SK171492A3 - Polypeptide, method of its preparation its use and pharmaceutical agent - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká polypeptidu A-C-B proinzulin, zpúsobu jeho prípravy, farmaceutického prostŕedku, který ho- obsahuje a použití A-C-B-proinzulinu jakožto meziproduktu pro prípravu inzulínu.

Dosavadní stav techniky

Intenzivní štúdie diabetes vedly k tomu, že inzulín je skutečné nejlépe prostudován ze väeoh bilkovinovýoh molekúl. Proto je inzulín výhodným substrátem pro zkoušeni vlivu obmÔn v primár- . ni štruktúre vyôšího rádu bi.lkovinové štruktúry a furikce. Rekom- λ binantní DNA technológie usnadftuje generaoi nových inzulínových \ analogú pro SAR a terapeutická použití. Katalogované efekty täkových obmén pravdepodobné objasní pravidla ŕidioí vztah mezi primárnimi a vyššími rády konformace bílkoviny. Takové . modifikaoe primárni štruktúry jsou pomôrnô vzáonôjši se zŕetelem na natívni sekvenci. Avšak takové omezené ,odliänosti od natívni sekvenoe N poskytují málo informaci, jelikož jde o odlišnou cestu. \

Úkolem sledováni biochémie je spíše konstrukoe umôlýoh mo-i lekul s pŕedem určenými funkcemi než nadéje na objeveni prírodné ₅ se vyskytujíoí slouóeniny, majicí žádouoi vlastnosti.Pŕes významné pokroky ve stavu techniky ohybi príklady syntetických,analogú, které se značné liší svoji primárni strukturou od svých. prírodné se vyskytujicich protôjškú. Vynález využivá dobre charakterizované molekuly inzulínu pro vývoj syntetického analogu proinzulinu, který se značné liši strukturou a fyzikálnmimi vlastnostmi od prírodné se vyskytujici proinzulinovó molekuly a od známýoh analogú proinzulinu.

Inzulín je bilkovina. sestávajíoi ze dvou podjednotkových polypeptidú, obeonô oznaôovanýoh jakožto A-ŕetôzeo a B-ŕetézec, které jsou kovalentné vázány prostŕedniotvim disulfidiokých vazeb. Lidský inzulín, který je representativnim pŕikladem inzulínové štruktúry, Je graficky znázovnôn na obr. 29. Biochemický zpúso.b výroby inzulínu je v oboru dobre znám a popsal ji napríklad Jtryer L., Bioohemístry, 2. vydání, 1961, W.H. Froeman & Co., Can Franoisoo, str. 647 až 048. Prírodní in vivo chemická cesta k inzulínu vede p í· e s pŕedproinzulin a proinzuiin jakožto mezi produkty.

Inzulín se rekombinančné pripravuje prostŕedniotvím exprese proínzulinu a následným enzymatickým zpraoováním. Proinzuiin, bezprostrední prekursor inzulínu, je jednoŕetôzcová bílkovina. Dva ŕetézoe inzulínové molekuly se produkuj! excisi interní oblasti, bÔŽné označovanou jakožto C-region nebo C-peptid proinzuiinu. Po vytvorení intraŕetézcového a interŕetôzcového disulfidického seslténí se internálni polypeptidová sekvence (C-peptid) vypustí pôsobením trypsínu a enzymô karboxypeptidasy B, Čímž se ziská funkční inzulínová molekula.

Prevode se translaoe proinzulínovového génu k dosaženi odpovidajíci aminokyselinové sekvence B-ŕetézec/C-peptid/A-ŕetôzeo. Jeiikož r ekonibinantní prcdukce inzulínu začíná spíše u proinzulinové molekuly než u pŕedproinzulinové moi&kuly, má rekombinantní proinzulinová molekula charakteristicky methioninový zbytek na aminokyseiinovém konci. Preto sa tento methionin, odvozený od Nkonca proínzulinu, pŕenáši a zustavá na aminokyselinovým konci inzulínového B-ŕetézce. Preto se tento methioninový zbytek neodstráni bakteriálni hostite1skou bunkou. Je preto nutné chemicky nebo enzymaticky odstraŕíovat tento N-koncový methionin in vitro i

k získaní natívni proinzulinové nebo inzulínové molekuly.

Páscbení methionyiamínové peptidasy (MAP), bílkoviny vlastní E. coli, odstraňuje N-koncový deformy1ovaný methionin za podminky, že druhým zbytkem nonl arginin, aspartát, glutamin, glutamát, isoleucin, leucin, lysín nebo methionin. Pŕezkoušení primárni štruktúry inzulínové molekuly, pŕičemž lidský inzulín je representstivnim pŕikladem, uvedeným na obr. 29, dokládá, 2e N-koncový zbytek B-ŕetézce, odpovídajioi N-konoovému zbytku pŕírodního proínzulinu, je feny?. al ani n. Tento transkripôní a translačni poŕádek bráni odstranáni H-koncovóho methioninu z rekombinačné E. coli produkované proinzulinové molekuly pôsobením MAP. Avšak N-koncovou aminokyselinou A-ŕetôzce je glyacin,^ jehož pŕítomnost neihhibuje púsobení MAP. Proto, v pŕipadô reverzní sekvence transiace z® systému B-ŕetôzec/C-peptid/A-ŕetôzec na A-ŕetôzeo/C-peptld/B-ŕetôzec bude pôsobení MAP eliminovať N-koncový methionin. Tím s® také vylouôi potreba dodatečného trans1ačniho odstraňovaní N-konoevého methioninu, což mé velké obchodní a technické prednosti.

Pod£.5^a^^a vynálezu

Podstatou vynálezu je po 1ypeptidová slouôenina obecného vzorce .1

Met_;<-A-C~B (I) kde znamená

Met aminokyselinu msthionin, x O nebo 1,

A ŕetôzec A inzulínu nebo jeho funkční derivát,

B ŕetôzec B inzulínu nebo jeho funkční derivát,

C C-peptid inzulínu nebo peptid obecného vzorce

Xi- X;- P - X₃- X₄ kde znamená

Xi,X;,Xí a X4 bázické aminokyseliny, které jsou stejné nebo odlišné a

P peptid obsahujíci 4 až 35 aminokyselín s výjlmkou cyste inu, její farmaceutický vhodné soli.

Podstatou vynálezu je také zpúsob prípravy funkční inzulínové molekuly nebo inzulínového anaiogu, pri kterém se používá nových výchozich látek a nových meziproduktú. Tento nový zpúsob prípravy pŕes inzulínový prekursor, je založen na inverzi kodujíci. sekverice proinzulinu ze systému B-ŕetôzeo/C-peptid/A-ŕetÔzeo na systém A/ŕetÔ2ec/C-peptid/B-ŕetôzec. Nový, vytvorený inzulínový prekursor vylučuje potrebu posttrans1ačniho chemického nebo enzymatíokého odstraňováni N-koncového methioninu z rekombinantni inzulínové molekuly.

Vynález se také týká nového meziproduktu inzulínového prekursoru, který v podstatô sestává z prvkú, ze kterých se konstru'-i j e· inzulín biosyntetickou oestou. Tyto nové inzulínové prekursory máji: (a) vôtái inzulínovou aktivitu než prírodné se vyskytujici proinzulin, (b) delži poločas in vivo se zŕetelem na inzulín z pŕírodniho proinzuiinu a (c) vykazuji zvýôenou schopnosť vázat IGF-ϊ receptor ve srovnání s pŕirodním proinzulinem. Charakteristiky a omoz&ní vynálezu vypiývají ze štúdia konstrukce nové molekuly, zviáätó se zŕeteiem na C-peptid, který je inštruktívni pro konstrukoi analogických rňoiskul proinzuiinu a inzulínu.

Reštrikční misto a funkční rnapy na priložených výkreseoh jsou ptibužná znázornení popisovaného rekombinantního DNA vektoru. ínformace o retrikčním mist.u není vyčerpávajioi: proto múže být více reštrikční ch mist pro daný typ na vektoru, než je na

obi	: . z	náror néno .
Na	obr	. 1	je	reštrikční	místo a funkční	mapa	plasmidu	pkC283.
Na	obr	. 2	je	reštrikční	mi sto a funkční	mapa	pi asmidu	pk.C283PX.
Na	obr	. 3	je	r e s t r i k č n í	místo a funkční	mapa	plasmidu	pkC283-L.
Na	obr	. 4	je	restr i kčni	misto a funkční	mapa	plasmidu	pkC283-LB.
Na	obr	. 5	je	reštrikční	mi s to a funkční	mapa	plasmidu	pk.C283-PRS
Ha	obr	. D	j®	r e s t r i k č n 1	místo a funkční	mapa	pl asini du	pL32.
Na	obr	. 7	j®	reštrikční	místo a funkční	mapa	plasmidu	pNM789.
Na	obr	. 8	je	'schéma kon	s t r u k c » p i a s m i č u	120.
Na	o b r	. 9	.1 e	reštrikční	místo a funkční	mapa	plasmidu	pL47.
Na	obr	. 10	je	reštrikční	misie a funkční	mapa	plasmidu	p.PR12.
Na	obr	. ii	je	Γ 6 S ’Cľ i k0 u x	misto a funkční	mapa	pi asmidu	pPR12ARl.
Na	c br	. 12	je	reštrikční	místo a funkční	mapä	plasmidu	pLUO.
Na	í j b r	. 13	je	schéma kon	s t r u k o p i a s m i d u	pLUOC.
N a	obr	, 14	j e	restr i kčni	místo a funkční	mapa	plasmidu	pCZR126S.
N a	obr	. 15	je	30héma,	objasňuj íci základní	rozdíly orientaoe

A-~fetézce, B-ľetäzce a C-peptidu a BCA a ÄCB proínzui inové mo1ekui y.

H t: obr.16 je schéma zpúsobu konstrukce ACB-PI kodujicí sekvence,odvozené od kompozitu kompatibilní kratôí syntetické DNA sekvenoe.

Na obr. 17 je špecifická DNA s&kvenoe, zahrnutá v konstrukci anaiogu iidskóho ACE-Pl génu, použitého pri konstrukoi ACB-PI génu.

Na obr. 13 je jedno provedení umí3tôni reštrikčních endonukleazových ätépioich bodú, určenýoh do anaiogu lidskô ACB-PI kodujici sekvence, Čimž se usnadhuje Integraoe do zvláôtnich kionovacich vektorú, príkladné uvedených.

Na	obr .	19	je	reštrikční	mi s to	a funkční mapa	plasmidu	pRB181.
Na	obr .	20		reštrikční	m í sto	a funkční mapa	plasmidu	pRB182.
Na	obr .	21	je	reversni	fázová	HPLC analýza Met-ACB proinsulinu a

ACB-proinzulinu. Chromatografické podminky jsou uvedený v pŕikladech.

Na obr. 22 je peptidové mapování ACB-proinzulinu po tryp3in/pepsinové digescí. Chromatogram vykazuje rezultujicí peptidy spolu s elučními posicemi tri možných disulfldickýoh isomernioh peptidú.

Na obr. 23 jsou výsledky zkoušky vázání lidského plaoentálniho inzulínového receptoru. Graf ukazuje konkurenci lidského inzulínu, lidského proinzulinu, ACB-proinzuiinu, Met-ACB-proinzulinu s ¹ I inzulinem v pŕípadô vázání na inzulínový receptor.

Na obr. 24 je vázáni lidského plaoentálniho IGF-I receptoru. Diagram predstavuje konkurenci lidského IGF-I, Met-ACBproinzuiinu, ACB-proinzulinu, lidského inzulínu a lidského proinzulinu s i2?i IGF-I v pŕipadô vázání na

Na obr. 25

Na obr. 26

Na obr. 27 Na obr. 2Θ

IGF-I receptor.

je HPLC analýza proteo1ytickó transforrnace ACB-proin/ zulinu na inzulín. Chromatogram pŕedvádi (a) reakci po 24 hodinách, (.b; bicsyntetický iidský inzulín a (c) biosyntetický iidský proinzulin. Chromatografické podminky jsou uvedený v pŕikladech.

je znázornôna preparativni HPLC chromatografie proinzulinové konverzní reakce.

je peptidová mapa inzulínu z konverní reakce.

jo vázání lidského plaoentálniho inzulínového receptoru. Je znázornôna konkurence s ^J‘°I inzulinem lidského inzulínu a lidského inzulínu, pripraveného z ACB-proinzulinu se zŕetelem na vázáni ha Iidský inzulínový receptor.

ACB~hPI

ACB-PI

ACB (a)

A-ŕetézec

Ala

Ana1 og

Arg

Asn

Asp

B-ŕetézec pár bázi (bp)

Na obr. 29 jsou znázornôny rozdiiy primárni štruktúry mezi prírodné se vyskytuj icimi molekulami (BCA) lidského proinzulinu a nového invertovaného (ACB) lidského proinzulinu.

Pro účely tohoto popisu se používá nás 1edujioioh výrazú: zkratka pro lid3ký ACB proinzulin zkratka pro ACB proinzulin proinzulin je po 1ypeptidová molekula, která obsahuje aminokyselinou sekvenoi odpovidajici inzulínovému A-ŕetôzci nebo jojimu funkônimu analogu, vázanou sekvenciálnô na (b) spojovací peptid, který váže karboxylovou koncovou aminokyselinu inzulínového A-ŕetézoe na aminovou koncovou aminokyselinu inzulínového B-ťetézce, pŕičemž spojovací peptid obsahuje alespoft 8 aminokyselín, vážených sekvenciálnô na (o) aminokyselinovou sekvenci odpovidajici inzulínovému B-ŕetézci nebo jeho funkčnlmu anaiogu.

A-ŕetézoc inzulínu nebo jeho funkčniho analogu, který vytváŕí jednu nebo dvô subjednotky inzulínové molekuly aminokyselina alanln sloučenina, která je štrukturálne podobná jirié sloučeniné. Pokud se výrazu používá v souvislosti s polypeptidy, vztahuje se na primárni, sekundárni nebo terciárni strukturu aminokyselina arginin aminokyselina asparagin aminokyselina asparagová kyselina

B-ŕetézec inzuiinu nebo jeho funkčniho analogu, odpovidajici vétši subjednotoe dvou ŕetôzcú inzulínové molekuly se tý'ká DNA nebo RNA.

Zkratky A,C, G a T odpovidají 5'-monofosfátovým formám nukleotldú (deoxy)adenin, (deoxy)citidin, (deoxy)guanin a (deoxy)thymidin, jak se vyskytují v DNA molekulách. Zkratky U, C, G a T odpovídaji 5'-monofosfátovým formám nukleotidú uraoil, cystidin, guanin a thymin, jak se vyskytuj! v RNA molekulách. V DNA s dvojím ŕetôz- 7 cára se pár bází mďže vzťahovať na partnerský vzťah

A s T nebo C s G. V heteroduplexu DNA/RNA se pár bázl nďže vzťahovať na partnerský vzťah T s U nebo

C s G.

