SK280854B6

SK280854B6 - Spôsob riadeného, obmedzeného proteolytického štiepenia proteínov

Info

Publication number: SK280854B6
Application number: SK309-93A
Authority: SK
Inventors: Peter Turecek
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1992-04-06
Filing date: 1993-04-06
Publication date: 2000-08-14
Also published as: FI107166B; NO931224L; JPH0698791A; DE59309646D1; AT397390B; US5432062A; FI931553A; CA2092776A1; CZ53893A3; HU9300788D0; SK30993A3; JP2832129B2; ATE181358T1; FI931553A0; CZ282519B6; PL298390A1; DK0565511T3; ES2134834T3; EP0565511A1; NO307384B1

Abstract

Je opísané riadené, obmedzené proteolytické štiepenie proteínov, najmä proenzýmov, pri ktorom sa vykonáva spracovanie s proteázami za prítomnosti detergentu alebo za prítomnosti chaotropnej substancie, látky, ktorá ruší trojrozmernú štruktúru väzieb vodíkovými mostíkmi vo vode s výnimkou solí aktívnych pri zrážaní. Pritom sa získajú enzýmové, prípadne proteínové fragmenty. Spôsob je obzvlášť vhodný na jednoduchú metódu cieleného štiepenia protrombínu za získania trombínu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu riadeného, obmedzeného proteolytického štiepenia proteínov, hlavne proenzýmov, kvôli získaniu enzýmov, prípadne proteínových fragmentov, pri ktorom sa proteín spracuje proteázou. Vynález sa týka najmä spôsobu získavania trombínu z protrombínu.

Doterajší stav techniky

Podobný spôsob je známy z EP-A 0 378 798. Podľa tohto spôsobu sa protrombín z plazmy alebo frakcie plazmy adsorbuje na pevný nosič (imobilizuje) a adsorbát sa spracuje s Ca²⁺ iónmi. Ca²⁺-ióny sa používajú v koncentrácii až 30 mM a pôsobia spolu rovnako z plazmy pochádzajúcimi a na nosiči adsorbovanými proteázami - odštiepenie trombínu z adsorbátu. Ako pevný nosič sa používa metakrylový a akrylový kopolymér.

Je ďalej známe, že trypsín odbúrava rozpustený protrombín na fragmenty s nízkou molekulovou hmotnosťou, pričom dochádza k úplnej strate trombínovej aktivity (Biochim. Biophys. Act. 329, 221 - 232 (1973)); proteolytické odbúranie protrombínu nekončí pri trombíne, a preto nie je táto metóda na získanie trombínu vhodná.

Všetky uvedené postupy vedú, podľa použitých proteáz a podmienok spracovania, k rozdielnym štiepnym produktom protrombínu, ktoré by mohli byť sčasti použité terapeuticky (napr. trombín), sčasti diagnosticky a na získavanie špecifických protilátok. Na všetky tieto použitia je však potrebné, aby boli proteínové fragmenty vo vysokej čistote, čo je závislé od charakteru pracovných podmienok, pretože všetky známe metódy štiepenia vedú k značnému počtu fragmentov. Ďalšia nevýhoda tohto mnohostupňového a časovo náročného čistiaceho postupu spočíva v tom, že je sprevádzaný značnými stratami znižujúcimi výťažok.

Cieľom vynálezu je odstrániť tieto nevýhody a navrhnúť zlepšený spôsob získavania enzýmov, prípadne proteínových fragmentov, spracovaním proteázami, pričom by tento spôsob mal byť vhodný najmä na jednoduché získanie trombínu.

