti aminokyselinovej sekvencie faktora X medzi aminokyselinami v mieste Arg469 a Ser476 a prípadne Lys370. Preferovaná je však taká substitúcia aminokyselín, ktorá zabráni tomu, aby pri výmene aminokyselín nedošlo k zmene priestoro vého usporiadania polypeptidu, čo by mohlo ďalej viesť k zmene štruktúry a pripadne i funkcie a aktivity daného proteínu.

Jeden spôsob vyhotovenia sa vyznačuje tým, že pri analógoch faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu je vykonaná zámena jednej aminokyseliny na mieste Arg469 a/alebo Gly470, pričom Arg469 sa prednostne zamieňa Lys, His alebo íle a Gly470 sa prednostne zamieňa Ser, Ala, Val alebo Thr.

Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu môžu obsahovať okrem mutácie na pozícii Arg469 a/alebo Gly470 ďalšiu mutáciu na pozícii Lys370 a/alebo Lys475, a/alebo Ser476. Substitúciou aminokyselín na tejto (týchto) pozícii (pozíciách) sa zabráni premene analógov faktora Xaa na analógy faktora Xa0, resp. na koncové analógy faktora Xa, pretože prirodzene sa vyskytujúce sekvencie premeny (premien) sú modifikované tak, že nemôže dôjsť k prípadnému autokatalytickému odštiepeniu karboxyterminálneho peptidu.

Iný spôsob vyhotovenia sa vyznačuje tým, že je pri analógoch faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu vykonaná delécia karboxyterminálneho β-peptidu (ΓΧΔβ). Takýto analóg faktora X je možné pripraviť tak, že cDNA na kódovanie analógu faktora ΧΔ sa exprimuje v rekombinantnom expresnom systéme, pričom sa klonujú iba tie sekvencie, ktoré sú kódované pre aminokyseliny Metl až Arg 179/Ile235, až Arg469.

Ďalší spôsob vyhotovenia sa vyznačuje tým, že analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu obsahujú translačný stop-signál v C-terminálnej časti sekvencie faktora X. Tento translačný stop-signál je pritom prednostne na pozícii, ktorá nasleduje za C-terminálnou aminokyselinou vznikajúcou pri prirodzenom reakčnom priebehu. Tento translačný stop-signál je preto prednostne na pozícii aminokyseliny 470 v sekvencií faktora X, pričom koncový Arg469 vo faktore ΧΔβ zostáva zachovaný. Pritom kódujúci kodón GGC pre aminokyselinu Gly470 nahradzuje TAA, TAG alebo TGA.

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka analógov faktora ΧΔ, ktoré sa aktivujú pôsobením príslušnej proteázy in vitro na analógy faktora Xa, t. j. na aktivované analógy faktora ΧΔ. V závislosti od použitého a aktivovaného analógu faktora ΧΔ sa získa analóg faktora XaA, ktorý má na C-konci ľahkého reťazca vykonanú zodpovedajúcu modifikáciu aminokyselín, ktorá sa odlišuje od prirodzeného faktora Xa. Tieto modifikácie sú však podľa tohto vynálezu zvolené tak, aby neovplyvňovali biologickú aktivitu.

Ak takýto analóg faktora X zahŕňa prípadne ešte translačný stop-signál v C-koncovej časti β-peptidu, získajú sa modifikované molekuly faktora Xa|3. Ak sa však použije analóg faktora X, táto modifikácia (tieto modifikácie) β-peptidickej sekvencie vedie (vedú) k tomu, že sa β-peptid neodštiepi, takže analóg faktora Xaa s vykonanou zámenou aminokyselín na C-konci molekuly zostane zachovaný.

Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu sa vyznačujú výhradne takými modifikáciami, ktoré menia špecificitu pri aktivácii; ale aktivitu významne neovplyvňujú. To znamená, že sa získavajú vždy biologicky i funkčne aktívne molekuly faktora Xa, resp. analógov faktora Xa.

Na aktiváciu in vitro je možné voliť proteázu zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X alebo kalikreín, alebo derivát týchto proteáz. V rámci tohto vynálezu je možné použiť akúkoľvek proteázu s výnimkou RVV alebo trypsínu, ktorá je vhodná na premenu analógov faktora ΧΔ na analógy faktora Xa.

Wolf a kol. (1991, J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730) síce uvádzajú, že endopeptidáza ako je Kex2, furín alebo PACE sa môže podieľať na tvorbe delečných mutantov faktora Xa, v žiadnom prípade však títo autori neuvádzajú údaje o vplyve týchto proteáz pri príprave faktora X. V patente US 5,669,950 je opísaná rekombinantná príprava PACE a použitie proteázy pri zlepšenej tvorbe proteínov závislých od vitamínu K. V rade výpočtov iných krvných faktorov je uvedený i faktor X, pri tomto údaji však chýbajú overujúce dáta.

V rámci tohto vynálezu bolo prvýkrát jednoznačne preukázané, že jednou z proteáz nevyhnutných pre proces zrenia faktora X je bibázická endoproteáza, hlavne endogénne sa vyskytujúci furín. V prostredí in vivo zaisťuje táto endoproteáza predovšetkým štiepenie molekuly faktora X s jedným reťazcom na zrelú formu skladajúcu sa z ťažkého a ľahkého reťazca. V prostredí in vitro zaisťuje táto endoproteáza okrem toho i odštiepenie pro-peptidovej sekvencie faktora X (príklad 2).

Podľa jedného zvláštneho spôsobu vyhotovenia sa pripraví analóg faktora ΧΔ, ktorý existuje prednostne v čistenom stave vo forme molekuly s jedným reťazcom. Analógy faktora ΧΔ, ktoré v modifikovanej oblasti obsahujú štiepne miesto pre proteázy, ktoré sa v rekombinantných bunkách nevyskytuje, sa po expresii získajú vo forme molekúl s jedným reťazcom. Molekuly faktora ΧΔ s jedným reťazcom sa vyznačujú hlavne vysokou stabilitou a integritou molekúl. Doteraz nebolo možné izolovať inaktívne molekuly faktora ΧΔ s jedným reťazcom v čistej forme, pretože v rekombinantných bunkách sa vo faktore Xa vytváral rad ďalších i inaktívnych intermediátov (Wolf a kol., 1991, J· Biol. Chem., 266, 13726 - 13730). Izolovaný analóg faktora ΧΔ s jedným reťazcom je možné špecifickým postupom aktivovať priamo na formu analógu faktora Xa s dvoma reťazcami. Táto aktivácia prebieha tak, že dôjde k styku jednoreťazcovej molekuly faktora ΧΔ so štiepnou proteázou, ktorá sa nachádza v aktivovanom mieste analógu faktora ΧΔ. Ak dôjde k expresii jedného analógu faktora ΧΔ s jedným furínovým aktivačným miestom v jednej fiirín-deficitnej bunke, je možné izolovať analóg faktora ΧΔ v jednoreťazcovej forme a stykom sbibázickou proteázou, ako je furín PACE alebo Kex2, je možné tento analóg previesť na aktívny analóg faktora ΧΔ a s dvoma reťazcami. Analógy faktora ΧΔ s jedným reakčným miestom pre jednu serínproteázu alebo kalikreín je možné izolovať i vo furín-exprimujúcich bunkách vo forme jednoreťazcových molekúl, ktoré je možné pomocou serínproteázy previesť na aktívny analóg faktora Xa.

Takto získaný analóg faktora Xa má vďaka selektívnej a riadenej príprave vysokú stabilitu a štruktúrnu integritu. Obzvlášť dôležité je, že neobsahuje inaktívne intermediáty analógov faktora X/Xa a produkty autoproteolytického odbúravania.

Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu je možné podľa predloženého vynálezu získať tak vo forme faktora ΧΔ a s intaktným β-peptidom, ako i vo forme analógov faktora ΧΔ s deléciou tohto β-peptidu.

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka rekombinantnej DNA kódovanej pre analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu. Rekombinantná DNA sa získa po expresii v analógu faktora ΧΔ s aminokyselinovou sekvenciou zodpovedajúcou ľudskému faktoru X, až na jednu deléciu aminokyselín od Argl80 až Arg234 a jednu modifikáciu, ktorá umožňuje premenu a aktiváciu na aktívnu formu analógu faktora Xa tak s intaktným, ako i s deletovaným β-peptidom.

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka preparátu zahŕňajúceho čistený analóg faktora ΧΔ s jednou deléciou aminokyselín od Argl80 do Arg234 a s jednou modifikáciou aminokyselín v oblasti medzi Glyl73 a Argl79 a prípadne Ue235. Touto modifikáciou sa získa nové rozpoznávacie, resp. štiepne miesto, ktoré sa na tejto pozícii polypeptidu v prírode nevyskytuje, pre proteázu, ktorá polypeptid v tomto mieste bežne nepremieňa. Tento preparát môže pritom byť čistený preparát obsahujúci jednoreťazcový analóg faktora ΧΔ, pričom polypeptidy sa získajú buď z kultivovaného bunkového systému po izolácii zo supematantu bunkovej kultúry, alebo z extraktu bunkovej kultúry. Predčistený rekombinovaný analóg faktora ΧΔ získaný z kultivovaného bunkového systému je možné ďalej čistiť známymi postupmi zodpovedajúcimi súčasnému stavu techniky. Na to sú vhodné hlavne chromatografické metódy, ako je gélová filtrácia, chromatografia na iónomeničoch alebo afinitná chromatografia.

Podľa jedného vyhotovenia obsahuje získaný preparát analóg faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu vo forme molekuly s jedným reťazcom v enzymaticky inaktivnej forme, pričom tento analóg faktora ΧΔ má čistotu minimálne 80 %, výhodne minimálne 90 %, obzvlášť preferovaná je čistota 95 % a tento vyčistený preparát neobsahuje žiadne inaktívne proteolytické intermediáty vzniknuté z analógu faktora X/Xa.

Podľa zvláštneho aspektu obsahuje tento preparát jednoreťazcový analóg faktora ΧΔ s modifikáciou, ktorá umožňuje aktiváciu na analógy faktora Xa pôsobením proteázy zo skupiny bibázických endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X alebo kalikreín, alebo derivát týchto proteáz. Aktivácia prebieha pritom pri kontakte analógu faktora ΧΔ so zodpovedajúcou proteázou, ktorá štiepi modifikovanú sekvenciu, pričom sa získa analóg faktora Xa.

V preparáte podľa tohto vynálezu sa môže analóg faktora ΧΔ vyskytovať ako faktor ΧΔα (FXAa) s intaktným β-peptidom alebo s deléciou β-peptidu ako faktor ΧΔβ alebo s inou C-terminálnou deléciou.

Podľa ďalšieho spôsobu vyhotovenia obsahujú preparáty analógov faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu prednostne jednoreťazcové molekuly v izolovanej forme. Pritom sa získavajú napríklad rekombinantné molekuly analógov faktora ΧΔ s jedným reťazcom s modifikáciou, ktorá umožňuje vykonať aktiváciu na analógy faktora Xa. Túto aktiváciu analógov faktora ΧΔ na analógy faktora Xa je možné vykonať stykom analógu faktora X s proteázou vybranou zo skupiny bibázických endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4. PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ila, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa alebo kalikreín, alebo derivát týchto proteáz. Tieto proteázy môžu byť pritom imobilizované na nosiči.

Preparáty podľa tohto vynálezu sa môžu použiť ako východiskový materiál na prípravu a získavanie analógov faktora Xa. Vo veľkom technologickom meradle sa pritom uvedie do styku preparát obsahujúci jednoreťazcový analóg faktora ΧΔ s prípadne imobilizovanou proteázou za podmienok umožňujúcich optimálnu aktiváciu analógov faktora ΧΔ na analógy faktora Xa, takže sa získajú analógy faktora Xa. Takto získané analógy faktora Xa je možné nakoniec vyčistiť pomocou všeobecne známych metód a získať tak farmaceutický preparát s definovanou aktivitou faktora Xa.

