SK17722002A3 - Nenukleozidové inhibítory reverznej transkriptázy, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie - Google Patents

Description

Oblasť techniky ' ,

Vynález sa týka nových zlúčenín a ich farmaceutický prijateľných solí, ich použitia, buď samotných alebo v kombinácii s inými terapeutickými látkami, pri liečení alebo profylaxii HIV infekcie a farmaceutických prostriedkov, obsahujúcich tieto zlúčeniny.

Doterajší stav techniky

Choroba, ktorá je známa ako syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS), je spôsobená vírusom ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV), konkrétne kmeňom, ktorý je známy ako HIV-1. Aby sa HIV replikoval hostiteľskou bunkou, informácia vírusového genómu sa musí integrovať do DNA hostiteľskej bunky. Avšak HIV je retrovírus, čo znamená, že jeho genetická informácia je vo forme RNA. HIV replikačný cyklus preto vyžaduje krok transkripcie vírusového genómu (RNA) do DNA, čo je opak normálneho reťazca krokov. Transkripciu vírusovej RNA do DNA uskutočňuje enzým, ktorý bol vhodne pomenovaný ako reverzná transkriptáza (RT). HIV virión zahrnuje kópiu RT spolu s vírusovou RNA.

Reverzná transkriptáza má tri známe enzymatické funkcie: pôsobí ako DNA polymeráza, závislá od RNA, ako ribonukleáza a ako DNA polymeráza, závislá od DNA. Keď pôsobí ako DNA polymeráza, závislá od RNA, RT transkribuje jednovláknovú DNA kópiu vírusovej RNA. Keď pôsobí ako ribonukleáza, RT zničí pôvodnú vírusovú RNA a uvoľní DNA, práve vytvorenú z pôvodnej RNA. Napokon, keď pôsobí ako DNA polymeráza, závislá od DNA, RT vytvorí druhé, komplementárne DNA vlákno, použijúc prvé DNA vlákno ako templát. Obe tieto vlákna vytvoria dvojvláknovú DNA, ktorá sa integruje do genómu hostiteľskej bunky ďalším enzýmom, ktorý sa nazýva integráza.

Zlúčeniny, ktoré inhibujú enzymatické funkcie HIV-1 reverznej transkriptázy, budú inhibovať replikáciu HIV-1 v infikovaných bunkách. Takéto zlúčeniny sú

-2užitočné pri prevencii alebo liečení HIV-1 infekcie u ľudských objektov, ako demonštrujú známe RT inhibítory, ako sú 3'-azido-3'-deoxytymidín (AZT), 2',3'dideoxyinozín (ddl), 2',3'-dideoxycytidín (ddC), d4T, 3TC, nevirapín, delavirdín, efavirenz a abacavir,' hlavné liečivá, doteraz povolené na použitie pri liečení AIDS.

Tak ako pri akejkoľvek antivírusovej terapii, použitie RT inhibitorov pri liečení AIDS prípadne vedie k vírusu, ktorý je menej citlivý voči danému liečivu. Rezistencia (znížená citlivosť) voči týmto liečivám je výsledkom mutácií, ku ktorým dochádza v segmente reverznej transkriptázy pol génu. Charakterizovalo sa niekoľko mutujúcich kmeňov HIV a rezistencia voči známym terapeutickým látkam je spôsobená mutáciami v RT géne. Niektoré z najznámejších pozorovaných mutantov sú klinicky: mutant Y181C, v ktorom tyrozín (Y) v kodóne 181 mutoval na cysteínový (C) zvyšok, a K103N, kde sa lyzín (K) v polohe 103 nahradil asparagínom (N). Ďalšie mutanty, ktoré sa objavujú stále častejšie počas liečenia známymi antivírusovými látkami, zahrnujú jednoduché mutanty V106A, G190A, Y188C a P236L; a dvojité mutanty K103N/Y181C, K103N/P225H, Κ103ΝΛ/108Ι a K103N/L100I.

S pokračovaním liečenia a prevencie HIV infekcie s použitím antivírusových látok sa očakáva, že sa bude zvyšovať počet nových rezistentných kmeňov. Preto existuje trvalá potreba nových inhibitorov RT s odlišnými schémami účinnosti voči rôznym mutantom.

Zlúčeniny s tricyklickými štruktúrami, ktoré sú inhibítormi HIV-1, sú opísané v US patente č. 5 366 972. Ďalšie inhibítory HIV-1 reverznej transkriptázy sú opísané v publikácii autorov Hargrave a ďalší, J. Med. Chem. 34, 2231, 1991.

US patent č. 5 705 499 opisuje 8-aralkyl- a 8-arylheteroalkyl-5,11-dihydro6/-/-dipyrido[3,2-B:2',3'-E][1,4]diazepíny ako inhibítory RT. Ukázalo sa, že tieto príklady zlúčenín vykazujú určitú aktivitu voči štandardnému typu a mutujúcej HIV-1 RT, najmä Y181C a iným jednoduchým mutantom, ako je K103N, aj keď menej účinnú.

Špecificky sú zlúčeniny podľa tohto vynálezu účinné pri inhibovaní Y181C a K103N mutantov, ako aj širokej palety iných jednoduchých mutantov a určitých, bežne sa vyskytujúcich dvojitých mutantov, ako sú K103N/Y181C a K103N/P225H.

-3Vynález zmenšuje ťažkosti a nevýhody doterajšieho stavu techniky tým, že poskytuje nové zlúčeniny, ktoré sú silnými inhibítormi jednoduchých a dvojitých mutujúcich kmeňov HlV-1 RT.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je zlúčenina všeobecného vzorca I

O kde

R² je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z H, F, Cl, C^-alkylu, C₃.₄-cykloalkylu a

R⁴ je H alebo Me;

R⁵ je H, Me alebo Et s podmienkou, že R⁴ a R⁵ nie sú oba Me, a ak R⁴ je Me, potom R⁵ nemôže byť Et;

R¹¹ je Me, Et, cyklopropyl, propyl, izopropyl alebo cyklobutyl;

Q je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z:

alebo jej farmaceutický prijateľná soľ

-4Z druhého aspektu vynález poskytuje inhibítor HIV replikácie všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ.

Z tretieho aspektu vynález poskytuje inhibítor enzýmu reverznej transkriptázy HIV všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ.

Zo štvrtého aspektu vynález poskytuje použitie HIV inhibujúceho množstva zlúčeniny všeobecného vzorca I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli na liečenie alebo prevenciu HIV infekcie.

Z piateho aspektu vynález poskytuje farmaceutický prostriedok na liečenie alebo prevenciu HIV infekcie, obsahujúci zlúčeninu všeobecného vzorca I alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ a farmaceutický prijateľný nosič.

Zo šiesteho aspektu vynález poskytuje spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli.

Definície

Tak ako sa tu požíva, výraz CM-alkyl znamená nerozvetvené alebo rozvetvené alkylové radikály, obsahujúce od jedného do štyroch uhlíkových atómov, a zahrnuje metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, se/r-butyl a terc-butyl.

Tak ako sa tu požíva, výraz C₃.4-cykloalkyľ znamená nasýtené cyklické uhľovodíkové radikály, obsahujúce tri až štyri uhlíkové atómy, a zahrnuje cyklopropyl a cyklobutyl.

Podrobný opis výhodných uskutočnení

Podľa výhodného uskutočnenia sú zlúčeniny podľa tohto vynálezu určené všeobecným vzorcom I, v ktorom R² je výhodne Cl, F alebo H. R² je výhodnejšie Cl alebo H. R² je najvýhodnejšie H.

Podľa výhodného uskutočnenia sú zlúčeniny podľa tohto vynálezu určené všeobecným vzorcom I, v ktorom R⁴ je výhodne H.

Podľa alternatívneho uskutočnenia sú zlúčeniny podľa tohto vynálezu určené všeobecným vzorcom I, v ktorom R⁵ je výhodne Me.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú výhodne určené všeobecným vzorcom I, v ktorom R¹¹ je Et alebo cyklopropyl. R¹¹ je výhodnejšie Et.

-5Podľa výhodného uskutočnenia sú zlúčeniny podľa tohto vynálezu určené všeobecným vzorcom I, v ktorom Q je výhodne vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva

Výhodnejšie je Q

Alternatívne, výhodné uskutočnenia tohto vynálezu zahrnujú zlúčeniny, vybrané zo skupiny, ktorá pozostáva z:

-6Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú účinnými inhibítormi reverznej transkriptázy štandardného typu, ako aj inhibujú napríklad jednoduché mutačné enzýmy Y181C, K103N, V106A, G190A, Y188C a P236L. Tieto zlúčeniny tiež inhibujú dvojité mutačné enzýmy K103N/Y181C, K103N/P225H, Κ103ΝΛ/108Ι a K103N/L100I.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I vykazujú inhibičnú aktivitu voči HIV-1 reverznej transkriptáze. Keď sa podávajú vo vhodných dávkových formách, sú užitočné na liečenie AIDS, ARC a príbuzných chorôb, spojených s HIV infekciou. Ďalším aspektom vynálezu je preto spôsob liečenia HIV-1 infekcie, ktorý zahrnuje podávanie terapeuticky účinného množstva novej zlúčeniny všeobecného vzorca I, ako bolo opísané vyššie, človeku infikovanému HIV-1. Či už sa to nazve liečením alebo profylaxiou, tieto zlúčeniny sa tiež môžu použiť na zabránenie perinatálnemu prenosu HIV-1 z matky na dieťa podávaním matke pred pôrodom.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu podávať v jednej alebo v delených dávkach orálnou alebo parenterálnou cestou. Vhodná orálna dávka pre zlúčeninu všeobecného vzorca I by mala byť medzi 0,5 mg a 1 g denne. Výhodná orálna dávka pre zlúčeninu všeobecného vzorca I by bola v rozsahu medzi asi 100 mg a 800 mg denne pre pacienta s telesnou hmotnosťou 70 kg. V parenterálnych formuláciách môže vhodná dávková jednotka obsahovať od 0,1 do 250 mg uvedených zlúčenín, výhodne 1 mg až 200 mg. Treba si však uvedomiť, že podávaná dávka sa bude od pacienta k pacientovi meniť a dávka pre konkrétneho pacienta bude závisieť od posúdenia klinika, ktorý použije ako kritériá na určenie vlastnej dávky veľkosť a stav pacienta, ako aj pacientovu odpoveď na liečivo.

Ak sa zlúčeniny podľa tohto vynálezu majú podávať orálnou cestou, môžu sa podávať ako lieky vo forme farmaceutických prípravkov, ktoré ich obsahujú v spojení s kompatibilným farmaceutickým nosným materiálom. Takýmto nosným materiálom môže byť inertný organický alebo anorganický nosný materiál, vhodný na orálne podávanie. Príkladmi takýchto nosných materiálov sú voda, želatína, mastenec, škrob, stearan horečnatý, arabská guma, rastlinné oleje, polyalkylénglykoly, vazelína a podobne.

Tieto farmaceutické prípravky sa dajú pripraviť bežným spôsobom a konečnými dávkovými formami môžu byť tuhé dávkové formy, napríklad tablety,

-7dražé, kapsuly a podobne, alebo kvapalné dávkové formy, napríklad roztoky, suspenzie, emulzie a podobne. Farmaceutické prípravky sa môžu podrobiť bežným farmaceutickým operáciám, ako je sterilizácia. Ďalej tieto farmaceutické prípravky môžu obsahovať bežné pomocné látky, ako sú konzervačné prostriedky, stabilizátory, emulgátory, prísady na zlepšenie chuti, zvlhčovadlá, pufre, soli na zmenu osmotického tlaku a podobne. Tuhé nosné materiály, ktoré sa dajú použiť, zahrnujú napríklad škrob, laktózu, manitol, metylcelulózu, mikrokryštalickú celulózu, mastenec, oxid kremičitý, dihydrogenfosforečnan vápenatý a polyméry s vysokou molekulovou hmotnosťou (ako je polyetylénglykol).

Na parenterálne použitie sa zlúčenina všeobecného vzorca I môže podávať vo vodnom alebo nevodnom roztoku, suspenzii alebo emulzii vo farmaceutický prijateľnom oleji alebo zmesi kvapalín, ktoré môžu obsahovať bakteriostatické látky, antioxidanty, konzervačné prostriedky, pufre alebo iné rozpustené látky, aby sa roztok zachoval izotonickým s krvou, zahusťovadlá, suspendujúce prostriedky alebo iné farmaceutický prijateľné prísady. Prísady tohto typu zahrnujú napríklad vínanové, citrátové a acetátové pufre, etanol, propylénglykol, polyetylénglykol, komplexotvorné látky (ako je EDTA), antioxidanty (ako je hydrogensiričitan sodný, disiričitan sodný a kyselina askorbová), polyméry s vysokou molekulovou hmotnosťou (ako, sú kvapalné polyetylénové oxidy) na reguláciu viskozity a polyetylénové deriváty sorbitolanhydŕidov. Ak je to potrebné, môžu sa podať aj konzervačné prostriedky, ako je kyselina benzoová, metyl- alebo propylparabén, benzalkoniumchlorid a iné kvartérne amónne zlúčeniny.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa tiež môžu podávať ako roztoky na nazálnu aplikáciu a okrem zlúčenín podľa tohto vynálezu môžu obsahovať vhodné pufre, nastavovače tonicity, mikrobiálne konzervačné prostriedky, antioxidanty a viskozitu zvyšujúce látky vo vodnom vehikule. Príkladmi látok, používaných na zvýšenie viskozity, sú polyvinylalkohol, deriváty celulózy, polyvinylpyrolidón, polysorbáty alebo glycerín. Pridané mikrobiálne konzervačné prostriedky môžu zahrnovať benzalkoniumchlorid, timerosal, chlórbutanol alebo fenyletylalkohol.

Okrem toho sa zlúčeniny, ktoré poskytuje tento vynález, môžu podávať vo forme čapíkov.

-8 Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa dajú pripraviť s využitím skúseností organického chemika z oblasti syntéz. Príkladná reakčná schéma je znázornená na schémach 1 až 6.