Podstata vynálezu

Tento cieľ sa dosiahne tak, že sa spracovanie proteázou vykonáva za prítomnosti detergentov, definovaných ako aniónové, katiónové alebo neiónové povrchovo aktívne látky, majúce aspoň jednu hydrofilnú a jednu hydrofóbnu skupinu, zvolené zo skupiny zahŕňajúcej z aniónových tenzidov sulfátovaný oxyetylovaný alkylfenol, sulfátovaný lauryléteralkohol, dodecylbenzénsulfonát sodný, 2-sulfoetyloleát sodný, N-metyl-N-oleoyletanolsulfonát sodný, dodecylsulfát sodný, cholát sodný, deoxycholát sodný, dodecylsulfonát sodný a dodecyl-N-sarkonizát sodný; z katiónových tenzidov dodecyldimetylbenzyl-amóniumchlorid, oxyetylované amíny, cetyltrietylamóniumbromid, tetradecyl-amóniumbromid, dodecylpyrimidínium-chlorid a hexadecyltrimetylamónium-chlorid; z amfolytických tenzidov dodecyl-[í-alanín. kyselina N-dodecylaminoetánsulfónová, palmitoyllyzolecitín a dodecyl-N-betain a zneiónových tenzidov kondenzáty etylénoxidu a propylénoxidu, oxyetylovaný alkylfenol, parciálne estery mastných kyselín C12-22 a hexitol anhydridov, polyoxyetylované deriváty parciálnych esterov, získaných adíciou polyoxyetylénových reťazcov na neesterifikované hydroxyly, polyoxyetylénové parciálne estery mastných kyselín a polyoxyetylénové étery mastných alkoholov alebo za prítomnosti močoviny, guanidínhydrochloridu, tiokyanátu alebo látky s rovnakými chaotropnými vlastnosťami s výnimkou solí aktívnych pri zrážaní, pričom tieto látky sú definované ako látky, ktoré rušia trojrozmernú štruktúru väzieb vodíkovými mostíkmi vo vode.

Vynález je založený na poznatku, že proteolytické štiepenie proteínov, hlavne proenzýmov, ako je protrombín, sa úspešne dosiahne, prípadne sa podporí, ak sa vykonáva za prítomnosti detergentu alebo za prítomnosti chaotropnej substancie. Ukázalo sa, že spôsob štiepenia proteínov sa odlišuje podľa druhu a koncentrácie týchto látok. Tento poznatok otvára možnosť voliť reakčné podmienky tak, aby sa tvorilo len málo a celkom určité proteínové fragmenty.

Výhodný variant spôsobu podľa vynálezu spočíva v tom, že sa spracováva proenzým, ktorý je imobilizovaný na pevnom nosičovom materiáli zo skupiny zahŕňajúcej anorganické nosiče, hlavne ťažko rozpustné soli alebo cheláty dvojmocných kovov, výhodne kovov alkalických zemín. Tento variant umožňuje ľahšie získanie odštiepených proteínových fragmentov z adsorbovaného proenzýmu, pretože zvyšná časť - adsorbovaná na nosiči - môže byť jednoducho oddelená s nosičom od reakčného roztoku.

Podľa postupu opísaného v EP-A 0 378 798 sa ako nosiče používajú kopolyméry, ktoré však majú tú nevýhodu, žc uvoľňujú do roztoku, obsahujúceho trombín, akrylový a metakrylový monomér, ktorý možno len ťažko odstrániť, a tým znečisťujú vyrobený farmaceutický prípravok. Takéto uvoľňovanie („leakage“) je známe pre všetky druhy organických polymerizačných nosičov. Ukázalo sa však, že podľa vynálezu vykonané cielené štiepenie proenzýmu, obzvlášť protrombínu, sa darí nielen na kopolyméroch, ale i na iných nosičoch, napríklad na ťažko rozpustných soliach, ako je Ca₃(PO₄)₂, CaSO₄, CaCO₃, BaSO₄, BaCO₃ alebo citrát bárnatý. Soli môžu byť pridané do roztoku, obsahujúceho protrombín alebo tiež môžu byť pripravené vylúčením v roztoku obsahujúcom protrombín.

Zvláštnou prednosťou dvojmocných iónov nosiča ďalej je, že viažu selektívne protrombín cez jeho y-karboxylové zakončenie. Protrombínové fragmenty, vznikajúce pri proteolytickom spracovaní protrombínu, nemajú vzhľadom na chýbajúce γ-karboxylové zakončenie, žiadnu afinitu k dvojmocným iónom, a tým k nosiču.

Ako ďalší nosič sú vhodné tiež hydroxyapatit, hydroxyapatitový gél alebo nosič afinitnej chromatografie pre cheláty kovov v cykle dv^mocného katiónu (napr. Pharmacia Chelating Sepharose j.