Podľa ďalšieho aspektu tohto vynálezu sa pripraví preparát obsahujúci analóg faktora Xa s vysokou stabilitou a štrukturálnou integritou, ktorý neobsahuje inaktívne intermediáty analógov faktora X/Xa, ani autoproteolytické produkty odbúravania, a ktorý sa získa v takej forme, že umožňuje vykonať aktiváciu na už skôr opísaný analóg faktora ΧΔ a pripraviť tak zodpovedajúci preparát.

Podľa zvláštneho vyhotovenia zahŕňa tento preparát analógy faktora ΧΔ s jedným alebo dvoma reťazcami a fyziologicky prijateľný nosič a je možné z neho prípadne pripraviť farmaceutický preparát. Túto pripravuje možné vykonať bežným spôsobom zmiešaním s prídavkom pufra obsahujúceho soli, ako sú NaCl, CaCl₂a aminokyseliny, ako je glycín a/alebo lyzín pri pH v rozmedzí 6 až 8 a získať tak farmaceutický preparát. Vyčistené preparáty obsahujúce analóg faktora X je možné pripravovať ako hotové roztoky, lyofilizáty alebo hlboko zmrazené produkty skladovateľné až do času ich konečného použitia. Skladovanie týchto preparátov sa prednostne vykonáva vo forme lyofilizátu a ich prevedenie na optický číry roztok sa vykonáva pomocou zodpovedajúceho rekonštitučného roztoku.

Preparáty podľa tohto vynálezu je možné pripraviť i v kvapalnej forme alebo vo forme hlboko zmrazenej kvapaliny.

Preparáty podľa tohto vynálezu sú obzvlášť stabilné, to znamená, že je možné ich nechať stáť v rozpustenej forme i po dlhší čas pred ich použitím. Preukázalo sa, že pri preparátoch podľa tohto vynálezu nedošlo k úbytku aktivity ani po niekoľkých hodinách až dňoch.

Preparáty podľa tohto vynálezu je možné získať vo vhodnom zariadení, prednostne v aplikátore s použitím proteázy vybranej zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa alebo kalikreín, alebo deriváty týchto proteáz.

Preparát podľa tohto vynálezu, obsahujúci analóg faktora ΧΔ v kombinácii s proteázou schopnou aktivovať analóg faktora ΧΔ na analóg faktora Xa, je možné pripraviť ako kombinovaný produkt skladajúci sa z nádobky obsahujúcej proteázu imobilizovanú na nosiči, prípadne vo forme minikolónky alebo injekčnej striekačky s imobilizovanou proteázou a z nádobky obsahujúcej farmaceutický preparát s analógom faktora ΧΔ. Aktivácia analógu faktora ΧΔ sa vykoná tak, že sa napr. roztok s analógom faktora XA pretlačí cez imobilizovanú proteázu. Roztok obsahujúci analóg faktora ΧΔ sa prednostne počas skladovania preparátu ukladá oddelene od imobilizovanej proteázy. Preparát podľa tohto vynálezu môže byť uložený i v rovnakej nádobke ako proteáza, aleje potrebné, aby obidve zložky boli oddelené nepriepustnou membránou, ktorú je možné pri prípadnom použití ľahko odstrániť. Tieto roztoky je možné uchovávať i v oddelených nádobách a zmiešať ich až krátko pred ich použitím.

Vo zvláštnom vyhotovení sa ako proteáza používa na aktiváciu prírodná serínproteáza, ktorá sa podieľa na prirodzenom zrážaní krvi, ako je napr. faktor Xlla, ktorý nemusí byť pred aplikáciou oddelený od aktivovaného analógu faktora Xa a môže s ním byť aplikovaný spoločne.

Aktivácia analógu faktora ΧΔ na analóg faktora Xa sa môže vykonať krátko pred priamym použitím, t. j. krátko pred podaním pacientom. Túto aktiváciu je možné vykonať stykom s imobilizovanou proteázou alebo zmiešaním roztokov obsahujúcich jednak proteázu a jednak analóg faktora ΧΔ. Je preto možné obidve zložky uchovávať v oddelených roztokoch a zmiešať ich pri prietoku vhodným zariadením, pričom dôjde k aktivácii analógu faktora ΧΔ na analóg faktora Xa. Pacientovi sa tak podáva zmes faktora Xa a ďalšej serínproteázy, ktorá vyvolala aktiváciu. Pritom je obzvlášť potrebné dbať na dávkovanie, pretože nadbytočná dávka serínproteázy aktivuje i endogénny faktor X, čo môže spôsobiť skrátenie času koagulácie.

Podľa výhodnej formy spôsobu vyhotovenia sa farmaceutický preparát dodáva vo vhodnom zariadení, prednostne v aplikátore, buď v kvapalnej - zmrazenej forme, alebo v lyofilizovanej forme. Ako vhodný aplikátor je možné použiť dvojkomorovú injekčnú striekačku, opísanú v patentoch AT 366 916 alebo AT 382 783.

Podľa ďalšieho aspektu tohto vynálezu obsahuje preparát podľa tohto vynálezu prípadne ako ďalšiu zložku krvný faktor (Blutfaktor) vo forme zymogénu alebo aktívnej serínproteázy. Ako ďalšie zložky sa pritom preferujú zložky s FEIB - aktivitou. K týmto látkam patrí hlavne faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor VIII, faktor V a/alebo príslušné serínproteázy. Ako ďalšie zložky sa môžu použiť i fosfolipidy, Ca - ióny a podobne. Podľa zvláštneho spôsobu vyhotovenia podľa tohto vynálezu obsahuje preparát podľa tohto vynálezu minimálne jednu ďalšiu zložku s FEIB - aktivitou.

Preparát podľa tohto vynálezu sa môže dodávať ako farmaceutický preparát s aktivitou faktora Xa ako jednozložkový preparát alebo v kombinácii s inými faktormi ako viaczložkový preparát.

Pred spracovaním na farmaceutický preparát sa vyčistený proteín podrobuje bežnej kontrole kvality a prevedie sa na terapeuticky použiteľnú formu. Pri rekombinantnej príprave je nutné hlavne vyčistený preparát kontrolovať, či neobsahuje bunkové nukleové kyseliny a nukleové kyseliny pochádzajúce z expresného vektora, pričom preferovaným postupom je postup opísaný v EP 0 714 987.

Vzhľadom na to, že každý biologický materiál môže byť kontaminovaný infekčnými zárodkami, je nutné kvôli príprave bezpečného preparátu prípadne vykonať inaktiváciu vírusov.

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka použitia preparátu uvedeného druhu na výrobu liečiva. Liečivo obsahujúce analóg faktora ΧΔ a zodpovedajúci aktivovaný analóg faktora X je vhodné najmä na liečenie pacientov s poruchami zrážania krvi, ako sú hemofilici alebo pacienti, u ktorých sa vyvinuli inhibujúce protilátky proti podávaným terapeutickým prostriedkom, ako napr. proti faktoru VIII alebo faktoru IX.

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka postupu prípravy analógu faktora ΧΔ a preparátu obsahujúceho analóg faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu. Pritom sa kódovacia sekvencia pre analóg faktora ΧΔ vloží do vhodného expresného systému a príslušné bunky sa transfektujú rekombinantnou DNA. Výhodne sa používajú bunkové línie, ktoré exprimujú analóg faktora ΧΔ. Tieto bunky sa kultivujú za optimálnych podmienok pre expresiu génu a analóg faktora X sa izoluje buď z extraktu bunkovej kultúry, alebo zo supematantu bunkovej kultúry. Rekombinované molekuly je možné ďalej čistiť pomocou všetkých známych chromatografických postupov, ako sú anexová, katexová, afinitná alebo imunoafinitná chromatografia alebo kombináciou týchto metód.

Na prípravu analógu faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu sa klonuje úplná cDNA pre kódovanie faktora X v expresnom vektore. To sa vykonáva podľa všeobecne známych spôsobov klonovania. Nukleotidová sekvencia kódujúca faktor sa nakoniec modifikuje tak, že sa kódujúca sekvencia pre aminokyseliny Arg 180 až Arg234 vyštiepi a aminokyseliny v oblasti medzi Gly 173 a Arg 179, prípadne Ile235 sa zmenia tak, aby sa získali molekuly faktora X opísaného druhu. To sa vykonáva známymi génovo-technickými metódami zodpovedajúcimi aktuálnemu stavu techniky, ako sú riadená mutagenéza in vitro, delécia sekvencií, napr. reštrikčným odstraňovaním pomocou endonukleáz, vkladaním iných pozmenených sekvencií alebo pomocou PCR. Takto pripravené mutanty faktora ΧΔ sa potom vkladajú a exprimujú do expresného systému vhodného na rekombinantnú expresiu.

Analógy faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu je možné pripravovať i chemickou syntézou.

Analógy faktora ΧΔ sa výhodne pripravujú rekombinantnou expresiou. Génovo-technickú prípravu je možné vykonávať pomocou všetkých dostupných expresných systémov, ako sú napr. permanentné bunkové línie alebo virálne expresné systémy. Permanentné bunkové línie sa pripravia stabilnou integráciou cudzej DNA (Fremd-DNA) do chromozómu hostiteľskej bunky, napr. z Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hcpl, hlavne z pečeňových buniek a buniek ľadvín alebo pomocou epizomálneho vektora odvodeného napr. z vírusu Papilloma. Rovnako je možné použiť virálne expresné systémy, ako sú napr. Vaccinia Vírus, Baculovirus alebo retrovirálne systémy. Ako bunkové línie je možné všeobecne použiť Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, žľazové (Driisen-), pečeňové a ľadvinové bunky. Ako eukaryotické expresné systémy je možné použiť i kvasinky, endogénne žľazy (napr. žľazy transgénnych zvierat) a iné bunkové typy. Transgénne zvieratá je možné samozrejme použiť i na expresiu polypeptidu podľa tohto vynálezu alebo jeho derivátov. Na expresiu rekombinantných proteínov sa osvedčili špeciálne bunky CHO-DHFR' (Urlaub a koľ, Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 77, 4216 - 4220, 1980).

Na rekombinantnú prípravu analógu faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu možno použiť i prokaryotické expresné systémy. Na to sú vhodné hlavne systémy, ktoré umožňujú expresiu v E. coli alebo B. subtilis.

Analógy faktora ΧΔ sa exprimujú v zodpovedajúcich expresných systémoch riadených vhodnými promótormi. Pri expresii v eukaryotoch sú vhodné všetky známe promótory, ako sú SV40-, CMV-, RSV-, HSV-, EBV-, β-aktín-, hGH alebo indukovateľné promótory, ako sú napr. hsp-, alebo metalotioneinový promótor. Preferovaná je exprimácia analógov faktora X riadená β-aktínovým promótorom v CHO-DHFR^- bunkách.

Podľa jedného spôsobu vyhotovenia tohto vynálezu zahŕňa postup prípravy preparátu podľa tohto vynálezu nasledujúce kroky: príprava DNA na kódovanie analógu faktora ΧΔ, transformácia bunky s rekombinantnou DNA, expresia analógu faktora X, prípadne za prítomnosti proteázy, izolácia analógu faktora X a prípadné čistenie pomocou chromatografie.