-'«u

EGA. proinzulin prírodné se vyskytujíoí proinzulin nebo jeho funkční analogy. Jde o výraz, používaný k rozliáení ACB-proinzullnové molekuly, zde popsané, pŕičemž ťranslačni rád inzulínových subjednotek je pŕevróC-pepťid

Cys po 1ypepdivová sekvence alespoft ôsmi aminokyselín, kde je tento polypeptid umisťén mezi inzulínový A-ťatézeo aminokyselinové sekvence (nebo funkčního analógu aminokyselinové sekvenoe inzulínového A-ŕetézce) a inzulínový B-ŕetézec aminokyselinové sekvenoe (nebo analógu aminokyselinové sekvenoe inzulínového B-ŕetôzce) umožftujici dostaťečné konformační permutace pro vhodné vytvorení inťraŕetôzcových a interŕetézcových disulfidických múst.kQ inzulínové prekursorové molekuly.

aminokyselina oysťein nebo polovina cysťinového zbytku kovalentné vázaného prostredníotvim disulfidiokého mústku na jinou polovinu cysťinového zbytku.

DMA desoxyribunekleová kyselina.

EDTA zkratka ethylendiamintetracctové kyseliny.

ED5O zkratka poloviční maximálni hodnoty.

FAE--MS zkratka hmotové spektrometr i e s bombardovánim rychiými atómy.

Funkční analog molekula nebo sloučenina majici podobné funkční vlastnosti aváak modifikovanou strukturu se zŕetelem na prírodné se vyskytujici formu molekuly nebo

G .1 n	sloučeniny. ami nokyse1 i na	glutami n.
Glu	ami nokyse 1 i na	glutamová kyselina
Gl y	ami nokyse1 i na	glycin .
His	aminokyselina	hystidin.

hPI zkratka pro lidský proinzulin.

inzulín bílkovinový hormon nebo jeho funkční anaiog, který snižuje hladinu cukru v krvi a stimuluje využití glukózy a blokuje glykogenolyžu. Je univerzálni zjiŠťován u savcfi, majícíoh pankreas.

inzulínový prekursor jednoŕetézcový polypeptid, který vzniká,

	když se interriáiní aminokyselinová sekvenoe ne ze dvouŕetôzoové molekuly inzulínu nebo	vyžiz- analogu
11 e	ipzulinu. aminokyselina isoleuoin.
Leu	aminokyselina leuoin.
Lys	aminokyselina lysin.
Met	aminokyselina methlonion nebo jeji deformylovaný
Met-ACB-PI	anaiog. zkratka methionyl ACB proinzulinu.
Met-ACB-hPI	zkratka methionyl ACB lidskóho proinzulinu.

Met-ACB-proinzulin ACB proinzuii nová molekula s methioninovým zbytkem kovalentná vázaným na aminokoneo ACB-pro-

	inzulínové molekuly.
mRNA	mediátorová RNA.
MWCO	zkratka excisni molekulové hmotnosti.
NIDDM	zkratka diabetes mellitus nezávislé na inzulínu.
NLe	noríeucin.
Nva	norvaiin.
Or n	ornithin.
Phe	aminokyselina fenylalanin.
Plasmi d	extrachromosomál ni spontáná se replikujioi genetický element.
PMSF	zkratka fenylmethylsulfonylfluoridu.
Pro	aminokyselina prolin.
Čtecí rámeo	nukleotidová sekvence, ze které transiaci dooházi ke ôteni v tripletech translačnim aparátem tRNÄ a ribosomď a príbuzných faktorú každého tripletu v souhlase s príslušnou aminokyselinou. Protože je každý triplet oddôlený a tóže délky, musí být kodujici sekvence násobkem tri, vôlenéni nebo vypuä-

Rekombi nanini

Rekombinantni

Re p 1 i ko n

RNA

RP-HPLC

Sez

Thr

Transkripce

Trans1ace

Tr i s Trp Tyr Val

Vektor tôni (koncová posunová mutaoe) páru bázi múže vést ke dvéma odliäným bílkovinám, zakodovávaným stejnou sekvenci. K pojiátôni proti tomu tripletovó kodony odpovidajici Žádanému polypaptidu, musí být vázány v násobku tri od iniciačniho kodonu, to je, musi být dodržen správriý ôteci rámec.

DNA klonovací vektor jakékoliv autonómni replikačni činidlo včetnô, avšak bez jakéhokoliv omezení, plasmidú a fágú, zahrnujíci DNA molekulu, ke které jeden nebo nékolik segmentú DNA môže být pŕidáno nebo je pŕidáno.

DNA expresní vektor jakýkoliv rekombinantni DNA klonovaci vektor, do nôhož je včlenén promotor.

DNA sekvenoe, která ŕidi a umožňuje autonómni replikaoi plasrnidu nebo jiného vektoru.

ribonukleová, kyselina.

zkratka pro reverzní fázovou vysoko účinnou kapali novou chromatografi i. aminokyselina serin. aminokyselina threonin.

proces, kdy se genetická informace, obsažená v nukleotidové sekvenci DNA, prepisuje do komplementárni RNA sekvenoe.

proces pŕekládáni genetické informace z mediátorovó RNA do primárni štruktúry ^zpolypeptidového ŕetézce pro speciťiksci a prímou syntézu polypeptidového ŕetézce.

zkratka pro tris(hydroxymethy1)aminomethan. aminokyselina tryptofan. aminokyselina tyrosin. aminokyselina val in.

replikon, používaný pro transformácii bunôk v génové manipulaci nsäoucí po 1ynukleotidovó sekvenoe odpovidajici vhodným bilkovinovým molekulám, které pri kombinaci se vhodnou ŕídici sekvenci dodávaj! špecifické vlastnosti hostujioí buftce, která se má transformovať. Plasmidy, viry a bakt'eriofág jsou vhodnými vektory, jelikož jsou repiikony ve vlastním slova srnyslu. Umáló vektory ae konstruují vyfíznutim a spojovánim DNA molekúl z rúzných zdrojú za použití reštrikční oh enzymú a ligas. Vektory zahrnuj i rekombinantní DNA klonovací vektory a rekombinantní DMA expresní vektory.

X-gal zkrratka pro 5-brom-4--chlor-3~indoí yl-p-D-galaktos i d.

Vynález se tedy tyká po 1ypeptidových 3loučenin obecného vzorce I

Metx-A-C-B (I) kde znamená

Met aminokyselinu methionín, x O nebo 1,

A fetézeo A inzulínu nebo jeho funkční derivát,

B ŕetézeo B inzulínu nebo jeho funkční derivát,

C C--peptid inzulínu nebo poptid obecného vzorce

X·,- _x._ p ... _X;_ _Xj kde znamená a X t. bázické aminokyseliny, které jsou stejné nebo odlišné a

P peptid obsahujici 4 až. 35 aminokyselín s výjimkou cysteinu. ,

Sloučeniny obecného vzoroe I máji dvé oddÔlená púsobení:

(a) jakožto prekursory rekombinantní produkce inzulínu a

b) jakožto nezávislé, terapeuticky účinné sloučeniny.

Užitečnost sloučenin podie vynálezu obecného vzorce I jakožto prekursorú inzulínu, je dále pcpsána.

Sioučeníny obecného vzorce I konstituuji nové proinzulinové bilkoviny nebo inzulínové prekursory, dále označované jakožtc ACB-proinzuliny, které máji nezávisle pŕiznivé vlastnosti vedie toho, že jsou meziprodukty na nové cestô k inzulínu, jak je dáie popsáno.Pod 1 e výhodného provôdéni vynálezu, jak je príklady doloženo, máji sloučeniny obecného vzorce I nás 1edujíoí a11 minokyse 1 i riou sekvenci: (sekvence ID číslo 1)

Gly	íle	Val	Glu	Gin	Cys	Cys	Thr	Ser
íle	Cys	Ser	Leu	Tyr	Gl n	Leu	Glu	Asn
Tyr	Cys	Asn	Arg	Arg	Glu	Ala	Glu	Asp
Leu	Gin	Val	Gly	Gin	Val	Glu	Leu	Gly
Gly	Gly	Pro	Gly	Ala	Gly	Ser	Leu	Gin
Pro	Leu	Al a	Leu	Glu	Gi y	Ser	Le u	Gin
Lys	Arg	Phe	Val	Asn	Gin	His	Leu	Cys
Gly	Ser	His	Leu	Val	Glu	Al a	Leu	Tyr
Leu	Val	Cys	Gly	Glu	Arg	Gly	Phe	Phe
Tyr	Thr	Pro	Lys	Thr
15 e	i 29	je	graficky objasnén celý ;
odním BCA”	proirtzul i nem a i	novým, i

Na obr dl i maz i pi¹:

proinzulinem. Štrukturálni rozdlly pŕlrodnlho proinzulinu (ozná-¹ čovaného zde a na obr. 15 jakožto BCA-proinzulin na rozdal od no-, vého invertovaného ACB-proinzulinu) a ACB-proinzulinu jsóu enormní . ; ’

V oboru je dobre známo, že určité obmôny štruktúry $1lkoylny jsou dostatečné k inhibici nebo k naprostému pŕedejití vlasthl formaoe sekundárni a terolárnl štruktúry, což vede k inefunkční bllkovinô. To piati zvlášté pro molekuly, které závisí .na' vl astni formé disulfldických pŕičných vazeb pro dosaženl účinnosti,^!jako * má prolnzulin a inzulín. To je zcela neoôekávate1né a pŕeký'apujicl, že konŕormaômi rozdíl mezí ACB-prolnzulinem a BCÄ-proinzu-, linem vede k molekule, které (a) má významné vôtfii inzulínovou účinncst než natívni prolnzulin a (b) po vyŕiznutl C-péptldu vytváŕi funkční inzulínovou molekulu se véemi disul f idiokýmlf pŕiô1 nými vazbami vhodné vytvorenými a bez N-koncového methiohinoyého \ zbytku na A-ŕetézci.

Zjistilo se, že forma proinzulinu, stŕižené na ;Arg65-Gly66 ¹ ·'· \ í í ¹ vazbé, mé vétäi inzulínovou účlnnost než prírodní foŕma- proinzulínu, pravdepodobné jakožto výsledek uvolnéni amino'kýséjl inového koncového zbytku na A-ŕetézci obsaženém v mistô a v oelé^truktuŕe proinzulinu (Peavy D.E. a kol., 1985, J. Biol. Chem.š ročník

- 12 260, str. 13989 až 13394). ACB-proinzulinová molekula má má volný aminokyselinový konec A-ŕetôzce, avšak vykazuje zvýšenou úôinnost, kdyl se C-peptid zakotvi na obou konoíoh za vytvorení stabilnejší konfcrmaoe.

Primárni štruktúra inzulínu a proinzulinu je äiroe modifikovane,. Tyto modiŕikaoe poakytiy inzulínové a proinzulinové molekuly majici nejráznéjéi žádcucí vlastnosti, užitečné pro ošetrovaní rázných forem dlabetes, k usnadnéni prdmyslové (zvláétô rekombinantní) výruby a/nebc k výrobé výhodnéjšich farmaceutických prostŕedkú. Representativní, nikcliv však vyčerpávajioí seznam takových modifikácii je v následujici tabule® I. Vvynález se tedy tyká ACB-proinzulinových molekúl se zmônaini v primárni štruktúre, jejichž representativr.í seznam je uveden v l'abuloe I. Zpúsobem podie vynálezu se pŕipravuji inzulínové analógy s® vôlenénými proimárními strukturálnimi zménami, jejíchž representstivní seznam je zrejmý z uásledujioi tabuíky I,

Tabulke I

Inzulínové a proinzu i i nové analógy

A.

Zmeny ’jedné aminokyseliny

Giy A21	Glu A21	hSer A21	Thr	B10	ASp B25
Ser A2i	Leu A21	Gly A22	Asp	B10	HiS B25
Ala A2i	Met A21	Ala A22	Arg	B10	Glu B26
His A2i	Tyr A21	Asp B9	íle	B12	Glu B27
Asp A2i	Val A2i	Asn Bg	His	Bl6	Asp B20
Thr A21	íle A2i	His Bg	Gin	B17	Ala B30
Gin A21	Trp A2i	Glu B10	Gin	B2 0	des-B3o

Thr30‘NH2 Ala30’NH2

B.

Zménv dvou aminokysei in

Gly A21	a	Asp B10	His A21	a:	Lys	B27
Ser A2i	a	Asp Bj.0	Asp A21	a	Lys	B27
Thr A21	a	Asp B10	Gly A21	a:	Arg	B27
Ala A21	a	Asp B10	Ser A2i	a	Arg	B27
His A2i	a.	Asp B10	Thr A21	a	Arg	B27
Asp A2i	a	Asp B10	Ala A2i	a	Arg	B27
Gly A2i	c	Thr B10	Glu B27	a.	. Glu	Bie
Ser A21	a	Thr B10	Asp B5	a	Asn	B10
Thr A2i	a	Thr B10	Glu B12	a	Gin	B13
Ala A21	a	Thr B10	Ser Bi4	a	Asp	B17
His A21	a.	Thr B10	Lys b28	a	Pro	B29
Asp A2i	a.	Thr B10	His A2i	a	. Arg	®27
Gly a2i	a	Arg B10	Asp A2i	a	. Arg	B27

Tabmka 1 (pokračovali )

Ser	A2i	a.	Arg	Bio	Glu	B12	a	des	B30
Thr	A21	a	Arg	B1O	Asp	Bio	a	Ser	B2
Ala	A2i	a;	Arg	Bio	Asp	Bio	a	Asp	B28
His	a2 1	a	. Arg	B1O	Glu	B10	a.	Glu	A13
Asp	A2i	a.	Arg	Bio	Glu	B27	a:	Ser	A13
Asp	Bio	a.	des-	'B30	GlU	B27	a	Asp	A2i
Thr	Bio	a ·	. des·	'B30	Glu	B27	a	Glu	Bl
Arg	BlO	a	des-	-B30	Glu	B27	a.	Asp	Bg
Gly	A21	a.	Lys	b27	Gly	A21	a	Ala	B30
Ser	A2i	a	Lys	B27	Ser	A2l	a	Ala	B30
Thr	A2i	a-	Lys	B27	Thr	A2i	a	Ala	B30
Ala	a2i	a	Lys	B27	Ala	a2í	a.	Ala	B30
des	b29	a.	. des	B30	hSer A2i a.	Ala B3