Na proteolytické štiepenie proenzýmov je vhodný veľký počet proteáz (napríklad chymotrypsín, dispáza, endopeptidáza Arg-C, endoproteináza Lys-C, endoproteináza Glu-C, endoproteináza Asp-N, faktor Xa, kalikreín, papaín, pepsín, plazmín, pronáza, proteináza K, stafylokoaguláza, subtilizín, trombín, trypsín (najmä ľudský, hovädzí, prasačí), proteázy trypsínového typu z Artropód alebo mikroorganizmov, ako je napríklad Streptomyces griseus - trypsín, serín - proteázy zjedovatých hadov, ako je Angkistrodon rhodostoma, Bothrops atrox, Dispholidus typus, Echis carinalus, Naja nigrocollis, Oxyuranus scutellatus scutellatus medzi inými). Výhodne používané proteázy sú trypsín, chymotrypsín, kalikreín, dispáza alebo endoproteinázy Glu-C, Lys-C alebo Asp-N. Môžu byť tiež použité rekombinantné proteázy.

Ukázalo sa, že proenzým môže byť za prítomnosti detergentu tak cielene štiepený, aby získaný enzým tvoril hlavný podiel fŕagmentovej zmesi. Ako detergent je vhodný deoxycholát (DOS), ktorý sa výhodne používa a tiež iné látky ako dodecylsulfát (SDS), CHAPS, deriváty polyoxy

SK 280854 Β6 etylénu ako Brij, Tween, Triton a Pluronic. Prítomnosť detergentu uľahčuje ďalšiu desorpciu vzniknutých proteínových fragmentov z nosičov.

Typické chaotropné substancie, ktoré sa používajú v spôsobe podľa vynálezu, sú močovina, hydrochlorid guanidínu a jeho tiokyanát, ale nie sú vhodné soli aktívne pri zrážaní ako napríklad soli vápnika, ktoré súčasne pôsobia chaotropné.

Získaný supematant, ktorý obsahuje požadovaný enzým, môže byť podrobený ďalšiemu čisteniu. Výhodne možno na tento účel použiť gélovú permeačnú chromatografiu alebo afinitnú chromatografiu. Na získanie koncentrovaných vzoriek sa odporúča použitie metód afinitnej chromatografie. Vhodné sú triazínafinitné chromatografické nosiče s ligandami typu Cibacron®-Blue F3GA (výrobok firmy ICI) alebo používajúce farbivá. Proteínové fragmenty môžu byť adsorbované priamo z desorpčného média po vykonaní aktivácie pevnou fázou na afinitnú matricu (napr. Fractogel® TSK AF-Blue (vyrobené firmou Merck), Blue-Sepharose* CL-6B (vyrobené firmou Pharmacia) vsádzkovo alebo vo forme balenej kolóny. Potom sa proteínové fragmenty eluujú premývaním pufrom detergentu a nakoniec vysokomolekulárnym (napr. IM) chaotrópom (napr. KSCN alebo NH₄SCN).

Eluát môže byť gélovou permeačnou chromatografiou (napr. cez Sephadex G25), diafiltráciou alebo dialýzou zbavený chaotrópu a uvedený do vhodného pufra alebo roztoku soli. Ďalšie čistenie kvôli dosiahnutiu homogenity sa môže vykonávať známym spôsobom chromatografiou s reverznou fázou, afinitnou chromatografiou alebo gélovou permeačnou chromatografiou.

Spôsob podľa vynálezu je vhodný najmä na získanie čistého trombínu. Predložený vynález sa preto tiež týka výroby farmaceutických prípravkov, obsahujúcich trombín, pričom sa výhodná forma vyhotovenia vyznačuje tým, že

- sa uvedie do kontaktu roztok, obsahujúci protrombín, s pevným nosičom, najmä ťažko rozpustnou soľou alebo chelátom dvojmocného kovu, výhodne kovu alkalickej zeminy, kvôli imobilizácii protrombínu na nosič,

- imobilizovaný protrombín sa spracuje s proteázou, najmä trypsínom, za prítomnosti detergentu, výhodne deoxycholátu, pričom sa získa roztok, obsahujúci trombín, ktorý sa oddelí, prečistí a

- spracuje sa na farmaceutický prípravok.