Podľa jedného spôsobu vyhotovenia tohto vynálezu sa analóg faktora Xa izoluje priamo ako molekula skladajúca sa z dvoch reťazcov. Pritom sa analóg faktora ΧΔ s modifikáciou, ktorá umožňuje vykonanie úpravy pomocou bibázickej proteázy, ako je furín, v bunke exprimuje a analóg faktora ΧΔ sa prevedie na analóg faktora Xa s dvoma reťazcami. Ako bunka sa používa prednostne bunka, ktorá exprimuje proteázu vhodnú na vykonanie tejto premeny, ako je bibázická proteáza napr. furín alebo jeho derivát. Kvôli zvýšeniu, resp. kvôli zlepšeniu účinnosti tejto premeny je prípadne možno bunku modifikovať tak, aby exprimovala proteázu vo zvýšenej miere. To je možné vykonať napr. ko-expresiou príslušnej bibázickej endoproteázy, ako je furín/PACE, Kex2 alebo zodpovedajúcim derivátom. Analóg faktora ΧΔ podľa tohto vynálezu je možné rovnako exprimovať v bunke, ktorá má normálnu alebo suboptimálnu endogénnu koncentráciu proteázy na premenu, a preto prebieha neúplná premena na dvojreťazcovú aktívnu formu. Nasledujúca premena na analógy faktora Xa prebieha, pokiaľ sa secemuje v supematante bunkovej kultúry jednoreťazcový analóg faktora X, ako bolo opísané ko-kultiváciou s bunkami exprimujúcimi proteázu alebo pri styku s proteázou prípadne v imobilizovanom stave. Bunkový supematant je možné prečerpať cez nosnú matricu, na ktorej je naviazaná proteáza, pričom sa v eluáte získa dvojreťazcový analóg faktora Xa.

Takto získaný analóg faktora Xa je možné nakoniec izolovať, vyčistiť a až do budúceho použitia, ako bolo opísané, prípadne upravený na farmaceutický preparát a v stabilizovanom stave uskladniť. Odborník môže bez problémov v závislosti od pokusného usporiadania a reakčných podmienok vykonať optimalizáciu reakčných podmienok na premenu a aktiváciu. Zvláštny význam pritom má čas styku a rýchlosť prietoku reakčných zložiek. Hodnoty prietoku by sa mali pohybovať v rozmedzí 0,01 ml/min. až 1 ml/min. Ďalšími dôležitým parametrami sú teplota, hodnota pH a elučné podmienky. Po prietoku môžu byť analógy faktora Xa prípadne ďalej čistené selektívnymi chromatografickými metódami. Vykonanie tohto postupu s proteázou naviazanou na nosič je výhodné preto, že usporiadanie reakcie s použitím nosiča, prednostne v chromatografickej kolóne umožňuje vykonanie ďalších čistiacich operácií.

Podľa jedného spôsobu vyhotovenia sa aktivácia vykonáva jedným chromatografickým postupom, pri

Čom proteáza je imobilizovaná na nosiči. Čistený analóg faktora ΧΔ s jedným reťazcom pritom vedie cez matricu, na ktorej je naviazaná proteáza a z eluátu sa potom izoluje vyčistený analóg faktora Xa.

Podľa jedného aspektu tohto vynálezu sa preparát, obsahujúci aktívny analóg faktora Xa, získa tak, že sa analóg faktora ΧΔ pripravený uvedeným spôsobom podrobí premene/aktivácii a aktivovaný polypeptid sa ďalej spracuje na vyčistený preparát, prípadne pripravený ako farmaceutický preparát.

Podľa ďalšieho aspektu prípravy preparátu obsahujúceho analóg faktora ΧΔ s jedným reťazcom sa analóg faktora ΧΔ s riadiacou sekvenciou pre bibázickú proteázu exprimuje v bunke s endoproteázovou deficienciou. Táto bunka pritom prednostne má deficienciu bibázickej endoproteázy, ako je kexín, furín, PACE alebo ich homológy. Z jednej takejto endoproteáza-deficitnej mutantnej bunky je možné izolovať analóg faktora ΧΔ vo forme jednoreťazcovej molekuly. Analógy faktora ΧΔ obsahujúce procesné miesto pre serínproteázu sa môžu exprimovať v akejkoľvek bežnej bunke, i v purín-pozitivnej bunke a izolovať vo forme jednoreťazcových molekúl.

Takto izolovaný a prípadne prečistený analóg faktora X sa nakoniec uvedie do styku s proteázou vybranou zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny sermproteáz, ako sú faktor Ila, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X alebo kalikreín, alebo s derivátom týchto proteáz za podmienok, pri ktorých sa analóg faktora X s jedným reťazcom rozštiepi na analóg faktora Xa a aktivuje sa.

Pri použití analógov faktora ΧΔ aktivovaných uvedeným postupom na analógy faktora Xa sa získajú analógy faktora Xa s vysokou stabilitou a štruktúrnou integritou, ktoré pritom neobsahujú inaktívne intermediáty faktora X/Xa.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia faktora X.

Obr. 2: Schematické znázornenie analógu faktora ΧΔ s modifikovaným štiepnym miestom pre proteázy (Proteasen-Schnittstelle).

Obr. 3: Schematické znázornenie expresného vektora phAct-rFX.

Obr, 4: Westemblotting-analýza rFaktora X exprimovaného v CHO-bunkách pred a po amplifikácii.

Obr. 5: Westemblotting-analýza rFaktora X po in vzťzO-štiepení furínovými derivátmi.

Obr. 6: Westemblotting-analýza molekúl rFaktora X exprimovaných v bunkách obsahujúcich a neobsahujúcich furín.

Obr. 7: Schematické znázornenie analógu rFaktora ΧΔ s pozmeneným C-koncom ťažkého reťazca.

Obr. 8: Schematické znázornenie N-konca produktu premeny rFaktora X z CHO-, CHO/rFurin- a z furíndeficitných buniek.

Obr. 9: Westemblotting-analýza rFaktora X^RVTR/I, exprimovaného v CHO-bunkách.

Obr. 10: Westemblotting-analýza rFaktora X^RVTCI po in vitro-aktivácii furínovým derivátom.

Tento vynález je bližšie opísaný v uvedených príkladoch a obrázkoch, pričom tento vynález sa však neobmedzuje iba na tieto zvláštne príklady vyhotovení.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 opisuje konštrukciu a expresiu rFaktora X; príklad 2 opisuje úpravu ťažkého a ľahkého reťazca rFaktora X furínom; príklad 3 opisuje postup na získanie pro-faktora X pomocou imobilizovanej proteázy; príklad 4 opisuje aktivitu rFaktora X pripravovaného in vitro·, príklad 5 opisuje expresiu rFaktora X vo fiirín-deficitných bunkách; príklad 6 opisuje konštrukciu a expresiu analógov rFaktora ΧΔ; príklad 7 opisuje stanovenie produktov premeny faktora X na N-konci; príklad 8 opisuje expresiu a charakterizáciu FX-analógu s miestom (Stelie) Arg-Val-Thr-Arg/Ile (rFX^RVTR/1); príklad 9 opisuje in vzíra-aktiváciu tohto rFX^R''^TR'¹ - proteínu pomocou derivátu rFurinu.

Expresné vektory boli pripravené bežnými spôsobmi klonovania (Maniatis a kol.: „Molecular Clonmg,, - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983). Príprava DNA-fragmentov pomocou polymerázovej reakcie (Polymerase-Ketten-Reaktion - PCR) bola vykonaná všeobecnými metódami (Clackson a kol., 1991, PCR A Practical approach. Ed. McPhcrson, Quirke, Taylor, s. 187 - 214).

Príklad 1

Expresia a prevedenie jednoreťazcového rFX na rFX s ľahkým/ťažkým reťazcom

a) Príprava rFX-expresného vektora

Na prípravu rekombinantného FX (rFX) sa izolovala cDNA z FX z ľudskej pečeňovej Lambda-cDNA-banky (Leber Lambda-cDNA-Bank), ako uviedli Messier a kol. (1991, Gene 99, 291 - 294). Z pozitívneho klonu bol pomocou PCR s oligonukleotidom # 2911 (5'-ATT ACT CGA GAA GCT TAC CAT GGG GCG CCC ACTG-3') (SEQ. ID. Nr. 1) ako 5'-primérom a oligonukleotidom # 2912 (5'-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3') (SEQ. ID, Nr. 2) ako 3-primérom amplifikovaný DNA-fragment, ktorý obsahoval 1,467 kB FX-kódujúcu sekvenciu a ďalej 39 bp 3'-netranslatovanú oblasť, a ktorý bol atakovaný v mieste štiepenia Xhol na 5'-konci a v mieste štiepenia Mfel na 3'-konci. Okrem toho bola pôsobením priméru #2911 vložená sekvencia ACC pred ATG v FX, takže vznikla optimálna Kozak-translačno-inicializačná sekvencia. Nakoniec bol tento PCR-produkt klonovaný ako Xhol/Mfel-fragment v expresnom vektore so Sali a EcoRI. Vzniknutý expresný plazmid bol označený ako phAct-rFX (obr. 3). Expresný vektor phAct zahŕňa ľudský β-aktín-promótor, 78 bp 5' UTR a rovnako intrón, násobné klonovacie miesto štiepenia a SV40 - polyadenylačné miesto.

b) Expresia rFX v CHO-bunkách

Kvôli získaniu stabilnej bunkovej línie pre expresiu rFX boli ko-transfekované dhfr-deficitné CHO-bunky s expresným plazmidom phAct-rFX a selektívnym markerplazmidom pSV-dhfr. Pri všetkých ďalších expresných a funkčných analýzach boli bunkové kultúry s bezsérovým selektívnym médiom inkubované za prítomnosti 10 pg/'nil vitamínu K počas 24 hodín. Expresia rFX vo vzniknutých bunkových klonoch sa preukazovala pomocou protilátky (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim) a rekombinantný proteín sa potom charakterizoval pomocou SDS-PAGE (obr. 4A a B). V počiatočných klonoch i v subklonoch je rekombinantný FX-proteín vo forme ľahkého reťazca (LC) 22 kD a ťažkého reťazca (HC) o cca 50 kD, ktoré sú identické s plazmatickým proteínom faktora X, ako vyplýva z Westemblotting-analýzy (obr. 4A). Okrem toho z pásu proteínu pri 75 kD vyplýva, že tento pás zodpovedá (SC)-molekule s jedným reťazcom, ktorej prítomnosť bola opísaná v FX-transfekčných CHO-bunkách (Wolf a kol., J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730, 1991) a rovnako v ľudskej plazme (Fair a kol., Blood, 64, 194 - 204, 1984). Na prípravu vysoko exprimujúcich klonov boli počiatočné klony amplifikované so stúpajúcim množstvom metotrexátu a nakoniec subklonované až do stabilizácie. Expresiu bolo možné zvýšiť z cca 200 - 500 ng/10E6 buniek, resp. 1 pg/ml na 78 pg/ l 0E6 buniek, resp. 120 pg/ml za 24 hodín. Westemblotting-analýza týchto vysoko exprimovaných bunkových klonov (obr. 4B a obr. 5 A, záznam 2) má obohatenie jednoreťazcových rFX-molekúl a rovnako prítomnosť ďalších foriem v ľahkom reťazci. Okrem 22 kD-formy v ľahkom reťazci, ktorá zodpovedá forme v plazme (úplne karboxylovaná a bez propeptidu), sú prítomné ešte tri ďalšie varianty ľahkého reťazca s 21 kD, 22,5 kD a kD. Heterogenita ľahkého reťazca v týchto klonoch môže byť spôsobená vytváraním N-terminálnych sekvencií v rekombinantnom materiáli na neúplne odštiepený propeptid (v tomto prípade: cca 50 % materiálu rFX) a rovnako nedostatočným stupňom karboxylácie (Untercarboxylierung) (v tomto prípade: 50 % rFX).

kD-proteín je nedostatočne karboxylovaná forma ľahkého reťazca obsahujúca propeptid a 20 kD-proteín je nedostatočne karboxylovaná forma ľahkého reťazca neobsahujúca propeptid, zatiaľ čo 22,5 kD-pás predstavuje úplne karboxylovanú LC-formu obsahujúcu propeptid.