Zmény tŕí ami nokyse1 i n

A21	Gly	+	Lys	B27	4-	Gin	A17
A21	Ser	+	Lys	B27	+	Gin	Al7
A21	Thr	+	Lys	b27	+	Gin	A17
A21	Ala	+	Lys	B27	+	Gin	A17
A21	His	+	Lys	B27	+	Gin	A17
A21	Asp	+	Lys	B27	+	Gin	A17
Gly	A21	+	Lys	B27	4-	Gin	Bl3
Ser	a2i	+	Lys	B27	4·	Gin	Bj.3
Thr	A21	+	Lys	B27	4-	Gin	B13
Ala	A2i	+	Lys	B27	+	Gin	B13
His	A2i	4·	Lys	B27	+	Gin	B13
Asp	A21	+	Lys	B27	+	Gin	B13
Gly	A21	+	Arg	B27	+	Gin	Al7

Tabujka I fpokračování

Ser	Ä21	+	Arg	B27	+	Gin	Αχ7
Thr	A2I	+	Arg	B27	+	Gin	Aj.7
Ala	Ä21	+	Arg	B27	+	Gin	Aj.7
His	Ä21	+	Arg	B27	+	Gin	Aj.7
Asp	A2I		Arg	B27	+*	Gin	Al7
Gly	A2I	+	Arg	B27	+	Gin	B13
Ser	A21	+	Arg	®27	+	Gin	Bl3
Thr	A21	+	Arg	B27		Gin	B13
Ala	A21	+	Arg	027		Gin	Bl3
His	A21	+	Arg	B27		Gin	Bl3
Asp	A21	+	Arg	B27	+	Gin	Bl3
Asp	BlO	+	His	Ae	+	His	B25
GlU	BlO	+	Glu	A3	+	Glu	B22
Glu	B27	+	Ser	B5	•4·	ASp	B5
Glu	B27	+	His	a8	+	Asp	Bg
Glu	B27		Asp	a2i	+	Asp	Bg
des	B28	+	des	B29	+	des	B30
Gly	A2I		Asp	B10	4-	Ala	B30
Ser	A21	+	Asp	B10	+	Ala	B30
Thr	A2I	+	Asp	BlO	+	Ala	B30
Ala	A21	+	Asp	B10		Ala	B30
His	A21	+	Asp	B10	+	Ala	B30
Asp	A21	+	Asp	B10	+	Ala	B30
Gly	A21		Thr	BlO	+	Ala	B30
Ser	A21	+	Thr	B10	+	Ala	B30
Thr	A2I	+	Thr	B10		Ala	B30
Ala	A21	+	Thr	B10		Ala	B30
His	A21	+	Thr	B10		Ala	B30
Asp	A21	+	Thr	B10	+	Ala	B30
Gly	A21	4	Arg	B10	·+	Ala	B30
Ser	A21	4	Arg	BlO	+	Ala	B30

Tabulka I (pokračovaní

Thr	A21	+	Arg	Bio	+ Ala	B30
Ala	a21	+	Arg	B10	+ Ala	B30
His	A21		Arg	B10	+ Ala	B30
Asp	A21	+	Arg	Bio	+ Ala	B30
Gly	A21	+	Asp	BI0	+ des	B30
Ser	A21	+	Asp	B10	+ des	B30
Thr	A21	+	Asp	Bio	+ des	B30
Ala	A21	+	Asp	B10	+ des	B30
HiS	A21	+	Asp	B10	+ des	B30
Asp	A2I	+	Asp	B10	+ des	B30
Gly	A21	+	Thr	B10	+ des	B30
Ser	A21	+	Thr	Bio	+ des	B30
Thr	A21		Thr	Bio	+ des	B30
Ala	A21	+	Thr	Bio	+ des	B30
His	A21	+	Thr	Bio	+ des	B30
Asp	A21	+	Thr	Bio	+ des	B30
Gly	A21	+ ·	Arg	Bio	+ des	B30
Ser	A21	+	Arg	BlO	+ des	B30
Thr	A21	+	Arg	Bio	+ des	B30
Ala	A21	+	Arg	Bio	+ des	B30
His	A21	+	Arg	Bio	+ des	B30
Asp	A21	+	Arg	Bio	+ des	B30
Thr	B10	+	Glu	B28	+ Pro	b29
Arg	B10	+	Glu	b28	+ Pro	b29
Asp	Bl0	+	Lys	b28	+ Pro	b29
Thr	B10	+	Lys	b28	+ Pro	B29
Arg	B10	+	Lys	b28	+ Pro	b29
Gly	A21		Glu	b28	+ Pro	b29
Ser	A21	+	Glu	B28	+ Pro	b29
Thr	A21	+	Glu	b28	+ Pro	b29
Ala	A21	+	Lys	b28	+ Pro	b29
His	A21		Lys	B28	+ Pro	b29

T a b u j k. s (' po krab cvikni .)

Asp	A21	+	Lys	B28	+	Pro	B29
Glu	B28	+	Pro	B29	4·	Ala	B30
Glu	B28	4-	Pro	B29	+	des	B30
Lys	B28	4-	Pro	B29	+	Ala	b30
Lys	B28	+	Pro	B29	4-	des	b30
Arg	B27	+	Gly	A21	+	ThrB30-NH2

Gly	A21	+	Lys	B27	+	Gin	A17	+	Gin	B13
Ser	A21	+	Lys	B27	4·	Gin	Ä17	4·	Gin	B13
Thr	A21	4-	Lys	b27	+	Gin	Al7	+	Gin	B13
Ala	A21	4-	Lys	b27	4-	Gin	Al7	+	Gin	Bl3
Asp	A21	4-	Lys	b27	+	Glň	A17	+	Gin	b13
His	A21	4-	Lys	b27	4-	Gin	Aí7	+	Gin	B13
Gly	A21	4-	Arg	b27	4-	Gin	Al7	+	Gin	b13
Ser	A21	+	Arg	b27	4·	Gin	A17	+	Gin	B13
Thr	A21	4-	Arg	b27	4-	Gin	Aí7	+	Gin	B13
Ala	A21	+	Arg	b27	4-	Gin	A17	4-	Gin	b13
Asp	A21	+	Arg	b27	4-	Gin	Al7	4-	Gin	B13
His	A21	+	Arg	b27	+	Gin	A17	+	Gin	B13
Glu	B10	+	His	Ae	+	His	b4	+	His	B27
des	B27	+	des	b28	+	des	b29	+	des	B30
Gly	A21	+	Asp	B10	+	Glu	B28	+	Pro	b29
Ser	A2l	+	Asp	B10	+	Glu	b28	4-	Pro	b29
Thr	A2l	+	Asp	B10	4*	Glu	B28	4-	Pro	B29
Ala	A21	4·	Asp	Bio	+	Glu	b28	4·	Pro	b29
His	A2l	+	Asp	B10	+	Glu	b28	4-	Pro	B29
Asp	A21	+	Asp	B10	4-	Glu	b28	+	Pro	B29
Gly	A2l	+	Thr	Bio	+	Glu	B28	4·	Pro	b29
Ser	A2l	+	Thr	B10	4-	Glu	b28	+	Pro	b29

Tabulka 1 (pokračovánlι

Thr	A21		Thr	B10	4·	Glu	B28	+	Pro	B29
Ala	A21	+	Thr	BlO	+	Glu	028	+	Pro	029
His	a21	+	Thr	BlO	+	Glu	028	+	Pro	029
Asp	A21	+	Thr	BlO	+	Glu	028	4-	Pro	029
Gly	A21	+	Arg	B10	+	Glu	028	4-	Pro	029
Ser	A21	+	Arg	B10	4-	Glu	028	4·	Pro	029
Thr	A21	+	Arg	BlO	4-	Glu	028	+	Pro	029
Ala	A21	+	Arg	B10	+	Glu	B28	+	Pro	029
His	A21	+	Arg	B10	4-	Glu	B28	+	Pro	029
Asp	A21	+	Arg	B10		Glu	028	+	Pro	®29
Gly	A21	+	Asp	BlO	+	Lys	028	4-	Pro	029
Ser	A2l	4-	Asp	BlO	4-	Lys	028	+	Pro	029
Thr	A2l	+	Asp	BlO	+	Lys	028	4-	Pro	029
Ala	A21	+	Asp	Bio	+	Lys	B2 8	+	Pro	029
His	A21	4-	Asp	B10		Lys	B28	+	Pro	029
Asp	A21	+	Asp	B10	+	Lys	02 8	4-	Pro	029
Gly	A21	4·	Thr	BlO	+	Lys	028	+	Pro	029
Ser	A21	+	Thr	BlO	+	Lys	028	4-	Pro	029
Thr	A21	4-	Thr	BlO	4*	Lys	028	4*	Pro	029
Ala	A21	4-	Thr	B10	+	Lys	028	4-	Pro	029
His	A21	•f*	Thr	BlO	+	Lys	028	+	Pro	029
Asp	A21	+	Thr	B10	+	Lys	028	4-	Pro	029
Gly	A21	4·	Arg	•B10	+	Lys	028	4*	Pro	029
Ser	A21	4-	Arg	B10	4-	Lys	028	4·	Pro	029
Thr	A21	4-	Arg	B10	4-	Lys	028	4-	Pro	029
Ala	A21	+	Arg	B10	+	Lys	028	+	Pro	029
His	A21	4·	Arg	B10	+	Lys	028	4-	Pro	029
Asp	A21	4-	Arg	BlO	+	Lys	028	4-	Pro	029
Gly	A21	+	Glu	028	+	Pro	029	4·	Ala	030
Ser	A21	4-	Glu	028	4-	Pro	029	+	Ala	030
Thr	A2i	+	Glu	®28	+	Pro	029	+	Ala	030
Ala	A21		Glu	B28	+	Pro	029	4-	Ala	030

T.?.buika I (pokračovaní)

His	A2i	+	Glu	B28	+	Pro	029	+	Ala	030
ASp	A21	+	Glu	B28	+	Pro	029	+	Ala	03C
Gly	A21	+	Lys	B28	+	Pro	029	+	Ala	030
Ser	A21	+	Lys	028	+	Pro	029	+	Ala	030
Thr	A2i	+	Lys	b28	+	Pro	029	+	Ala	B30
Ala	A21	+	Lys	028	+	Pro	029	+	Ala	030
His	A21	+	Lys	b28	+	Pro	029	+	Ala	030
Asp	A2i	+	Lys	B28	+	Pro	029	+	Ala	030
Gly A21	+	Glu	028	+	Pro	029	+	des	030
Ser	A21	+	Glu	b28	+	Pro	029	+	des	b30
Thr	A21	+	Glu	028	+	Pro	029	+	des	030
Ala	A21	+	Glu	b28	+	Pro	029	+	des	b30
His	A21	+	Glu	b28	+	Pro	029	+	des	030
Asp	A21	+	GlU	028	+	Pro	029	+	des	030
Gly	A2í	+	Lys	028	+	Pro	029	+	des	b30
Ser	A21	+	Lys	028	+	Pro	029	+	des	030
Thr	A21	+	Lys	028	+	Pro	029	+	des	030
Ala	A21		Lys	028	+	Pro	029	+	des	030
His	A21	+	Lys	B28	+	Pro	B29	+	des	®30
Asp.	A21	+	Lys	B28		Pro	B29	+	des	030
Asp	B10	+	Glu	028	+	Pro	029	+	Ala	030
Thr	B10	+	Glu	02 8	+	Pro	029	+	Ala	030
Arg	BlO	+	Glu	028	+	Pro	029	+	Ala	030
Asp	B10	+	Lys	028	+	Pro	029	+	Ala	030
Thr	BlO	+	Lys	028	+	Pro	029		Ala	030
Arg	B10	+	Lys	028	+	Pro	029	+	Ala	b30
Asp	B10	+	Glu	028	+	Pro	029	+	des	b30
Thr	BlO	+	Glu	028	+	Pro	029	+	des	030
Arg	B10	+	Glu	028	+	Pro	029	+	des	B30
Asp	B10	+	Lys	02 8	+	Pro	029	+	des	030

	Tabulka	I	(pokračování)
Thr	Bio + Lys B;a	+	Pro B2 9 + des	B 3 0
Arg	Bio + Lys B 26	+	Pro B29 + des	B 3 o
des	B2- + des B;a	+	des B2 9 + des	B 3 0

E. Zmôny pôti aminosyselin des B20 + des B;? + des Bas + des B29 + des Bso

Jakkoliv je výhodné používať prírodné se vyskyťujioi C-peptidové sekvence, jak shora uvedeno, jsou prípustné variaoe délky a aminokyselinové sekvence tohoto peptidu a ziská se nioménô funkční ACB-PI molekula. Molekulárni modelovaoí štúdie ukazujl, že C-peptidová oblasť shora uvedených ACB-PI múže mit i délku jen Θ aminokyselín. Tyto štúdie dále ukazujl, že C-peptid múže být delôi než je jeho pŕirozená délka (35 aminokyselín v pŕipädé íidského proinzulínu) a stále jeätó umožňuje vhodné vytvorení sekundárni, terciám! a kvarterni štruktúry zralé inzulínové molekuly.Jedinými požadavky je (1) aby délka byla dostatečná k umožnôni vytvorení vlastni disulfidické a (2) aby byla odátôpitelná väzby v ACB-proinzullnovó molekule od ACB-PI molekuly s doprovodným vtvoŕením inzulínu.

Jiná provedení vynálezu zahrnuj! ACB-proinzulinové molekuly králíkú, opič, koni, krýs I a krýs II, vepŕú, skotu, psú, mqrôat, činôil nebo kaohen. Je výhodné, aby aminokyselinové eekvenoe ACB-proinzulinové molekuly téchto alternatlvhioh druhú byla prírodné se vyskyťujioi sekvenoi aminokyselín A-ŕetôzoe následovanou prírodné se vyskytujíci sekvencí C-peptidu, následovanou prírodné se vyskytujíci sekvencí B-ŕetôzoe. Jiná provedení vynálezu se zaméŕuji na funkční analogy proinzuli nové molekuly, odvozené od shora uvedených druhú.

ACB-proinzulinové útvary obsahujicí C-peptidy obecného vzorce :

Xi Xi^-(4 - 8 aminokyse1 i n)-Xj-X₄

Xi-X;-(9 - 13 aminokyselin)-Xj-X₄

Xi^_X2(14 - 19 aminokyselin)-X3-X₄

Xi-X;-(20 - 24 aminokyselin)-X?-X₄ délkou C-peptidu ACB-proinzulinové

Xi-X2~(25 - 31 aminokyselln)-Xô~X4 kde znamená Xi,X>,X₃ a X₃ bázíoké aminokyseliny, pŕičemž Χι,Χζ,Χ;} a X₄ jsou stenó nebo rúzné a kde intervenujioi aminokyseinová sekvenoe neobsahuje cysteinový zbytek, se mohou rovnéž použiť pri provádôni vynálezu. Podie výhodného provedeni vynálezu se vôli Xi,X;,X₃ a X4 ze souboru zahrnujioiho Arg, Lys a Orn.

Intervenujici poptidy o délce ŕetézoe vôtál než 35 aminokyselín jsou podie vynálezu plné užitečné. Aváak se vzrústajici současné vzrústá konformaóni nezávi3lost molekuly, rnajioí tak prodloužený C-peptid.