Zistilo sa, že spracovaním s detergentom sa dosiahne výrazné zníženie vírusovej aktivity v prípade, že sa použije východiskový produkt, ktorým bola vírusom kontaminovaná plazma viacerých darcov. V jednom prípade sa zistilo, že v jednom trombínovom prípravku vyrobenom podľa vynálezu nebol preukázateľný žiaden Vaccinia vírus, i keď východiskový materiál (fermentačný supematant) Vaccinia vírus obsahoval. Samozrejme, je možné v rámci spôsobu podľa vynálezu použiť i prídavné opatrenia na inaktiváciu prípadne prítomných infekčných agens, napríklad spracovaním lyofilizovaného produktu zahrievaním parou.

Spôsob podľa vynálezu na získanie trombínu sa výhodne vykonáva nasledovne:

Najprv sa roztok, obsahujúci protrombín, uvedie do kontaktu s pevným nosičom, kvôli adsorpcii protrombínu. Ako roztok, obsahujúci protrombín, sa môžu použiť nielen plazmy alebo frakcie plazmy, ale tiež bunkové kultivačné médium obsahujúce rekombinantný protrombín. Kvôli vykonaniu mobilizácie sa protrombín naviazaný na nosič vhodne oddelí a premyje, aby sa odstránili nešpecifický naviazané proteíny, ktoré by mohli znečisťovať neskorší konečný produkt. Potom sa imobilizovaný protrombín spracuje za prítomnosti deoxycholátu s proteázou, aby sa od štiepil trombín z protrombínu, pričom sa získa roztok, obsahujúci trombín a pevná látka, ktorá sa oddelí od roztoku. Toto sa vykoná sedimentáciou alebo filtráciou.

Trombín obsahujúci médium sa môže podrobiť opísaným stupňom čistenia. Výhodne sa vykonáva afínitná chromatografia s Fractogel® TSK-AF Blue (Merck) nasledovaná chromatografiou na Sephadexe-G25.

Potom sa získaný čistý trombín obsahujúci roztok prípadne zahustí ultrafiltráciou alebo lyofilizáciou a spracuje na farmaceutický prípravok.

Vynález je bližšie vysvetlený nasledujúcimi príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príprava imobilizovaného protrombínu

Bunkové kultivačné médium podľa PCT-prihlášky WO 91/11519, ktoré obsahuje rekombinantný ľudský protrombín, sa zmieša s 5 g práškového Ca₃(PO₄)₂ na 100 j protrombínu a ľahko sa mieša jednu hodinu pri 4 °C. Potom sa pevná látka odstredí pri 5000 g, získaná peleta sa resuspenduje v 40 ml 2 mM tris/HCl-pufra (pH 7,4), 10 minút sa mieša a znova sa odstredí pri 5 000 g. Tento postup sa opakuje so 40 ml 5 % (hmotn./obj.) síranu amónneho v uvedenom pufri a nakoniec znova so 40 ml čistého pufra.

Rovnakým spôsobom sa môže spracovať ako východiskový materiál, obsahujúci protrombín, napr. čiastočný protrombínový komplex, tiež zmes faktorov II, IX a Xm, na prípravu imobilizovaného protrombínu.

Príklad 1

Vplyv reakčného prostredia na tryptické štiepenie imobilizovaného protrombínu

Kvôli stanoveniu vplyvu chaotropných substancií a detergentov na tryptické štiepenie protrombínu sa najprv pripravia štyri roztoky (A - D) tris/HCl-pufra (20 mM, pH 8,3) s nasledujúcimi prísadami (štvrtý roztok (D) slúži ako porovnávací): roztok A: močovina (0,5 M) roztok B: Na-deoxycholát (0,05 M) roztok C: Na-dodecylsulfát (0,05 M) roztok D: žiadna prísada ml roztokov A - D sa potom pridajú vždy k 200 mg pufrom zvlhčenej, premytej pelety (vyrobená, ako je opísané) a trepe sa s 20 μΜ tris/HCl pufra, obsahujúceho 1 mg trypsínu/ml pri teplote miestnosti. Po 1, 2 a 3 hodinách sa odoberú vzorky suspenzií, pevná fáza sa odstredí a supernatant sa analyzuje pomocou Immun-Westem-Blot na zloženie fragmentov.