Schéma 1: Príprava medziproduktov, v ktorých R⁴ je Me

Schéma 2: Príprava medziproduktov, v ktorých R⁵ je Me

NaH, Mel DMF, 50°C

O

Br

-9Postupnosť schémy 2 je analogická postupnosti, opísanej J. M. Klunderom a ďalšími, J. Med. Chem. 41, 2960-2971, 1998, a C. L. Cywinom a ďalšími, J. Med. Chem. 41, 2972-2984, 1998.

Schéma 3: Príprava medziproduktov, v ktorých R² je C-i-3-alky!

Schéma 4: Príprava medziproduktov, v ktorých R² je CF3

o/n, RT’

1. NaH.DMF. 40°C,

2. (CF,SO,)_?NPh

3. EtNH₂ RT, 20h

XX

NOj

F,C N

F₃C

Pd(OH)₂, H₂ ->MeOH

ΝΗ₂

NH o

MeCN

- 10Schéma 5: Zavedenie chinolínového jadra

Schéma 6: Alternatívna cesta k zlúčeninám, v ktorých R⁴ je Me

Me^- O r<^<^NH2 + ci^X^ cr n ci cr n

Ako sme uviedli vyššie, zlúčeniny, ktoré poskytuje tento vynález, inhibujú enzymatickú aktivitu HIV-1 RT. Na základe testovania týchto zlúčenín, ako je opísané ďalej, je známe, že inhibujú od RNA-závislú DNA polymerázovú aktivitu HIV-1 RT. Je známe (údaje nie sú uvedené), že tiež inhibujú od DNA-závislú DNA polymerázovú aktivitu HIV-1 RT. S využitím Testu Reverznej Transkriptázy (RT), opísaného ďalej, sa zlúčeniny dajú testovať na ich schopnosť inhibovať od RNAzávislú DNA polymerázovú aktivitu HIV-1 RT. Určité špecifické zlúčeniny, opísané v

- 11 príkladoch, ktoré sú uvedené ďalej, sa takto testovali. Výsledky tohto testovania sú uvedené v Tabuľke 2 ako IC₅₀ (nM) a v Tabuľke 3 ako EC₅o (nM).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je ďalej podrobnejšie ilustrovaný nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi. Všetky reakcie sa uskutočnili v dusíkovej alebo argónovej atmosfére. Teploty sa uvádzajú v stupňoch Celzia. Percentá alebo pomery v roztokoch vyjadrujú vzťah objem k objemu, pokiaľ nie je uvedené ináč.

I

Skratky alebo symboly, ktoré sa tu používajú, zahrnujú:

DEAD: dietylazodikarboxylát;

DIAD: diizopropylazodikarboxylát;

DIEA: diizopropyletylamín;

DMAP: 4-(dimetylamino)pyridín;

DMSO: dimetylsulfoxid;

DMF: dimetylformamid;

ES MS: hmotnostné spektrometria s elektrorozprašovanim;

Et: etyl;

EtOAc: etylacetát;

Et₂O: dietyléter;

HPLC: vysokovýkonná kvapalinová chromatografia;

/Pr: izopropyl;

Me: metyl; ,

MeOH: metanol;

MeCN: acetonitril;

NBS: N-brómsukcínimid;

Ph: fenyl;

TBE: fr/s-borát-EDTA;

TBTU: 2-(1 H-benzotriazol-1 -yl)-/V,/\/,/\/',A/’-tetrametyluróniumtetrafluórboritan;

TFA: kyselina trifluóroctová;

THF: tetrahydrofurán;

-12MS (ES): hmotnostné spektrometria s elektrorozprašovaním;

MS (FAB) alebo FAB/MS: hmotnostné spektrometria s bombardovaním rýchlymi atómami;

HRMS: vysokorozlišovacia hmotnostné spektrometria;

PFU: jednotky, ktoré tvoria plaky; '

DEPC: dietylpyrouhličitan;

DMSO: dimetylsulfoxid;

DTT: ditiotreitol;

EDTA: etyléndiamíntetraacetát;

UMP: uridín-5'-monofosfát;

UTP: uridín-5'-trifosfát.

Syntézy

Nasledujúce príklady ilustrujú spôsoby prípravy zlúčenín podľa tohto vynálezu.

Príklad 1 (por. číslo 24, Tabuľka 1)

5,11 -Dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

a) 2-(Etylamino)-3-nitropyridín

Do roztoku 2-chlór-3-nitropyridínu (51 g, 325 mmol) v THF (650 ml) sa pridal 2M roztok etylamínu v THF (365 ml, 731 mmol). Reakčná zmes sa miešala pri teplote miestnosti cez noc. Reakčná zmes sa naliala do vody (~ 1,5 I) a výsledná tuhá látka sa prefiltrovala a sušila pri zníženom tlaku, aby poskytla titulnú zlúčeninu (52 g).

b) 3-Amino-2-(etyIamino)pyridín

Roztok 2-(etylamino)-3-nitropyridínu (52 g) v MeOH (600 ml) sa miešal cez noc pri teplote miestnosti pod vodíkom (1 atm.) v prítomnosti 20 % Pd(OH)2/C (10,4 g). Katalyzátor sa odstránil filtráciou cez kremelinu. Filtrát sa skoncentroval pri

- 13zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina ako čierna tuhá látka (39 g, 88% výťažok v krokoch a) a b)).

c) 2-Chlór-A/-[2-(etylamino)-3-pyridinyl]-5-bróm-3-pyridínkarboxamid

Do ochladeného roztoku 3-amino-2-(etylamino)pyridínu (30,6 g, 223 mmol) v MeCN (740 ml) sa pridal tuhý NaHCO₃ (56,3 g, 669 mmol). Po 5 min sa pridal surový 5-bróm-2-chlór-3-pyridínkarbonylchlorid (1 ekv., 223 mmol) (pripravený z kyseliny 5-bróm-2-hydroxy-3-pyridínkarboxylovej a SOCb [ako opísali T. W. Gero a ďalší v Synth. Commun. 1989, 19, 553-559 (zahrnuté sem s odkazom), ale s vynechaním vodného spracovania]. Po 2 h sa reakčná zmes naliala na ľad/H₂O (1,5 I) a výsledná tuhá látka sa prefiltrovala, prepláchla H₂O a potom hexánom. Po sušení pri zníženom tlaku cez noc sa titulná zlúčenina získala ako čierna tuhá látka (54,9 g, 69% výťažok).

d) 8-Bróm-5,11 -dihydro-11-etyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Do roztoku 2-chlór-/V-[2-(etylamino)-3-pyridinyl]-5-bróm-3-pyridínkarboxamidu (54,9 g, 154,4 mmol) v pyridíne (308 ml) pri 50 °C sa po kvapkách pridal 1M roztok NaHMDS (hexametyldisilazid sodný) v THF (355 ml, 355 mmol). Po 10 min sa reakčná zmes nechala ochladiť na teplotu miestnosti a potom sa naliala na ľadovú vodu (2 I). Výsledná tuhá látka sa prefiltrovala, prepláchla vodou a potom hexánom. Tuhá látka sa sušila pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (36 g, 75% výťažok) ako tmavozelená tuhá látka.

e) 8-Bróm-5,11-dihydro-11-etyl-5-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepín-6-ón

Do roztoku 8-bróm-5,11 -dihydro-11-etyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepín-6-ónu (36,7 g, 115 mmol) v DMF (380 ml) sa pridal NaH (3,5 g, 138 mmol) a zmes sa zahrievala na 50 °C 30 min. Reakčná zmes sa ochladila na teplotu miestnosti a pridal sa Mel (14,3 ml, 230 mmol). Po 1,5 h sa reakčná zmes naliala na ľadovú vodu. Tuhá látka sa prefiltrovala, premyla vodou a potom hexánom, aby poskytla po sušení titulnú zlúčeninu (37,9 g, 99% výťažok) ako tmavošedú tuhú látku.

-14f) 5,11-Dihydro-11-etyl-5-metyl-8-(2-propenyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazeρίη-6-όη

Alyltributylcín (30,7 ml, 99,0 mmol) a Pd(Ph₃P)₄ (5,20 g, 4,50 mmol) sa pridali do odplyneného (N₂ cez roztok 30 min) roztoku 8-bróm-5,11 -dihydro-11 -etyl-5metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (30,0 g, 90,0 mmol) v DMF (450 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri 90 °C 1,5 h, potom sa ochladila na teplotu miestnosti a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 8:2 až 7:3), aby vznikla titulná zlúčenina (22,19 g, 84% výťažok).

g) 5,11 -Dihydro-11 -etyl-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e]-[1,4]diazepín-6-ón

Prúd ozonizovaného kyslíka sa prebublával cez studený (-78 °C) roztok 5,11dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-(2-propenyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (22,19 g, 75,4 mmol) v CH2CI2 (150 ml) a MeOH (150 ml) 2,5 h. Prúd N₂ sa potom prebublával cez roztok 15 min a potom sa do roztoku pridal tuhý NaBH₄ (4,99 g, 132 mmol). Reakčná zmes sa nechala zahriať na teplotu miestnosti. Po 1 h sa pridal nasýtený vodný roztok NH₄Cl (200 ml) a zmes sa miešala pri teplote miestnosti 2 h. Organické rozpúšťadlá sa odstránili pri zníženom tlaku. Do zvyšku sa pridala voda (300 ml) a CHCI₃ (300 ml). Fázy sa oddelili a vodná vrstva sa extrahovala CHCI₃ (3 x 300 ml). Spojené organické vrstvy sa sušili (MgSO₄), prefiltrovali sa a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:CHCI₃, 4:1), aby vznikla titulná zlúčenina (16,1 g, 72% výťažok) ako biela tuhá látka.

h) 5,11-Dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6A7-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (12,8 ml, 81,0 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 5,11 -dihydro-11 -etyl-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4jdiazepín-6-ónu (16,1 g, 54,0 mmol), 4-hydroxychinolínu (11,6 g, 81,0 mmol) a Ph₃P (21,3 g, 81,0 mmol) v THF (270 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil

-15rýchlou chromatografiou (EtOAc.MeOH; 95:5), aby vznikla titulná zlúčenina (17,7 g, 77% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 426 (M⁺).

Príklad 2 (por. číslo 2, Tabuľka 1)

2-Chlór-5,11 -dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/7-dipyrido[3,2b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

a) 6-Chlór-2-(etylamino)-3-nitropyridín

Ľadovo studený roztok EtNH₂ (49,8 g, 1,10 mol) v toluéne (200 ml) sa pridal v priebehu 15 min do ľadovo studeného roztoku 2,6-dichlór-3-nitropyridínu (100,0 g, 0,52 mol) v toluéne (225 ml). Zmes sa miešala pri 0 °C 45 min. Pridala sa voda (500 ml) a EtOAc (500 ml) a fázy sa separovali. Organická vrstva sa postupne premyla vodou (200 ml) a soľankou (200 ml), sušila (MgSO4), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšková tuhá látka sa rekryštalizovala z MeOH, aby vznikla titulná zlúčenina (83,7 g, 80% výťažok) ako žlté ihličky.

b) 3-Amino-6-chlór-2-(etylamino)pyridín

Roztok SnCI₂H₂O (616,3 g, 2,73 mol) v 12N vodnom roztoku HCI (500 ml) sa rýchlo pridal do roztoku 6-chlór-2-(etylamino)-3-nitropyridínu (169,5 g, 0,84 mol) v AcOH (1,7 I) pri teplote miestnosti. Po 20 min sa zmes ochladila na 0 °C a pridala sa voda (250 ml). Potom sa po malých častiach pridal tuhý NaOH (240 g). Výsledná suspenzia sa prefiltrovala, aby sa odstránili soli cínu. Filtrát sa zriedil vodou (3,5 I), roztok sa udržiaval zásaditým pridaním 10N vodného roztoku NaOH a potom sa extrahoval EtOAc (3 x 1,7 I). Spojené organické fázy sa premyli soľankou (1 I), sušili (MgSO4), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 3:2), aby vznikla titulná zlúčenina (89,9 g, 62% výťažok) ako hnedá tuhá látka: MS (ESI) m/z 172/174 (MH)⁺.

c) 5-Bróm-2-chlór-A/-{2-(etylamino)-6-chlór-3-pyridinyl}-3-pyridínkarboxamid

Roztok 5-bróm-2-chlór-3-pyridínkarbonylchloridu (30,0 g, 97,0 mmol) v MeCN (100 ml) sa pridal cez kanylu do roztoku 3-amino-6-chlór-2-(etylamino)pyridínu (16,6 g, 97,0 mmol) v MeCN (180 ml), obsahujúceho tuhý NaHCO₃ (14,2 g, 169 mmol) pri

-16teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h. Pridala sa voda (200 ml) a zmes sa miešala 10 min. Výsledná suspenzia sa prefiltrovala. Tuhá látka sa premyla Et₂O (50 ml) a skoncentrovala z pyridínového roztoku (3 x 50 ml), aby vznikla titulná zlúčenina (28,4 g, 75% výťažok).

d) 8-Bróm-2-chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]-diazepín-6-ón

1M roztok NaHMDS v THF (167,5 ml, 167,5 mmol) sa pomaly pridal do roztoku 5-bróm-2-chlór-A/-{2-(etylamino)-6-chlór-3-pyridinyl}-3-pyridínkarboxamidu (28,4 g, 72,8 mmol) v pyridíne (146 ml), zahriateho na 50 °C. Reakčná zmes sa miešala pri 50 °C 1,5 h. Zmes potom naliala do zmesi vody a ľadu (1 I) a po 1 h sa výsledná suspenzia prefiltrovala. Tuhá látka sa premyla vodou a sušila sa pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (23,4 g, 91% výťažok).

e) 8-Bróm-2-chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-5-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]-[1,4]diazepín-6-ón

Tuhý NaH (60% olejová disperzia, 3,46 g, 86,1 mmol) sa pridal v priebehu 30 min do roztoku 8-bróm-2-chlór-5,11 -dihydro-11 -etyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3^,-e]-[1,4]diazepín-6-ónu (23,4 g, 66,3 mmol) v DMF (220 ml) pri 50 °C. Zmes sa miešala pri 50 °C 1 h, potom sa nechala ochladiť na teplotu miestnosti. Zmes sa naliala do vody (1 I) a výsledná suspenzia sa prefiltrovala. Tuhá látka sa postupne premyla vodou a hexánom, potom sa sušila pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (23,0 g, 94% výťažok).

f) 2-Chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-5-metyl-8-(2-propenyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ón

Alyltributylcín (21,3 ml, 68,7 mmol) a Pd(Ph₃P)4 (3,61 g, 3,12 mmol) sa pridali do odplyneného (N₂ cez roztok 30 min) roztoku 8-bróm-2-chlór-5,11-dihydro-11-etyl5-metyi-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (23,0 g, 62,5 mmol) v DMF (312 ml). Zmes sa zahrievala na 90 °C 2 h. Zmes sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 7:3), aby vznikla titulná zlúčenina (13,4 g, 65% výťažok).