Vzrústajici konformaóni nezávislosť vede obecné k molekule se sníženou účinnosti vytváŕet vlásenkový útvar. Proto podie výhodného provedeni vynálezu obsahuje C-peptid méné než približné 35 aminokyselin.

KromÔ nové štruktúry bilkoviny, dokložené jejimi meziprodukty, prokázaly t-yto nové sloučeniny také terapeutický význam. Jakkoliv vôtáina biologické účinnosti proinzulinu je v ŕetézcích A a B, nebyl znám možný vliv C-peptidové väzby na biologickou účinnosť proinzulinu. Uvolnénim aminokyse1inovó koncové skupiny glycínu A-l se získal inzulinový analóg, který má vétáí inzulínovou účinnosť než prírodní BCA-proinzulin, podržuje si déle in vivo poločasové charakteristiky pŕirodniho proinzulinu. ACB-proinzulin má také schopnosť stimulovať DNA syntézu v buftkáoh hladkého svalstva pro svoji sohonost vázat IGF-I receptor.

Biologické účinnosti dvou invertovanýoh proinzulinú se oharakterizuji četnými zkouôkami in vivo a in vitro. Ve váeoh pŕipadech invertované proinzuliny vykazují účinnosť prijímať glukózu, které leží mezi účinnosti inzulínu a proinzulinu. Pri zkouáeni na schopnosť konkurence se ^li5inzulinem se zŕetelem na vázáni na plaoentálni membránové inzulínové receptory, Met-ACB-proinzulin a ACB-proinzúl in poskytuj! ED·,;, hodnoty 5,5 a 3,1 nM ve srovnáni k inzulínu (0,45 nM) a proinzulinu (20,4 nM) jak je zrejmé z obr. 23 a z tabulky II.

Tabulka II

Biologické aktivity invertovaných proinzulinových analogú in vi tro

EDso (nM)

Ana1og	Receptor i nzuli nuu	Receptor IGF-I	Transport glukozy
Inzulín	0,45	328,00	0,043
IGF-I	ND	0,45	ND
proinzulin	20, 40	10000,00	ND
ACB-pro i nzuli n	3,10	520,00	0,83
Met-ACB-proinzulin	5, 50	940,00	2,50

ND = nestanoveno

Schopnopst ACB-proinzulinú stimulovať pŕijimáni glukózy adipocyty se rovnôž môŕi a poskytuje podobné hodnoty pro potenci téchto dvou bílkovin ve srovnáni s inzulinem, jak je ukázéno v tabulce II. Na rozdil od jejich chováni na inzulinovém receptoru jsou obé molekuly mnohem podobnéjôi k inzulínu než k proinzulinu se zŕetelem na schopnosť stimulovať DNA syntézu v lidských buftkách hladkého svalstva.

Invertované proinzuliny jsou značné účinnôjáí in vivo než in vitro a vykazuji stejné prodlouženi trváni púsobení, jak je zrejmé z tabulky III.

Tabulka III

Hypoglycemíoké púsobení inzulínových analogú in vivo

Max. hypoglycenické ED₅o(nM)² Relatívni biologické

Látka púsobení (%)¹ púsobeni na inzulín hodina 2 hodiny 1 hodina 2 hodiny 1 hodina 2 hodiny

H-lneulin	59;0±4f3	45r7±6f7	l(0±0,01	1,6±0?09	100,0	100,0
hPI	55,1±2,6	61?0±4,0	9,1±1,7	6,2±0j8	14,3±2,8	19 f 5i 1;8
MetACBHPI	54,4±θ,4	64j8±3;e	8.4±0,4	5.1±0,0	15,4±0,7	31.3± 0,0
ACB-hPI	60,5±9r5	69,5±9,5	3.3±l,0	3,4±0,θ	39,6±3.6	47,l±10,6

Maximálni hypog1ycemické púsobeni se vyjadruje jako procentová

-<Α·ν_;ι zmôna od času nula, korigovaná pro kontrolní skupinu pri táže zkouäce ' Hodnoty EDso znamenaj i koncentroi bílkoviny, která poskytuje poločas maximálni hypoglyoemické účinnosti 1 nebo 2 hodiny po subkutannim podání

VSoohny hodnoty v tabulco III jsou stŕedem ±S.E.M. pro ťri oddélená stanovení v prípade lidskóho inzulínu a pro dvô. oddôlená stanovaní v pŕipadô každého proinzulinu.

Lidský inzulín produkuje maximálni hypoglyoemiokou odezvu jednu hodinu po subkutannim podání a koncentrace glukózy v krvi se vraci na základni hodnotu po 3 až 4 hodinách. Lidský proinzulin a ACB--proínzul iny produkuji maximálni hypoglyoemioké púsobení 2 hodiny po subkutannim podání či pokračuji k vytváraní vétái biologické odezvy v prúbShu dalái 3 a* 4 hodinové periódy, pŕičemž velikost odezvy závisí na podané dávoe. Kromô toho se zjistilo, že invertované prolnzuliny jsou zhruba dvojnásobné účinné než proinzulíny in vivo, pŕičemž ACB-proinzulin je účinnéjôi než Met-ACE~proinzulinová sloučonina, jak je zrejmé z tabulky III.

Vynález se také týká zpúsobu oáetŕováni diabetes mellitus. Vynález se rovnôž týká zpúsobu oáetŕováni diabetes mellitus nezávislého na inzulínu. Tento zpúsob oáetŕováni je založen na podávání organismu množství ACB~pxoinzulinu v dávce približné 10 až 1000 μσ/kg. Výhodnou dávkou je približné 10 až 100 pg/kg účinné látky. Typická denní dávka pro dospôlého ôlovôka je približné 0,5 až 100 mg.

Pri provádéni tohoto oáetŕováni se slouôenina obecného vzorce I podie vynálezu múže podávat jakožto jedna denní dávka nebo v nékollka dávkách za cien. Režim oáetŕováni múže vyžadovat podáváni v prňbéhu deláí doby. Množství na podávanou dávku nebo celkové podávané množství závisí na takových faktoreoh, jako je povaha a závažnosť, onemocnéní, vék a celkový zdravotní stav ošetrovaného a snášenlivcst nemocného pro podávanou sloučeninu obecného vzorce I podie vynálezu.

Obvykle se oáetŕováni provádí podáváním sloučeniny obecného vzorce í intravenózni infuzí. Pri tomto zpúsobu se sterilní far- 24 maceutický prostŕedek vhodné rozpustné solí slouôeniny včleňuje do fyziologické kapaliny, jako je napríklad 5% dextrozový roztok a získaný roztok se pomalú podává infuzi IV. Múže ae však také použit jíného zpúsobu infuze IV.

Slouôeniny obecného vzorce I, to je ACB-proinzuliny jsou užitečné pro náhradu dlouho púsobicího bazálního inzulínu. ACBproinzul inovó analogy mají značný terapeutický význam, zvláštô v pŕipadô diabetes mellitus nezávislé na inzulínu (NIDDM) k ŕizeni glukozového metabolismu.

Vynález se dále týká farmaceutických prostŕedkú, obsahujicich jakožto účinnou látku sloučenínu obecného vzorce I podie vynálezu. Slcučenlny podie vynálezu obecného vzorce I, 3 výhodou ve formé farmaceutický vhodných soli, se mohou zpracovávat pro orálni nebo parenterálni podáni pro terapeutické nebo profylaktické ošetŕování diabetes mellitus a/nebo diabetes mellitus nezávislé na inzulínu (NIDDM).

Napríklad se slouôeniny podie vynálezu obecného vzorce I mohou misit s bčžnými farmaceutickými nosiči a excipienty a používať ve formô napríklad tablet, kapsli, elixírú, suspenzi, sirupťi a oplatek. Farmaceutické prostŕedky, obsahujíoi ACB-proinzulinovou sloučenínu, mohou obsahovať účinné látky hmotnostné 0,1 až 90 % a obecné obsahuji účinné látky hmotnostné 10 až 30 %. Farmaceutické prostŕedky mohou obsahovať béžné nosiče a excipienty, jako jsou kukuričný škrob, želatina, laktóza, sacharóza, mikrokrystalická celulóza, kaolín, mannitol, fosforečnan divápenatý, chlorid sodný a kyselina alginová.

Jakožto rozptylovaci činidla, béžné používaná ve farmaceutických prostŕedcich podie vynálezu, se uvádôji kroskaramellosa, mikrokrystalická celulóza, kukuričný škrob, glykolát a kyselina alginová.

Jakožto pojivo tablet se uvádi akaoia, methylcelulóza, natriumkarboxymethylce1ulóza, poylviny1pyrro1idon (Povidone), hydroxypropylmethylce1ulóza, sacharóza, škrob a ethylcelulóza.

Jakožto mazadla, kterých se múže použit, se uvádôji stearát horečnatý nebo jiné kovové stearáty, kyselina stearová, kapalný silikon, masiek, vosky, oleje a koloidní oxid kremičitý.

Máže se rovnôž použiť oohuoovacích prísad, jako je napríklad peprmint, olej libavky položené a ôery aróma.

Môže být rovnéž žádouoi pridávať barvioi prísadu, aby móla dávkovací forma hezči vzhled nebo k napomáhání idenťifikaoe farmaceutického prostŕedku.

Pro intravenózni (IV) podáni se máže rozpouôtôt ve vodé rozpustná forma sloučeniny podie vynálezu obecného vzorce I v jednô z bôžné používaných lntravonoznioh kapal in a farmaceutický prostŕedek se máže podávast intravenózni infuzi. Máže se použiť napríklad fysiologické solanky, Ringerova roztoku nebo 5¾ dextrozového roztoku.

Pro intramuskulárnô podávané farmaceutické prostŕedky se máže rozpouôtôt sterilní vhodné rozpustná sál sloučenin podie vynálezu obecného vzorce I, napŕikkad hydroohloridová sál a podávať ve farmaceutický vhodném ŕedidle, jako je pyrogenu prostá voda (destilovaná voda), fyziologická solanka nebo 5% glukozový roztok. Vhodná, nerozpustná forma sloučeniny obecného vzorce I podie vynálezu se máže zpraoovávat a podávať jakožto suspenze ve vodné bázi nebo ve farmaceutický vhodné olejové bázi, jako je napríklad ester mastné kyseliny s dlouhým ŕetôzoem, napŕikkad ethyloleát.

Pro orálni podáni jsou zvláôtô vhodné sterilní farmaceutické prostŕedky ve formé vhodné soli ACB-proinzulinu, jako je napríklad hydrochloridová sál, formulované v ŕedidle, jako je napŕikad destilovaná nebo deionizovaná voda.

Nebo máže být jednotkovou dávkovací formou sloučeniny podie vynálezu obecného vzorce I roztok sloučeniny, s výhodou její soli, ve vhodném ŕedidle ve sterilné hermeticky uzavŕených ampulich. Koncentrace sloučeniny v jednotkové dávce se máže ménit a máže být napríklad približné hmotnostná 1 % až približné 50 % v závislosti na formé pŕisluôné sloučeniny a na jeji rozpustnosti a na dávce, určené lékaŕem.

Vynález se dále týká zpásobu rekombinantni produkce ACB-PI bílkovin nebo Met-ACB-PI bilkovin, pŕičemž tento zpásob zahrnuje:

1. vytvorení syntetického génu, pŕičemž tento gen zahrnuje DNA sekvenoi zakodujici ACB-PI peptidovou slouôeninu obecného vzorce I,

2. vnesení tohoto génu do vhodného vektoru obsahujioiho promotor operátorovou regionálni funkci v hostujioi molekule,

3. orientováni uvedeného génu ve vektoru k dosaženi transkripoe a transiace syntetického génu a aby byl gen pod transkripčni kontrolou promotor operátorového regiónu;

4. tranformováni hostujioi buftky vektorem,

5. kuitivaci hostujioi buftky za podminek vhodných k navození transkripoe a transiace génu a

6. ziskáni a čiäténi produkované peptidové sloučeniny.

Syntetické gény, in vitro a in vivo transkripoe a transiace, vedoucí k produkoi sloučenin obecného vzorce I podie vynálezu, jsou známy ze stavu techniky. Vzhledem k prírodní degeneraoi genetického kódu, pracovník v oboru zná konstrukoi potrebného počtu DNA sekvenci pro zakodováni sloučenin obecného vzorce I.

Podie výhodného provedení zpúsobu vynálezu, jak je také príklady doloženo,se dosahuje rekombinantni produkoe sloučenin obecného vzorce I za použití syntetického génu zahrnujioiho DNA sekvenci (sekv. ID číslo 2).

Tato DNA sekvence zakodovává sloučeninu obecného vzorce I do aminokyselinové sekvence (sekv. ID čislo 1).

Gly	I i e	Val	Glu	G1 n	Cys	Cys	Thr	Ser
íle	Cys	Ser	Leu	Tyr	Gl n	Leu	Gl u	Asn
Tyr	Cys	Asn	Arg	Arg	Glu	Ala	Glu	Asp
Leu	Gin	Val	Gly	Gin	Val	Gl u	Leu	,Gly
Gly	Gly	Pro	Gly	Al a	Gly	Ser	Leu	Gin
Pro	Leu	Ala	Leu	Glu	Gly	Ser	Leu	Gin
Lys	Arg	Phe	Val	Asn	Gin	His	Leu	Cys
G1 y	Ser	His	Leu	Val	Gl u	Ala	Leu	Tyr
Le u	Val	Cys	Gly	Glu	Arg	Gly	Phe	Phe
Tyr	Thr	Pro	Lys	Thr

Gen zakodujloí ACB—proinzulinovou molekulu se múže vytvorit syntetickou metodológii. Taková metodológie konstrukoe syntetického génu je v oboru dobte známa (Brown E.L., Belagaje R., Ryan

M. J, a Khorana H.G., 1979, Methods in Enzymology, Aoademic Press,

N. Ϊ., svazek 6Θ, str. 109 až 151). DNA segmenty, odpovidajíoi píl s 1 ušnému proinzuli novému génu. se generuj! za použití béžného DNA synteti zuj i o í ho pf í3troJ e. jako jsou DNA syntetizer Applied Biosystems Model 33ΟΆ nebo 38OB (obchodné dostupné u společnosti Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA. 94404J . Syntetický ACB-PI gen se rndže vytvárať tak, aby mé 1 reštrikční endonukleazová rniste. štôpení na jednom ze dvou koncú transkriptu k usnadnéní izoiace a k intergaci do expresnich a amplíŕikačních plasmidCt,. Vo 1 ba restrikônich míst je raková, aby se vhodné orientovaly ACB-PI. kóduj i cl sekvence s Mzenlm sekvenoi k dosažení vhodného čtecího rámce a exprese ACE-PI molekuly. Múže se včleňovať cbména jínýcb takových míst. átôpeni v závislosti na použitých konstruktech určitého plasmidu a mohou se generovať technikami o sobô znárnými v oboru. Schematické znázornéni tohoto procesu je na obr.' 16.