Príklad 2

Premena rFX na rFX ľahký/ťažký reťazec pôsobením rFurínového derivátu

Vzhľadom na podobnosť štiepnych miest medzi faktor X-propeptidom/N-koncom ľahkého reťazca (RVTR A) a medzi ľahkým/ťažkým reťazcom (RRKR S) s rozpoznávacou sekvenciou furínu (Furin-Konsensus-Erkennungssequenz) (RXK/RR X) sa naskytla možnosť na zlepšenie premeny tak jednoreťazcovej, ako i propeptid-obsahujúcej rFX-molekuly pôsobením rFurínového derivátu in vitro. V literatúre boli pre oba spôsoby premeny navrhnuté proteázy, ktoré však nemali k furínu žiaden vzťah (Rehemtulla a kol., 1992, Blood, 79, 2349 - 2355, Wallin a kol., 1994, Thromb. Res., 1994, 395 - 403).

Supematanty bunkových kultúr CHO-rFX a CHO-rFurín TMĎxHis (prihláška vynálezu EP 0 775 750) a rovnako CHO-rFX a netransfekované CHO (ako negatívna kontrola) boli zmiešané v pomere 1:1a inkubované pri teplote 37 °C. V alikvotných podieloch reakčnej zmesi bol pomocou Westernblotting-analýzy sledovaný obsah premeneného rFX pred inkubáciou (t = 0) a po rôznych časoch inkubácie (t = 2, 4, 6 hodín) (obr. 5). Dôkaz rFX v supematante bunkových kultúr bol vykonávaný pomocou antihumánneho FX-antiséra (obr. 5 A), resp. monoklonálnej protilátky špecifickej pre ľahký reťazec FX (obr. 5B).

Na rozdiel od zmesi CHO-rFX/CHO mala zmes CHO-rFX/CHO-rFurin už po dvoch hodinách inkubácie pri teplote 37 °C (obr. 5A, záznam 7; obr. 5B záznam 8) takmer úplnú premenu. Jednoreťazcový rFX je v prevažnej miere prevedený na formu ľahkého a ťažkého reťazca. V oblasti ľahkého reťazca boli však ešte nájdené premenené bezpropeptidové formy 22 kD (karboxylovaná forma) a 20 kD (nedostatočne karboxylovaná forma) v pomere 50 : 50. Optimalizáciou podmienok bunkovej kultúry je možné tento pomer posunúť v prospech karboxylovanej formy. Správne odštiepovanie pro-sekvencie medzi Arg-1 a Ala+1 a homogenita N-konca ľahkého reťazca boli stanovované pomocou N-terminálneho vytvárania sekvencii. Pri porovnávacom pokuse, pri ktorom boli zmiešané CHO-rFX so supematantmi CHO, nebola ani po 6-hodinovej inkubácii preukázaná žiadna zmena rFX-pásov (obr. 5A, záznam 5; obr. 5B, záznam 6). Preukázalo sa tak, že rFurín v supematante CHO-buniek je biologicky aktívny a že je možné uskutočniť tak premenu propeptidu, ako i ťažkého/ľahkého reťazca rFX.

Príklad 3

Premena faktora X pomocou rFurínu imobilizovaného na chelát-Tentakelgele

Kvôli zisteniu, či je možné substrát štiepiť rFurínovým derivátom viazaným v chromatografickej kolóne, bolo pri jednom experimentálnom usporiadaní zisťované, či je možné ako matricu v kolóne namiesto Nr-NTA-agarózy použiť Fractogel EMD^R-Tentakelgel (Fa. Merck). Kovové ióny sú v tomto prípade v porovnaní s Ni²⁺-NTA-agarózou priestorovo viac vzdialené od vlastnej matrice v kolóne, Čo by mohlo zlepšiť sférickú prístupnosť viazaného rFurínového derivátu. Pri tomto pokusnom usporiadaní bol profaktor X získaný pomocou rFurínového derivátu viazaného na Tentakelgel nasledujúcim spôsobom:

Do Fractogel EMD-Tentakelgelu boli podľa predpisu pripraví' zakotvené Ni²⁺-ióny a získaný materiál bol ekvilibrovaný s bezsérovou bunkovou kultúrou. Nakoniec bol na kolónu zakotvený CHO-rFurínový derivát. Premývanie sa vykonávalo bezsérovou bunkovou kultúrou obsahujúcou stúpajúcu koncentráciu imidazolu až na 40 mM. Nakoniec bol cez túto kolónu vedený profaktor X ako bezsérový CHO-supematant. Pomocou Westemblotting-analýzy so špecifickým faktor X-antisérom bola po prietoku kolónou preukázaná premena profaktora X na faktor X s dvoma reťazcami.

Príklad 4

Aktivita rekombinantného faktora X pripravovaného in vitro

Rekombinantný prekurzor faktora X bol inkubovaný pri teplote 4 °C s rFurínom a bez rFurínu. Po určitých intervaloch sa odobrali vzorky a zmrazovali na teplotu -20 °C. Po skončení inkubácie (po 4 dňoch) bola pri všetkých vzorkách sledovaná FX-aktivita pomocou súpravy FX-Coatest Kit (Fa. Chromogenix). Pritom bolo vždy 50 μΐ supematantu zmiešaných s 50 μΐ FX-deficitnej ľudskej plazmy a podľa predpisu výrobcu bol rFX prídavkom hadieho jedu (RVV) za prítomnosti CaCl₂ prevedený na rFXa; rFXa hydrolyzoval nakoniec chromogénny substrát (S-2337), pričom prišlo k uvoľneniu žltého paranitroanilínu. Množstvo rFXa a intenzita farby sú navzájom úmerné, čo umožňuje stanoviť množstvo rFXa aktivovateľného v rFX/ml-bunkovom supematante pomocou kalibračnej priamky interpolovanej podľa hodnôt zried’ovacieho radu vplazme. Z týchto výsledkov a zo známeho množstva rFX-antigénu (ELISA-dáta) je možné vypočítať percentuálny podiel rFaktora X aktivovateľného na faktor Xa. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 1.

Aby bolo možné vylúčiť nešpecifickú proteolytickú aktivitu CHO- a CHO-rFurínových supematantov, bola vyhodnocovaná i zmes týchto oboch supematantov bunkových kultúr.

CHO-rFX inkubovaný s CHO-supematantmi (bez rFurínu) ako kontrolná vzorka nemal po 4 dňoch žiadnu podstatnú zmenu aktivity rFXa, ktorá v rozmedzí experimentálnych chýb bola cca 800 mU/ml, čo zodpovedalo 50 až 60 % funkčného rFX. Kvôli porovnaniu bol CHO-rFX inkubovaný s CHO-rFurínom, pričom bol počas inkubácie zistený konštantný nárast rFX-aktivity z cca 60 % (čas T = 0) na 86 % (tabuľka 1). Tým sa preukázalo, že in vitro-úpravou CHO-rFX z vysoko exprimovaných klonov pomocou derivátu rFurínu sa podstatne zvyšuje podiel rFX aktivovateľného na funkčný rFXa.

Tabuľka 1

Inkubácia, dni	Aktivita, mU	Množstvo antigénu, Mg/ml	Funkčný podiel rFX, %
CHO-rFX + CHO	0	814	14	58
	1	847	14	61
	2	835	14	60
	3	790	14	56
	4	763	14	55
CHO - rFX +	0	853	14	61
CHO-rFurín	1	1018	14	73
	2	1099	14	49
	3	1135	14	81
	4	1198	14	86
CHO + CHO-		0
rFurín
Plazma FX 500 mU	585

Príklad 5

Expresia rekombinantného faktora X vo furín-deficitných bunkách

Ako bolo uvedené v predchádzajúcich príkladoch, dochádza pri pTekurzorovom proteíne faktora X pôsobením furínu in vitro tak k odštiepeniu propeptidu, ako i k štiepeniu jednoduchého reťazca na ľahký/ťažký reťazec. Z toho vyplýva, že tieto kroky môžu byť s rôznou účinnosťou uskutočnené i endogénne v bunkách pôsobením všadeprítomného furinu v závislosti od množstva príslušného exprimovaného rFaktora X. Týmto postupom sa ďalej získa zmes heterogénnych foriem rFaktora X.

Jednou z možností, ako získať maximálne homogénnu a pritom stabilnú formu molekúl rFaktora X, je zabrániť štiepeniu rFaktora X endogénnymi proteázami, hlavne furínom, a tak získať funkčne inaktívny prekurzor rFaktora X (ktorý je možné neskoršou úpravou prietokom kolónou previesť na funkčne aktívnu formu, pokiaľ možno priamo pred použitím).

Tento postup je obzvlášť výhodný pri príprave FX-delečných mutantov, ktoré obsahujú namiesto pôvodného aktivačného miesta miesto štiepiteľné furínom (Furin-Spaltstelle). Pri týchto látkach (konštruktov) je možné vykonať aktiváciu týchto rekombinantných rFX-mutantov in vivo pôsobením endogénneho furínu a sekréciou aktivovaných nestabilných rFX foriem. Degradáciou týchto foriem CHO-proteázami, napr. v bunkových kultúrach s vysokou bunkovou lýziou pri skladovaní supematantu bunkovej kultúry alebo pomocou čistiacich postupov, je možné získať inaktívne produkty odbúravania (Wolf a kol., 1991).

Tento cieľ je možné dosiahnuť napr. prídavkom činidiel, ktoré znižujú alebo blokujú intracelulámu furínovú aktivitu, do bunkovej kultúry.

Inou možnosťou je apriórne použitie furín-deficitných buniek (Môhring a kol., 1983, Infect. Immun., 41, 998 - 1009; Ohniski a kol., 1994, J. Virol., 68, 4075 - 4079; Gordon a kol., 1995, Infect. Immun., 63, 82 -87).

Pri tomto postupe bol furín-deficitný CHO-bunkový kloň FD11 (Gordon a kol., 1995, Infect. Immun,. 63, 82 - 87) ko-transfektovaný s 20 pg phAct-FX a 1 pg pUCSV-neo (s obsahom neomycín-rezistentného génu v pUC vektore za kontroly SV40-promótora). Kvôli získaniu stabilného klonu bolo toto médium suplementované 0,8 pg G418/ml. Pri porovnaní molekúl rFaktora secemovaného vbezsérovom supematante CHO-klonov s obsahom a bez obsahu furínu bolo pomocou Westemblotting-analýzy preukázané, že vo furín-deficitných bunkách nedochádzalo k premene prekurzora rFaktora a bol prítomný iba jednoreťazcový prekurzor faktora X (obr. 6); oproti tomu sa rFaktor X z „normálnych,, buniek pri miernejšej (modeste) expresii premieňal ešte úplne, pri vyššej expresii sa napriek prítomnosti endogénneho furínu premieňal iba v obmedzenej miere. Vzhľadom na veľmi nízky stupeň expresie rFX pri použitom bunkovom klone nie je ľahký reťazec rFaktora X pri Blotting-analýze vidieť.

Príklad 6

Príprava analógov faktora X (podľa vyjadrenia prihlasovateľa ide v súčasnej dobe o najlepší spôsob vyhotovenia podľa tohto vynálezu)

6.1. Konštrukcia expresných plazmidov na prípravu FX-delečných mutantov

Delečné mutanty faktora X sa od „divokého typu,, sekvencie faktora X odlišujú deléciou aktivačného peptidu s veľkosťou cca 4,5 kDa medzi aminokyselinami 180 až 234. Okrem toho je možné mutagenézou v C-koncovej časti ľahkého reťazca a/alebo vN-koncovej časti ťažkého reťazca vkladať rôzne štiepne miesta slúžiace na aktiváciu takto vzniknutých jednoreťazcových molekúl faktora X na aktivovaný polypeptid. Expresné plazmidy pre tieto delečné mutanty faktora X sú vždy odvodzované od phAct-FX (opísaného v príklade 1).

