SK279666B6 - Spôsob výroby 17-oxosteroidov - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby 17-oxosteroidov fermentatívnou oxidáciou 17p-hydroxysteroidov.

Doterajší stav techniky

Spôsob fermentatívnej výroby 17-oxosteroidov je už dlhý čas známy. Už v roku 1938 opísal A. Vercellone a L. Momoli spôsob výroby 4-andrósten-3,17-diónu fermentáciou 5-andrósten-3[},17p-diolu (Ber. 71, 1938, 152-155). Tento spôsob poskytuje vysoké výťažky produktu postupu, keď sa zvolia vhodné mikroorganizmy (Czech 87.068; ref. C.A. 54, 1960, 2441). Je možné nájsť tiež veľa publikácií, v ktorých je opísané, že sa môžu vyrobiť 17-oxosteroidy (ako je 4-andrósten-3,17-dión, 1,4-androstadién-3,17-dión alebo 3-hydroxy-l,3,5,10/-estratrién-17-ón/ za dosiahnutia vysokých výťažkov fermentatívnym odbúravaním postranných reťazcov substrátov, ktoré v pozícii 17β nesú uhľovodíkový reťazec.

Spôsoby, pomocou ktorých by bolo možné v dobrom výťažku oxidovať mikrobiologickou cestou 17β-hydroxysteroidy na 17-oxosteroidy bez toho, že by prebiehala dodatočná premena steroidov, sú známe veľmi málo. N.Welsh a C.Heusghem opisujú spôsob, pomocou ktorého je možné premeniť estradiol za výťažku 95% na estrón, ale tento spôsob nie je reprodukovateľný, lebo autormi použitý organizmus nie je verejnosti dostupný (Compt. Rend. Soc. Biol.., 142, 1948, 1074).

Podstata vynálezu

Teraz vznikla značná potreba vypracovania takéhoto fermentatívneho postupu, lebo chemické spôsoby oxidácie sú skutočne veľmi nákladné. Inak majú chemické spôsoby ten nedostatok, že sa vykonávajú s použitím činidiel, ako je napríklad pyridín a oxid sírový, ktorých odstraňovanie je z hľadiska životného prostredia veľmi problematické.

Teraz bolo zistené, že je možné prekvapivo vyrobiť 17-oxosteroidy vo vysokých výťažkoch tak, že sa na fermentáciu ^-hydroxysteroidov použijú bakteriálne kultúry kmeňov Mycobactérium sp. NRRL B-3805, Mycobactérium sp NRRL B-3683, Mycobactérium phlei NRRL B-8154 alebo Mycobactérium fortuitum NRRL B-8153.

Spôsob podľa predloženého vynálezu sa vykonáva za rovnakých podmienok, za akých sa tiež vykonávajú známe feimentatívne premeny, s použitím uvedených mikroorganizmov týchto bakteriálnych kultúr.

Za podmienok, ktoré sú bežne používané pre uvedené bakteriálne kultúry, sa vo vhodnom živnom médiu za zavzdušňovania vypestuje submerzná kultúra. Potom sa do kultúry pridá substrát (rozpustený vo vhodnom rozpúšťadle, alebo v emulgovanej for me) a fermentuje sa, pokiaľ sa nedosiahne maximálna premena substrátu.

Vhodnými rozpúšťadlami pre substrát sú napríklad metylalkohol, etylalkohol, glykolmonometyléter, dimetylformamid alebo dimetylsulfoxid. Emulgovanie substrátu sa môže napríklad vykonávať tak, že sa tento v mikronizovanej forme, alebo rozpustený v rozpúšťadle miešateľnom s vodou (ako je napríklad metylalkohol, etylalkohol, acetón, glykolmonometyléter, dimetylformamid alebo dimetylsulfoxid), nastrekuje za silnej turbulencie do vody (výhodne ochladenej), ktorá obsahuje bežné emulgačné pomocné činidlá. Vhodné emulgačné pomocné činidlá sú neiónogénne emulgátory, ako sú napríklad adukty etylénoxidu alebo esterov mastných kyselín s polyglykolmi. Ako vhodné (adukty) emulgátory je možné uviesť na trhu bežné zmáčadlá Tegín®, Tween® a Span®.