V tabuľke 1 sú integrály plochy píkov pruhov fragmentov pri 12, 19, 23, 25,5, 33, 35 a 44 kD po denzitometrickom meraní Immun-Westem-Blot. Je zrejmé, že v závislosti od zvoleného prostredia je možné preukázať rôzne veľké tryptické fragmenty v rozdielnych množstvách. Na rozdiel po 3-hodinovej inkubácii v čistom tris-pufri (roztok D), zostávajú vo všetkých ostatných roztokoch (A - C) fragmenty v rozsahu molekulovej hmotnosti nad 30 kD. Fragmenty 33 kD a 35 kD zodpovedajú trombínu, pričom 33 kD je priradený aktívnej forme.

Za prítomnosti deoxycholátu (roztok B) sa aktívny trombín tvorí ako hlavný fragment, ktorý tiež po 3-hodinovom spracovaní trypsínom nie je odbúravaný na menšie oligopeptidy.

SK 280854 Β6

Tabuľka 1

Molekulová hmotnosť (kD)	,2	19	23	25,5	33	35	44
Roztok	Reakčný čas (h)	Integrál plochy pflíov
	1	26	18	22	14	94	95
A	2	22	20	13		54	20
	3	24	27	14		51	17
	1				31	155	90
Θ	2	15				175	25
	3	18				170
	1						53	11
C	2						35	2
	3						9
	1	25		132		117	22
D	2	25		120			34
	3	42		129

Tabuľka 2

Molekulová hmotnosť (kD)	12	16	19	20	23	33	34	35	44	47	50	52	54	55	71	75
Proteáza	Integrál plochy píkov
Kalikrein		12		31						15	16		16			59
Dispáza								36			27	8	39
H-chymotrypein								7	57		9			18	44
Trypsln	20				14	56
Endoprcrteináza Glu-C		13	28			39		17	13	17			78
Endoproteináza Lys-C									6		51					21
Endoproteináza Asp-N						21		Ô3			11		11			19
Faktor Xa							12	10					31			98

Príklad 2

Štiepenie imobilizovaného protrombínu pomocou rôznych proteáz (za prítomnosti detergentu)

Z protrombín obsahujúceho bunkového kultivačného média bol, ako je opísané, adsorbovaný protrombín na Ca₃(PO₄)₂ a premytý.

vzoriek vždy po 250 mg pufrom zvlhčeného adsorbátu sa suspenduje v 1 ml 20 mM tris/HCl pufra, pH 8,3, ktorý obsahuje 200 mM Na-deoxycholátu a zmieša sa s 50 ml nasledujúcich ôsmich roztokov enzýmu:

- kalikreín z pankreasu ošípanej, 250 j/ml v 20 mM TBS, pH 8,3

- dispáza I z Bacillus polymyxa, 1 mg/ml v 20 mM TBS, pH 8,3

- chymotrypsín z hovädzieho pankreasu, 350 j/ml v 20 ml TBS, pH 8,3

- trypsín z bravčového pankreasu, 0,76 mg/ml v 20 mM TBS, pH 8,3

- endoproteináza Glu-C zo Staphylococcus aureus V8, 1 mg/ml v 20 mM TBS, pH 8,3

- endoproteináza Lys-C z Lysobacter enzymogenes, 0,1 mg/ml v 20 mM TBS, pH 8,3

- endoproteináza Asp-N zo Pseudomonas fragi, 0,04 mg/ml v 20 mM TBS, pH 8,3

- faktor Xa, ľudský, 20 j/ml

Označenie 20 mM TBS (TBS = tri pufrovaný salinícký roztok) sa vzťahuje na 20 mM tris-HCl-pufor (pH 8,3), ktorý obsahuje 0,9 % NaCl.