Kvôli zjednodušeniu klonovania delečných mutantov faktora X bol DNA-fragment HindlII-Nael z plazmidu phAct-FX, obsahujúcej kódovanie faktora X od pozície +1 až do +1116, vložený do HindlII/Smal-reštrikčných štiepnych miest plazmidu pUC19. Takto získaný plazmid bol označený ako pUC/FX. Kvôli delécii aktivačného peptidu a vloženiu nových štiepnych miest, napr. furínových alebo FXIa-, FXIIa-, FXa, Flla-štiepnych miest bol DNA-fragment Bspl20I/BstXI FX z pUC/FX - vektora nahradený syntetickým oligonukleotidom. Kvôli vloženiu trombín- alebo FXIa-štiepneho miesta bola prečnievajúca sekvencia BstXI-3' vyhladená pomocou Mung Beanovej nukleázy, takže bolo možné vykonať i výmenu aminokyseliny íle na pozícii 235. Potom boli deletované DNA-fragmenty faktora X v plazmide pAct-FX klonované pomocou HindlII-Agel.

Na prípravu Asp-Phe-Thr-Arg/Val FXIa-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0009 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG GAC TTC ACC AGG GTG-3') (SEQ. ID, Nr. 3) a oligonukleotid antisens # 0010 (5'-CAC CCT GGT GAA GTC CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID, Nr. 4) a bol vložený do Bsp-miesta a do BstXI-miesta upraveného Mung Beanovou nukleázou. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Asp-Phe-Thr a Val (obr. 2A).

Na prípravu Arg/Thr Flla-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens #0011 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ACC-3') (SEQ. ID, Nr. 5) a oligonukleotid antisens #0012 (5'-GGT CCG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID, Nr. 6) a bol vložený do Bspl20I-miesta a do BstXI-miesta upraveného Mung Beanovou nukleázou. Týmto spôsobom bola vykonaná mutácia aminokyseliny íle na pozícii 235 na Thr (obr. 2B).

Na prípravu Ile-Lys-Pro-Arg/Ile FXIIa-štiepneho miesta bol použitý oligonukleotid sens # 0013 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC AAG CCC AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 7) a oligonukleotid antisens # 0014 (5'-CT GGG CTT GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3 ) (SEQ. ID. Nr. 8) a bol vložený do Bsp 1201- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Ile-Lys-Pro (obr. 2C).

Na prípravu Ser-Met-Thr-Arg/Ile kalikreín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0015 (5 -GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGC ATG ACC AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 9) a oligonukleotid # 0016 (5'-CT GGT CAT GCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 10) a bol vložený do Bsp- a BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Ser-Met-Thr (obr. 2D).

Na prípravu Met-Lys-Thr-Arg/Ile FXa-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0033 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATG AAA ACG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 11) a oligonukleotid antisens # 0034 (5'-CT CGT TTT CAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ ID. Nr. 12) a bol vložený do Bsp 1201- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 z Thr-Leu-Glu na Met-Lys-Thr (obr. 2E).

Na prípravu Ile-Glu-Gly-Arg/Ile FXa-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0035 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC GAG GGA AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 13) a oligonukleotid antisens # 0036 (5'-CT TCC CTC GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 14) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 z Thr-Leu-Glu na Ile-Glu-Gly (obr. 2F).

Na prípravu Arg-Arg-Lys-Arg/Ile furín-štiepncho miesta sa použil oligonukleotid sens #0017 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AAG AGG ATC-3 ) (SEQ. ID. Nr. 15) a oligonukleotid antisens #0018 (5'-CT CTT CCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 16) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Arg-Arg-Lys (obr. 2G).

Na prípravu Arg-Val-Arg-Arg/Ile furín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0019 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTG AGG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 17) a oligonukleotid antisens # 0020 (5'-CT CCT CAC CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 18) a bol vložený do Bsp 1201- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Arg-Val-Arg (obr. 2G).

Na prípravu Arg-Arg-Arg-Arg/Ile furín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0021 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AGG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 19) a oligonukleotid antisens # 0022 (5 -CT CCT CCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 20) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Arg-Arg-Arg (obr. 2G).

Na prípravu Arg-Pro-Lys-Arg/Ile furín-štiepneho miesta bol použitý oligonukleotid sens # 0023 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CCC AAG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 21) a oligonukleotid antisens # 0024 (5 '-CT CTT GGG CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 22) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Arg-Pro-Lys (obr. 2G).

Na prípravu Ile-Arg-Lys-Arg/Ue furín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0025 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC AGG AAG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 23) a oligonukleotid antisens # 0026 (5'-CT CTT CCT GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3 ) (SEQ. ID. Nr 24) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Ile-Arg-Lys (obr. 2G).

Na prípravu Arg-Ser-Lys-Arg/Ile furín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0027 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGC AAG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 25) a oligonukleotid antisens # 0028 (5'-CT CTT GCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 26) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Arg-SeT-Lys (obr. 2G).

Na prípravu Arg-Val-Thr-Arg/Ile furín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0029 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTC ACG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 27) a oligonukleotid antisens # 0030 (5 '-CT CGT GAC CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 28) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Arg-Val-Thr (obr. 2G).

Na prípravu Arg-Leu-Lys-Arg/Ile furín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0031 (5 '-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CTG AAA AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 29) a oligonukleotid antisens # 0032 (5'-CT TTT CAG CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 30) a bol vložený do Bspl20I- a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Arg a Lys (obr. 2G).

Na prípravu Pro-Gln-Gly-Arg/Ile FXa-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0037 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG CCC CAA GGA AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 31) a oligonukleotid antisens # 0038 (5'-CT TCC TTG GGG CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3 ’) (SEQ. ID. Nr. 32) a bol vložený do Bspl20I-miesta a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 z Thr-Leu-Glu na Pro-Gln-Gly (obr. 2H).

Na prípravu Thr-Ser-Thr-Arg/Ile FXIIa-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0039 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACG AGC ACG AGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 33) a oligonukleotid antisens # 0040 (5'-CT CGT GCT CGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 34) a bol vložený do Bspl20I-miesta a do BstXI-miesta. Týmto spôsobom sa vykonala mutácia aminokyselín na pozícii 176 až 178 na Ser-Thr (obr. 21).

Na prípravu Arg/Ile trypsín-štiepneho miesta sa použil oligonukleotid sens # 0041 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ATC-3') (SEQ. ID. Nr. 35) a oligonukleotid antisens # 0042 (5 -CG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 36) a bol vložený do Bspl20I-miesta a do BstXI-miesta (obr. 2J).

Získané expresné plazmidy (pozri obr. 3) zahŕňajú ľudský β-aktínový promótor, 78 bp 5'UTR, β-aktínintrón, modifikovanú sekvenciu faktora X a ďalej 39 bp 3 'UTR a polyadenylačné miesto SV40.

6.2. Konštrukcia expresných plazmidov na prípravu ΡΧβ-analógov

Tieto konštrukty sú odvodené od konštruktov uvedených analógov faktora ΧΔ, do ktorých bol vložený jeden TGA-stop-kodón na pozícii 470. Pritom boli aminokyseliny od pozície 457 až k stop-kodónu odstránené natrávením (Verdau) pôsobením Spel a čiastočne BstEII a nahradené oligonukleotidovým párom # 0003 (5'-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3') (SEQ. ID. Nr. 37) a # 0004 (5'-CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEQ. ID. Nr. 38). Schematické znázornenie tohto konštruktu analógu faktora ΧΔ β je uvedené na obr. 7. Kvôli zjednodušeniu vyobrazenia sú všetky konštrukty analógu faktora ΧΔ β znázornené ako všeobecný konštrukt, v ktorom sú premenlivé aminokyseliny v oblasti miesta štiepenia znázornené ako tieňované ,,X„.

6.3. Konštrukcia expresných plazmidov na prípravu FXAa-analógov

Aktiváciou faktora X odštiepením 4,5 kDa-aktivačného peptidu na C-konci ťažkého reťazca vznikne Xaa-forma faktora. Táto forma sa potom premení pôsobením autoproteolytickej aktivity a odštiepením C-konca ťažkého reťazca medzi Arg469 a Gly470 na formu ΡΧ3β. Na prípravu expresných plazmidov faktora X vedúcich k tvorbe analógov faktora ΧΔ, ktoré sa po aktivácii vyskytujú výhradne vo forme FXaa s intaktným β-peptidom, sa vykonala zámena aminokyseliny Arg469 na Lys, takže nemohlo dochádzať k žiadnej premene na C-konci ťažkého reťazca.

Preto bola DNA-sekvencia faktora X kódujúca C-koncovú sekvenciu aminokyselín odstránená od pozície 1363 až k stop-signálu čiastočným naštiepením pomocou BstEII-Spel a nahradená dvoma väzbovými oligonukleotidovým pármi. Oligonukleotid # 0005 (5 '-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3') (SEQ. ID. Nr. 39) a oligonukleotid # 0006 (5'-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEQ. ID. Nr. 40) boli ligované s oligonukleotidom # 0007 (5 '-GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3') (SEQ. ID. Nr. 41) a oligonukleotidom # 0008 (5'-CTA GTG GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC-3') (SEQ. ID. Nr. 42). Mutácia aminokyseliny Arg469 bola vykonaná oligonukleotidovým párom # 0005 - # 0006. Schematické znázornenie FXA-analógu je uvedené na obr. 7.

Príklad 7

Stanovenie N-konca faktora X a produktov jeho premeny s rFurínom a bez rFurínu

Rekombinantný faktor X bol exprimovaný v CHO-bunkách s endogénnym furínom, ako bolo opísané v príklade 1, resp. vo furín-deficitných bunkách, ako bolo opísané v príklade 5. Izolácia rFaktora X bola vykonaná jednak z a) predbežne neupravenej, b) inkubovanej 12 hodín pri 37 °C a c) 12 hodín pri 37 °C s CHO -rFurínom upravenej bunkovej kultúry vysoko exprimujúceho CHO-rFX-klonu a jednak z d) predbežne neupravenej a e) 12 hodín pri 37 °C s CHO-rFurínom upravenej bunkovej kultúry klonu CHO-FDll-rFX. Vzniknutá N-koncová aminokyselina faktora X a produktov premeny pri reakčných podmienkach a) až e) bola stanovená Edmanovou analýzou. Na obr. 8 je uvedené schematické znázornenie výsledkov.

rFaktor X z vysoko exprimujúcich CHO-buniek sa vyskytuje vo forme zrelého ťažkého a ľahkého reťazca a rovnako v jednoreťazcovej forme, ktorá čiastočne obsahuje propeptid. Po kultivácii tejto bunkovej kultúry počas 12 hodín pri 37 °C (b) vznikajú navyše, ako opísali už Wolf a kol. (1991, J. Biol. Chem., 266, 13726 - 13730), chybné N-koncovky ľahkého reťazca rFX s troma aminokyselinami Val38-Thr39-Arg40. Tieto kryptické konce sa našli i pri sekvenovaní rFX materiálu z neupravených CHO-FDl 1-buniek (d). Z týchto pozorovaní vyplýva, že výskytu týchto chybných N-koncoviek je možné zabrániť minimalizáciou rFX-proteolýzy pôsobením CHO-proteáz, ak sa použijú vhodné reakčné alebo bunkové podmienky, zodpovedajúce spôsoby skladovania a zodpovedajúce čistiace postupy.

Na rozdiel od čisteného materiálu z CHO-buniek (a a b) je rFX z neamplifikovaných furín-deficitných buniek (d) prítomný iba vo forme neupraveného jednoreťazcového prekurzora. Nezistili sa ani žiadne N-koncové sekvencie, ktoré by zodpovedali podielu propeptidu. Tým sa preukázalo, že úprava jednoreťazcového prekurzora rFX v ľahkom/ťažkom reťazci vo furín-deficitných CHO-bunkách (d) už neprebieha, čo ukazuje na hlavnú úlohu endoproteázy furínu v tomto operačnom kroku prebiehajúcom in vivo. Dodatočne sa preukázalo, že premena rFX-molekúl obsahujúcich propeptid prebieha i vo furín-deficitných CHO-bunkách, takže furín nemá pri úprave v podmienkach in vivo žiadnu podstatnú úlohu. Po inkubácii rFX z CHO-buniek (c) a z CHO-FDl 1-buniek (e) za prítomnosti furínu sa zistili ľahké a ťažké reťazce so správnymi N-koncami. Tým sa preukázalo, že tak jednoreťazcové prekurzory FX, ako i rFX-molekuly obsahujúce propeptid sa pri spracovaní in vitro premieňajú na homogénny zrelý faktor X. Faktor X pripravovaný za prítomnosti furínu mal okrem toho mimoriadnu integritu štruktúry.