- 17g) 2-Chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Ozonizovaný kyslík sa zavádzal do studeného (-78 °C) roztoku 2-chlór-5,11 dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-(2-propenyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (13,4 g, 40,7 mmol) v MeOH (102 ml) a CH2CI2 (102 ml) až do úplného vymiznutia alkénu. Dusík sa prebublával cez roztok, aby sa odstránil nadmerný O3. Potom sa po malých častiach pridal tuhý NaBH₄ (2,69 g, 71,1 mmol) a zmes sa nechala pomaly zahriať na teplotu miestnosti. Po 1 h sa pridal nasýtený vodný roztok NH4CI (150 ml) a zmes sa miešala 20 min. Organické rozpúšťadlá sa odstránili pri zníženom tlaku. Do vodného roztoku sa pridala voda (100 ml). Roztok sa extrahoval CHCI3 (3 x 200 ml). Spojené organické vrstvy sa sušili (MgSO₄), prefiltrovali sa a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAcOHCb, 4:1), aby vznikla titulná zlúčenina (10,4 g, 77% výťažok).

h) 2-Chlór-5,11 -dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3’-e] [1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (4,26 ml, 27,0 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 2-chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6H-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (6,00 g, 18,0 mmol), 4-hydroxychinolínu (3,92 g, 27,0 mmol) a Ph₃P (7,09 g, 27,0 mmol) v THF (90 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc.’MeOH; 95:5), aby vznikla titulná zlúčenina (6,22 g, 75% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 460/462.

Príklad 3 (por. číslo 6, Tabuľka 1)

2-Chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/dipyrido[3,2-b:2',3’-e][1,4]diazepín-6-ón

a) 6-Chlór-2-(cyklopropylamino)-3-nitropyridín

Roztok cyklopropylamínu (1,25 g, 22,0 mmol) v toluéne (11 ml) sa pridal v priebehu 10 min do ľadovo studeného roztoku 2,6-dichlór-3-nitropyridínu (2,00 g,

10,4 mmol) v toluéne (10 ml). Zmes sa miešala pri 0 °C 1 ha pri teplote miestnosti

- 182 h. Do zmesi sa pridala voda (50 ml) a fázy sa oddelili. Organická vrstva sa premyla soľankou (25 ml), sušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 3:2), aby vznikla titulná zlúčenina (1,97 g, 89% výťažok) ako žltá tuhá látka.

b) 2-Chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Titulná zlúčenina sa pripravila zo 6-chlór-2-(cyklopropylamino)-3-nitropyridínu s použitím spôsobu, podobného tomu, ktorý je opísaný pre 11-etylový analóg v príklade 2.

c) 2-Chlór-11 -cyklopropyl-5,11-dihydro-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (85,6 μΙ, 0,54 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 2-chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (125 mg, 0,36 mmol), 4-hydroxychinolínu (78,9 g, 0,54 mmol) a Ph₃P (143 mg, 0,54 mmol) v THF (1,8 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 3 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čiastočne vyčistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5). Tuhá látka sa ďalej čistila HPLC s obrátenými fázami (CombiPrep ADS-AQ 50 x 20 mm, 5μ, 120 A, 5 až 100 % MeCN + 0,10 % TFA / voda + 0,10 % TFA za 25 min), aby vznikla trifluóracetátová soľ titulnej zlúčeniny (17,7 g, 77% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 472/474 (MH)⁺.

Príklad 4 (por. číslo 4, Tabuľka 1)

5,11-Dihydro-11-etyl-2-fluór-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

a) 2,6-Difluór-3-nitropyridín

Do zmesi koncentrovanej kyseliny sírovej (600 ml) a dymiacej kyseliny dusičnej (90%, 400 ml) v ľadovom kúpeli (vnútorná teplota udržiavaná na 5 až 10 °C) sa po kvapkách pridal 2,6-difluórpyridín (200 g, 1,74 mol). Výsledná zmes sa

- 19miešala cez noc pri teplote miestnosti. Zmes sa pomaly naliala do 3 kg ľadu a extrahovala Et₂O (2x2 I). Spojené organické vrstvy sa premyli 1,5N vodným roztokom NaOH (2 x 1 I), potom nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (400 ml), alebo až kým pH nebolo okolo 8 až 9. Organické vrstvy sa sušili nad MgSO4, prefiltrovali sa a skoncentrovali pri zníženom tlaku až do konštantnej hmotnosti (aby sa odstránil nezreagovaný 2,6-difluórpyridín: 10 až 12 %). Titulná zlúčenina sa získala ako žltá kvapalina (207,3 g, 74% výťažok).

b) 2-(Etylamino)-6-fluór-3-nitropyridín

Do roztoku 2,6-difluór-3-nitropyridínu (45,7 g, 285 mmol) v THF (500 ml) pri -40 °C sa po kvapkách pridal roztok etylamínu (25,7 g, 570 mmol) v THF (250 ml). Po 30 min sa reakčná zmes skoncentrovala pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozpustil v EtOAc. Organická fáza sa premyla soľankou, sušila (MgSO^, prefiltrovala a skoncentrovala. Výsledná žltá tuhá látka sa čistila rýchlou chromatografiou (15 % EtOAc v hexáne), aby vznikla titulná zlúčenina (43,2 g, 82% výťažok) ako žltá tuhá látka.

c) 3-Amino-2-(etylamino)-6-fluórpyridín

Roztok 2-(etylamino)-6-fluór-3-nitropyridínu (43,2 g, 230 mmol) v THF (1 I) sa miešal cez noc pri teplote miestnosti pod vodíkom (1 atm.) v prítomnosti 20 % Ρ0(ΟΗ)₂/Ο (4,35 g). Katalyzátor sa odstránil filtráciou cez kremelinu. Filtrát sa skoncentroval pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (36,3 g, 95% výťažok) ako čierna tuhá látka.

d) 2-Chlór-/V-[2-(etylamino)-6-fluór-3-pyridinyl]-5-bróm-3-pyridínkarboxamid

Do ochladeného roztoku (4 °C) 3-amino-2-(etylamino)-6-fluórpyridínu (31,0 g, 200 mmol) v MeCN (160 ml) sa pridal tuhý NaHCO₃ (50,4 g, 600 mmol). Po 15 min sa pridal roztok 5-bróm-2-chlór-3-pyridínkarbonylchloridu (1 ekv., 200 mmol) v MeCN (155 ml). Po 60 min pri teplote miestnosti sa reakčná zmes naliala do vody (1,2 I) a miešala sa 30 min. Výsledná tuhá látka sa prefiltrovala, sušila pri zníženom tlaku pri 50 °C cez noc. Titulná zlúčenina (73,7 g, 99% výťažok) sa získala ako čierna tuhá látka.

-20e) 8-Bróm-5,11 -dihydro-11-etyl-2-fluór-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepín-6-ón

Do roztoku 2-chlór-A/-{2-(etylamino)-6-fluór-3-pyridinyl]-5-bróm-3-pyridínkarboxamidu (73,5 g, 216 mmol) v pyridíne (435 ml) pri 50 °C sa po kvapkách pridal 1M roztok NaHMDS v THF (520 ml, 520 mmol). Po 10 min sa reakčná zmes nechala ochladiť na teplotu miestnosti, potom sa naliala na ochladenú vodu (2 I). Výsledná tuhá látka sa prefiltrovala, prepláchla vodou a potom hexánom. Tuhá látka sa sušila pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (50,6 g, 69% výťažok) ako tmavozelená tuhá látka.

f) 8-Bróm-5,11-dihydro-11-etyl-2-fluór-5-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]-diazeρίη-6-όη

Do roztoku 8-bróm-5,11 -dihydro-11-etyl-2-fluór-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (44 g, 130,5 mmol) v DMF (520 ml) sa pridal NaH (4,28 g, 178 mmol) a zmes sa zahrievala na 50 °C 30 min. Reakčná zmes sa ochladila na teplotu miestnosti a pridal sa Mel (24,4 ml, 522 mmol). Po 1,5 h sa reakčná zmes naliala na ľadovú vodu. Tuhá látka sa prefiltrovala, premyla vodou a potom hexánom, sušila sa pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (43,2 g, 94% výťažok) ako tmavošedá tuhá látka.

g) 5,11 -Dihydro-11 -etyl-2-fluór-5-metyl-8-(2-propenyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3^,-e][1,4]diazepín-6-ón

Alyltributylcín (32,0 ml, 103,4 mmol) a Pd(Ph₃P)₄ (5,43 g, 4,70 mmol) sa pridali do odplyneného (N₂ cez roztok 45 min) roztoku 8-bróm-5,11-dihydro-11-etyl2-fIuór-5-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (33,0 g, 94,0_: mmol) v DMF (470 ml). Na skončenie reakcie sa pridávali ďalšie množstvá Pd(Ph₃P)₄ (1,09 g, 0,94 mmol, pridané po 1,2, 3, 4, 5 h reakcie). Zmes sa zahrievala na 90 °C 6 h. Zmes sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexány:EtOAc, 8:2 až 7:3), aby vznikla titulná zlúčenina (22,4 g, 76% výťažok).

h) 5,11 -Dihydro-11-etyl-2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

-21 Prúd ozonizovaného kyslíka sa prebublával cez studený (-78 °C) roztok 5,11dihydro-11 -etyl-2-fluór-5-metyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín6-ónu (22,38 g, 71,6 mmol) v CH₂CI₂ (100 ml) a MeOH (100 ml) 3 h. Prúd N₂ sa potom prebublával cez roztok 15 min a potom sa do roztoku pridal tuhý NaBH₄ (5,05 g, 133 mmol). Reakčná zmes sa nechala zahriať na teplotu miestnosti. Po 1 h sa do reakčnej zmesi pridala dodatočná časť NaBH₄ (1,62 g, 43 mmol). Po ďalšej hodine sa pridal nasýtený vodný roztok NH₄CI (150 ml) a zmes sa miešala pri teplote miestnosti 30 min. Organické rozpúšťadlá sa odstránili pri zníženom tlaku. Pridala sa voda (200 ml) a zmes sa extrahovala CHCb (3 x 300 ml). Spojené organické vrstvy sa sušili (MgSO₄), prefiltrovali sa a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:CHCl3, 4:1), aby vznikla titulná zlúčenina (19,7 g, 72% výťažok) ako biela tuhá látka.

i) 5,11-Dihydro-11-etyl-2-fluór-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido-[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (14,3 ml, 91,0 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 5,11 -dihydro-11-etyl-2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (19,2 g, 60,7 mmol), 4-hydroxychinolínu (13,2 g, 91,0 mmol) a Ph₃P (23,9 g, 91,0 mmol) v THF (300 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5), aby vznikla titulná zlúčenina (17,9 g, 67% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 444 (MH)⁺.

Príklad 5 (por. číslo 1, Tabuľka 1) '

I .

2-Chlór-5,11-dihydro-11-etyl-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6H-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e] [1,4]diazepín-6-ón

a) 2-Chlór-A/-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-3-pyridínkarboxamid

NaHCO3 (21,72 g, 258,6 mmol) sa pridal do roztoku 3-amino-2,6-dichlór-4metylpyridínu (41,61 g, 235,1 mmol; pripraveného, ako opísali K. G. Grozinger a ďalší, J. Heterocyclic Chem. 32, 259-263, 1995) v MeCN (350 ml) a výsledná suspenzia sa miešala 15 min. Potom sa vyše 30 min zavádzal roztok 2-22chlórnikotinylchloridu (43,44 g, 246,8 mmol) v MeCN (500 ml). Výsledná suspenzia sa miešala pri teplote miestnosti. Po 24 h sa roztok ukázal byť kyslým, a tak sa pridalo ďalšie množstvo NaHCO₃ (3,00 g, 35,7 mmol). Suspenzia sa potom miešala pri teplote miestnosti ďalšie 2 dni. Zmes sa potom naliala do zmesi vody (2 I) a ľadu (20Ó g) a miešala sa 20 min. Tuhá látka sa prefiltrovala a premyla vodou (500 ml) a výsledná tuhá látka sa potom sušila nad P₂O₅ pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (62,55 g, 84% výťažok) ako biely prášok.

b) /V-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-2-(etylamino)-3-pyridínkarboxamid

Roztok 2-chlór-/\/-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-3-pyridínkarboxamidu (63,17 g, 194,0 mmol) a etylamínu (28,0 g, 583 mmol) v xylénoch (250 ml) sa miešal pri 120 až 125 °C v oceľovom autokláve 7 h. Výsledná suspenzia sa naliala do vody (1 I), miešala sa 15 min a prefiltrovala. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc a premyl sa vodou (3 x), soľankou a sušil sa nad MgSO₄. Filtrát sa extrahoval EtOAc a spojené organické extrakty sa premyli vodou a soľankou a sušili sa nad MgSO4. Obe frakcie sa potom spojili a nadbytočné xylény sa odstránili spoločnou destiláciou s benzénom, aby vznikla titulná zlúčenina (61,98 g, ružová tuhá látka) ako hlavná zložka zmesi zlúčenín. Materiál, v tomto bode nečistený, sa použil priamo v nasledujúcej reakcii.

c) 5-Bróm-/V-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyrídinyl)-2-(etylamino)-3-pyridínkarboxamid