Špecifické sekvence kompozitu, objasftující konstrukci 278 páru bází lidské ACB-PI molekuly jsou na obr. 17. Výhodné provedenl vynálezu, používajíci ACB-PI kodujici sekvence, je na obr. 13, který objasňuje pozíce restrikoe endonukleasových Štépiclch míst pre EcoRI, Hindl.II, Hdel a BamHi. Sekvence na obr. 18 odpovídá výhodným ACB-proinzuli novým kodujioim sekvencim lidského, príkladné vvádéného ACB-PI.

Jak je príkladné uvedeno, ACB-PI gen se vytváŕi ze dvou polovín, jak je zrejmé 2 obr. 16. Jedna polovina génu se vytváŕi míčením a iigaci oligonvkleotidú 1,· 2, 5 a 6. Zatimco druhá poloví na génu se vytváŕi mi žením a Iigaci c i igonuki eotidú 3,4,7 a 8, jak je zrejmé z obr. 16. Obé poloviny génových fragmentú se čistí 15¾ polyakry.lamidovou gslevou e iektroforezou. DNA se ziská elektroŕoreticky z gélu vykrojením oblasti gélu, odpovidajici ACB-PI génovým polovieím a podrobením tenkého výrezu e 1ektroforeze.

E.'. ektro ŕereticky izolované fragmenty DNA se pak odsoluji na 2ΐον.-βοχ Sephftdexu G-50 nebo jeho ekvivalentu. ACB-PI génové polovlce se pak navzájom spoji za. vzniku ACB-PI génu, který se pak integruje do vhodného vektoru pre amplifikaoi (zvýšení počtu kopil) DNA.

Syntetické gény, zakodujíci sloučeniny obecného vzoroe I podie vynálezu, se mohou včleňovať do vektorú vhodných pro klo28 novací účely. Pro tento účel dostupné rúzné plasmidy a techniky integrace a amplifikace a selekce jsou v oboru dobre známy (Sambrook J., Fritsch E.F., Miniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydáni, svazek 1, Cold Spring Harbor Press, 1989). DNA sekvence se také múže amplifikovat za použití polymerazové ŕetôzové reakce, popsané v Current Protocols in Molecular Biology, (1989 a doplňky), Wilwy Interscience, N.Y.

Podie výhodného prevedení zpúsobu podie vynálezu se používá pUC18 plasmidu (obchodné dostupný u spoločnosti Boehringer-Mannheim Biochemicals, P.O.Box 50414, Indianopo1is, Indiana 46250) pro DNA amplifikaôní fázi. Volba plasmidu pUC18 se vzťahuje na prítomnosť EcoRI a HindlII reštrikční endonukleasovó štôpioi body v mnohaôetném klonovacim mistu p(JC18. Volba ampl i f akôniho plasmidu určuje reštrikční endonukleasové body ätépeni ACB-PI kodujíoí sekvence. Volba plasmidu a konstrukce syntetického ACB-PI génu jdou ruku v ruce, jelíkož amplífikační plasmid určuje reštrikční sekvenci pro vôlenéní do ACB-PI sekvenoe a odpovidajíoioh sekvencí o 1igonukleotidú používaných pro konstrukci syntetiokóho AVB-PI génu.

Podie jednoho prevedení vynálezu se približné 5 pg pUC18 plasmidu suspenduje v 10 ul puŕru, vhodného pro jedno z určitých restrikčnioh enzymových míst určené do ACB-PI syntetického génu. Podie výhodného provedenl vynálezu, príklady doloženého, je tímto restričnim enzymem HindlII. Plasmid plľC18 se v souhla3e s tim suspenduhe v 10 pl HindlII pufru (1 M chlorid sodný, 50 mM chlorid horečnatý, 100 mM tris-HCl, hodnota pH = 8,0, 10 mM dithioerythritol). Do tohoto roztoku se pridá ekvivalent 20 jednotek vhodného restrikčního enzýmu. Podie výhodného provedenl vynálezu to odpovidá 2 pl HindlII, který je ziskatelný od společ^nosti Boehringer-Mannheim Biochemicals, P.O.Box 50414, Indianopolis, Indiana 46250. Roztok se zŕedí 85 pi vody, mírné se mlchá a nechá se inkubovat pri teploté 37 “C po dobu dvou hodín. Reakce se ukonči a DNA se vysráži za použití tri objemú ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. Peleta se odstredí a vysuší.

Peleta se pak znova suspenduje v 10 pml restrikčního enzymovóho pufru, pŕizpúsobeného k jinému distálnimu volenému rest29 rikônimu enzymovómu mistu ACB-PI génu. Podie výhodného provedeni vynálezu, príklady doloženého, je EooRI jiným restrikônim enzymovým mistem. Peleta se tudíž suspenduje v 10 μΐ EcoRI pufru (IM chlorid sodný, 100 mM chlorid horečnatý, 500 mM tris-HCl·, hodnota pH 7,5, 10 mM dithiorythri to 1). Do tohoto roztoku se pridá ekvivalent 20 jednotek vhodné reatriôní endonukleasy, s výhodou EcoRI. EcoRI a HindlII reštrikční enzymya rCizné jiné reštrikční endonukleasy, které se mohou použitv tomto protokolu, jsou obchodné dostupné napríklad u společnosti Boehringer-Mannheim Bio- . Chemicals, P.O.Box 50414, Indianopo1is,Indiana 46250. Pak se pridá 88 μΐ vody a roztok se mirnô michá a inkubuje se pri teploté 37 ⁴ C po dobu dvou hodin. Reakce se pak ukončí a ĎNA se vysráží tŕemi objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. DNA ze shora uvedenó digesce se pak podrobuje e 1ektroforese na 1% agarosovém gélu. \ ; o nizké teploté táni. Vétäi reštrikční fragment, odpovídajici 11nearizovanému vektoru DNA, se odŕízne z gelu\ Vektor DNA se ziská . ; vedením gelového tenkého rezu sloupoem Elutip-d* (obchodné dos- , tupný u společnosti Sohlichter & Schuell, Keene, NH, USA) v podar- \ tatô v souhase s instrukcemi výroboe. DNA se pak vysráží , jak 'N/

·. ' ''.'Y shora uvedeno a vysuäi se. DNA se ukládá v 30 μΐ 10 mM tris-HCl·,. \ hodnota pH 8,0. ' ,

Približné 5 μΐ vektoru DNA se smísí s 10 plkomól sýnťetio- > \ ; kých PNA fragmente, odpovidajícich dvéma po 1 ovi riám AGB-PI synte- •'ý í tického génu, v 50 μΐ ligaôního pufru (50 mM tris-HCl, hodnota pH 7,6, 100 mM chlorid horečnatý, 10 mM DTT (dithiothreitol), 800 mM ' * f

ATP a 3,5 jednotek T4 DNA ligazy (obchodné dostupné u společnosti Boehringer-Mannheim Biochemicals, P.O.Box 50414, Indianopo1is, Indiana 46250). Reakční smés se pak inukubuje pri teploté 4 ’C pŕes noc a pak se transformuje do vymrazenýoh kompetentních

E.coli DH5a bunôk (obchodné dostupných u společnosti Bethesda Research 1aboratories, Inc., P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877) o sobé známým zpúsobem pro praoovniky v oboru a znázornéných ve standardnich 1aboratornich príručkách, jako j'e napríklad Sambrook J. a kol., jak shora uvedeno. Transformanty' výhodného prevedení podie vynálezu se nechávaji rúst pri tepl.oté 37 ’C pŕes .

• t noc na x-gal TY agarových doštičkách, obsahujicioti 100 μg/ml am30 pi ?·.! ϊ :.n u . Vo i ba antlbioti ka a prostred! závisí na ampl i fikačnim v s k tr u a použité bunôôr.é línii.

Xi ony. obsnhujici správny Inzert, ae vôli modro/biiou koionovou a e 1 o ko i . otrátet funkčností lacZ génu se pŕiôítá transťorí-i:·! n túra, jáiikož bod in2®rce kionovaci oblasti pUC18 je v iaoZ kodujici sekvenci . Selekce kionú. obsahuj í c ich vhodnou sekvenci, se po vrz.u j© ds-DNA sekvencovánini za použití · Sequenasy ^l! (obchodné doáxupné u spoločnosti United States Biochemickí Corp., P.O. Box 224ύΰ, Cleveland,, OH 44122.) podie protokolu, dodávaného výrobcem. Vysiedný plasmid lidské ACB-PI sekvence se určuje pRBldl. Vyvljejici se ŕetézec. nesouci ampli fikační plasmid, se p«k neohavá rust pŕes no o pri teplo'té 37 ’C v prostredí TY, obsahujícim 1OO pg/ml ampiciiinu a plasmid, obsahujici. syntetickou ACtí-hPi kociujicí sekvenci se izoluje zpúsobem, který popsal Maníartís T., Fritsch, E.E. a Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982), str. b9 al 94. Obecné približné 20 pg plasmidu DNA, shora izolovaného. sa suspenduje ve 20 μΐ pufru, vhodného pro jeden, z vnitŕnš zač 1enénýoh do restrikôních mist. Volba téchto' vnitŕnich” r estríkčnich mist je funkoi volby vektoru pro expres1, .používaného ve vztahu k ŕidicim oblastem vektoru pro expresi. Podie výhodného provedení vynálezu, príklady doloženého, je restrikônim enzyrn-.-in vo i by Ndoi. Ke shora uvedenému roztoku ee pridá približné 40 jednotek rostrikčního enzýmu, 175 μΐ vody a mirnô se michá a inkuhujc- se pri teploté 37 ’C po dobu jedné hodiny. Pak se pridá približne 40 jednotek jiné vnitŕní” reštrikční endonukleasy

i.podi& príkladného výhodného prevedení BamHI) a inkubuje se pri teploté 37 ‘C po dobu dalälch dvou hodín. Reakce s® pak ukončí a DNA se vysráži tŕemí objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. Roztok se pak podrobuje elektroforez© na 1,2% agarosovém gélu c nízké teploté táni. Fragment, odpovidaj íol približné 265 bp Ať'B-hri kodujici sekvenci, s® pak odŕizne od gélu. ACB-hPI DNA se ziská vedením sioupoem Elutip-d*, jak je popsáno v príkladu 2. Po vysrážoní a vysu&enl v« vákuu s® DNA ukládá v 25 μ.1 10 mM trís-HCl, hodnota pH 8,0.

Expresní plasmid, ktorého se používá, s® múž© volit z četnť:?. í. i U^! .vňati \· ₁ má vhodne··..·, kor, t r c i r, i oblasť a vhodná reštrikční m .i .·; es 'i£ua.l.P.'.j í c i i n t e g r a c i ACB-Pí kóduj 1 oi sekvenoe operatívne se z ŕ ·? t ô I e m na r i či 3 o í o bi ústi. Hojrúzné u::: r i e t n i pro ‘.-.r a na f o r irme í pro k a f yoti cfcycd etických buiwŕ. jnou v n b·?. r u .*i .-b 1‘ e známy r'.

’ťi ? -k p r i'vexpr uvádôj i jši vektor y pro expres! ,

·. a t r ar.s fektnloh eukavyJnkož to príklady ta kop'frc 99A, pKK.2,23-3, ľi’RôiO t <>.o· p r o iiio r.·; v.· v y vektor pDR trp promotorový vek*

			V '3 '3.	20, pbbbBOl.íd a 1OC
~1		ľ r	u p	7.,ilo v y n á.ι ί·2«, jak ju
	i	.•;k :.	i.l	buíik.iu Ľ . c o i i bi?,
P -	t j	ti í	i’j	b :. -U:;mi d i o muk·;· pri p
		'· í ./ 1 '	Λ u S	o. t n í ú·:.' i. n né t e ·:; i.a > r i p
t.			: Vil	ľ.'. :ô -J 0 1 ÚVcJ 1 'p i, ·-? Itlp V. í
	<·	’.L hl	bí‘	•l· .c ϊ ϊ .3 iii y n o j 'i? u z rt -í? j £; i p* ť
v	I*		! '·	h i.:··., i Volských hubkách.
Ϊ--	1		' · y i	bili, ;,..k j o p z í k L ad y
Ί ; .·		. í.·	J ’·..>·.í	ii p r u m·.. t c·) 0 v á c b i a «t •e výhodného provodení
; y	£ i	rb:	i o k	►‘-h·.· génu. jenž má z ako
i.		Uľil i	.1 ' j ú	iič; v t e á e naši edué q.v
d .·	i i	i ·. :	T t·'.	j ako u z a u j í iná promotc
ru i.		L·.··.:	0 .1 u	iiT’.j cieíiu, 7. n é ho* by
r r	];	i ' u	J t '.·	p r .:· ηκ· t o j; o v -i- ~„· p u r á <: c r o
Z n	..:un y íu		(.'...i! :, Jion'i z* stavu t e o h n
o y	ľi	to t	.i -:..1:	ý c b nebo iv, od i f i k o van ý c
Π!<·.	j	j b	ľ	or ientovány se zíetel
9	i 1	P	jak d i	j s u r c e i , o j e j i c h k r e á c výhodného prevedení
pi	í	k .1 ·;·	•i y	:·o i,ož.;·no , se ssuspenčiuj

bunka, v e k t o r a m p r o e x p r s » i opurátorovou-oblastí. V oboru

•.ίο i oženo, jo proinotoi'ovou oparáto· pribi itnô 15 pgr zvoleného expr o j b . pi ·,.·:·mi Ju » pc ZRI k f.'S..' ve 20 pl puťru. odpovidajíciho prvníbu 2t· o·, :·>.; vi.i ľni ob'' vestrlkčnich mlat ÄCB-PI kóduj íoi sekvenoe t. pi.ii o i. r., m ob j as huj i o i m Maei reštrikční mlsto). Ptidávé se približné -b..· j edno tok restr ikčního enzýmu (napríklad NDel), 175 μϊ voly a Lnkubuje se po dobu dvou hodín pri ťeploté 37. ’C. Po inkubaci se DNA vysráži ve tŕeoh objemeoh athanoiu, 0,3·M v.octanu sodném. jak shora uvedenc, vysuší ae a suspenduje se ve 20 μΐ roatrikóní.ho enzyroového pufru odpovidajioiho druhému vnittnímu r?3tr1kônimu rol stu (zpúscbem objasftujiclm BamHI reštrikční mlsto). Pak se pridá približné 25 jednotelc druhého r©3trlkčního enzýmu (napríklad BamHI) a ptibllžné '178 μΐ vody, mirnô s© promiohá a inkubuje se po dobu dalSioh dvou hodín pri teplotô 37 ’C. Reakoe ss psk ukončí a DNA se vyeráýi tŕemi objemy ethanolu O,3 M v eth y i a -o e h t u , V e k t o r p C Z R í 2 6 S , í z .· i. o v s n ý t i m t o zpftsobem, s e p a k p-druhu je -1 ektr o f o r ť»ze na 1¾ agarczovém gélu s nízkou teplotou •ji vektoru DNA, so pnk. ve formé itor DNA se izoluje vedením pfea a vysušení se ukládá v 35 μΐ oného vektoru DNA roztoku se pak čištôného ACB-PT. fragmentu, shora se pridá 4 μ,Ι ΙΟπιΜ ATP, 0,5 μί gázového pufru (500 mM trÍ3-HCl., horečnatý), 26 μΐ vody a 0,5 μ! (.obchodné dostupné u spoleônosti Avenue, Piscataway, N.J. 08854), teplôt“? 4 ‘C po dobu 16 hodiri. σ»“·ηί smés se zrodí 50 /.ti 10 mM 1 chloridu vápenatého a následné príslušných bunék El. coli K12 d u '.J A. P c- d 1 & ' v ý h o d n é h o provedení 8 se použivaji jakcžto hostujíci aké četné j iné buftky, pŕiôerož se 7. 1.,201, L687 , 1,693, L5O7, 1.640, ; čemž tento výčet ne n i m iné n j ako ské buftky se pak vnesou na vhodné antibiotika odpovldajicího resisi pi asm!d. Kul. tura se pak inkubu1 í; k o u b i i l\ k. u a p f í teplôt č vho d n é k shora uvedenými vektory, jsou popsali Maniatis a kol. (1988) h'Aní. fragment, o d po vl da j i t tenkého fezu odflzne z gélu a ve] t 1 r.upeč El utíp-d·'* . Po vysiráženi i U'riili tris-HCl, hodnota pH 8,0.