Príklad 8

Expresia a charakterizácia rekombinantného delečného mutantu FX s miestom štiepenia Arg-Val-Thr-Arg/Ile (FXA^RVTR/I)

Expresný plazmid, kódujúci delečné mutanty FX s miestom štiepenia Arg-Val-Thr-Arg/Ile (FXA^{rvtr i}) bol, ako bolo uvedené v príklade 1, ko-transferovaný so selekčným markerom pS V/dhfr do dhfr-deficitných CHO-buniek. Rekombinantný proteín FXA^RVTRI z permanentných CHO-klonov bol charakterizovaný pomocou Westemblotting-analýzy. Ako vyplýva z obr. 9, záznam 4, vystupuje tento rekombinantný proteín vo forme dvojitého pásu s cca 56 a 50 kD. V bunkových kultúrach netransferovaiiých CHO-buniek nebol žiaden FX-reaktívny materiál detegovaný (záznam 2). Tieto výsledky vylučujú, že by tieto proteínové pásy zodpovedali znečisteniu analyzovaného supematantu divokým typom FX zo zvyškov hovädzieho séra v bunkovom médiu. Je preto pravdepodobné, že dvojité pásy môžu súvisieť s rôznymi posttranslačnými modifikáciami, napr. prítomnosťou propeptidu alebo rozdielnou glykozyláciou molekuly rFXA^RVTR/I.

Štiepne miesto Arg-Val-Thr-Arg/Ile zavedené do tohto konštruktu je identické s propeptidovým štiepnym miestom divokého typu molekúl FX, ktoré bolo účinne rozpoznané a rozštiepené in vivo pôsobením CHO-endoproteázy (pozri príklad 7). Westemblotting-analýza nepreukázala žiadne ďalšie 35 kD-, resp. 31 kD ťažké FX-molekuly, ktoré by zodpovedali aktivovaným a- a β-formám ťažkých reťazcov rFXA^RVTR/I. Tieto výsledky nasvedčujú tomu, že buď nebolo množstvo endoproteázy pre aktiváciu proteínu dostatočné a/alebo tomu, že štiepne miesto Arg-Val-Thr-Arg/Ile v uvedených sekvenciách nie je in vivo rozlíšené vôbec alebo je rozlíšené nedostatočne. rFXA^RV™ sa preto vyskytuje prakticky výhradne v jednoreťazcovej forme.

Príklad 9

Aktivácia rekombinantného proteínu rFXA^RVTR/| pomocou rekombinantných furínových derivátov in vivo

Miesto štiepenia Arg-Val-Thr-Arg v rFX-propeptide in vivo sa síce preukázalo pomocou inej proteázy ako je furín, v príklade 2 však bolo uvedené, že táto sekvencia sa in vitro veľmi účinne a správnym spôsobom štiepi rFurinovým derivátom.

Vyhodnocovanie aktivovateľnosti rFXA^{RVTR I}-proteínu pôsobením rFurínu in vitro sa vykonalo pomocou zmesových experimentov. Pri nich bol k supematantu kultúry buniek CHO- rFXA^RVIR/l pridaný rFurínový derivát rFurín Cys-Spacer-lOxHis (pozri prihláška vynálezu EP 0 775 750 A2) za prítomnosti 20 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl₂ a 0,1 % BSA v pomere 1.1. Pri kontrolnom pokuse bol supematant CHO-rFXA^RVTR'¹ zmiešaný v rovnakom pomere iba s pufrom obsahujúcim BSA. Prídavok BSA má slúžiť na stabilizáciu enzymatickej aktivity rFurínového derivátu a vznikajúcich aktivovaných produktov rFXA^RVTR/l. Priebeh premeny rFXA^RVTR/) sa sledoval pomocou Westemblotting-analýzy v alikvotných podieloch reakčnej zmesi pred a po inkubačnom čase 6, 24, 48 a 72 hodín (t = 0, t = 6, t = 24, t = 48, t = 72) pri teplote 37 °C (obr. 10). Pri pokuse bez prídavku rFurínu (obr. 10B) nie je v spektre pásov v priebehu inkubačného času zrejmá žiadna zmena (záznam 4 až 9). Vzhľadom na prítomnosť BSA v reakčnej zmesi sú dobre viditeľné iba ľahšie molekuly rFXA^RVTR/I (50 kD), molekuly 56 kD sú prekryté pásmi BSA.

Za prítomnosti rFurínového derivátu (obr. 10A) sa objavil už po inkubačnom čase 6 hodín (záznam 5) proteínový pás zodpovedajúci 35 kD, ktorý zodpovedá a-forme FX-ťažkého reťazca (pozri záznam 9). Tento proteín sa v priebehu inkubácie akumuluje a nakoniec sa - ako je známe pri plazme FX - premieňa na proteolytickú β-formu (záznam 7 a 8). Súčasne s detekciou aktivovaných foriem ťažkého reťazca boli detegované ľahké reťazce 22 kD a 20 kD, ktoré boli v príklade 1 .b identifikované ako karboxylovaná LC2-forma neob sahujúca propeptid (čo vlastne zodpovedá funkčnej forme), resp. ako nedostatočne karboxylovaná LC4-forma neobsahujúca propeptid. Prítomnosť nedostatočne karboxylovanej LC4-formy potvrdzuje, že v analyzovaných CHO-klonoch sú posttranslačné mechanizmy modifikácie obmedzené. 50 kD - pás sa síce javí ako nemenný, zatiaľ čo zdanlivo sa 56 kD - forma priamo odbúrava na ľahké/ťažké reťazce, v skutočnosti však dochádza k tomu, že 56 kD - molekula sa najprv premieňa na 50 kD - formu a až potom sa štiepi na ľahký a ťažký reťazec. To je spôsobené prítomnosťou propeptidu v 56 kD - molekule, ktorý sa odstraňuje za vzniku 50 kD - formy.

Tým sa preukázalo, že rFXÄ^RVTR/l-konštrukt je aktivovateľný prostredníctvom zabudovaného štiepneho miesta Arg-Val-Thr-Arg/Ile pôsobením rFurínového derivátu in vitro a že veľkosť vzniknutých produktov premeny konštruktu rFXA^RVTRJ zodpovedá plazmovým produktom FXa. Prítomnosť rFXAp, vznikajúceho autoproteolytickým priebehom reakcie z rFXAa, ukazuje na funkcionalitu molekuly rFXA^{RVI R}'¹.

Sekvenčný protokol (1) Všeobecné údaje:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: IMMUNO AG (B) Ulica: Industriestrasse 67 (C) Miesto: Viedeň (D) Spolková krajina: Rakúsko (E) Zem: Rakúsko (F) PSČ: 1220 (A) Meno: Friedrich Dorner (B) Ulica: Peterlinigasse 17 (C) Miesto: Viedeň (D) Spolková krajina: Rakúsko (E) Zem: Rakúsko (F) PSČ: 1238 (A) Meno: Falko - Guenther Falkner (B) Ulica: Mannsdorf 116 (C) Miesto: Mannsdorf (D) Spolková krajina: Rakúsko (E) Zem: Rakúsko (F) PSČ: 2304 (A) Meno: Michele Himmelspach (B) Ulica: Breitstetten 19 (C) Miesto: Leopoldsdorf (D) Spolková krajina: Rakúsko (E) Zem: Rakúsko (F) PSČ: 2285 (A) Meno: Michael Pfleiderer (B) Ulica: Johann Nestroygasse 12/16 (C) Miesto: Gross-Enzersdorf (D) Spolková krajina: Rakúsko (E) Zem: Rakúsko (F) PSČ: 2301 (A) Meno: Uwe Schlokat (B) Ulica: Hauptstrasse 51 (C) Miesto: Orth/Donau (D) Spolková krajina: Rakúsko (E) Zem: Rakúsko (F) PSČ: 2304 (A) Meno: Johann Eibl (B) Ulica: Gustáv Tschermakgasse 2 (C) Miesto: Viedeň (D) Spolková krajina: Rakúsko (E) Zem: Rakúsko (F) PSČ: 1180 (ii) Názov vynálezu: Delečné mutanty faktora X a ich analógy (iii) Počet sekvencii: 44 (iv) Počítačom čitateľné znenie:

(A) Nosič dát: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Pracovný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patent In Release #1.0, Version #1.30 (EPA) (2) Údaje k sekvencii ID NO: 1:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 34 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 1:

ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 2:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 2:

ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 3:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 3:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGGACTTCA CCAGGGTG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 4:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 34 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 4:

CACCCTGGTG AAGTCCTGTT TCCCACAGGG GTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 5:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 5:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACGGACC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 6:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 34 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 6:

GGTCCGTTCC AGGGTCTGTT TCCCACAGGG GTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 7:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 7:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAAGC CCAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 8:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 8: CTGGGCTTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 9:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 9:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGCATGA CCAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 10:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 10: CTGGTCATGC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 11:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 11:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATGAAAA CGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 12;

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie. Sekvencia ID NO: 12:

CTCGTTTTCA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 13:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 13:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCGAGG GAAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 14:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 14:

CTTCCCTCGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 15:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 15:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA AGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 16:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO; 16:

CTCTTCCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 17:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 17:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGGTGA GGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 18:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 18:

CTCCTCACCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 19:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 19:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA GGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 20:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 20:

CTCCTCCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 21:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 21:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCCCA AGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 22:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 22:

CTCTTGGGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 23:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 23:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAGGA AGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 24:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 24:

CTCTTCCTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 25:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 25:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGCA AGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 26:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 26:

CTCTTGCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 27:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 27:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGGTCA CGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 28:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 28:

CTCGTGACCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 29:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 29:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCTGA AAAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 30:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 30:

CTTTTCAGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 31:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 31:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGCCCCAAG GAAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 32:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 32:

CTTCCTTGGG GCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 33:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 33:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACGAGCA CGAGGATC (2) Údaje k sekvencii ID NO: 34:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 34:

CTCGTGCTCG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencii ID NO: 35:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 35:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACGGATC (2) Údaje k sekvencií ID NO: 36:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 36:

CGTTCCAGGG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvencií ID NO: 37:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 49 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 37:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA (2) Údaje k sekvencií ID NO: 38:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 48 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 38:

CTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGA GGAAGGCG (2) Údaje k sekvencií ID NO: 39:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 57 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 39:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG (2) Údaje k sekvencií ID NO: 40:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 57 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 40:

TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG (2) Údaje k sekvencií ID NO: 41:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 55 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 41:

GCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA (2) Údaje k sekvencií ID NO: 42:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 54 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 42:

CTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC (2) Údaje k sekvencií ID NO; 43:

(i) Dáta sekvencie (A) Dĺžka: 1467 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Forma reťazca: jednotlivý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Genóm - DNA (IX) Znak:

(A) Meno/kľúč: CD S (B) Poloha: 1.. 1467 (xi) Opis sekvencie: Sekvencia ID NO: 43