Pokusy sa inkubujú dve hodiny, v prípade kalikreínu 20 hodín, pri teplote miestnosti za trepania. Potom sa zmiešajú vzorky z jednotlivých pokusov sSDS-pufrom na vzorky (1 : 1) a pomocou Immun-Westem-Blot analýzy sa skúma zloženie fragmentov.

Integrály plochy píkov fragmentových pruhov 12, 18, 19, 20, 23, 33, 34, 44, 47, 50, 52, 54, 55, 71 a 75 kD sú po denzitometrickom meraní Immun-Westem-Blot uvedené v tabuľke 2.

Je zrejmé, že pomocou uvedených proteáz je možné získať rad fragmentov v oblasti molekulovej hmotnosti 12 až 71 kD. Fragment (33 kD) zodpovedajúci aktívnemu trombínu sa získa tryptickým odbúraním protrombínu v obzvlášť vysokom výťažku.

Príklad 3

Štiepenie imobilizovaného protrombínu za prítomnosti deoxycholátu v rôznych koncentráciách

Ako bolo opísané, najprv sa adsorbuje rekombinantný protrombín z fermentačného média na Ca₃(PO₄)₂.

vzoriek vždy 0,6 g vlhkého adsorbátu sa za trepania pri teplote miestnosti inkubuje vždy s 3 ml 20 mM tris/HCl-pufra, pH 8,3, ktorý obsahuje Na-deoxycholát v koncentráciách 50 mM, 100 mM, 250 mM a 500 mM, po prídavku 60 pl roztoku s koncentráciou 0,76 mg/ml trypsínu. Potom sa skúša jeho trombínová aktivita proti 0,9 % NaCl prepufrovaným vzorkám. Stanoví sa pritom trombínový čas v zrážacom teste s normálnou plazmou, ako i amidolytická aktivita s chromogénnym substrátom TH-1 (2 A-cOH.H-D-CHG-Ala-Arg-p-nitroanilid) fotometrický proti medzinárodnému trombínovému štandardu (obr. 1). Obrázok ukazuje, že výťažok aktívneho trombínu (33 kD-fŕagment) pri 350 mM deoxycholátu má maximum.

Ďalej sa zistilo, že sa vytvorený trombín cez prítomnosť trypsínu ďalej neodbúrava počas najmenej 20 hodín.

Čistenie proteínových fragmentov štiepeného protrombínu

1,5 ml protrombínové fragmenty obsahujúceho z príkladu 3 odobratého roztoku (350 mM DOC) sa adsorbujú s 0,1 % kyselinou trifluóroctovou vH₂O (elučné činidlo A) na HPLC-stlpec s reverznou fázou (Nucleosil 100-5C18, 125 x 4 mm) (prietoková rýchlosť 1,7 ml/min.). Potom sa eluuje 0,1 % kyselinou trifluóroctovou v acetonitrile (eluačné činidlo B) s lineárnym gradientom 30 až 70 % B za 30 minút pri prietokovej rýchlosti 1,7 ml/min. Detekciou pri 220 nm je možné identifikovať 6 hlavných píkov (retenčné časy: 10,01 min., 11,96 min., 12,68 min., 13,47 min., 13,94 min., 14,47 min.), tieto frakcie boli oddelene zhromaždené a lyofilizované. Ďalšia analýza jednotlivých fragmentov sa vykonávala pomocou SDS-PAGE s detekciou vyfarbenia Coomassie, ako i prostredníctvom Immun-Westem-Blot s polyklonálnym zajačí-anti-ľudský protrombín antisérom. Molekulové hmotnosti fragmentov boli stanovené pre šesť hlavných píkov 9 kD, 16 kD, 21 kD, 23 kD, 12 kD a 33 kD.

Príklad 4

Získanie trombínu

K pufrom zvlhčenej pelete (asi 10 g) sa pridá 50 ml roztoku 0,76 mg bravčového trypsínu (Sigma T-0134) na ml v 20 mM tris/HCl-pufra (pH 8,3), ktorý obsahuje 200 mM Na-deoxycholátu a 1 hodinu sa inkubuje pri teplote miestnosti za ľahkého miešania. Potom sa Ca-fosfát oddelí odstredením. Supematant obsahuje v prvom rade

SK 280854 Β6 trombín okrem niektorých malých iných fragmentov protrombínu.