Približné 2.5 μ'Ι shora u v* d s m 1 s í s p i¹ i b 1 i Ž n é 1 2 μ 1 r o z t o k u pripraveného, Po tohoto roztoku IM di thí othroi telu, 5 μϊ '1 O X i í hodnotu?. pH 7,6, 100 mM chlorid (3,5 jednotek) T4 DNA ligasy Pharmao i. a , Ino.. 800 Centenrilai Ro -i kčn :í. sripjs se pak inkubuje p f í J a x príklady doiožono, i i triy-H··?'! (hodnota pH 7,6) a 3 μ se použije k primá transforreact R V 3 06, jak je pope áno v pH. kle y n ?. i. oz u b > i f. k y Eo 1 i K12 R V 3 O hufíky, mohou se však použi t t phikií-driá uvíidéjí E. c :· > t KÍ 1..64 i . 1..,69 i. 1,814. (E. o o 11 B), p f η να e t - n í . ť r a n s ť o r m o v a n é h o .s t: i t e 1 prostí*· e 11 23 se lektivnlhn tlaku t u no i prítomného génu na -r.cpvssn je po '-dobu vhodnou pro hosti t* pr o ho v; 111© 1 s ko u buii ku,

Zpúsoby tranaťcrrnace bunô v oboru dobbe známy a obecné je

Muleouiar Cloning: A Labo-ratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York Curront Pi'ctoovis in'Móleouiar Biol>gy (1909) a doplftky. Tato metóde log i <> txat'isformaoe . bunék E. coli, používaná pti najvýhodnejším provAddni zpúaobu podie vynálezu.j® príklady objasnéna a doložená. Pťooná podmlnky, ťa ktorých s© buftky E. ooli tranšťormujl a 1 ti vu j i , závlsejl na povaz-e E. ooli hostujloioh bunék a na použitých expresnloh noho klonovac-ioh vektoroch. Napríklad vektory, která vóiaftuj.1 'tapelrUl zavedít©Iné .promotor operátorovi oblv,c;t;. .naptikl-ad clS57 tepelné zaveditelnou .lamda fágovou promotor operátorovou. , ohlas t, vyžaduj! teplotní posun v kul tivaônioh podminkách k navození bllkovinové syntézy., K expres! bľlkovín dooházl ve vys.oee. konoentro'vanýoh .bakter i á l nich . expr.oenľoft systémoch, charakteristicky .ee . agreguji φλ granule nebo. inkiužrd,.'útvary, která obsahuj! vysokou hladinu bil-? koviny (Krauge-r ia’kol 1990) Proteín Folding, Gierasch & King, .«i t. r . 136 až 142... American Asaooiation f or, the Advanoeméňt o ť ,Soience Publ ication¹ .Ňo . 39-103, Washington, D.C.) Taková .bi Iko vínová egiegáty sa muáaijí a g l.ubi 1 1 zovat pro další ôištôni ;a . ízól aol · ,ΜΑγ ' daného hl i kovi nového .produktu. Id. Pro sol ubil i zač f· bi lkovin se rucii: u použít n©jríižnôjšl techniky užívajiol silné denaturovaných, r ·.);. t o K. ú . jako jy napríklad guanldinium-HCÍ a/nebo s habôydana'turovaných roztoku, . Jako 'je napr J. k: ad dithi othréi to,í (DTT^> .¹ Postupná odrtraneni d© ΰ a t· u r a č n i ch ôínidel (často dialýzou) « v ^tevád^oirn · r c útok·.· urao2.hu j e·, aby denaturovaná bi l koviná ..pti jai a ..svoji’¹· n'áyi’.yr.-.t f.urií'ormscl PŕíjisJuäpé po dm i n ky· denaturao© a’ prevedení, f 3 a 31 ánovej! pre uvd.l tý ’ b.l j kov i. no vý expresní systém a/nebó · pro-pti shuté·miu bi ikovinu, ' , ’ '

Ptezkoýäenl .ACB.-pr·-. 1 nz u i in obsahujioi bakter.le’f po· fermantá'ci indikuj© ,ρί,Ι toniňost granúl ovanýoh útvarft. Po. izolac/i . sol ubili zac i a snutí t o typ» ’ae r e kombi nant n i bilkoviny oďdáPi; ma 'iahexovem sioupci·. Mrýlo Q oh? omatogra ť.i© sul ŕí to'1 yzovaných: byi ko'vi.n s$·' provádi po o0íro,Í.en5l· reverrnl fázovou HPLC, ôímžfde . ,x-í «kaji , dva ACB-pro insul JÍnoyé tohdy (ροοί). Fond A (32 mg), výkazu je •hmo'tový pík 9878 podie í’ABýMŠ· .á aminokoncová 'sekvenoe vykazuj®' Gly-ľíeVai . Fond B k.ť1,5 , ímgk vykazuje hmotový , pik 10009 'poďí© FÁB-MS a aminokonoová sekvence vykazuje Met-Gly-Ile. Spoiu s hodnotami aminokyselinové anaiyzy, 89 zdá, že fond A odpovidá autentickému ACB-proi n z u 1 in-S-aui fonátu zatlmco fond B odpovidá ACB-proinzul in S-suifonátcvé molekule plus odpovidajioimu Iniciátorovému methioninovárau zbytku k inioiaci kodonu. BP-HPĽC, aminokyselinová analýza a N-koncové s©kvenoovani ukazuj i, Že oba bi i kovinové fondy jsou zneôiátény majoritní eiožkou druhého fondu kromé nôkolika j iných pikú.

;>~Sui ťonáty o bo u ACB-proinz u i i nových molekúl s e konvertuj í n a «.li sni j. i di cky zpárované vi áaenkové ACB proinzul inové molekuly za použití kombinace vysoké hodnoty pH a pridaného thlolu , jak pcpsft) Frank B.H. a kol., (,198i), Peptides, Synthesis, Structure and Funotior», Proceedings oí the fíoventh American Peptido Sympo5ium (Fdoh, D.H. a Gross E.;, str. 729 a& 738, Pi&rc© Chemical Co . , Rockíord, IL. Obé molekuly vytváŕejí vláserikovou strukturu v dobrém výtôžku (v.toe než 75 %) » čistí se reverzní fázovou

HPLC ílmi í© z i s ká 3 3 mg

MetO-Gl. yi'-ACB-prolnzuiinu (2-86) k > n z e r v a t i v n i eh i minimai i žací (Met-ACB-proinzulin) a 4 mg G1yl-ACB-proinzulinu (2-86) (ACB-proinzulin). Nizké výtôžky každého analogu jsou zpúsobeny potrebou ŕezú ve fondu a shromáždôním frakci z ôištôni pflôné kontaminace mezi dvéma invertovanými proinzuiinovými formami. 'Biikoviny se charakterizuji se zŕetelem nu čistotu a Identitu použitím RP-HPLC (obr. 21) aminoterminálnim sekvencovánim, aminckyse1 i novou analýzou a FAB-MS s očakávanými výsledky. Kromô toho se Glyl-ACB proinzulínová (2-86) molekula analyzuje se zŕetelem na vzor spárováni d isulŕ i dl okých vazeb.

Vynález se týká dále zpúsobu rekombinantní produkoe nativních inzulínových bílkovín ŕfebo inzulínových analogú, pri kterém 5 β

l.. vytváŕi syntetický gen, pťičemž tento gen zahrnuj© DNA sekvenci zakódujte! ACB-PI peptidovou sióuôerdnu obecného vzorce 1, kde x znamená i,

2. tento gen se vnáôi do vhodného vektoru obsahujlciho promotor operátorovou regionálni funkoi v hootujici molekule E. ooli,

3. uvedený gen se orientuje ve vektoru k dosaženi transkripoe a translace syntetického génu a aby byl gen pod trahskripčni k o n t r o i o u p r o motor - o p e r á t ·.; r o v é oblasti,

4, hostujioi buftka E. coli so transformuje vektorom,

5. transformovaná hostujlcl buftka E. coli se kultivuje za podminek vhodných k navození transkripce a translao© genu

o. ACB-TJ. poptid set ziské a č i á t í ,

ACB-P'ľ peptid so štSpi vhodnými peptidazami noho chemickými činidly, takže ae C-peptid odštépi..

Vynález tedy poskytuje zceía novou cestu pre prípravu inzulínu za použití rekombinantní DMA technológie. Vynález využivô použití ’ceia nového génu, mRNA. a proinzul inových mez i pr oduktCi pro produkoi funkční lldská inzulínové molekuly spolu » konstituo vánim nové re kombinantni biosynletioké cesty k inzulínu. ACB-proiiizvliní'VÚ molekula ae výrazné i i á í svoji strukturou od natívni p-en 1 rrzul inové molekuly í.zde označované BCA-proinzulin pro účely srovnaní > a praste se múže účinne konvertovať za získóní funkční i n z u i 11 -i o v i m o 1 ej k u 1 y .

Tatu nová cesta prípravy inzulinu je odlišná od souče.aného zpusoiu repiikaob pil rečni oh procesú v odlišných organismeoh. Tento e.i f ernettivní z pús o b vede k inzulínu za značných úspor v rokombinantní produkci obchodné významných množství inzulínu eliminaci požadavku otls tr a ň o vár, í N~kunoového methlonu z r ©kombi nantni molekuly za použití oathepsinu C nebo jinýoh zpúaobú za využití vnitťmho pús obe n 1 me thi ony i ami nopepfidazy E. oolí hostujicí bunky k oôstranôni N-koncového methioninu.

deiikcž je odstranéni H-koncového iriethioninového zbytku ACb-Tí závislé πει pi* i temnosti MAP, musí zvolená hostujicí buftka •vniffné produkovať MAP nebo musí. byt Konštruovaná k produkoi MAP. PrctéssB MAP je vlastni bunkám E, coli. Proto ae roúž© použít rezných rad bunék E. ooti, ktere produkuji MAP, pri zpúaobu podie vynálezu. Jakožto pblklad E. coli hostujicioh bunék, užitočných uťi prevádéni zpúsobu podie vynálezu, se uvádéjí bun&Čné fady E. coli K12 1.201. 1.687, L693, 1,607. L640, L641, L695, 1.814 f E.

coli li) . Podie výhodného provádéni vynálezu je E. coli hostujioi buftkou E. coli K12 RV3O0.

Konverze ACB-PI molekuly 3 jednoduchým ŕetézcem na funkční natívni inzulín nebo na inzuli nový analóg vyžaduje odátépeni in36 ternálního C-peptidu. To je možné enzymatickými nebo chemickými prostŕedky napríklad bromkyanovým ôtépením. Jestliže se použije aminokyselinových sekvenci nativniho lidskóho proinzulínu, A-ŕetózec, B-ŕetézeo a P-peptid, pri konstrukci ACB-hPI peptidu, jak príkladné doloženo, je aminokyselinová sekvence ACB-hPI peptidu následujici:

Gly	íle	Val	Glu	Gin	Cys	Cys	Thr	Ser	íle
Al	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10
Cys	Ser	Leu	Tyr	Gin	Leu	Glu	Asn	Tyr	Cys
All	A12	A13	A14	A15	A16	A17	A18	A19	A20
Asn	Arg	Arg	Glu	Ala	Glu	Asp	Leu	Gin	Val
A21	Cl	C2	C3	C4	C5	C6	C7	C8	C9
Gly	Gin	Val	Glu	Leu	Gly	Gly	Gly	Pro	Gly
CIO	Cll	C12	C13	C14	C15	C16	C17	C18	C19
Ala	Gly	Ser	Leu	Gin	Pro	Leu	Ala	Leu	Glu
C20	C21	C22	C23	C24	C25	C26	C27	C28	C29
Gly	Ser	Leu	Gin	Lys	Arg	Phe	Val	Asn	Gin
C30	C31	C32	C33	C34	C35	Bl	12	B3	B4
HÍS	Leu	Cys	Gly	Ser	His	Leu	Val	Glu	Ála
B5	B6	B7	BS	B9	BIO	Bil	B12	B13	B14
Leu	Tyr	Leu	Val	Cys	Gly	Glu	Arg	Gly	Phe
B15	B16	B17	B18	B19	B20	B21	B22	B23	B24
Phe	Tyr	Thr	Pro	Lys	Thr
B25	B26	B27	B28	B29	B30

Následující diagram objasňuje trypsinenzymatický model zpracováni ACB-PI, používaný pri konverzi ACB-PI na inzulín:

Trypsin i i 1 i

ACB-PI Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Glu......Gln-Lys-Arg-Phe-Val-Ile

ACB-PI# 19 20 21 22 23 24 63 64 65 66 67 68

Insulin# A19 A20 A21 Cl C2 C3 C42 C43 C44 BI B2 B3

Jelikož trypsin ôtôpi na karboxypolohách Arg21, ARg22, Lys64 a Arg65, ziská se smôs inzulínových bilkovin pri tryptickóm ôtôpení ACB-PI. Ty zahrnují:

ΑΤ9Α22/ ArgA23# Arge-i insulin ArgA22, Argg-i insulin ArgA22, ArgA23 insulin

ArgA22 insulin

Následujicí ôtôpení shora uvedených druhú s karboxypeptidazou B odstraňuje argininové zbytky z karboxykonce A-fetézce, ôimž se produkuje

Arge-i inzulin natívni inzulin

Múže se tudíž produkovať natívni lidský zralý inzulin proteo1ytickým ôtôpením ACB-hPI meziproduktu. B-koncový methioninový zbytek ACB-PI molekuly se vnitŕnô odstraňuje s približné 30¾ účinností púsobeni methionylaminopeptidasy (MAP) v hostujioi í

buňce.