Optimálna koncentrácia substrátu, okamih pridávania substrátu a fermentačná doba sú závislé od typu použitého substrátu a mikroorganizmu a od podmienok fermentácie. Tieto veličiny sa musia priebežne zisťovať pomocou predbežných pokusov, ako je pre odborníkov na mikrobiologické premeny steroidov všeobecne známe, pre každý možný jednotlivý prípad.

Na vykonávanie spôsobu podľa predloženého vynálezu sa ako substráty používajú výhodne 17β-hydroxysteroidy všeobecného vzorca (I)

v ktorom znamená

Rj vodíkový atóm alebo metylovú skupinu

St zvyšok estrán-17p-olovcho derivátu, obsahujúceho až 5 nekumulovaných dvojitých väzieb, substituovaného v polohe 3 fenolickou hydroxylovou skupinou, nižšou alkoxyskupinou, nižšou 1-alkoxy-alkoxyskupinou, 2-tetra-hydropyranyloxyskupinou, alebo nižšou alkyléndioxyskupinou, ako i prípadne v polohe 5,10 epoxyskupinou a v polohe 19 pripadne metylskupinou. Pod pojmom nižšia alkoxyskupina sa rozumie výhodne skupina, obsahujúca až 4 uhlíkové atómy. Vhodné alkoxyskupiny sú napríklad metoxyskupina alebo tere.-butyloxyskupina.

Pod pojmom nižšia 1-alkoxy-alkoxy skupina sa rozumie výhodne nižšia alkoxy-metoxyskupina s až 4 uhlíkovými atómami valkoxyskupine. Ako príklad je možné uviesť 1-metoxymetoxyskupinu. Pod pojmom nižšia alkyléndioxyskupina sa rozumie obzvlášť skupina s 2 až 6 uhlíkovými atómami, ako je napríklad etyléndioxyskupina alebo 2,2-dimetyl-propyléndioxyskupina.

Substrát, ktorý je vhodný na vykonávanie spôsobu podľa predloženého vynálezu, je napríklad derivát εί1ιύη-17β-ο1ιι všeobecného vzorca (la)

SK 279666 Β6

v ktorom znamená

R.2 vodíkový atóm alebo alkylovú skupinu s až 4 uhlíkovými atómami a

I I

-A-B-C-D- skupiny čiastkových vzorcov

I I II

-CH2-CH2-CH-CH- , -ch₂-ch=c-ch

I I alebo -CH=CH-C=C a

Rj má uvedený význam.

Z týchto substrátov vytvorené deriváty estran-17-ónu, prípadne z týchto zlúčenín éterovým štiepením získané 3-hydroxyzlúčeniny, sú ako je známe farmakologicky účinné a môžu sa ako je známe okrem toho redukovať na zodpovedajúce 17a-hydroxyzlúčeniny alebo previesť na zodpovedajúce 17p-hydroxy-etinylzlúčeniny.

Vhodné substráty sú ďalej deriváty estranu všeobecného vzorca (Ib)

v ktorom znamená

R3 alkylovú skupinu s až 4 uhlíkovými atómami jednoduchú alebo dvojitú väzbu a

Rj má uvedený význam

17-Oxo-steroidy, vytvorené z týchto zlúčenín, môžu ako je známe slúžiť na výrobu farmakologicky účinných 17a-etinyl-17p-hydroxy-4-ester-3ónov, prípadne ich 18-metyl-homológov.

Ako substráty, ktoré je možné brať do úvahy, sú zlúčeniny všeobecného vzorca (Ic)

výrobu pregnanových derivátov, čo je odborníkom známe.

Konečne je tiež možné uvažovať deriváty estran-17P-olu všeobecného vzorca (Id)

v ktorom znamená

R9 vodíkový atóm, ako i R7 a Rg spoločne nižšiu alkyléndioxyskupinu, alebo

R7 a R9 dva vodíkové atómy alebo spoločne väzbu uhlik-uhlik a

Rg nižšiu alkoxyskupinu, nižšiu 1-alkoxy-alkoxyskupinu alebo 2-tetrahydropyranyloxyskupinu a Rj a R5 majú uvedený význam

Ketóny získané z týchto zlúčenín sa môžu spôsobom opísaným v EP-A-0129499 previesť na antigestagénne účinné steroidy.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady uskutočnenia slúžia na bližšie objasnenie spôsobu podľa vynálezu:

Príklad 1

a) Erlenmayerova banka s objemom 500 ml naplnená 100 ml sterilného živného média, obsahujúceho 1% kvasnicového extraktu