Na čistenie supernatantu sa pripraví kolóna s priemerom 8 cm² naplnená Fractogelom® TSK-AF Blue (Merck) do výšky 12 mm (objem gélu asi 9,6 ml) v 20 mM tris/HCl-pufra a premyje sa tým istým pufrom. Tento a všetky nasledujúce kroky sa vykonávajú pri 4 °C.

Supematant, obsahujúci trombín (asi 50 ml), sa čerpá k adsorpcii prietokovou rýchlosťou 2 ml/min. cez gél. Potom sa eluujú nešpecifický viazané protrombinové fragmenty pomocou 20 ml 0,5 M roztoku NaCl, 40 ml 1,0 M roztoku NaCl a 20 ml tris/HCl-pufra (pH 7,4) pri prietokovej rýchlosti 6 ml/min. Pri obrátenom prietoku 1 ml/min. sa eluujú len protrombinové fragmenty 20 mM tris/HCl-pufrom, ktorý obsahuje 1 M KSCN. Eluát sa meria prietokovou bunkou pri 280 nm fotometrický, celkom sa zhromaždí 15 ml.

Obsah proteínu v eluáte je podľa Bradforda 188 mg/ml. Obr. 2 predstavuje zloženie fragmentov (denzitometrická Immun-Westem-Blot analýza) s dominantným 33 kD - fragmentom (aktívny trombín). Na trombín pripadá asi 30 %, vztiahnuté na obsah proteínov. Podľa stanovenia trombínového času by mohol trombín mať špecifickú aktivitu asi 2 200 m. j./mg proteínu. Tryptickou aktiváciou pevnej fázy by mohlo byť z 1 m. j. protrombínu získaných asi 100 m. j. trombinu.

Získaný roztok, obsahujúci trombín, môže byť známym spôsobom ďalej prečistený, koncentrovaný a ďalej spracovávaný na farmaceutický prípravok.

Príklad 5

Štiepenie rozpusteného protrombínu

Dve vzorky vždy po 1 ml protrombínu obsahujúceho fermentačné médiá sa zmiešajú vždy s 1 ml 40 mM tris/HCl-pufra, pH 8,3, ktorý obsahuje 0,1 M Na-deoxycholátu tak, aby koncentrácia detergentu v roztoku bola 0,05 M. Kvôli porovnaniu sa zmieša tretia vzorka 1 ml protrombín obsahujúceho fermentačného média so 40 mM tris/HCl-pufra bez detergentu. Po prídavku vždy 15 ml roztoku 1 mg trypsínu/ml v 20 mM tris/HCl-pufra, pH 8,3, ktorý obsahuje 0,9 % NaCl, sa vykoná inkubácia za trepania pri teplote miestnosti 4 hodiny.

Príklad 6

Štiepenie rozpusteného protrombínu

Dve vzorky vždy po 1 ml protrombínu obsahujúceho fermentačné médiá sa zmiešajú vždy s 1 ml 40 mM tris/HCl-pufra, pH 8,3, ktorý obsahuje 0,1 M Na-deoxycholátu, prípadne 0,1 M Na-dodccylsulfátu tak, aby koncentrácia detergentu v roztoku bola 0,05 M. Kvôli porovnaniu sa pripraví tretia vzorka 1 ml protrombín obsahujúceho fermentačného média so 40 mM tris/HCl - pufra bez detergentu. Po prídavku vždy 15 ml roztoku 1 mg trypsínu/ml v 20 mM tris/HCl-pufra, pH 8,3, ktorý obsahuje 0,9 % NaCl, sa vykoná inkubácia za trepania pri teplote miestnosti 4 hodiny.