ACB-proinzulin se konvertuje na lidský inzulin použitím trypsinu a karboxypeptidasy B, jak se používá pro normálni proinzulln a jak popsal Kemmler W. a kol., (1971) J. Biol. Chem., svazek 246, str. 6786 až 6791. Konverze ACB-proinzulinu na inzulin vyžaduje podstatné drsnôjôí podminky než odpovidajici transformace proinzul inu. Reakce se sleduje RP-HPLC, jak je ukázáno na obr. 25 a vykazuje naprosté vymizeni výohoziho materiálu spolu s výskytem nôkolika nových bilkovinových pikú. Obr. 25 se týká transformace A-C-B-proinzulinu na lidský inzulin. Na ose x se odečitá doba v sekundách, na ose y odezva v milivoltech. Spodní k/izk<· piati pro lidský piolmulin, vyži í pro lidský inžulin a n ijvyžži odpovidá 23 hodinové tr ans f ormao i . Legenda k obr. 25:

'·. p n z o b c ľt e π» i k č 1 a 1 5:1o pi, oK o n c o r. t i' a o e G ΐ a d i ··, n t

HBI.. 4 PK H a r í an oiu VY PAC cie

Príprava vzorku ľ ··, dni i n k y

z. a c i z o n i 8

lien zkouáky	07/12/90
be Lektor	211 Níl. 02 AUFS 0,1 mg/ml
	52,3 5,2.317,35,0,5
	použité zŕídér.1 O, IN HCI
	45C, 1 mi/min. 40 UL injekol,

TFA. B’-DlTTO/5Qífc CHjCN

Λ ~ 201,1/2 j i d s ký pro i nzui. i. n

..... -ľ -:·· B š 1.7 hodinová traqnsťcrmaoe rada í i i 3 i nj akoe 2 1 i dský i nzuiin

Po enzýmov6m átépeni se získaná peptidová smé.-s rozdélí n® své slúžky :a použití RP-HPLC, jak je zŕojmé z obr, 26 « rúznó frakoe se shroméždx a analyzuj 1 se, jak je doložená v tabúl oe IV,

Legenda k obr. 26, který se tyká transformácie GI y-A-C-B HPI na BHI pŕeo trypsin & CPB. Na oao x ce odeóltá doba v sekundách, na ose y odezvt’i v mi 1 i vo i teh.

2pÚSvb Chemik d i s j. S i <:< upe ::

Po dm:i nky Zabi z oni.

D&n z k o už k y De tekto r

HBL 4 PK J'3 f.; i: i t. í;

1.5 tfli VYbAC C16 pop & Prot e

07/26/90

214 nm, 2,0 AUFS mg vzorku + trYpsin a CPB 45C, 1 ml/min, A--O, 1% TFA, B-“v 50% CHíCN grád 35-52,5/5 až 60/5 až 53/30 aŕ 90/.1 rada 1113 injeko® 4 podlí Ά528ΜΗΟ25

Tabu) ka IV

Analýza peptldú z proteo1ytioké transformaoô ACB-proinzulinu na inzulín

Pi k	#	Identi ta	A FAB/MS	n a 1 AAAa	y t 1 o HPLC	ká metóda Peptidová mapa
2 +	4	B22 30	N I)	ano	ND	ND
3 +	K	B22 29	ND	ano	ND	ND
9		C-peptid	3020,3	Nll	ano	ND
14		DOP-irtzul in C	4866,4	ano	ND	ND
16		Arg-inzuli n	5964,8	ano	ND	ND
1.7		í nzul in	5808,5	N D	ano	ano
17		des-Thr-inzulín	5707,3	ND	ND	ano

ND = nestanoveno ^;· Ami no kyselinová analyea '•VO proteésový peptid mapujioi 'deS (B22~⁵inzul in '· d e s -Thr ^b ·' -inzulín

Piky 2 + 4 a 3 + 5 na obr, 26 uq identifikuji jakožto

GFFYTPK = <31 y-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys (Bí’-ä’) a GFFYTPKT »

G i. y-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (B ·³ - -‘-'j , což J© pravdepodobné výsledkem Stôpeni trypsinem na Arg-22 B-ŕetézoe inzulínu (Tabulka IV i a jsou jakožto dubiety pro nutnosť dvou oddelených jednotlivých vstŕikú na sloupeo. Pík 9 (obr. 26) se identifikuje jako C-peptid na základé koeluoe C-peptidovým standardem a molekulovým hmotovým stanovením FAB-MS (tabulka IV). Pík 14 (obr^;. 26) odpovidá des-oktapeptid (B-’“ ··:·) inzulínu, což je druhý produkt reakcie, který poskytuje pík 2 a 3. Pík 16 se identifikuje jako mono-Arginzuíir., pravdepodobné mono-Arg(A22)-inzulin, na základé FAB-MS a aminokyse1 i nové analyzy (tabulka IV). Vétéi izolovaný pik z transŕcrmace 1t> frakce 17 (133 pg) . Tento bilkovinový pik koeiuuje ® autentickým biosyntetickým lldským inzulinem sa použití RP-HPLC,

jak dokladá obr. 27,	na kterém je peptidová mapa inzulínu. Na o
>; s e ·: d e č i tá doba v	sekundách, na os® y odozva v milivoltech.
Legenda k obr, 27:
Zpúsob	WY1.-0
Chemik čislo	A885
S 1 Ô u p e c	ZORBAX C0 150A
P ŕ 1 p r ava vz o r k u
Podmí nky
Z o f í z o n í	1.5 9
Don zkoušky	00/07/90
P -? f o k f o r	214 NM
	enzymová Ätápeni jako pŕes WOT-O
A:	5%ACN/75V1 ..0/20¾ 1,25(4 Na-;SO,j

— rado 716 i njekoí 1 podl J Λ30086 r acta 718 i n jeko i 2 i pcdíi A52~'8MH~O25-17

Pri analýze FAB-MS se získa pík molekulové hmotnosti 5300,5, Jak se cžekává pro lidský inzulín. Kromé toho se,' pozoruje menši pík mojekuiové hmotnosti 5707,3, predstavuj í o í 10 až 125 % veáfceré biikovíny a identifikovaný jako des-Thr(B30) inzulín. Des-Thr CB30) 1 nzul i n je znám ke kcO'h)?&mcitografo váni s 1 i dakým inzulinem za. RP-HPLC systému, použitého tak, že se neočekává neúspéch k oddelení tohoto materiálu od i nzul i r. u. Pík 1.7 se také analyzuje za použití Staphy)occcous aureus V8 proteazováhe peptidu, mapujíciho podie Chance R.E a kol. ť 1981.). Peptldes. Synthes is , S’tructure and Functlon. Prcceedings of the Seventh American Peptide Symposlom (Rich, D.K. ä Groša, E.), str. 721 až 728, Pierce Chemical Company, Rockford, ÍL, pŕiôemž se zjišťuje, Že je identický s biosyntetickým lldským inzulinem za očekáváni, že se pozoruje malý '-Ή pík, reprezentuj Ιοί (0FFYTPX) Cl y-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro.-Lys (z desThr ( B · ) i nzul inu) vedie normálni hc piku (OFFYTPKT) <31 y-Phe-PheTyŕ-Thr-Pro-Lys-Thr, jak je zrejmé z obr, 27. Jak j© zrejmé z obr 30, produkovaný inzulín preteč1ytickou transformaol ACB-lnzulinu je 100¾ biologicky aktívni pri receptorových zkouôkáoh lidského pl ao entá'tni ho inzulínu.

Pro další stanovení, zdali bllkovina. produkovaná príkladným enzymr.tldkým štéper.im ACB-proinzul inú odpovldť· nebo neodpovldá r«a tívnimu 1. idskému inzulínu, se porovnávajl obrazce trypsin + pepsi nového štôpení ACB-proinzulinom produkované bilkoviny ve srovη-,ηΐ ε obrazci trypsin i- popsinovýoh fttôpicíoh obrazcú lidského inzulínu. Prostŕedniotvlm trypsin + pepjs í nového štépeni. lidského inzulínu se získá stabilní A.l-1.3/B.l-11 fragment plus četné jiné menši fragmenty, jak popisuje Toren, P a kol., (1988) Anál. Biochem. svazek 169, str. 287 až 299. 2 12 možných inzulínových disulfidickýoh izomerú, obsahujlcioh jednoduchý A a B ŕetézec, pouze tŕ.l mohou poskytovať volné s. oddélené fragmenty pri štôpeni s pepsinem,, jmenovitá prírodní hormon a dva disulfidioké izoméry chemicky syntetizované dŕíve, jak popisuje Sieber P.a fco1.,(1978) Hcppe-Seylor's 2. PhysioV. Chem., svazek 359, str. 113 až 123. Fragment A1-13/B1-11 se zlské z t r yps in/peps i nového štépenl ACBproinzul i nu a porovnávé se s fragmenty Α1-13/Β1-11, získanými z téchto tri inzulinovýoh izomerú. Kompletní pepsinové Stépenl ukazuje?, že vôtší HPLC pi k koeluuj© ;; Al-13/B1-1.1 fragmentom z pŕlrodniho inzulínu a Že neobsahuje Sádný z pikú soutôžicioh A1-13/B1—11 fragmente ze dvou d i rul f idi okých. izemerú, jak je ukázáno na obr. 22. Vétši Mtépný pík se čisti (53 ,ug ) a podie zjiôtíní má oôekávsné arni nokysel inové nložení pro ΑΓ-13/B1-11.

Následujici príklady praktického provedenl vynález objesftuji, ni jak jej však neoroezuj í.

Pŕ 1 k 1 a d y pro ve d en1 vy n á l e z u

Príklad 1

Konstrukoe syntetického ACB-proinzulinového génu

278 pár bázi DNA fragment, který zakodovává lidský

ACB-proinzulinový gen se udróí na bázi dobre známé aminokyselinovó sekvence lidskó proinzulinovó molekuly a zahrnuje sekvence:(pozitivni ŕetézec sekv ID číslo 2, negatívni ŕetézec = sekv ID číslo 3) ' - AGCTTCATATGGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTG

3' - AGTATACCCGTAACACCTTGTTACGACATGGTCGTAGACGAGGGAC

TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACCGCCGTGAGGCAGAGGACCTGCAGGTG

ATGGTCGACCTCTTGATGACGITGGCGGCACTCCGTCTCCTGGACGTCCAC

GGTCAGGTGGAGCTGGGCGGTGGCCCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTG

CCAGTCCACCTCGACCCGCCACCGGGCCCACGTCCGTCGGACGTCGGCGAC

GCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGAAGCGTTTTTTGAACCAACACCTGTGCGGC

CGGGACCTCCCAA3GGACGTCTTCGCAAAAAACTTCGTTGTGGACACGCCG

TCCCACCTGGTGGAAGCTCTGTACCTGGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCrrC

AGGGTGGACCACCTTCGAGACATGGACCACACGCCACTTGCACCGAAGAAG

TACACCCCGAAGACCTAGGATCCG - 3'

ATGTGGGGCTTCTGGATCCTAGGCTTAA - 5'

Nukleotidové sekvence se modifikuj! na svých zakončeních 5’ a 3' pŕidánim bázi k vytvorení NDel a BamHI restrikônich poloh lemovaných HindlII a ECoRI polohami pro klonováni génu do polyspojovníkové oblasti pUC18 plasmidu. Osm syntetických oligonukleotidú (oblasti 1 - 8 ve shora uvedeném grafu), 1 iôicich se délkou od 56 do 74 bázi, jak shora uvedeno, se generuji za použití DNA syntetizeru Applied Biosystems Model 38OA nebo 38OB (obchodní produkt spoločnosti Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) podie pokynú výrobce a čisti se elektroforezou na 15¾ polyakrylamidového gélu. Tyto o 1igonukleotidy se fosforyluji za použití [gamma-p32] ATP a polynukleotidovó kinásy j a pak se komplexují s T4 DNA ligasou k vytvorení dvou 139 párô.

i i

I

I bázi dlouhýoh DNA duplexú, jak popisuj© Brown, E.L.,, Belagaje R.,

Ryan M.J. a Khorana H.G., (1979), Method in Enzymology, Aoademio

Press, N.Y. 68, str. 109 až 151.

První polovina ACB-PI génu se formuje mišenim nefosforylovanôho oligonukleotidu 1 fosforylovanými o 1igonukleotidy 2, 5 a 6, zatimco druhá polovina génu se formuje mišenim fosforylovanýoh o 1igonukleotidú 3, 4 a 7 nefosforyiovaným oligonukleotidem 8. Obé poloviny génových fragmentu se čisti na 15¾ poiyakrylamidovém gélu a DNA se ziská; z gelového tenkého rezu elektroforetioky a odsolením na sioupci Sephadexu G-50.

Príklad 2

Konstrukce plasmidu pRB 181

Približné 5 pg plasmidu pUC18 (obchodné dostupný u spoleônosti Boehringer-Mannheim) se suspenduje v 1O pl 10X HindlII pufru (IM chloridu sodného, 50 mM chloridu horečnatého, 100 mM tris-HCl, hodnota pH 8,0, 10 mM dithioerythritolu), ve 2 pl HindIII reštrikční endonuklease (obchodné dostupná u spoločnosti Boehringer-Mannheim, 20 jednotek), v 85 μΐ vody, mírné se míchá a inkubuje se pri teploté 37 *C po dobu dvou hodin. DNA se výsráži tŕemi objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. Po odstŕedéní a usušení ve vákuu se peleta rozpusti v ΙΟ pl 10X EcoRI pufru (IM chloridu sodného, 100 mM chloridu horečnatého, 500 mM tris-HCl, hodnota pH 7,5, 10 mM dithioerythríto 1 u), ve 2 pl EcoRI restrikčniho enzýmu (obchodné dostupný u spoločnosti BoehringerMannheim, 20 jednotek), v 88 pl vody, mirné se míchá a inkubuje se pri teploté 37 *C po dobu dalôich dvou hodin. DNA se opôt vysráží tŕemi objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném, a podrobuje s® elektroforeze na 1¾ agarosovém gélu s nízkou teplotou tánl. Vôtši HindIII/Εσο RI reštrikční fragment (2623 bp) se odŕizne z gélu a DNA se ziská vedením sloupoem Elutip-d* (obchodné dostupný u spoleônosti Schlloher & Sohuell, Keene, NH, 03431) podie návodu výroboe. Po vysráženi a usušení se DNA skladuje v 30 pml lOmM tris-HCl, hodnota pH 8,0 pri teploté 4 “C.