Tuhý KOAc (22,2 g, 229 mmol) sa pridal do roztoku surového A/-(2,6-dichlór4-metyl-3-pyridinyl)-2-(etylamino)-3-pyridínkarboxamidu (61,98 g, <190 mmol) v AcOH (600 ml). Vyše 30 min sa pridával roztok Br₂ (9,7 ml, 191 mmol). Po 30 min miešania sa zaviedli ďalšie množstvá KOAc a Br₂, až kým TLC neindikovala, že nezostal žiadny východiskový materiál (celkovo 11,2 g KOAc a 5,91 ml Br₂). Roztok sa potom nalial do vody (2 I) a miešal sa 20 min. Tuhá látka sa odstránila filtráciou a potom sa rozpustila v Et₂O (1 I). Éterový roztok sa premyl vodou (3 x), nasýteným vodným roztok NaHCO3, soľankou, potom sa sušil (MgSO4,), aby vznikla zmes, obsahujúca ako hlavnú zložku titulnú zlúčeninu (77,7 g, žltá pena). Materiál sa použil priamo v nasledujúcej reakcii.

e r

f. r c r

-23d) 8-Bróm-2-chlór-5,11-dihydro-11-etyl-4-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]-[1,4]diazeρίη-6-όη

Roztok surového 5-bróm-N-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-2-(etylamino)-3pyridínkarboxamidu (77,7 g) v bezvodom pyridíne (1,0 I) sa zahrial na 50 °C. Potom sa po kvapkách pridal 1M roztok NaHMDS v THF (418 ml, 418 mmol) a miešanie pokračovalo ďalších 15 min. Po ochladení na teplotu miestnosti sa pridala voda (50 mi) a zmes sa skoncentrovala na dve tretiny objemu na rotačnej odparke. Zvyšok sa potom nalial do vody (3 I). Filtrácia poskytla titulnú zlúčeninu (23,44 g) ako žltohnedú tuhú látku. Filtrát sa extrahoval EtOAc (3 x) a spojené extrakty sa premyli vodou a soľankou, potom sa sušili (MgSCU), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 9:1 alebo CHCI3), aby vzniklo ďalšie množstvo titulnej zlúčeniny (14,06 g, celkovo 37,50 g, 50% výťažok v 3 krokoch).

e) 2-Chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-4-metyl-8-(2-propenyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1.4] diazepín-6-ón

Roztok 8-bróm-2-chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-4-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2’,3'-e][1.4] diazepín-6-ónu (12,6 g, 34,3 mmol) v DMF (250 ml) sa odplyňoval pri zníženom tlaku 20 min. Potom sa pridal Pd(PPh3)4 (775 mg, 0,7 mmol), nasledovaný alyltributylcínom (12,5 ml, 41,1 mmol). Po odplyňovaní pri zníženom tlaku po dobu 10 min sa zmes zahrievala na 100 °C 7 h. Zmes sa potom skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 19:1), aby vznikla titulná zlúčenina (8,04 g, 71% výťažok) ako žltá tuhá látka.

f) 2-Chlór-5,11-dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1.4] diazepín-6-ón

Prúd O3 sa zaviedol do studeného (-78 °C) roztoku 2-chlór-5,11 -dihydro-11etyl-4-metyl-8-(2-propenyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (8,04 g,

24,4 mmol) a Sudanu III v CH2CI2 (120 ml) a MeOH (120 ml). Keď sa ružový roztok zmenil na hnedý, prebublával sa O2 cez roztok 10 min. Potom sa pridal NaBH4 (1,12 g, 29,4 mmol) a roztok sa nechal zahriať na teplotu miestnosti. Po 30 min sa pridalo ďalšie množstvo NaBH4 (500 mg). Po 1 h sa potom pridal nasýtený vodný

-24roztok NH₄CI a zmes sa miešala 20 min. Roztok sa skoncentroval pri zníženom tlaku a extrahoval sa CH2CI2 (3 x). Spojené organické extrakty sa premyli soľankou, sušili (MgSO₄), prefiltrovali sa a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (CHCI₃:EtOH, 97:3), aby vznikla titulná zlúčenina (6,01 g, 74% výťažok) ako biela tuhá látka.

g) 2-Chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (83 μΙ, 0,53 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 2-chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2’,3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (125 mg, 0,38 mmol), 4-hydroxychinolínu (76,3 g, 0,53 mmol) a Ph₃P (138 mg, 0,53 mmol) v THF (2,5 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 3 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (60 ml) a roztok sa postupne premyl 1N vodným roztokom NaOH (3 x 10 ml) a soľankou (15 ml), potom sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 9:1), aby vznikla titulná zlúčenina (52 mg, 30% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 460/462 (MH)⁺.

Príklad 6 (por. číslo 7, Tabuľka 1)

5,11 -Dihydro-11-etyl-2-fluór-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/7-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e] [1,4]diazepín-6-ón

a) 8-Bróm-5,11-dihydro-11-etyl-2-{{(4-metoxyfenyl)metyl}amino}-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

8-Bróm-2-chlór-5,11-dihydro-11-etyl-4-metýl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepín-6-ón (2,50 g, 6,80 mmol) sa rozpustil v dioxáne (10 ml) v sklenenej tlakovej nádobe a do roztoku sa pridal 4-metoxybenzylamín (4,0 ml, 30,6 mmol). Zmes sa zahrievala na 170 °C 5 dní. Reakčná zmes sa ochladila na teplotu miestnosti a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa pozberal do EtOAc a premyl 10% vodným roztokom NH₄CI, sušil nad MgSO₄, prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku, aby vznikol hnedý olej, ktorý sa chromatografoval nad silikagélom

-25(hexán:EtOAc, 4:1). Titulná zlúčenina sa získala ako žltá tuhá látka (1,35 g, 42% výťažok).

b) 2-Amino-8-bróm-5,11-dihydro-11-etyl-4-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3^,-e]-[1,4]diazepín-6-ón

8-Bróm-5,11 -dihydro-11 -etyl-2-{{(4-metoxyfenyl)metyl}amino}-4-metyl-6W-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón (6,52 g, 18,7 mmol) sa rozpustil v kyseline trifluóroctovej (100 ml) a roztok sa magneticky miešal pri teplote miestnosti 18 h. Kyselina trifluóroctová sa odparila pri zníženom tlaku a zvyšok sa nalial do zmesi, obsahujúcej vodu (450 ml), skoncentroval NH₄OH (50 ml) a EtOAc (400 ml). Zmes sa magneticky miešala 2 h pri teplote miestnosti. Organická fáza sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Žltý precipitát sa odfiltroval a premyl vodou, sušil pri zníženom tlaku, aby vzniklo 7,51 g žltej tuhej látky, ktorá sa triturovala v Et₂O, aby vznikla titulná zlúčenina (5,12 g, 105% výťažok) ako žltá tuhá látka.

c) 8-Bróm-5,11 -dihydro-11-etyl-2-fluór-4-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]-diazeρίη-6-όη

Plastová fľaša sa naplnila 2-amino-8-bróm-5,11-dihydro-11-etyl-4-metyl-6/-/dipyridojS^-b^'.S'-eHMjdiazepín-e-ónom (5,10 g, 14,6 mmol). Pridal sa HF pyridín (100 g) a výsledná suspenzia sa ochladila na 0 °C. V niekoľkých dávkach sa pridal dusitan sodný (1,12 g, 16,1 mmol) v priebehu 30 min, aby sa vytvoril fialový roztok. Zmes sa potom miešala 16 h pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa naliala do ľadu a 6N NaOH. Béžová suspenzia sa extrahovala EtOAc. Organické extrakty sa spojili, sušili nad MgSO4, prefiltrovali a skoncentrovali. Zvyšok sa trituroval s Et₂O/hexánom, aby vznikla titulná zlúčenina (4,30 g, 84% výťažok).

d) 5,11 -Dihydro-11-etyl-2-fluór-4-metyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Alyltributylcín (7,77 ml, 25,1 mmol) a Pd(Ph₃P)₄ (1,32 g, 1,14 mmol) sa pridali do odplyneného (N₂ cez roztok 30 min) roztoku 8-bróm-5,11-dihydro-11-etyl-2-fluór4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (8,0 g, 22,8 mmol) v DMF (114 ml). Zmes sa zahrievala na 90 °C 3 h. Zmes sa naliala do vody (250 ml) a

-26extrahovala EtOAc (4 x 250 ml). Spojené organické vrstvy sa premyli 20% vodným roztokom NH₄OH (250 ml) a soľankou (250 ml), sušili (MgSO₄), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexány:EtOAc, 4:1 až 1:1), aby vznikla titulná zlúčenina (3,16 g, 51% výťažok).

e) 5,11-Dihydro-11-etyl-2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Prúd ozonizovaného kyslíka sa prebublával cez studený (-78 °C) roztok 5,11dihydro-11 -etyl-2-fluór-4-metyl-8-(2-propenyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepín-6-ónu (3,16 g, 10,1 mmol) v CH₂CI₂ (25 ml) a MeOH (25 ml) 45 min. Prúd N₂ sa nasledovne prebublával cez roztok 15 min a potom sa do roztoku pridal tuhý NaBH₄ (669 mg, 17,1 mmol). Reakčná zmes sa nechala zahriať na teplotu miestnosti. Po 2 h sa pridal nasýtený vodný roztok NH₄CI (50 ml) a zmes sa miešala pri teplote miestnosti 15 min. Organické rozpúšťadlá sa odstránili pri zníženom tlaku. Zvyšný vodný roztok sa extrahoval CHCI3 (3 x 100 ml). Spojené organické vrstvy sa sušili (MgSO4), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:CHCI₃, 1:1), aby vznikla titulná zlúčenina (2,40 g, 75% výťažok) ako biela tuhá látka.

f) 5,11 -Dihydrp-11-etyl-2-fluór-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2’,3'-e] [1,4]diazepín-6-ón

Diizopropylazodikarboxylát (DIAD) (117 μΙ, 0,59 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 5,11 -dihydro-11-etyl-2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/7-dipyrido[3,2b^'.S'-eKMjdiazepín-e-ónu (125 mg, 0,40 mmol), 4-hydroxychinolínu (86 mg, 0,59 mmol) a Ph₃P (156 mg, 0,59 mmol) v THF (1,9 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 3 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (40 ml) a roztok sa postupne premyl 3N vodným roztokom NaOH (3 x 20 ml), nasýteným vodným roztokom NH4CI (15 ml), soľankou (15 ml), potom sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čiastočne vyčistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5). Tuhá látka sa ďalej čistila HPLC s obrátenými fázami (CombiPrep ADS-AQ 50 x 20 mm, 5 μ, 120 A, 5 až 100% MeCN + 0,10% TFA / voda + 0,10% TFA za 25 min), aby

-27vznikla soľ kyseliny trifluóroctovej pre titulnú zlúčeninu (106 mg, 48% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 444 (MH)⁺.

Príklad 7 (por. číslo 5, Tabuľka 1)

11-(Cyklopropyl)-5,11-dihydro-2-fluór-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

a) 11-Cyklopropyl-5,11-dihydro-2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Titulná zlúčenina sa pripravila z 8-bróm-2-chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro4-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ónu s použitím spôsobu podobného tomu, ktorý je pre príslušný 11-etylový analóg opísaný v príklade 6.

b) 11-Cyklopropyl-5,11-dihydro-2-fluór-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Diizopropylazodikarboxylát (DIAD) (131 μΙ, 0,66 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 11-(cyklopropyl)-5,11-dihydro-2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (140 mg, 0,44 mmol), 4-hydroxychinolínu (96,4 mg, 0,66 mmol) a Ph₃P (124 mg, 0,66 mmol) v THF (2,2 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 3 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (60 ml) a roztok sa postupne premyl 3N vodným roztokom NaOH (3 x 20 ml), nasýteným vodným roztokom NH4CI (20 ml) a soľankou (20 ml), potom sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čiastočne vyčistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5). Tuhá látka sa ďalej čistila HPLC s obrátenými fázami (CombiPrep ADS-AQ 50 x 20 mm, 5 μ, 120 A, 5 až 100% MeCN + 0,10% TFA / voda + 0,10% TFA za 25 min), aby vznikla soľ kyseliny trifluóroctovej pre titulnú zlúčeninu (104 mg, 43% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 456 (MH)⁺.

Príklad 8 (por. číslo 8, Tabuľka 1)

5,11-Dihydro-11-etyl-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-ej[1,4]diazepín-6-ón

-28f

a) 5,11-Dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-eH1,4]diazepín-6-ón

Zmes 2-ch!ór-5,11 -dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6H-dipyrido[3,2b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (168 mg, 0,51 mmol), mravčanu amónneho (318 mg,

5,1 mmol) a 10% Pd/C (50 mg) v EtOH (6 ml) sa miešala pri teplote miestnosti. Po 24 h sa pridali ďalšie množstvá mravčanu amónneho (200 mg) a 10% Pd/C (50 mg). Po ďalších 24 h miešania sa reakčná zmes skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v CHCb a zmes sa premyla nasýteným vodným roztokom NaHCO₃, sušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (122 mg, 81 %) ako žltý olej.

b) 5,11 -Dihydro-11 -ety l-4-mety l-8-{2-(4-ch i n ol i ny loxy )ety l}-6/7-d ipy rido[3,2-b:2', 3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Diizopropylazodikarboxylát (DIAD) (42 μΙ, 0,21 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 5,11 -dihydro-11 -etyl-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2', 3'e][1,4]diazepín-6-ónu (42,0 mg, 0,14 mmol), 4-hydroxychinolínu (31 mg, 0,21 mmol) a Ph₃P (55,4 mg, 0,21 mmol) v THF (0,7 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 2 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (60 ml) a roztok sa postupne premyl 3N vodným roztokom NaOH (3 x 20 ml), nasýteným vodným roztokom NH4CI (20 ml) a soľankou (20 ml), potom sa sušil (MgSO4), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čiastočne vyčistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5). Tuhá látka sa ďalej čistila HPLC s obrátenými fázami (CombiPrep ADS-AQ 50 x 20 mm, 5 μ, 120 A, 5 až 100 % MeCN + 0,10 % TFA / voda + 0,10 % TFA za 25 min), aby vznikla soľ kyseliny trifluóroctovej pre titulnú zlúčeninu (14,2 mg, 19% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 426 (MH)⁺.