Po 1,2, 3 a 4 hodinách sa vždy alikvotný podiel vzorky zriedi 50 pm Laemmli-pufra(l : 1), povarí a elektroforeticky analyzuje. Immun-Westem-Blot 12 % SDS-polyakrylamidového gélu (1. protilátka: anti-ľudský-faktor II-zajačie sérum, 2. protilátka: kozí-anti-zajačí-IgG-peroxidáza-konjugát, vyvíjanie pomocou 4-chlór-l-naftolu) sa denzitometricky skúma kvôli kvantifikácii fragmentov. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3

Molekulová hmotnosf (kD)		₂₅,5		35
Prídavok	Reakčný čas (h)	Integrál plochy piku
	1			10
Deoxychctól	2			9

	4			β
	1				es
DooeqttuHt	2	6			67
	3	5			69
	4	4			67
			4	9	4
Žiadny	2		3	1	0
	3		0	0	0

Hoci spôsob podľa vynálezu je opísaný na jednotlivých príkladoch získania trombinu z protrombínu, je odborníkom zrejmé, že by bolo možné vykonať podobné štiepenie iných proenzýmov, ako je protrombín analogickým spôsobom. Napríklad by bolo možné týmto spôsobom získať plazmín z plazminogénu, pripadne aktivované faktory zrážania krvi z iných proenzýmov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob riadeného, obmedzeného proteolytického štiepenia proteínov, najmä proenzýmov, na získanie enzýmov, prípadne proteínových fragmentov, obzvlášť trombínu, spracovaním proteázami, vyznačujúci sa t ý m , že sa spracovanie proteínov proteázami vykonáva za prítomnosti detergentu, zvoleného zo skupiny zahŕňajúcej z aniónových tenzidov sulfátovaný oxyetylovaný alkylfenol, sulfátovaný lauryléteralkohol, dodecylbenzénsulfonát sodný, 2-sulfoetyloleát sodný, N-metyl-N-oleoyletanolsulfonát sodný, dodecylsulfát sodný, cholát sodný, deoxycholát sodný, dodecylsulfonát sodný a dodecyl-N-sarkonizát sodný; z katiónových tenzidov dodecyldimetylbenzylamóniumchlorid, oxyetylované amíny, cetyltrietylamóniumbromid, tetradecylamóniumbromid, dodecylpyrimidíniumchlorid a hexadecyltrimetyl-amóniumchlorid; z amfolytických tenzidov dodecyl-p-alanín, kyselina N-dodecylaminoetánsulfónová, palmitoyllyzolecitín a dodecyl-N-betaín a zneiónových tenzidov kondenzáty etylénoxidu a propylénoxidu, oxyetylovaný alkylfenol, parciálne estery mastných kyselín C_l2.₂₂ a hexitol anhydridov, polyoxyetylované deriváty parciálnych esterov, získaných adíciou polyoxyetylénových reťazcov na neesterifikované hydroxyly, polyoxyetylénové parciálne estery mastných kyselín a polyoxyetylénové étery mastných alkoholov alebo za prítomnosti chaotropných látok, vybraných zo skupiny zahŕňajúcej napríklad močovinu, guanidínhydrochlorid a tiokyanát s výnimkou soli aktívnych pri zrážaní.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že proteíny, obzvlášť proenzýmy, sú pri proteolytickom spracovaní imobilizované na pevnom nosičovom materiáli, vybranom zo skupiny zahŕňajúcej kopolyméry a ťažko rozpustné soli alebo cheláty dvojmocných kovov, obzvlášť fosforečnan vápenatý, síran vápenatý, uhličitan vápenatý, síran bámatý, uhličitan bárnatý a citrát bámatý.
3. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 alebo 2, v y značujúci sa tým, že sa proteolytické spracovanie vykonáva trypsínom, chymotrypsínom, kalikreínom, dispázou alebo endoproteinázou Glu-C, Lys-C alebo Asp-N.
4. Spôsob podľa nároku 2 na výrobu trombinu, vyznačujúci sa tým, že sa

- protrombín obsahujúci roztok uvedie do kontaktu s ťažko rozpustnou soľou alebo chelátom dvojmocného kovu, výhodne kovu alkalickej zeminy ako pevným nosičom a protrombin sa imobilizuje na nosič,

- imobilizovaný protrombín sa spracuje s proteázou, najmä trypsínom, za prítomnosti uvedeného detergentu, výhodne deoxycholátu, čím sa získa roztok obsahujúci trombín, ktorý sa oddelí a prečistí.