ATG

GGG

CGC

CCA CTG

CAC

CTC

GTC

CTG

CTC

AGT

GCC TCC

CTG

GCT

GGC

48

Met

Gly

Arg

Pro Leu

His

Leu

Val

Leu

Ser

Ala Ser

Leu

Ala

Gly

1

5

10

15

CTC

CTG

CTC GGG

GAA

AGT

CTG

TTC

ATC

CGC

AGG GAG

CAG

GCC

AAC

96

Leu

Leu Gly

Glu

Ser

Leu

Phe

íle

Arg

Arg Glu

Gin

Ala

Asn

20

25

30

AAC

ATC

CTG

GCG AGG

GTC

ACG

AGG

GCC

AAT

TCC

TTT CTT

GAA

GAG

ATG

144

Asn

íle

Leu

Ala Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Asn

Ser

Phe Leu

Glu

Met

35

40

45

AAG

AAA

GGA

CAC CTC

GAA

AGA

GAG

TGC

ATG

GAA

GAG ACC

TGC

TCA

TAC

192

Lys

Gly

His Leu

Glu

Arg

Glu

Cys

Met

Glu

Glu Thr

Cys

Ser

Tyr

50

55

60

GAA

GAG

GCC

CGC GAG

GTC

TTT

C-AG

GAC

AGC

GAC

AAG ACG

AAT

GAA

TTC

240

Glu

Ala

Arg Glu

Val

Phe

Glu

Asp

Ser

Asp

Lys Thr

Asn

G1U

Phe

6 5

70

75

80

TGG

AAT

.AAA

TAC AAA

GAT

GGC

GAC

CAG

TGT

GAG

ACC AGT

CCT

TGC

CAG

288

Trp

Asn

Lys

Tyr Lys

Asp

Gly

Asp

Gin

Cys

Glu

Thr Ser

Pro

Cys

Gin

85

90

95

AAC

CAC-

GGC

AAA TGT

AAA

C-AC

GGC

CTC

GGG

GAA

TAC ACC

TGC

ACC

TGT

336

Asn

Gin

Gly

Lys Cys

Lys

Asp

Gly

Leu

Gly

Glu

Tyr Thr

Cys

Thr

Cys

100

105

110

TTA i

GAA

GGA

TTC GAA

GGC

AAA

AAC

TGT

GAA

TTA

TTC ACA

CGG

AAG

CTC

384

Leu

Glu

Gly

Phe Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Glu

Leu

Phe Thr

Arg

Lys

Leu

115

120

125

TGC .

AGC

CTG

GAC AAC

GGG

GAC

TGT

GAC

CAG

TTC

TGC CAC

GAG

GAA

. CAG

432

Cys

Ser

Leu

Asp Asn

Gly

Asp

Cys

Asp

Gin

Phe

Cys His

Glu

. Gin

130

135

140

AAC Asn 145

TCT GTG

GTG TGC

TCC TGC

GCC CGC GGG TAC ACC CTG

GCT Ala

GAC Asp

AAC Asn 160

480

Ser

Val

Cys

Ser 150

Cys

Ala

Arg

Gly

Tyr Thr 155

Leu

GGC

AAG

GCC

TGC

ATT

CCC

ACA

GGG

ccc

TAC

CCC

TGT

GGG

AAA

CAG

ACC

528

Gly

Lys

Ala

Cys

íle

Pro

Thr

Gly

Pro

Tyr

Pro

Cys

Gly

Lys

Gin

Thr

165

170

175

CTG

GAA

CGC

AGG

AAG

AGG

TCA

GTG

GCC

CAG

GCC

ACC

AGC

GGG

576

Leu

Glu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

Ala

Gin

Ala

Thr

Ser

Gly

íso

185

190

GAG

GCC

CCT

GAC

AGC

ATC

ACA

TGG

.AAG

CCA

TAT

GAT

GCA

GCC

GAC

CTG

624

Glu

Ala

Pro

Asp

Ser

íle

Thr

Trp

Lys

Pro

Tyr

Asp

Ala

Asp

Leu

195

200

205

GAC

CCC

ACC

GAG

AAC

CCC

TTC

GAC

CTG

CTT

GAC

TTC

AAC

CAG

ACG

CAG

672

Asp

Pro

Thr

Glu

Asn

Pro

Phe

Asp

Leu

Asp

Phe

Asn

Gin

Thr

Gin

210

215

220

CCT

GAG

AGG

GGC

GAC

AAC

CTC

ACC

AGG

ATC

GTG

C-GA

GGC

CAG

GAA

720

Pro

Glu

Arg

Gly

Asp

Asn

Leu

Thr

Arg

íle

Val

Gly

Gin

Glu

225

230

235

240

TGC

AAG

GAC

GGG

GAG

TGT

CCC

TGG

CAG

GCC

CTG

CTC

ATC

AAT

GAG

GAA

768

Cys

Lys

Asp

Gly

Glu

Cys

Pro

Trp

Gin

Ala

Leu

íle

Asn

Glu

G1U

245

250

255

AAC

GAG

GGT

TTC

TGT

GGT

GGA

ACT

ATT

CTG

AGC

GAG

TTC

TAC

ATC

CTA

816

Asn

Glu

Gly

Phe

Cys

Gly

Thr

íle

Leu

Ser

Glu

Phe

Tyr

íle

Leu

260

265

270

ACG

GCA

GCC

CAC

TGT

CTC

TAC

CAA

GCC

AAG

AGA

TTC

AAG

GTG

AGG

GTA

864

Thr

Ala

His

Cys

Leu

Tyr

Gin

Ala

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

Arg

Val

275

280

285

GGG

GAC

CGG

AAC

ACG

GAG

CAG

GAG

GGC

GGT

GAG

GCG

GTG

CAC

GAG

912

Gly

Asp

Arg

Asn

Thr

Glu

Gin

Glu

Gly

Glu

Ala

Val

His

G1U

290

295

300

GTG

GAG

GTG

GTC

ATC

AAG

CAC

AAC

CGG

TTC

ACA

AAG

GAG

ACC

TAT

GAC

960

Val

Glu

Val

íle

Lys

His

Asn

Arg

Phe

Thr

Lys

Glu

Thr

Tyr

Asp

305

310

315

320

TTC

GAC

ATC

GCC

GTG

CTC

CGG

CTC

AAG

ACC

CCC

ATC

ACC

TTC

CGC

ATG

1008

Phe

Asp

íle

Ala

Val

Leu

Arg

Leu

Lys

Thr

Pro

íle

Thr

Phe

Arg

Met

325

330

335

AAC Asn

GTG GCG

CCT Pro 340

GCC Ala

TGC Cys

CTC Leu

CCC Pro

GAG Glu 345

CGT Arg

GAC TGG

GCC Ala

GAG TCC

ACG Thr

1056

Val

Ala

Asp

Trp

Glu 350

Ser

CTG

ATG

ACG

CAG

AAG

ACG

GGG

ATT

GTG

AGC

GGC

TTC

GGG

CGC

ACC

CAC

1104

Leu

Met

Thr

Gin

Lys

Thr

Gly

íle

Val

Ser

Gly

Phe

Gly

Arg

Thr

His

3S5

360

365

GAG

AAG

GGC

CGG

CAG

TCC

ACC

AGG

CTC

AAG

ATG

CTG

GAG

GTG

CCC

TAC

1152

Glu

Lys

Gly

Arg

Gin

Ser

Thr

Arg

Leu

Lys

Met

Leu

Glu

Val

Pro

Tyr

370

375

380

GTG GAC CGC

AAC AGC

TGC AAG

CTG TCC AGC

AGC Ser 395

TTC Phe

ATC íle

ATC ACC

CAG Gin 400

1200

Val 385

Asp

Arg

Asn

Ser

Cys 390

Lys

Leu

Ser Ser

íle

Thr

AAC

ATG

TTC

TGT

GCC

GGC

TAC

GAC

ACC

AAG

CAG

GAG

GAT

GCC

TGC

CAG

1248

Asn

Met

Phe

Cys

Ala

Gly

Tyr

Asp

Thr

Lys

Gin

Glu

Asp

Ala

Cys

Gin

405

410

415

GGG

GAC

AGC

GGG

GGC

CCG

CAC

GTC

ACC

CGC

TTC

AAG

GAC

ACC

TAC

TTC

1296

Gly

ASp

Ser

Gly Gly

Pro

His

Val

Thr

Arg

Phe

Lys

Asp

Thr

Tyr

Phe

420

425

430

GTG

ACA

GGC

ATC

GTC

AGC

TGG

GGA

GAG

AGC

TGT

GCC

CGT

AAG

GGG

AAG

1344

Val

Thr

Gly

íle

Val

Ser

Trp

Gly

Glu

Ser

Cys

Ala

Arg

Lys

Gly

Lys

435

440

445

TÁC

GGG

ATC

TAC

ACC

AAG

GTC

ACC

GCC

TTC

CTC

AAG

TGG

ATC

GAC

AGG

1392

Tyr

Gly

íle

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Ala

Phe

Leu

Lys

Trp

íle

Asp

Arg

450

455

460

TCC

ATG

AAA

ACC

AGG

GGC

TTG

CCC

AAG

GCC

AAG

AGC

CAT

GCC

CCG

GAG

1440

Ser

Met

Lys

Thr

Arg

Gly

Leu

Pro

Lys

Ala

Lys

Ser

His

Ala

Pro

Glu

465

470

475

480

GTC

ATA

ACG

TCC

TCT

CCA

TTA

AAG

TGA

1467

Val

íle

Thr

Ser

Pro

Leu

Lys

*

435 (2) Údaje k sekvencií ID NO: 44:

(i) Dáta sekvencie (A) DÍžka: 489 aminokyselín (B) Druh: aminokyseliny (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: Proteín (xi) Opis sekvencie. Sekvencia ID NO: 44:

Met 1

Gly

Arg

Pro

Leu 5

His

Leu

Val

Leu

Leu 10

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala 15

Gly

Leu

Leu 20

Gly

Glu

Ser

Leu

Phe 25

íle

Arg

Glu

Gin 30

Ala

Asn

íle

Leu 35

Ala

Arg

Val

Thr

Arg 40

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu 45

Glu

Met

Lys

Lys 50

Gly

His

Leu

Glu

Arg 5S

Glu

Cys

Met

Glu

Glu 60

Thr

Cys

Ser

Tyr

Glu 65

Glu

Ala

Arg

Glu

Val 70

Phe

Glu

Asp

Ser

Asp 75

Lys

Thr

Asn

Glu

Phe 80

Trp

Asn

Lys

Tyr

Lys 8 S

Asp

Gly

Asp

Gin

Cys 90

Glu

Thr

Ser

Pro

Cys 95

Gin

Asn Gin Gly Lys

Cys

Lys Asp Gly

Leu 105

Gly

Glu

Tyr Thr

Cys 110

Thr

Cys

100

Leu

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Glu

Leu

Phe

Thr

Arg

Lys

Leu

115

120

125

Cys

Ser

Leu

Asp

Asn

Gly

Asp

Cys

Asp

Gin

Phe

Cys

His

Glu

Gin

130

135

140

Asn

Ser

Val

Cys

Ser

Cys

Ala

Arg

Gly

Tyr

Thr

Leu

Ala

Asp

Asn

145

150

155

160

Gly

Lys

Ala

Cys

íle

Pro

Thr

Gly

Pro

Tyr

Pro

Cys

Gly

Lys

Gin

Thr

165

170

175

Leu

Glu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

Ala

Gin

Ala

Thr

Ser

Gly

180

185

190

Glu

Ala

Pro

Asp

Ser

íle

Thr

Trp

Lys

Pro

Tyr

Asp

Ala

Asp

Leu

195

200

205

Asp

Pro

Thr

Glu

Asn

Pro

Phe

Asp

Leu

Asp

Phe

Asn

Gin

Thr

Gin

210

215

220

Pro

Glu

Arg

Gly

Asp

Asn

Leu

Thr

Arg

íle

Val

Gly

Gin

Glu

225

230

235

240

Cys

Lys

Asp

Gly

Glu

Cys

Pro

Trp

Gin

Ala

Leu

íle

Asn

Glu

245

250

255

Asn

Glu

Gly

Phe

Cys

Gly Gly

Thr

íle

Leu

Ser

Glu

Phe

Tyr

íle

Leu

260

265

270

Thr

Ala

His

Cys

Leu

Tyr

Gin

Ala

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

Arg

Val

275

280

285

Gly

Asp

Arg

Asn

Thr

Glu

Gin

G1 u

Glu

Gly

Glu

Ala

Val

His

Glu

220 295 300

Val Glu Val Val íle Lys His Asn

305 310

Phe Asp íle Ala Val Leu Arg Leu

325

Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro

340

Arg	Phe Thr 315	Lys	Glu	Thr	Tyr	Asp 320
Lys	Thr	Pro	íle	Thr	Phe	Arg	Met
	330					335
Glu	Arg	Asp	Trp	Ala	Glu	Ser	Thr
345					350