Príklad 9 (por. číslo 3, Tabuľka 1)

11-(Cyklopropyl)-5,11-dihydro-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

a) 5-Bróm-2-chlór-N-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-3-pyrídínkarboxamid

-293-Amino-2,6-dichlór-4-metylpyridín (0,51 g, 2,85 mmol) sa rozpustil v toluéne (35 ml) a pridal sa pyridín (0,27 ml, 3,28 mmol). Potom sa v priebehu 30 min po kvapkách pridal 5-bróm-2-chlór-3-pyridínkarbonylchlorid (0,80 g, 3,14 mmol). Výsledná zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, zriedila sa vodou a extrahovala toluénom (2x). Spojené organické extrakty sa sušili (MgSO4), prefiltrovalí a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Výsledný hustý olej sa trituroval s CH2CI2 a biela tuhá látka sa zozbierala pomocou filtrácie pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (0,41 g, 36% výťažok).

b) 5-Bróm-2-(cyklopropylamino)-/V-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-3-pyridín-karboxamid

Roztok 5-bróm-2-chlór-/\/-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-3-pyridín-karboxamidu (3,00 g, 7,61 mmol) a cyklopropylamínu (2,11 ml, 30,5 mmol) v xylénoch sa zahrievala v utesnenej skúmavke na 120 °C 24 h. Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C, zriedila vodou a extrahovala EtOAc (2x). Spojené organické extrakty sa sušili (MgSO4), prefiltrovalí a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Výsledný zvyšok sa čistil trituráciou (Et2O:hexán, 3:1), aby vznikla titulná zlúčenina (2,35 g, 75%) ako bledožltá tuhá látka.

c) 8-Bróm-2,-chlór-11 -cyklopropyl-5,11-dihydro-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ón

Roztok 5-bróm-2-(cyklopropylamino)-/V-(2,6-dichlór-4-metyl-3-pyridinyl)-3pyridínkarboxamidu (105 mg, 0,254 mmol) v pyridíne (3,0 ml) sa zahrial na 50 °C, zatiaľ čo sa pridal 1M roztok NaHMDS v THF (0,53 ml, 0,53 mmol). Výsledný roztok sa miešal pri 50 °C 3 h. Reakčná zmes sa kvenčovala nasýteným vodným roztokom NH4CI, zriedila vodou a extrahovala EtOAc (3x). Spojené organické extrakty sa premyli soľankou, sušili (MgSO4), prefiltrovalí a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Výsledný zvyšok sa čistil pomocou rýchlej chromatografie (hexán:EtOAc, 7:3), aby vznikla titulná zlúčenina (32 mg, 33% výťažok).

d) 2-Chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-4-metyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido-[3,2-b: 2’,3’-e][1,4]diazepín-6-ón

-30Roztok 8-bróm-2-chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-4-metyl-6/7-dipyrido[3,2b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (0,046 g, 0,122 mmol) v DMF (2,0 ml) sa odplynil malým množstvom N₂ 10 min. Pridali sa Pd(PPh₃)4 (2,8 mg, 0,003 mmol) a alyltributylcín (0,45 ml, 0,146 mmol) a výsledný roztok sa zahrieval na 90 °C 2,5 h. Reakčná zmes sa zriedila vodou a extrahovala sa CH₂CI₂ (3x) a EtOAc (2x). Spojené organické extrakty sa sušili (MgSO₄), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Výsledný zvyšok sa čistil pomocou rýchlej chromatografie (hexán na hexán:EtOAc, 7:3), aby vznikla titulná zlúčenina (0,033 g, 80% výťažok).

e) 2-Chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Studený roztok (-78 °C) 2-chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-4-metyl-8-(2propenyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (0,82 g, 2,43 mmol) v CH₂CI₂ (7,5 ml) a MeOH (7,5 ml) sa sýtil O₃, až kým sa roztok nezmenil na bledomodrý. Reakčná zmes sa ponechala pri -78 °C 10 min, potom sa pridal NaBH₄ (0,23 g,

9,71 mmol) a zmes sa nechala pomaly zahrievať na teplotu miestnosti 2 h. Reakčná zmes sa kvenčovala vodným roztokom 10% kyseliny citrónovej a extrahoval sa EtOAc (3x). Organické extrakty sa spojili, premyli soľankou, sušili (MgSO₄), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Výsledný zvyšok sa čistil pomocou rýchlej chromatografie (MeOH:CH₂CI₂, 2 až 10 %), aby vznikla titulná zlúčenina (0,41 g, 60% výťažok) ako biela tuhá látka.

f) 11-Cyklopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Titulná zlúčenina sa pripravila s použitím spôsobu podobného tomu, ktorý je opísaný pre 11-etylový analóg v príklade 8a.

g) 11 -Cyklopropyl-5,11 -dihydro-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6H-dipyrido[3,2-b: 2' ,3'-e] [1,4]diazepín-6-ón

Diizopropylazodikarboxylát (DIAD) (167 μΙ, 0,85 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 11-cyklopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:

2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (175 mg, 0,57 mmol), 4-hydroxychinolínu (123 mg, 0,85

-31 mmol) a PhsP (223 mg, 0,85 mmol) v THF (2,8 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 3 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (60 ml) a roztok sa postupne premyl 3N vodným roztokom NaOH (3 x 20 ml), nasýteným vodným roztokom NH4CI (20 ml) a soľankou (20 ml), potom sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5), aby vznikla titulná zlúčenina (74 mg, 30% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 438 (MH)⁺.

Príklad 10 (por. číslo 21, Tabuľka 1)

5,11-Dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Tuhá mCPBA (80 až 85 %, kyselina m-chlórperbenzoová) (2,21 g, 10,2 mmol) sa pridala do roztoku 5,11-dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (2,56 g, 6,02 mmol) v CH2CI2 (30 ml) a THF (30 ml) pri teplote miestnosti (poznamenajme, že reakcia sa môže uskutočniť v samotnom CH2CI2). Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v CHCI₃ (400 ml), roztok sa postupne premyl vodným 10% roztokom Na₂S₂O3 (3 x 75 ml), nasýteným vodným roztokom NaHCO3 (3 x 75 ml) a soľankou (75 ml), sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (CHCbMeOH, 9:1), aby vznikla titulná zlúčenina (2,01 g, 76% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 442 (MH)⁺.

Príklad 11 (por. číslo 17, Tabuľka 1)

2-Chlór-5,11-dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-{2-{(1 -oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6A7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Použitím spôsobu, identického so spôsobom z príkladu 10, 2-chlór-5,11 dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-di-32azepín-6-ón (2,70 g, 5,87 mmol) poskytol titulnú zlúčeninu (2,05 g, 73% výťažok) ako bielu tuhú látku: MS (ESI) m/z 476/478 (MH)⁺.

Príklad 12 (por. číslo 11, Tabuľka 1)

5,11 -Dihydro-11 -etyl-2-fl uó r-5-metyl-8-{2-{( 1 -oxid ο-4-ch i nol i nyl )óxy}ety l}-6 A7-d i py ridoiS^-b^'.S'-eJiMjdiazepín-e-ón

Tuhá mCPBA (457 mg, 2,12 mmol) sa pridala do roztoku 5,11-dihydro-2fluór-11 -etyl-5-metyl-8-{2-(4-ch inol inyloxy)etyl}-6F/-d ipyrido[3,2-b:2', 3'-e] [1,4]-diazepín-6-ónu (470 mg, 1,06 mmol) v CH2CI2 (10 ml). Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 13 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v CHCI3 (75 ml), roztok sa postupne premyl 10% vodným roztokom Na2S2O₃ (3 x 25 ml), nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (3 x 25 ml) a soľankou (25 ml), sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (CHCI₃:MeOH, 19:1 až 9:1), aby vznikla titulná zlúčenina (250 mg, 51% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.

Príklad 13 (por. číslo 10, Tabuľka 1)

2-Chlór-11-cyklopropyl-5,11-dihydro-5-metyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6/7dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Tuhá mCPBA (177 mg, 0,82 mmol) sa pridala do roztoku 2-chlór-11cyklopropyl-5,11-dihydro-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'e][1,4]diazepín-6-ónu (143 mg, 0,30 mmol) v CH₂CI₂ (3 ml) a THF (3 ml). Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 14 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (50 ml), roztok sa postupne premyl 10% vodným roztokom Na2S2O₃ (3x10 ml), nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (3 x 10 ml) a soľankou (10 ml), sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čiastočne vyčistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5 až CH₂Cl2:MeOH, 9:1). Nečistý produkt sa ďalej čistil HPLC s obrátenými fázami (CombiPrep ADS-AQ 50 x 20 mm, 5 μ, 120 A, 5-100 % MeCN + 0,10 % TFA / voda + 0,10 % TFA za 25 min). Čisté frakcie sa spracovali nasýteným vodným roztokom

-33NaHCCb, extrahovali EtOAc a roztok sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (28,3 mg, 19% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 488/490 (MH)⁺.

Príklad 14 (por. číslo 14, Tabuľka 1) '

2-Chlór-5,11-dihydro-11-etyl-4-metyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6/7-dipyridotS^-b^'.S'-ejfl^jdiazepín-G-ón

Tuhá mCPBA (46,9 mg, 0,22 mmol) sa pridala do roztoku 2-chlór-5j11dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]-diazepín-6-ónu (50,0 mg, 0,11 mmol) v CH₂CI₂ (2,2 ml). Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (50 ml), roztok sa postupne premyl 10% vodným roztokom Na₂S₂O3 (3x10 ml), nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (3 x 10 ml) a soľankou (10 ml), sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil HPLC s obrátenými fázami (CombiPrep ADS-AQ 50 x 20 mm, 5 μ, 120 A, 5-100 % MeCN + 0,10 % TFA / voda + 0,10 % TFA za 25 min). Čisté frakcie sa spracovali nasýteným vodným roztokom NaHCO3, extrahovali EtOAc a roztok sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (32,5 mg, 63% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 488/490 (MH)⁺.

Príklad 15 (por. číslo 9, Tabuľka 1)

5,11 -Dihydro-11 -etyl-2-fluór-4-metyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

S použitím spôsobu, podobného spôsobu z príkladu 14, 5,11 -dihydro-11 -etyl2-fluór-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]-diazepín-6ón (125 mg, 0,28 mmol) poskytol titulnú zlúčeninu (40 mg, 31% výťažok) ako bielu tuhú látku: MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.

Príklad 16 (por. číslo 12, Tabuľka 1)

-345,11 -Dihydro-11 -etyl-4-metyl-8-{2-{(1 -oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6A7-dipyrido[3,2b:2',3'-e] [1,4]diazepín-6-ón

Tuhá mCPBA (163 mg, 0,75 mmol) sa pridala do roztoku 5,11 -dihydro-11 etyl-4-metyl-8-{2-(4-chinólinyloxy)etyl}-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (144 mg, 0,34 mmol) v CH2CI2 (7,5 ml). Roztok sa miešal pri teplote miestnosti 2 h. Zmes sa zriedila CH2CI2 (125 ml), postupne premyla 10% vodným roztokom Na₂S₂O₃ (2 x 25 ml), nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (2 x 25 ml) a soľankou (25 ml), potom sa sušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (Ch^C^MeOH, 10:1), aby vznikla titulná zlúčenina (102 mg, 68% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 442 (MH).

Príklad 17 (por. číslo 15, Tabuľka 1)

11-Cyklopropyl-5,11-dihydro-11-etyl-4-metyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6/7dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ón

S použitím spôsobu, podobného spôsobu z príkladu 14, 11-cyklopropyl-5,11dihydro-11 -etyl-4-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy )etyl}-6A7-d ipy rido[3,2-b:2', 3'-e][1,4]d iazepín-6-ón (37,1 mg, 0,085 mmol) poskytol titulnú zlúčeninu (35 mg, 91%) ako bielu tuhú látku;. MS (ESI) m/z 454 (MH)⁺.

Príklad 18 (por. číslo 25, Tabuľka 1)

2-Chlór-5,11-dihydro-11-etyl-4-metyl-8-{2-(5-chinolinyloxy)etyl}-6/7-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (77 μΙ, 0,49 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 2-chlór-5,11 -dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (125 mg, 0,38 mmol), 5-hydroxychinolínu (70,9 mg, 0,49 mmol) a Ph₃P (128 mg, 0,49 mmol) v THF (2,5 ml) pri teplote miestnosti. Po 1,5 h sa do zmesi pridali ďalšie množstvá DEAD (35 μΙ, 0,22 mmol) a Ph₃P (59 mg, 0,22 mmol). Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, potom sa zriedila v EtOAc (50 ml) a roztok sa postupne premyl 1N vodným roztokom NaOH (4 x 10 ml) a soľankou (15 ml), potom sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku.

-35Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (CH₂CI₂:acetón, 85:15). Výsledná tuhá látka sa triturovala s Et₂O, aby vznikla titulná zlúčenina (38 mg, 22% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 460/462 (MH)⁺.

I

Príklad 19 (por. číslo 20, Tabuľka 1)

2-Chlór-5,11 -dihydro-11 -etyl-5-metyl-8-{2-{(1 -oxido-5-chinolinyl)oxy}etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (160 μΙ, 1,01 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 2-chlór-5,11-dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (225 mg, 0,68 mmol), 5-hydroxychinolínu (147 mg, 1,01 mmol) a Ph₃P (266 mg, 1,01 mmol) v THF (3,4 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa

I miešala pri teplote miestnosti 3 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čiastočne vyčistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH 95:5). Frakcie, obsahujúce 5-chinolinyloxy derivát, sa skoncentrovali, rozpustili v CH₂CI₂ (2 ml) a THF (5 ml) a spracovali mCPBA (80%, 248 mg, 1,15 mmol) pri teplote miestnosti. Roztok sa miešal pri teplote miestnosti 2,5 h, potom sa skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc (50 ml), postupne premyl 10% vodným roztokom Na₂S₂O₃ (3x10 ml), nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (3 x 10 ml) a soľankou (10 ml), potom sa sušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH, 95:5 až CH₂Cl2:MeOH, 9:1), aby vznikla titulná zlúčenina (113 mg, 35% výťažok pre 2 kroky) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 476/478 (MH)⁺.

Príklad 20 (por. číslo 18, Tabuľka 1)

5,11-Dihydro-11-etyl-2-fluór-5-metyl-8-{2-{(1-oxido-5-chinolinyl)oxy}etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

S použitím spôsobu, identického so spôsobom z príkladu 14, 5,11-dihydro11 -etyl-2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ón (267 mg, 0,84 mmol) poskytol titulnú zlúčeninu (204 mg, 52% výťažok pre 2 kroky) ako bielu tuhú látku: MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.