0,45% dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného

0,34% dihydrogénfosforečnanu draselného a

0,2% tweenu 80, sa pri hodnote pH 6,7 zaočkuje suspenziou Mycobactérium sp. NRRL B-3683 a počas 72 hodín sa pri teplote 30 °C trepe na trepačke pri 180 otáčkach za minútu.

b) 50 Erlenmayerových baniek (100)ml, obsahujúcich vždy 20 ml sterilného média zloženého z 0,5% comsteep liquoru

0,05% glukózomonohydrátu

0,2% kvasnicového extraktu sa pri pH 7 zaočkuje vždy 1 ml predpestovanej kultúry Mycobactérium sp. a tieto banky sa inkubujú počas 24 hodín na rotačnej trepačke pri 220 otáčkach za minútu a pri teplote 30 °C.

Potom sa každá kultúra zmieša s 0,02 g 3,3-(2,2-dimetyltrimetyléndioxy)-5,10 a-epoxy-5a-estra-9(ll)-én-17p-ólu, rozpusteného v 0,2 ml dimetylformamidu a sterilné prefiltrovaného, načo sa fermentuje d’alších 48 hodín.

c) Spojené kultúry sa extrahujú metylizobutylketónom a extrakt sa zahustí v rotačnej trepačke pri teplote maximálne 50°C za vákua.Potom sa vykonáva čistenie chromatografiou na stĺpci silikagélu.

v ktorom znamená

R4 vodíkový atóm alebo metylovú skupinu, I<5 a Rg spoločne nižšiu alkyldioxyskupinu alebo R5 vodíkový atóm a

R6 nižšiu alkoxyskupinu, nižšiu 1-alkoxy-alkoxy skupinu alebo 2-tetrahydropyranylovú skupinu a

R] má uvedený význam

17-Oxosteroidy, získané z týchto zlúčenín, sa môžu rovnakým spôsobom ďalej spracovávať, ako steroidy z estran-17p-olových derivátov všeobecného vzorca (Ic); na druhej strane však tiež môžu slúžiť na

Uvedeným spôsobom sa získa 0,85 g 3,3(2,2-dimetyltrimetyléndioxy)-5,10a-epoxy-5a-estra-9(ll)-én-170-ónu, ktorý je identický podľa HPLC s autentickou vzorkou.

Príklad 2

a) Výroba očkovacej kultúry prebieha rovnako, ako je uvedené v príklade la)

b) 50 Erlenmayerových baniek s obsahom 100 ml sa naplní vždy 20 ml sterilného živného média so zložením

2,5% comsteep liquoru

0,25% sojovej múčky

0,3% hydrogénfosforečnanu amónneho

0,25% tweenu 80 hodnota pH sa upraví na 6,5 a zaočkujú sa vždy 1 ml predpestovanej kultúry Mycobactérium sp., načo sa inkubujú na rotačnej trepačkc pri 220 otáčkach za minútu počas 24 hodín pri teplote 30°C.

Po inkubácii sa do každej kultúry pridá 0,002 g α-equilolu, rozpusteného v 0,2 ml dimetylformamidu a fermentuje sa ďalších 72 hodín pri teplote 30°C.

c) Izolácia produktu prebieha rovnako, ako je opisané v príklade lc).

Uvedeným spôsobom sa získa 0,095 g equilínu, ktorý je podľa HPLC identický s autentickou vzorkou.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob výroby 17-oxosteroidov fermentatívnou oxidáciou 17p-hydroxysteroidov, vyznačujúci sa tým, že sa na feimentáciu použijú bakteriálne kultúry kmeňov Mycobactérium sp. NRRL B-3805, Mycobactérium sp. NRRL B-3683, Mycobactérium phlei NRRL B-8154 alebo Mycobactérium fortuitum NRRL B-8153.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa oxiduje 17[i-hydroxysteroid všeobecného vzorca (I) st z--v ktorom znamená

Rj vodíkový atóm alebo metylovú skupinu

St zvyšok estran-17p-olového derivátu, obsahujúceho až 5 nekumulovaných dvojitých väzieb, substituovaného v polohe 3 fenolickou hydroxylovou skupinou, nižšou alkoxyskupinou, nižšou 1-alkoxy-alkoxyskupinou, 2-tetrahydropyranyloxyskupinou alebo nižšou alkyléndioxy-skupinou, ako i prípadne v polohe 5,10 epoxyskupinou a v polohe 19 prípadne metylskupinou.