Leu Met Thr Gin Lys

355

Thr Gly íle Val

360

Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 365

Glu	Lys 370	Gly	Arg	Gin	Ser	Thr 375	Arg
Val 385	Asp	Arg	Asn	Ser	Cys 3 90	Lys	Leu
Asn	Met	Phe	Cys	Ala 405	Gly	Tyr	Asp

Leu	Lys	Met	Leu 380	Glu	Val	Pro	Tyr
Ser	Ser	Ser	Phe	íle	íle	Thr	Gin
		395					400
Thr	Lys	Gin	Glu	Asp	Ala	Cys	Gin
	410					415

Gly

Asp

Ser

Gly 420

Gly

Pro

His

Val

Thr 425

Arg

Phe

Lys

Asp

Thr 430

Tyr

Phe

Val

Thr

Gly 435

íle

Val

Ser

Trp

Gly 440

Glu

Ser

Cys

Ala

Arg 445

Lys

Gly

Lys

Tyr

Gly 450

íle

Tyr

Thr

Lys

Val 455

Thr

Ala

Phe

Leu

Lys 460

Trp

íle

Asp

Arg

Ser 465

Met

Lys

Thr

Arg

Gly 470

Leu

Pro

Lys

Ala

Lys 475

Ser

His

Ala

Pro

Glu 480

Val

íle

Thr

Ser

Pro

Leu

Lys

*·

485

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Analóg faktora ΧΔ, zahŕňajúci jednu deléciu aminokyselín Arg 180 až Arg234 v aminokyselinovej sekvencií faktora ΧΔ a jednu modifikáciu v oblasti aminokyselinovej sekvencie medzi Glyl73 a Argl79, pričom modifikácia predstavuje miesto premeny pre proteázu, ktorá za prírodných podmienok sekvenciu faktora X na tomto mieste neštiepi.
2. Analóg faktora ΧΔ podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že táto modifikácia spočíva vo výmene minimálne jednej aminokyseliny v oblasti aminokyselinovej sekvencie medzi Gly 173 a Argl79, založené na číslovaní aminokyselín podľa obr. 1.
3. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje sekvenciu faktora X zahŕňajúcu Glyl73 - R6 - R5 - R4 - R3 - R2 - Argl79/Rl (235), kde

a) R1 je aminokyselina vybraná zo skupiny Val, Ser, Thr, íle alebo Ala,

b) R2 je aminokyselina vybraná zo skupiny Glu, Thr, Pro, Gly, Lys alebo Arg,

c) R3 je aminokyselina vybraná zo skupiny Leu, Phe, Lys, Met, Gin, Glu, Ser, Val, Arg alebo Pro,

d) R4 je aminokyselina vybraná zo skupiny Thr, Asp, Asn, íle, Ser, Met, Pro, Arg alebo Lys,

e) R5 je aminokyselina vybraná zo skupiny Asn, Lys, Ser, Glu, Gin, Ala, His alebo Arg, a

f) R6 je aminokyselina vybraná zo skupiny Asp, Phe, Thr, Arg, Leu alebo Ser.
4. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého nároku 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že táto modifikácia predstavuje miesto premeny pre proteázu vybranú zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa alebo kalikreín, alebo derivát týchto proteáz.
5. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého nároku 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa vyskytuje ako jednoreťazcová molekula v enzymaticky inaktivnej forme.
6. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého nároku 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že táto modifikácia umožňuje aktiváciu inaktívneho polypeptidu jednoreťazcového analógu faktora ΧΔ na dvojreťazcovú aktívnu formu analógu faktora Xa.
7. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého nároku 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ďalšiu modifikáciu v oblasti C-koncovej aminokyselinovej sekvencie faktora X.
8. Analóg faktora ΧΔ podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že táto modifikácia je vykonaná v C-koncovej časti β-peptidického štiepneho miesta.
9. Analóg faktora ΧΔ podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m, že táto modifikácia predstavuje mutáciu, deléciu alebo vloženie v oblasti aminokyselinovej sekvencie faktora X medzi pozíciou aminokyseliny Arg469 a Ser476.
10. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého nároku 7 až 9, vyznačujúci sa tým, že táto modifikácia zabraňuje odštiepeniu β-peptidu.
11. Analóg faktora ΧΔ podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa deléciu β-peptidu faktora X.
12. Analóg faktora ΧΔ podľa nároku 11,vyznačujúci sa tým, že zahŕňa translačný stop-signál v oblasti C-konca sekvencie faktora X.
13. Analóg faktora ΧΔ podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa translačný stop-signál na pozícii aminokyseliny Lys470 sekvencie faktora X.
14. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že táto modifikácia umožňuje v oblasti aminokyselinovej sekvencie medzi Gly 173 a Argl79 in vitro aktiváciu inaktívneho analógu faktora X na aktívny analóg faktora ΧΔ.
15. Analóg faktora ΧΔ podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že táto modifikácia umožňuje aktiváciu pôsobením proteázy vybranej zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serinproteáz, ako sú faktor Ila, faktor Víla, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X alebo kalikreín, alebo derivátu týchto proteáz.
16. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že obsahuje intaktný β-peptid a vyskytuje sa ako faktor ΧΔα.
17. Analóg faktora ΧΔ podľa niektorého z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa deléciu β-peptidu.
18. Rekombinantná DNA, kódujúca analóg faktora ΧΔ podľa niektorého z nárokov 1 až 17, obsiahnutá vo vektore pre rekombinantnú expresiu kódovaného proteínu.
19. Transformované bunky obsahujúce rekombinantnú DNA podľa nároku 18.
20. Preparát na prípravu a získavanie analógov faktora Xa, obsahujúci čistený analóg faktora ΧΔ, zahŕňa jednu deléciu aminokyselín Argl80 až Arg234 v oblasti aminokyselinovej sekvencie faktora X a jednu modifikáciu v oblasti aminokyselinovej sekvencie medzi Glyl73 a ArgI79, pričom modifikácia predstavuje miesto premeny pre proteázu, ktorá za prírodných podmienok sekvenciu faktora X na tomto mieste neštiepi.
21. Preparát podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jednoreťazcový analóg faktora ΧΔ v enzymaticky inaktívnej forme s čistotou minimálne 80 %, výhodne 90 %, obzvlášť výhodne 95 % a že neobsahuje žiadne inaktívne proteolytické intermediáty analógu faktora X/Xa.

s
22. Preparát podľa niektorého z nárokov 20 alebo 21,vyznačujúci lóg faktora ΧΔ ako faktor ΧΔα.
23. Preparát podľa niektorého z nárokov 20 alebo 21,vyznačuj úci lóg faktora ΧΔ ako faktor ΧΔβ.
24. Preparát podľa niektorého z nárokov 20 až 23, v y z n a č u j ú c i s faktora ΧΔ vo forme jednoreťazcovej molekuly v izolovanej forme.
25. Preparát podľa niektorého z nárokov 20 až 24, v y z n a č u j ú c i s faktora ΧΔ s vysokou stabilitou a štruktúrnou integritou molekuly.
26. Preparát podľa niektorého z nárokov 20 až 25, v y z n a č u j ú c i s t ý m , že obsahuje anat ý m , že obsahuje anatý že obsahuje analóg tý žc obsahuje analóg že obsahuje analóg tý a

faktora ΧΔ, majúci modifikáciu umožňujúcu in vitro aktiváciu analógu faktora ΧΔ na analóg faktora Xa.
27. Preparát podľa niektorého z nárokov 20 až 26, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že je formulovaný ako farmaceutický preparát.
28. Preparát podľa nároku 27, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že je uložený vo vhodnom zariadení, prednostne v aplikátore, v kombinácii s proteázou vybranou zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serinproteáz, ako sú faktor Ila, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa alebo kalikreín, alebo derivátom týchto proteáz.
29. Preparát podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že jednotlivé zložky sú vzájomne priestorovo oddelené.
30. Preparát obsahujúci čistený analóg faktora Xa s vysokou stabilitou a štruktúrnou integritou, ktorý neobsahuje najmä inaktívne intermediáty analógov faktora ΧΔ/Xa a produkty autoproteolytického odbúravania, a ktorý je získateľný aktiváciou analógu faktora ΧΔ podľa niektorého z nárokov 1 až 19.
31. Preparát podľa nároku 30, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje aktívny analóg faktora Xa v izolovanom stave vo forme dvojreťazcových molekúl.
32. Preparát podľa niektorého z nárokov' 30 alebo 31,vyznačujúci sa tým, že obsahuje aktívny analóg faktora Xa s čistotou minimálne 80 %, výhodne 90 %, obzvlášť výhodne 95 % a že neobsahuje žiadne inaktívne proteolytické intermediáty analógu faktora X/Xa.
33. Preparát podľa niektorého z nárokov 30 až 32, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že obsahuje nosič vo fyziologicky akceptovateľnej forme a je dlhodobo skladovateľný v stabilnej forme.
34. Preparát podľa niektorého z nárokov 19 až 32, vyznačujúci sa tým, že obsahuje pripadne ako ďalšiu zložku krvný faktor alebo aktivovanú formu krvného faktora.
35. Preparát podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako ďalšiu zložku minimálne jednu zložku s faktor VlII-bypassovou aktivitou.
36. Preparát podľa niektorého z nárokov 20 alebo 35, vyznačujúci sa tým, že je formulovaný ako farmaceutický preparát.
37. Použitie preparátu podľa niektorého z nárokov 20 až 36 na výrobu liečiva.
38. Použitie preparátu podľa niektorého z nárokov 20 až 36 na výrobu liečiva na liečenie pacientov s poruchami zrážania krvi, ako sú pacienti trpiaci na hemofíliu, u ktorých sa vyvinuli inhibičné protilátky.
39. Spôsob prípravy preparátu obsahujúceho čistený rekombinantný analóg faktora ΧΔ, vyznačujúci sa tým, že analóg faktora ΧΔ, získaný rekombinantnou prípravou, sa izoluje ako jednoreťazcová molekula a Čistí sa chromatografickým postupom.
40. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky: - príprava nukleovej kyseliny na kódovanie analógu faktora ΧΔ podľa niektorého z nárokov 1 až 17, - transfekcia vhodnej bunky, - expresia analógu faktora ΧΔ, - izolácia jednoreťazcového analógu faktora ΧΔ a - čistenie polypeptidu.
41. Spôsob prípravy preparátu, obsahujúceho aktívny analóg faktora Xa, vyznačujúci sa t ý m , že sa preparát, pripravený podľa niektorého z nárokov 39 alebo 40, podrobí aktivačnému kroku.
42. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že sa preparát, obsahujúci jednoreťazcový analóg faktora ΧΔ, uvedie do styku s proteázou vybranou zo skupiny endoproteáz, ako sú kexín/Kex2, furín/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, zo skupiny serínproteáz, ako sú faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X alebo kalikreín, alebo derivátom týchto proteáz, za podmienok umožňujúcich štiepenie na dvojreťazcovú formu analógu faktora Xa.
43. Spôsob podľa nároku 42,vyznačujúci sa tým, že táto proteáza je imobilizovaná.
44. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 43, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa získa vyčistený analóg faktora Xa s vysokou stabilitou a štruktúrnou integritou, ktorý najmä neobsahuje inaktívne intermediáty analógu faktora ΧΔ/Xa.