-36Príklad 21 (por. číslo 19, Tabuľka 1)

2-Chlór-5,11 -dihydro-11 -etyl-4-metyl-8-{2-{(1 -oxido-5-chinolinyl)oxy}etyl}-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3’-e][1,4]diazepín-6-ón

S použitím spôsobu, podobného spôsobu z príkladu 14,’ ale s použitím diizopropylazodikarboxylátu (DIAD) namiesto dietylazodikarboxylátu, 2-chlór-5,11dihydro-11 -etyl-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3’-e][1,4]diazepín-6ón (223 mg, 0,67 mmol) poskytol titulnú zlúčeninu (43,4 mg, 14% výťažok pre 2 kroky) ako bielu tuhú látku: MS (ESI) m/z 476/478 (MH)⁺.

Príklad 22 (por. číslo 23, Tabuľka 1)

5,11 -Dihydro-11 -etyl-2-f I uór-4-metyl-8-{2-{( 1 -oxido-5-ch i nol inyl )oxy}etyl}-6/-/-d ipyridoIS^-b.^'.S'-elfMJdiazepín-e-ón

S použitím spôsobu, podobného spôsobu z príkladu 21, 5,11 -dihydro-11 -etyl2-fluór-8-(2-hydroxyetyl)-4-metyl-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ón (250 mg, 0,79 mmol) poskytol titulnú zlúčeninu (64,7 mg, 18% výťažok pre 2 kroky) ako bielu tuhú látku: MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.

Príklad 23, por..číslo 22, Tabuľka 1

2-Chlór-5,11-dihydro-11-etyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón MS (ESI) m/z 462/464 (MH)⁺.

Príklad 24, por. číslo 26, Tabuľka 1

5.11- Dihydro-5,11-dietyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

MS (ESI) m/z 440 (MH)⁺.

Príklad 25, por. číslo 27, Tabuľka 1

5.11- Dihydro-5,11-dietyl-8-{2-{(1-oxidό-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3^,e][1,4]diazepín-6-ón

-37MS (ESI) m/z 456 (MH)⁺.

Príklad 26 (por. číslo 28, Tabuľka 1)

2,5-Dimetyl-5,11 -dihydro-11 -etyl-8-{2-{(1 -oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6H-dipyrido[S^-b^'.S'-eHMJdiazepín-e-ón

a) 5-Bróm-2-chlór-/\/-(6-chlór-2-metyl-3-pyridinyl)-3-pyridínkarboxamid

NaHCO₃ (3,9 g, 46,4 mmol) sa pridal do roztoku 3-amino-2-chlór-6-metylpyridínu (2,2 g, 15,4 mmol; pripraveného, ako opísali K. G. Grozinger a ďalší, J. Heterocyclic Chem. 32, 259-263, 1995) v MeCN (50 ml). Výsledná suspenzia sa miešala 15 min a v priebehu 30 min sa zaviedol roztok surového 5-bróm-2-chlór-3pyridínkarbonylchloridu (pripraveného z kyseliny 5-bróm-2-hydroxy-3-pyridínkarboxylovej a SOCb [ako opísali T. W. Gero a ďalší v Synth. Commun. 19, 553559, 1989 (zahrnuté sem odkazom), ale s vynechaním vodného spracovania] (4 g) v MeCN (10 ml)). Výsledná suspenzia sa miešala pri teplote miestnosti: Po 24 h sa zmes naliala do zmesi vody (100 ml) a ľadu (10 g) a miešala sa 20 min. Suspenzia sa prefiltrovala a výsledná tuhá látka sa premyla vodou (50 ml) a hexánom (25 ml), potom sa sušila nad P₂O₅ pri zníženom tlaku, aby vznikla titulná zlúčenina (1,8 g, 31% výťažok) ako biely prášok.

b) 5-Bróm-A/-(2-chlór-6-metyl-3-pyridinyl)-2-(etylamino)-3-pyridínkarboxamid

Roztok 5-bróm-2-chlór-/\/-(2-chlór-6-metyl-3-pyridinyl)-3-pyridínkarboxamidu (1,7 g, 4,8 mmol) a etylamínu (2M v THF, 10,5 mmol, 5,2 ml) v THF (5 ml) sa miešal pri 90 až 95 °C v oceľovom autokláve 16 h. Výsledná zmes sa naliala do vody (100 ml), miešala sa 15 min a prefiltrovala. Tuhá látka sa premyla vodou, potom hexánom, aby vznikla titulná zlúčenina (1,58 g, 89% výťažok).

c) 8-Bróm-5,11-dihydro-2,5-dimetyl-11-etyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepín6-ón

Roztok surového 5-bróm-/V-(2-dichlór-6-metyl-3-pyridinyl)-2-(etylamino)-3pyridínkarboxamidu (0,7 g, 1,8 mmol) v bezvodom pyridíne (18 ml) sa zahrial na 50 °C. Potom sa po kvapkách pridal 1M roztok NaHMDS v THF (7,2 ml, 7,2 mmol) a

-38miešanie pokračovalo ďalšie 3 h. Po ochladení na teplotu miestnosti sa pridal metyljodid (0,6 ml, 9 mmol) a reakčná zmes sa miešala cez noc. Pridala sa voda (25 ml) a zmes sa extrahovala EtOAc (3x) a spojené extrakty sa premyli vodou a soľankou, potom sa sušili (MgSO₄), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 8:2), abý vznikla titulná zlúčenina (259 mg, 41% výťažok).

d) 5,11-Dihydro-2,5-dimetyl-11-etyl-8-(2-propenyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Roztok 8-bróm-5,11-dihydro-2,5-metyl-11-etyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (258 mg, 0,7 mmol) v DMF (7,4 ml) sa odplyňoval pri zníženom tlaku 20 min. Potom sa pridal Pd(PPh₃)₄ (43 mg, 0,04 mmol), nasledovaný alyltributylcínom (0,3 ml, 0,85 mmol). Po odplyňovaní pri zníženom tlaku 10 min sa zmes zahrievala na 100 °C 1,5 h. Zmes sa potom skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 8:2), aby vznikla titulná zlúčenina (184 mg, 98% výťažok) ako žltá tuhá látka.

e) 5,11-Dihydro-2,5-dimetyl-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ón

Prúd O₃jsa zaviedol do studeného (-78 °C) roztoku 5,11-dihydro-2,5-dimetyl11 -etyl-8-(2-propenyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b:2’,3’-e][1,4]diazepín-6-ónu (187 mg, 0,6 mmol) a Sudanu lll v CH2CI2 (3 ml) a MeOH (3 ml). Keď sa ružový roztok zmenil na hnedý, prebublával sa O₂ cez roztok 10 min. Potom sa pridal NaBH₄ (57 mg, 1,52 mmol) a roztok sa nechal zahriať na teplotu miestnosti. Po 30 min sa pridalo ďalšie množstvo NaBH₄ (20 mg). Po 2 h sa potom pridal nasýtený vodný roztok NH₄CI a zmes sa miešala 20 min. Roztok sa skoncentroval pri zníženom tlaku a extrahoval sa CH₂CI₂ (3x). Spojené organické extrakty sa premyli soľankou, sušili (MgSO₄), prefiltrovali a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:hexán 6:4), aby vznikla titulná zlúčenina (111 mg, 58% výťažok) ako biela tuhá látka.

-39f) 2,5-Dimetyl-5,11 -dihydro-11-etyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6H-dipyrido-[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (139 μΙ, 0,88 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 5,11-dihydro-2,5-dimetyl-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (110 mg, 0,35 mmol), 4-hydroxychinolínu (128 mg, 0,88 mmol) a Ph₃P (231 mg, 0,88 mmol) v THF (3,5 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 16 h. Reakčná zmes sa zriedila v EtOAc (60 ml) a roztok sa postupne premyl 1N vodným roztokom NaOH (3 x 10 ml) a soľankou (15 ml), potom sa sušil (MgSO4), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc, potom EtOAc:MeOH, 9,5:0,5), aby vznikla titulná zlúčenina (57 mg, 37% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 440 (MH)⁺.

g) 5,11-Dihydro-2,5-dimetyl-11-etyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}etyl}-6/7-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Tuhá mCPBA (80 až 85%, kyselina m-chlórperbenzoová) (60 mg, 0,28 mmol) sa pridala do roztoku 5,11 -dihydro-2,5-dimetyl-11 -etyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-6/-/-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (55 mg, 0,13 mmol) v CH₂CI₂ (1,3 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 2,5 h, potom sa zriedila pomocou CH₂CI₂. Výsledný roztok sa potom postupne premyl 10% vodným roztokom Na₂S2O₃, nasýteným vodným roztokom NaHCO3 a soľankou, sušil sa (MgSC>4), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (MeOH/EtOAc, 2 % až 5 %), aby poskytol titulnú zlúčeninu (59 mg, 99% výťažok) ako bielu tuhú látku: MS (ESI) m/z 456 (MH)⁺.

Príklad 27 (por. číslo 29, Tabuľka 1)

5,11-Dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-(1-oxo-4-chinolinyloxy)etyl}-2-(trifluórmetyl)-6/7dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

a) 2-(Etylamino)-3-nitro-6-(trifluórmetyl)pyridín

Do roztoku amónnej 2-nitroacetamidovej soli (4 g, 33 mmol) vo vode (165 ml) sa pridal piperidínacetát (33 mmol) vo vode, po čom nasledovalo pomalé pridávanie

4-etoxy-1,1,1-trifluór-3-butén-2-ónu (6,1 ml, 43 mmol) v MeOH (11 ml). Reakčná

-40zmes sa miešala 2 h pri teplote miestnosti a pod refluxom 3 h. Reakčná zmes sa nechala ochladiť na 45 °C a pridával sa vodný roztok HCI (1N), kým pH nebolo kyslé. Po 1 h pri teplote miestnosti sa reakčná zmes extrahovala pomocou CH2CI2 (3x). Spojená organická vrstva sa postupne premyla vodou a soľankou, sušila (MgSO4), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc, potom EtOAc:MeOH, 9:1), aby poskytol 3-nitro-6(trifluórmetyI)-2(1/-/)-pyridinón (2,7 g, 40% výťažok) ako žltú tuhú látku.

Do roztoku 3-nitro-6-(trifluórmetyl)-2(1 /7)-pyridinónu (2,4 g, 11,5 mmol) v DMF (69 ml) sa pridal hydrid sodný (350 mg, 13,8 mmol). Reakčná zmes sa miešala 30 min pri 45 °C, ochladila sa na teplotu miestnosti a pridal sa A/-fenyltrifluórmetánsulfonimid (4,9 g, 13,8 mmol). Po 1 h sa pridal 2M roztok etylamínu v THF (13 ml, 25 mmol). Reakčná zmes sa miešala pri teplote miestnosti cez noc. Reakčná zmes sa vyliala do vody (100 ml) a extrahovala sa EtOAc (3x). Spojená organická vrstva sa postupne premyla vodou a soľankou, sušila (MgSO4), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 9:1), aby poskytol požadovanú zlúčeninu (1,1 g, 41% výťažok) ako žltý olej.

b) 3-Amino-2-(etylamino)-6-(trifluórmetyl)pyridín

Roztok 2-(etylamino)-3-nitro-6-(trifluórmetyl)pyridínu (1,1 g, 4,9 mmol) v MeOH (40 ml) sa miešal cez noc pri teplote miestnosti pod vodíkom (1 atm.) v prítomnosti 20% Pd(OH)₂/C (100 mg). Katalyzátor sa odstránil filtráciou cez kremelinu. Filtrát sa skoncentroval pri zníženom tlaku, aby poskytol titulnú zlúčeninu ako oranžový olej (1 g).

c) 2-Chlór-A/-{(2-(etylamino)-6-(trifluórmetyl)-3-pyridinyl}-5-bromo-3-pyridín-karboxamid

Do ochladeného roztoku 3-amino-2-(etylamino)-6-(trifluórmetyl)pyridínu (1 g,

4,9 mmol) v MeCN (24 ml) sa pridal tuhý NaHCO3 (906 mg, 11 mmol). Po 5 min sa pridal surový 5-bróm-2-chlór-3-pyridínkarbonylchlorid (pripravený z kyseliny 5-bróm2-hydroxy-3-pyridínkarboxylovej a SOCI₂ [ako opísali T. W. Gero a ďalší v Synth. Commun. W, 553-559, 1989 (zahrnuté sem odkazom)] (1 ekv., 4,9 mmol). Po 2 h

-41 sa reakčná zmes vyliala na ľad/H₂O (1,5 I) a výsledná tuhá látka sa prefiltrovala, prepláchla H₂O a potom hexánom. Po sušení pri zníženom tlaku cez noc sa získala titulná zlúčenina ako svetlohnedá tuhá látka (1,6 g, 77% výťažok).

^: I

d) 8-Bróm-5,11 -dihydro-11 -etyl-2-(trif I uórmetyl )-6/7-d i py rido [3,2-b: 2’, 3'-e]-[ 1,4]diazeρίη-6-όη

Do roztoku 2-chlór-/\/-{(2-(etylamino)-6-(trifluórmetyl)-3-pyridinyl}-5-bromo-3pyridín-karboxamidu (766 mg, 1,8 mmol) v DMF (18 ml) sa pridal NaH (137 mg, 5,4 mmol). Reakčná zmes sa miešala pri 80 °C. Po 1 h sa reakčná zmes nechala ochladiť na teplotu miestnosti a potom sa vyliala do vody (20 ml). Výsledná zmes sa extrahovala EtOAc (3x). Spojená organická vrstva sa postupne premyla vodou a soľankou, sušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 7:3), aby poskytol požadovanú zlúčeninu (200 mg, 28% výťažok) ako žltú tuhú látku.

e) 8-Bróm-5,11 -dihydro-11 -etyl-5-metyl-2-(trifluórmetyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Do roztoku 8-bróm-5,11-dihydro-11-etyl-2-(trifluórmetyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (200 mg, 0,52 mmol) v DMF (2,6 ml) sa pridal NaH (20 mg, 0,78 mmol) a táto zmes sa zahrievala na 50 °C 30 min. Reakčná zmes sa ochladila na teplotu miestnosti a pridal sa Mel (97 μΙ, 1,56 mmol). Po 16 h sa reakčná zmes zriedila vodou. Výsledná zmes sa extrahovala EtOAc (3x). Spojená organická vrstva sa postupne premyla vodou a soľankou, sušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 8,5:1,5), aby poskytol titulnú zlúčeninu (110 mg, 53% výťažok) ako bielu penu.

f) 5,11-Dihydro-11-etyl-5-metyl-8-(2-propenyl)-2-(trifluórmetyl)-6H-dipyrido-[3,2-b: 2',3’-e] [1,4]diazepín-6-ón

Alyltributylcín (98 μΙ, 0,32 mmol) a Pd(Ph₃P)₄ (16 mg, 0,02 mmol) sa pridali do odplyneného (N₂ cez roztok 30 min) roztoku 8-bróm-5,11 -dihydro-11-etyl-5metyl-2-(trifluórmetyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (11 mg, 0,27

-42mmol) v DMF (1,4 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri 90 °C 1,5 h, potom sa ochladila na teplotu miestnosti a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (hexán:EtOAc, 8:2 až 7:3), aby vznikla titulná zlúčenina (101 mg, 99% výťažok).

g) 5,11-Dihydro-11-etyl-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-2-(trifluórmetyl)-6/-/-dipyrido[3,2-b: 2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Prúd ozonizovaného kyslíka sa prebublával cez studený (-78 °C) roztok 5,11dihydro-11-etyl-5-metyl-8-(2-propenyl)-2-(trifluórmetyl)-6/7-dipyrido[3,2-b:2^,,3^,-e][1,4]diazepín-6-ónu (100 mg, 0,27 mmol) v CH2CI2 (2,7 ml) a MeOH (2,7 ml) 2,5 h. Prúd N₂ sa potom prebublával cez roztok 15 min a potom sa do roztoku pridal tuhý NaBH₄ (52 mg, 1,4 mmol). Reakčná zmes sa nechala zahriať na teplotu miestnosti. Po 1 h sa pridal nasýtený vodný roztok NH₄CI (5 ml) a zmes sa miešala pri teplote miestnosti 2 h. Reakčná zmes sa zriedila CH₂CI₂ a vodná vrstva sa opätovne extrahovala ΟΗ₂ΟΙ₂. Spojená organická vrstva sa postupne premyla vodou a soľankou, sušila (MgSO₄), prefiltrovala sa a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:hexán: 75:25 až EtOAc 100 %), aby vznikla titulná zlúčenina (60 mg, 59% výťažok) ako biela tuhá látka.

h) 5,11 -Dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-2-(trifluórmetyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ón

Dietylazodikarboxylát (DEAD) (38 μΙ, 0,24 mmol) sa po kvapkách pridal do roztoku 5,11 -dihydro-11 -etyl-8-(2-hydroxyetyl)-5-metyl-2-(trifluórmetyl)-6/-/-dipyrido[S^-b^'.S'-ej-IMjdiazepín-e-ónu (58 mg, 0,16 mmol), 4-hydroxychinolínu (35 mg, 0,24 mmol) a Ph₃P (62 mg, 0,24 mmol) v THF (1,6 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 1 h, potom sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (EtOAc:MeOH; 95:5), aby vznikla titulná zlúčenina (24 mg, 31% výťažok) ako biela tuhá látka: MS (ESI) m/z 494, 495 (M⁺).

i) 5,11-Dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-[(1-oxido-4-chinolinyl)oxy]etyl}-2-(trifluórmetyl)6/-/-dipyrido[3,2-b:2',3^,-e][1,4]diazepín-6-ón

-43Tuhá mCPBA (80 až 85%, kyselina m-chlórperbenzoová) (16 mg, 0,08 mmol) sa pridala do roztoku 5,11-dihydro-11-etyl-5-metyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)etyl}-2-(trifluórmetyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepín-6-ónu (22 mg, 0,04 mmol) v CH2CI2 (0,5 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 2,5 h, potom sa zriedila pomocou CH₂CI₂. Výsledný roztok sa postupne premyl 10% vodným roztokom Na₂S₂O3, nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ a soľankou, sušil sa (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (MeOH:EtOAc, 5 % až 10 %), aby poskytol titulnú zlúčeninu (11 mg, 52% výťažok) ako bielu tuhú látku: MS (ESI) m/z 511 (MH)⁺.

-44Tabuľka 1

Zlúčeniny všeobecného vzorca I

Tabuľka 1 por. číslo	R	R4	Rô	R11	Q
1	Cl	Me	H	Et	xP
2	Cl	H	Me	Et	ó5
3	H	Me	H	CycPr	xpp
4	v F	H	Me	Et	)pP
5	F	Me	H	CycPr
6	Cl	H	Me	CycPr	pp
7	F	Me	H	Et	PP

-45(I)

Tabuľka 1 por. číslo	Rz	R4	R	R11	Q
8	H	Me	H	Et	Y	Ό -íSN
9	F	Me	H	Et		Ό
					v	\ — o
10	- Cl	H	Me	CycPr
					Y	\7° ( w
11	F	H	Me	Et
					Y	^N + 0
12	H	Me	H	Et
					Y	<^N + \ 0
14	Cl	Me	H	Et		r/
					Y	>> < w
15	H	Me	H	CycPr		Ό
					Y	<^N + 0

-46(I)

Tabuľka 1 por. číslo	Rz	R4	Rb	R11	Q
17	Cl	H	Me	Et		rs
						\ — O
18	F	H	Me	Et
					í	— \ 0“
19	. Cl	Me	H	Et		jQ
					f	-^N + --- \ 0“
20	Cl	H	Me	Et	í	'O j=^N + O-
21	H	H	Me	Et		Ό
					V	^N + \ — 0
22	Cl	H	H	Et		íT
					Cr 0
23	F	Me	H	Et		Y\
					í	^N + 0“

-47(I)

Tabuľka 1 por. číslo	R	R4	Rb	R	Q
24	H	H	Me	Et	ť?
25	Cl	Me	H	Et
26	- H	H	Et	Et
27	H	H	Et	Et	''ti
28	ch3	H	ch3	Et	0
29	cf3	H	H	Et	0

-48Testy reverznej transkriptázy (RT)

Teória testov

Medzi enzýmami, ktoré kóduje vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV1), je reverzná transkriptáza (1), nazvaná tak, pretože transkribuje DNA kópiu z RNA templátu. Táto aktivita sa dá kvantitatívne merať v bezbunkovom enzýmovom teste a ten sa zakladá na pozorovaní, že reverzná transkriptáza je schopná použiť syntetický templát poly r(C), senzibilizovaný biotinylovaným oligo d(G), aby transkriboval rádioaktívne značkované DNA vlákno s využitím 3H-dGTP ako substrátu. Ďalej opísaný test využíva enzým štandardného typu (ktorý je prevládajúcou formou enzýmu, pozorovaného u pacientov, infikovaných HIV-1) a tiež sa dá použiť s enzýmami mutujúcej RT (napríklad Y181C, pripraveným miestne orientovanou mutagenézou, v ktorej sa tyrozínový zvyšok v kodóne 181 nahradil cysteínovým zvyškom) pri analogických podmienkach testu. Tento test umožňuje vyhodnotiť účinnosť zlúčenín pri inhibovaní mutujúcich enzýmov.

Materiály

a) Príprava enzýmu

Niektoré--BH10 RT mutanty HIV-1 IIIB klonu pripravil Dr. C.-K. Shih (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc., USA) vo vektore pKK233-2 (Pharmacia). Stručne, HIV RT kloň pKRT2, obsahujúci len RT p66 gén, regulovaný lac operónom/trc promótorom, sa získal od Dr. W. Summersa (Yale University) (2). Rôzne špecifické substitúcie aminokyselín sa zaviedli do RT génu štandardného typu miestne orientovanou mutagenézou. RT klony sa subklonovali do vektora pKK233-2 bakteriálnej expresie. Vytvorené klony zahrnovali štandardný typ, Val106Ala, Tyr181Cys, Tyr188Cys, Tyr188Leu, Gly190Ala a Pro236Leu. Ďalšie sa pripravili vo vlastnom laboratóriu miestne orientovanou mutagenézou pKK233-2 RT klonov a zahrnovali Lys103Asn, Lys103Asn/Tyr181Cys, Lys103Asn/l_eu100lle, Lys103Asn/Pro225His a Lys103Asn/Val108lle.

-49b) Čistenie enzýmu

Čistenie rekombinantnej reverznej transkriptázy sa uskutočnilo s použitím kombinácie predtým opísaných metód (3). Jednotlivá kolónia z čerstvej platne transformovaných JM109 buniek sa použila na iniciovanie rastu predkultúry, rastúcej na o/n pri 37 °C. Touto predkultúrou sa zaočkovali dva litre rastového média. Pri Οϋβοο ~ 1,5 (5 až 6 h pri 37 °C) sa RT génová expresia indukovala pomocou IPTG (konečných 1 mM) a fermentácia pokračovala ďalších niekoľko hodín pri 37 °C. Po centrifúgovaní sa supernatanty odstránili, zatiaľ čo bunkové pelety sa spojili a skladovali pri -80 °C až do čistenia. Bunky sa rozmrazili pri 4 °C cez noc a suspendoval! sa v lýznom pufri (MES 50 mM, pH 6, EDTA 1 mM, 10% (hmotn.) glycerol, 0,02% (hmotnosť/objem) n-oktyl-p-D-glukozid, 0,02% (hmotnosť/objem) azid sodný). Pridal sa lyzozým a zmes sa inkubovala na ľade 40 minút. Po homogenizácii s použitím Dounce v prítomnosti lyzozýmu a sonikácii sa bunky centrifúgovali 30 minút. Supernatant (S1) sa uchoval a skladoval pri 4 °C. Centrifúgovaná peleta sa resuspendovala v extrakčnom pufri (MES 50 mM, pH 6, KPO₄ 50 mM, pH 6, KCI 100 mM, 10% (obj.) glycerol, 0,02% (hmotnosť/objem) noktyl-p-D-giukozid, 0,02% (hmotnosť/objem) azid sodný) a miešalo sa 30 minút pri 4 °C. Táto druhá zmes sa opäť centrifúgovala a supernatant (S2) sa uchoval. Vyššie uvedený postup sa zopakoval ďalšie dva razy, pričom sa uchovali supernatanty S3

Vr a S4 a posledná extrakcia sa uskutočnila cez noc (S5). K spojeným supernatantom sa pridal Polymin P (konečných 0,005 %), aby sa odstránili nukleové kyseliny. Tento roztok sa miešal 75 minút pri 4 °C a centrifúgoval sa 1 h. Supernatant (SS1) sa vyzrážal na ľade 20% (hmotnosť/objem) síranom amónnym a miešal sa 1 h pri 4 °C. Zmes sa potom centrifúgovala a výsledný supernatant (SS2) sa vyzrážal ďalším 40% (hmotnosť/objem) síranom amónnym (celkove 60 %), miešal sa 1 h a opäť sa centrifúgoval. Konečná peleta (P1) sa skladovala cez noc pri 4 °C predtým, než sa nasledujúci deň podrobila čisteniu. Všetky kroky čistenia sa uskutočnili pri 4 °C, pokiaľ nie je uvedené ináč.

Peleta (P1) sa resuspendovala do MES 50 mM, pH 6, KPO₄ 10 mM, pH 6, KCI 100 mM, 10% (obj.) glycerolu, 0,02% (hmotnoť/objem) n-oktyl-p-D-glukozidu, 0,02% (hmotnosť/objem) azidu sodného. Suspenzia sa dialyzovala voči tomu

-50istému pufru cez noc s použitím 12 až 14 kD MWCO dialýznej hadičky. Dialyzát sa centrifúgoval a supernatant sa prefiltroval cez Millex-PF 0,8 pm filtračné jednotky. Prefiltrovaná vzorka sa naložila na hydroxyapatitový stĺpec (objem lôžka 30 ml) a premyla sa tým istým pufrom. Viazaný enzým sa eluoval ~ 220 ml 10 až 300 mM KPO₄ s lineárnym gradientom vo vyššie uvedenom pufri. Frakcie, obsahujúce p66/p51 heterodimér (ako sa stanovilo pomocou SDS-PAGE 8% a Western blottingu), sa spojili pre nasledujúci stĺpec. Frakcie, ktoré obsahovali RT, sa dvojnásobne zriedili Bis-Tris propánom 50 mM, pH 7,0, (NH₄)2SO₄ 1M, 0,02% (hmotnosť/objem) OBG, 10% (obj.) glycerolom, 0,02% (hmotnosť/objem) NaN₃ a naložili sa na stĺpec Hi-Trap Heparine Sepharose (objem lôžka 5 ml) a premyli sa tým istým pufrom. Viazaná RT sa potom eluovala 75 ml 0 až 1M síranu amónneho s lineárnym gradientom v tom istom pufri. Frakcie s obsahom RT sa spojili podľa SDS-PAGE a Western blotting analýz. Koncentrácia proteínov v tejto dávke sa určila Bradfordovou metódou s použitím BSA ako štandardu. Konečný enzýmový prípravok sa dialyzoval v MES 50 mM, pH 6, KPO₄ 300 mM, pH 6, KCI 175 mM, 10% (obj.) glycerole, 0,02% (hmotnosť/objem) azide sodnom a rozdelil sa a zmrazil pri -80 °C.

Testovací postup

Rádiometrický test enzýmu sa prispôsobil 96-miskovému formátu mikrotitračnej platne a používa streptavidínové scintilačné výmenné guľôčky. Test je stručne opísaný ďalej. HIV-1 RT enzým sa rozmrazil a príslušne zriedil v Tris/HCI 50 mM, pH 7,8, obsahujúcom NaCl 60 mM, hexahydrát MgCI₂ 2 mM, DTT 6 mM, redukovaný glutatión 2 mM a 0,02% (hmotnosť/objem) Chaps, aby vznikli - 3 nM enzýmu. K 30 μΙ tohto enzýmu sa pridalo 10 μΙ roztoku inhibítora (50 μΜ až 2,5 nM inhibítora v tom istom testovacom pufri ako vyššie, obsahujúcom 15% (obj.) DMSO). Platňa sa predinkubovala 15 minút pri teplote miestnosti pred prechodom k nasledujúcemu kroku. V tomto kroku predinkubácie boli najvyššia a najnižšia koncentrácia inhibítora 12,5 μΜ a 0,62 nM a koncentrácia DMSO bola 3,75 % (obj.). Potom sa iniciovala enzymatická reakcia pridaním 10 μΙ roztoku substrátu. Konečná reakčná zmes obsahovala Tris/HCI 50 mM, pH 7,8, NaCl 60 mM, MgCI₂-6H₂O 2

-51 mM, DTT 6 mM, GSH 2 mM, Chaps 0,02% (hmotnosť/objem) DMSO 3 % (obj.), Poly rC 179 nM, Biotin dG₁₅18 nM, dGTP 288 nM a ³H-dGTP 71 nM.

V tomto kroku inkubácie boli najvyššia a najnižšia koncentrácia inhibítora 10 μΜ a 0,5 nM. Po pridaní substrátov sa platňa pokryla plastovým krytom a inkubovala sa 1 hodinu pri 37 °C v suchom inkubátore. Potom sa reakčná zmes kvenčovala pridaním 75 μΙ EDTA 0,5M, obsahujúcich 5 mg/ml streptavidínových scintilačných výmenných guľôčok.

Platňa sa pretrepávala 2 minúty strednou rýchlosťou a inkubovala sa 1 hodinu pri teplote miestnosti. Potom sa pridalo 75 μΙ 7M roztoku chloridu cézneho, platňa sa pretrepávala 2 minúty strednou rýchlosťou a opäť sa inkubovala 1 hodinu pri teplote miestnosti. Platňa sa potom pokryla plastovým krytom a spočítala sa s použitím zariadenia TopCount-NXT™ Microplate Scintillation & Luminescence Counter, Packard. Každá miska sa počítala 60 sekúnd. Každý rad obsahoval na svojich koncoch prázdnu misku a kontrolnú misku.

Výpočet percenta inhibície je nasledovný:

% inhibície = cpm.miska - cpm.prázdna miska x 100 cpm.kontrolná miska - cpm.prázdna miska.

S použitím vyššie uvedeného testu sa zlúčeniny podľa tohto vynálezu testovali na inhibovanie RT štandardného typu (WT) a mutujúcich enzýmov. Výsledky sú uvedené v Tabuľke 2 ako IC50 (nM).

Na potvrdenie schopnosti týchto zlúčenín inhibovať HIV replikáciu sa tieto tiež testovali v teste kultúry ľudských T-buniek (Syncytia)), opísanom ďalej.

ELISA test na stanovenie aktivity v bunkovej kultúre

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa testovali na ich schopnosť inhibovať HIV replikáciu v bunkovej kultúre v teste s 96-miskovou platňou. Na zriedenie zlúčeniny ako aj rastového média sa použil úplný RPMI 1640, pozostávajúci z RPMI 1640 + 10% fetálneho bovinného séra, 10 pg/ml gentamycínu a 10 μΜ β-merkaptoetanolu. T lymfocytová bunková línia C8166 sa infikovala s násobnosťou infekcie 0,001 vírusmi, kódujúcimi štandardný typ a mutujúcu reverznú transkriptázu. Bunky sa

-52% inhibície = J 1 x 100 potom inkubovali tri dni v prítomnosti sériových zriedení zlúčenín podľa tohto vynálezu. Supernatant sa spojil z ôsmich replikačných misiek a koncentrácia mimobunkového p24 sa určila s použitím komerčne dostupnej HIV-1 p24 antigénovej testovacej súpravy (Beckman-Coulter®). Úroveň inhibície (% inhibície) sa vypočítalo z nasledujúcej rovnice:

p24pg/ml. inhibítor p24pg/ml.kontrola

Výsledky sú uvedené v Tabuľke 3 ako EC₅₀ (nM).

Testy špecifickosti

Aby sa stanovila špecifickosť enzýmovej inhibičnej aktivity zlúčenín, ktoré poskytuje tento vynález, zopár z nich sa testovalo na ich schopnosť inhibovať iné vírusové polymerázy (ako sú od RNA závislé RNA polymerázy vírusu hepatitídy C a respiračného synsyciálneho vírusu), ako aj cicavčie polymerázy (ako je od RNA závislá DNA polymeráza teľacieho týmusu a ľudská telomeráza) s použitím známych testovacích metód. U žiadnej z takto testovaných zlúčenín sa nezistilo, že by vykazovala významnú inhibičnú aktivitu voči týmto enzýmom. Tieto výsledky naznačujú, že enzýmová inhibičná aktivita zlúčenín, ktoré poskytuje tento vynález, je zameraná skôr špecificky voči HIV-1 RT.

Literatúra (zahrnutá sem odkazom)

1. Benn S. a ďalší, Science 230, 949,1985.

2. DAquilla R. T. a Summers W. C., J. Acq. Imm. Def. Syn. 2, 579, 1989.

3. a) Warren T. C. a ďalší, Proteín Expression & Purification 3, 479, 1992; b) Kohlstaedt L. A., Science 256(5065), 1783, 1992.

- 53Tabuľka 2. Inhibícia štandardných a mutujúcich kmeňov RT pre zlúčeniny vzorca 1

s p

K103N/

L100I

(nM)

28,5

46

124

108

98

86

135

88

229

102

124

24

270

40

158

27

o in p

K103N

V108I

(nM)

29

T“ CO

47

32

, 38

45

63

58

255

55

75

59

215

83

96

56

O

LO p

00 00 >

2 c

r-f

6,6

8,1

o m

Ž 00

'225H

S

CN

CO

r-

00

CO

r-

m

m

00

o

co

00

o

co

p

o

CO

CN

in

CN

CO

M-

co

CN

co

co

CD

CN

CN

X“

*

ĽL

o m p

103N/

O oo

p

52

24,5

612

52

536

199

301

175

710

55

212

5

1522

48

146

v— O)

x.

>

<

s o

o CD

c

4,5

CD

25

O

1

o

o

Y188I

X—>

,o

258

CO

T—

CO

V

in

CN

o

00

o

198

r-

00

in

;>

'

CO

52(

M*

X“

cn

CN

66'

o

CD

o

CO

C)

p

C

r^- CN

32

25

43

75

33

’M’

o Λ

22

>10

-

39

_l

s p

P236

(nM)

50,5

56

09

s p

V106A

(nM)

132 I

148

79

206

v~ CO

74

190

98

1372

336

CN

77

206

319

737

89

o in

Y181C

SF

o

LO

CO

co

CO

<30

CO

co

co

r-

00

00

226

CD

o

p

c

CN

CN

l·-

CN

N-

CO

'ď

CM

CN

CO

CN

CN

CN

o m

)3N

s

CD

IO

m

in

in

CO

h-

CO

I--

00

CD

CO

m

h-

in

p

T“ x.

00 CM

x)·

CM CM

b- CO

CN

CO

CN

CO

CO

X“

CO

CN

CO

CN

H

o m

CĹ

in

m

LO

o_

CD

in

CO

o

M“

x—

m

CN

in

’M“

T“

p

WT

c

o’

in

CO x—

CN

CD

CD

CO

ro

c

X^s

N

X“

c Q) >O

O Q_

jo ro

-

CN

CO

't

in

CO

r-

00

CD

O T“

CN

M“

io

N-

00

CD

O N

>Ó

H

ο ΙΌ Ο

Κ103Ν/

L100I

(nM)

44

168

169

28

443

28

g ο

Κ103Ν

00 ο >

S c

64

120

38

147

35

ο ΙΌ Ο

Y188C

(ηΜ)

6‘5

9,0

2

I

s

οο

ΙΟ Osi Osi

2

r-

o

oo

LO

lO

ο

Ο

CN

00

CN

0.

2

Ο

ΙΌ Ο

Κ103Ι

Υ181

f 'C

m

95

336

247

70

64

200

299

xŕ T~

84

ο ΙΌ

190Α

S

oo

m

lO

Ο

C

Osi

Osi

CN

Ο

ο

_ι

439

0-

o

l^·

in

O

578

ΙΌ Ο

0Ô

'C

135

299

561

ON co

253

520

533

CD

_ι

s ο

CO CO Osi

c

129

0_

ο ΙΌ Ο

V106A

Σ

661

1106

2493

105

344

CO

1745

2271

605

893

ο ΙΌ

Ο

Osi

T~

r^-

T“

Ο

C0

c

Osi

m

lO

2

!ό

C0

S

oo

cd

o

ο

ο

C

CO

r—

ΪΖ

I—

s ο

QZ Η

1Γ c

o T~

l·- •X“

45

co

5,6

CO

6*8

38

CD

35

Ξ

ω

c

ι_

Ν

V“

ο

o

T—

CN

CO

ιο

CD

0-

00

CD

φ >ο

ο.

xi Π3

Osi

CN

Os|

Osi

Osi

Osi

Osi

Osi

CN

CN

ο Ν

>υ

H

55Tabuľka 3. Inhibicia štandardného typu a mutujúcich kmeňov HIV v bunkových kultúrach zlúčeninami vzorca I

s g

K103N/

L100I

£

CM co'

cn cm'

CM_

s g

ž CO o 5

00 o >

c

CT) co'

o LD

r- cm'

s g

2 CO o T~ Sí

T m CM CM Q_

s c

O cm'

LD

CM_

s g

2 co o T— ÍL

O V“ 00 T” >

z c

CD r-'

LD h-'

O) cm'

LD_ CT)'

CM CM

s g

oo CO

c.

00

CM LD

00 LD

s g

< <o o >

LO

00 CM

xŕ CN

xr CN

S g

o 00 V“

Se c

’Φ

r- cm'

00 CN

o vo g

2 co O 5

s

CM

00 cm'

to_

o m g

μ- α: 1-

c

CO CN

CM CM*

03

00 σ> o

00 00 o'

co CT) o

CM CT) o

Φ CO O

CD CM o'

N· CD O

Φ- co o

Φ CO o

r- co o

Zlúčenina

n N O CĽ >6

xi ro H-

V“

CM

CO

in

CD

r^-

00

CT)

O

T“

CM

LD

t'-

00

CT)

ο m ο

Κ103Ν/

L100I

(nM)

CD iri

ο ιη ο

03Ν/

1081

ZS c

O’S

>

Ž

I

s ο

CO ο Τ”

m CM CXJ

2,9

Dl

ž

Ο

ιη Ο

ro Ο

T“ 00

s

r^

4,3

LO

3,5

>-

_1

s

00

2

r-

o

in

ο

C

<o

b-

CD

>-

ο ιη

V9C

z

m

CM

ro

ο

>

c

CD

co

Ο

s ο

5

2 c

4,8

2,6

>

ζ

ιη ο

ro ο

2 c

3,5

ro cm

SÍ

Η

s ο

C£

S

O

53

CM

CM

co_

co_

Η

c

o

o

CM

cm'

ro

c

L—

o*“’.

Ν

ο

o

T“

CM

CO

xj-

in

CO

oo

CD

>Ο

ο.

xS 03

cm

CM

r\i

CM

CM

CM

CM

CM

CM

Ο Ν

>ό

H

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Nenukleozidové inhibítory reverznej transkriptázy všeobecného vzorca I kde

   R² je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z H, F, Cl, Ci_₄-alkylu, C₃.₄-cykloalkylu a

   CF₃;

   R⁴ je H alebo Me;

   R⁵ je H, Me alebo Et, s podmienkou, že R⁴ a R⁵ nie sú oba Me, a ak R⁴ je Me, potom R⁵ nemôže byť Et;

   R¹¹ je Me, Et, cyklopropyl, propyl, izopropyl alebo cyklobutyl; a

   Q je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z:

   alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
2. 2. Nenukleozidové inhibítory reverznej transkriptázy podľa nároku 1, kde R¹¹ je Et alebo cyklopropyl, alebo ich farmaceutický prijateľné soli.

   -583. Nenukleozidové inhibitory reverznej transkriptázy podľa nároku 1, kde Q je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z:

   alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
3. 4. Nenukleozidové inhibitory reverznej transkriptázy podľa nároku 1, kde Q alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
4. 5. Nenukleozidové inhibitory reverznej transkriptázy podľa nároku 1, kde R⁵ je Me, alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
5. 6. Nenukleozidové inhibitory reverznej transkriptázy podľa nároku 1, kde R¹¹ je. Et, alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
6. 7. Nenukleozidový inhibítor reverznej transkriptázy podľa nároku 1, ktorým je zlúčenina vzorca alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.

   -598. Nenukleozidový inhibítor reverznej transkriptázy podľa nároku 1, ktorým je zlúčenina vzorca alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.
7. 9. Nenukleozidový inhibítor reverznej transkriptázy podľa nároku 1, ktorým je zlúčenina vzorca alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.
8. 10. Inhibítor replikácie HIV všeobecného vzorca I kde (I)

   -60R² je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z H, F, Cl, Ci-₄-alkylu, C₃-₄-cykloalkylu a CF₃;

   R⁴ je H alebo Me;

   R⁵ je H, Me alebo Et, s podmienkou, že R⁴ a R⁵ nie sú oba Me, a ak R⁴ je Me, potom R⁵ nemôže byť Et;

   R¹¹ je Me, Et, cyklopropyl, propyl, izopropyl alebo cyklobutyl; a

   Q je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z:

   alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
9. 11. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, kde R¹¹ je Et alebo cyklopropyl, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
10. 12. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, kde Q je vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z:

    alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
11. 13. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, v ktorom Q je:

    alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
12. 14. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, kde R⁵ je Me.
13. 15. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, v ktorom R¹¹ je Et.
14. 16. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, ktorým je zlúčenina vzorca alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
15. 17. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, ktorým je zlúčenina vzorca alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
16. 18. Inhibítor replikácie HIV podľa nároku 10, ktorým je zlúčenina vzorca alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
17. 19. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1 ha výrobu lieku na liečenie alebo prevenciu HIV infekcie.
18. 20. Farmaceutický prostriedok na liečenie alebo prevenciu HIV infekcie, v y značujúci sa tým, že obsahuje množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1 alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ účinné na inhibíciu HIV a farmaceutický prijateľný nosič.