Približné 5 pl tohoto vektoru DNA se smisi s 10 pikomoly dvou syntetických DNA fragmentá, ’shora pripravených, v 50 μΙ ligačního pufru (30mM tris-HCl, 10 mM chloridu horečnatého, 10 mM DTT, 800 uM ATP a 3,5 jsdnotek T4 DNA ligasy, hodnota pH 7,6).Reakční smés se inkubuje pri teploté 4 ’C pŕes noc a pŕevede se do zmrazených príslušných bunek E. ooli DH5 (obchodné dostupných u spoločnosti Bethesda Research Laboratories, Ino., P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877). Transformanty se neohávaji rást pŕes noc pri teplotô 37 ’C na x-gal TY agarovýoh destičkáoh, obsahujlcích 100 pg/ml ampieilinu. Vôli se klony obsahujioí správný inzert ztrátou funkoionálňiho laoZ génu podie modro/bilé kolonové selekce a potvrzuje se ds-DNA sekvenoováním za použití Sekvenasové soupravyy (obchodné dostupná u spoleônosti United States Biochemical Corp.). Získaný plasmid se označuje jako pRB181,

Príklad 3

Konstrukce rekombinantnich vektorá a hostitelá

A. Konstrukce plasmidu pCZR126S

1. Izolace plasmidu pkC283

Lyofily E. ooli K12 BE1201/pKC283 se získají u spoločnosti Northern Regionai Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, pod ôíslem NRRL BG-15830. Lyofily se dekantuji do zkumavky obsahujíoi 10 ml LB prostredí (10 g Baoto-tryptónu, 5 g Baoto kvasniônéno extraktu a 10 g chloridu sodného na litr, hodnota pH nastavená na 7,5) a inkubuje se po dobu dvou hodin pri teploté 32 ’C, pŕičemž se vytvorí kuitury 50 pg/ml v ampieilinu a pak se inkubuje pri teploté 32 ‘C pŕes noc. Bučky E. coli K12 BE1201/pKC263 se kultivujl pri teploté 32 ’C, jelikož buftky obsahují k teploté citlivý cl represni gen, integrovaný do bunéôné DNA. Jesliže se použiji bučky, které obsahují divoký typ lambda pL represorového génu nebo které neobsahuji lambda pL promoter pri izolačním postupu, jak popsáno v nás iedujicich pŕikladeoh, je inkubační teplota 37 ‘C.

Malý dí1 kuitury, pôstované pŕes noo, se vnese na LB-agarovó destičky (LB prostredí s 15 g/1 Bacto-agaru),.obsahujioi 5 pg/ml ampioilinu tak, že se ziská, jednoduchý kolonový izolát E.

coli K12 BE1201/pKC283. Získaná jednoduchá kolona se naoôkovává do 10 ml LB prostredí, obsahujíciho 50 pg/ml ampioilinu a inkubuje sa pŕes noc pri teploté 32 ‘C za intenzívniho.tŕepáni. Naočkovává se 10 ml kultury, kultivované pŕes noo, do 500 LB prostredí, obsahujíciho 50 pg/ml ampioilinu a inkubuje se pri

». teploté 32 ‘c za intenzlvniho tŕepáni tak diouho·, až kultura dosáhne stacionárni fáze.

* Následujioi procedúra je pŕizpúsobená podie Maniatis a kol.,

1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory). Buftky se sklidi odstŕedônim pri 4000 g po dobu 10 minút pri teploté 4 “C a pak se supernatant zahodí. Bunéôná peleta se premyje ve 100 ml ledové chladného STE pufru (O,IM chloridu sodného, 10 mM Tris-HCl, hodnota· pH 7,8 a 1 mM EDTA). Po promyti se bunéôná peleta resuspenduje v 10 ml Roztoku 1 (50 mM glukóza, .25 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0 a 10 mM EDTA), obsahujícim 5 mg/ml lysozymu a ponechá se pri teploté mistnosti po dobu 10 minút. Pridá se 20 ml Roztoku 2 (0,2 N hydroxidu sodného a 1 % SDS) do bunôk zpraoovaných lysozymem a roztok se mirné míché za inverze. Smés se inkubuje na ledu po dobu 10 minút.

* Pridá se 15 ml ledové chladného 5 M octanu draselného, hodnota pH 4,8 do zpracované smési bunék a roztok se miohá za * inverze. Roztok se inkubuje na ledu po dobu 10 minút. Pripraví se 5 M roztok octanu draselného pfidáním 11,5 ml ledové kyseliny octové do 28,5 ml vody a 60 ml 5 M octanu draselnéiho. Získaný roztok je 3 M se zŕetelem na draslík a 5 M se zŕetelem na aoetát.

Lysovaná smés bunék se odstŕečtuje v odstŕedivoe Beckman SW27 (nebo v rovnocenné odstŕedivoe) pri počtu otáôek 20000/min po dobu 20 minút pri teploté 4 ‘C. Bunéôná DNA a zlomky vytváŕeji peletu na dnô zkumavky. Zlská se približné 36 ml supernatantu a pridá se 0,6 objemú isopropano1 u, smísí se a získaný roztok se ponechá pri teploté mistnosti po dobu 15 minút. Plasmid DNA se ziská ostŕedováním pri 12000 g po dobu 30 minút pri- teploté mistnosti. Supernatant se vyhodí a DNA peleta se promyje 70% ethanolem pri teploté mistnosti. Ethanolový promývaoi roztok se dekantuje a peleta se vysuäi ve vakuovém desikátoru. Peleta se pak re46 s uspená u j v e ml TE -pufru (10 mM Trís-HČl , hodnota pH 8,0 a lmM

EDTA).

Pridá se 3 g chloridu cesnihc· do DNA roztoku. Približné 0,8 mi 10 mg/ml roztoku·! ethidiumbromidu ve vodô ss pridá na každých 10 mi roztoku chloridu oesného . ·- DNA. Konečná hustota roztoku j© približné 1,55 g/ml a ethidiumbromidová koncentťace je približné 600 pg/ml. Roztok se prevod© do odstredivkové zkuroavky Beckman Type 50, naplní ss po vrch parafínovým olejem, utéshi se a odstŕeduje se pri počtu otáčok 45000/mi n po dobu 24 hodín pri teple ·- é 20 ^!C. Po .odstredí· n i'^-. jsc-u v.idi te 1 né dva .pásy DNA v obyčejmém svétio. Po odstranéni čepičky ze zkumavky, se odstráni nižší DNA pás použitím atrikačky s hypodermni jehlou #21, zavedenou z boku odstredivkové zkumavky.

Ethidiumbromid se odstráni opakovanou extrekci vodou nasyoenou 1-butanolem. Chlorid cesný se odstráni dialýzou proti TE pufru. Pc extrakcich pufrovaným fenolem a pak chloroformom se DNA vysrážl, premyje sa 70% eíhanot cm a vysuší se. Ziská se približné 1 mg pi«3inidu pKC283 a uloží se pi‘i teplotô 4 ‘C v TE pufru pri koncentraci približné 1 Pls/M'· · Reštrikční poloha a funkční mapa piasmidu pi<C283 je ne obr. 1.

Príklad 3.A.2 r ys trikční

Konsxrukco plasmidu pKC233PX

Približné 10 μΐ plasm 1du pKC.233 DNA, pripraveného zpdsobem podlo príkladu 1, se amíuhA se 20 μϊ systému 10 X stŕedni- solný (500 mM chlorid sodný, 1OO míl Tri s-HCI, hodnota puf r pH 7.5, 100 mM chlorid horečnatý a 10 mll DTT) , 20 μϊ 1 mg/ml BSA, μί restričního enzýmu Pvull (približné 50 jednotek, jak definovane r po 1 ečno.utí Bethesda Research Laboratories (BRL), od které jsou véechny zde používané reštrikční enzymy) a 145 μϊ vody •a získaná reakční smôs se inkubuje pri teplote 37 ’C po dobu dvou hodín. Reštrikční enzymové reakce, zde popisované, ae rutinné ukončuji f'enoiovou a pak chl oroformovou extrakoi, po které se provede vysráženi DNA, premytí ethanolem a reauspendovánl DNA v TE pufru. Po ukončení Pvull ôtépeni, jak shora popsáno, Pvull

- 47 štépený piasmid pKC283 DNA se vysráží a pak se resuspenduje v 5 μΙ TE pufru.

Približné 600 pikomol (pM) Xhol spojovníka (5'-CCTCGÄGG-3') (sekvence Id čislo 4) se kinazuje ve smési obsahujici 10 μΐ 5 X pufru Kinasa (300 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 50 mM chloridu hofeônatého a 25 mM DTT), 5 μΐ 5 rnM ATP, 24 μΐ vody, 0,5 μΐ T4 poly nukleotidové kinasy (približné 2,5 jednotek, jak definováno P-L Bioohemicals), 5 μΐ 1 mg/ml BSA a 5 μΐ 10 mM spermidinu inkubaol smési pri teploté 37 *C po dobu 30 minút.

Približné 12,5 μΐ kinasovaných Xhol spojovníkú se pridá do 5 μΐ PvuII ôtépeného plasmidu pkC283 DNA a pak se pridá 2,5 μϊ 10 X ligasovôho pufru (300 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,6, 1OO mM chlorid horečnatý a 50 mM DTT), 2,5 μΐ 1 mg/ml BSA, 7 μΐ 5 mM ATP, 2,5 μϊ (približné 2,5 jednotek podie P-L Biochemioals) T4 DNA ligasy, 2,5 μϊ 10 mM spermidinu a 3 μΐ -vody do DŇA. Výsledná ligační reakční smés se Inkubuje pŕes noo pri teploté 4 ‘C. Po ukončení ligačni reakce se reakční smôs nastaví tak, aby móla s i ožení'vysoce slaného pufru (0,1 M chloridu sodného, 0,05 M Tris HOt, hodnota pH 7,5, 10,0 mM chloridu hoŕečnatého a 1 mM DTT). Pridá se približné 10 μϊ (1OO jednotek) restrikčniho enzýmu Xhol do smési a získaná reakční smôs se inkubuje pri teploté 37 “C po dobu dvou hodín.

Reakce se ukončí a Xhol ôtépená DNA se vysráží, resuspenduje a provede se ligaoe shora popsaným zpúsobem s tou výjirakou, že se do ligační smési nepridá žádný Xhol spojovník. Ligatovaná DNA je žádariým piasmidem pKC283PX. Reštrikční misto a funkční mapa piasmidu pKC283PX je na obr. 2.

Príklad 3.A.3

Konstrukoe E. coli K12 MO (lambda ±)/pKC283PX

E. coli K12 MO(lambda⁺) se múže získat od Northern Regional Research Laboratories, kde je uloženo pod číslem NRRL B-15993, v 1yofi 1izovaném stavu. E. coli K12 MO(lambda ⁺ ) obsahuje divoký typ lambda pL CI represorový gen, takže transkripoe z hybridu pLlpp promoteru podie vynálezu neprobihá v buftkáoh E. ooli K12

MO (1 ambda ·* ) . Lyofily se rekonstituují, jednoduché kolonie MO(lambda⁺) se izoluji a pripraví se 10 ml pŕes noc kultivovaých M0(lambda⁺) bunôk v podstatô zpúsobem podlo príkladu 29A1 s tou výjimkou, že teplota pri inkubaci je 37 ‘C a v rústovém prostredí se nepoužívá žádného ampicilinu.

Použije se 50 μΐ kultury kultivované pŕes noc k naočkováni 5 ml LB prostredí, které také obsahuje 10 mM síran horečnatý a 10 mM chlorid horečnatý. Kultura se inkubuje pri teploté 37 ‘C pŕes noc za intenzivniho tŕepání. Nósledujici ráno se kultura zŕedi na 200 ml LB prostredím, obsahujicím 10 mM síranu hoŕeônatého a 10 mM chloridu horečnatého. Zŕedéná kultura se Inkubuje pri teploté 37 “C za intenzivniho tŕepání až je absorbance pri 550 nm (A;. približné 0,5, což indikuje hustotu bunôk približné 1 x 106 bunék/ml. Kultura se ochladí na 10 minút v lézni ledové vody a buňky se pak shromáždi odstŕedováním pri 4000 g po dobu 10 minút pri 4 ’C. Bunôčná peleta se resuspenduje ve 100 ml studeného 10 mM siranu horečnatého a pak se bezprostredné znova peietizuje odstŕedéním. BunéČná peleta se resuspenduje ve 100 ml 30 mM chloridu vápenatého a inkubuje se na ledu po dobu 20 minút.

Buftky se opét shromáždi odstŕedéním a resuspendují se v 10 ml 30 mM chloridu vápenatého. Púl mililitrový podil bunôk se pridá do ligovanó. DNA, pripravené podie príkladu 29A2; DNA se pripraví 30 mM v chloridu vápenatém. Smés bunôk a DNA se inkubuje na ledu po dobu jedné. hodiny, tepelné se na ni , púsobi pri 42 ‘C po dobu 90 sekúnd: a pak se ochladí na ledu v pr'úbôhu približné dvou minút. Smés bunék a,DNA se zŕedi na 10 ml LB prostredím ve 125 ml baftkách'/a inkubuje se pri teploté 37 ‘C po dobu jedné hodiny. Nanésou se 1Q0 μΐ podily na LB agarové destiôky obsahujíoí ampici) lin a inkíibuji se pri teploté 37 *C až do výskytu kolonií.

Kolgnie se jednotlivé kultivují a plasmid DNA jednotlivých /

kolonii /se zkoumá.reštrikční enzymovou analýzou a gelovou elektf roforéz/óu. Píasmid DNA se Izoluje zpúsobem podie príkladu 29A1, avšak f/tupeft gr.pdiéntú .chloridu cesného se vynechává dokud se žádané Ei. coíili Jpl2 MO(1 ambda *)/pKC28 3PX transformáty neidentifikuji. Restpíkftni’míato a funkční mapa plasmidu pKC283PX je na obr. 2.

Príklad 3.A.4

Konstrukce E. coli K12 MO (lambda ±)/pKC283-L

Pripraví se 10 pg plasmidu pKC283PX DNA zpúsobem podie príkladu 29A1 a rozpustí se v 2o μΐ 10X vysoce slaného pufru, 20 μΐ 1 mg/ml BSA, 5 μΐ (približné 50 jednotek) restrikôniho enzýmu BglII, 5 μΐ (približné 50 jednotek) restrikôniho enzýmu Xhol a 150 μΐ vody a získaná reakôni smés se inkubuje podobu dvou hodín pri teplotó’ 37 ’C. Reakce se ukonči a po vysráženi

BglII-Xhol ätópenó DNA se DNA resuspenduje v 5 μΐ TE pufru. Syntetizuje a kinazuje se DNA spojovník s konci DNA s jednoduchým ŕetôzcem charakteristický restrikčnim enzymovým ätôpenim BglII a Xhol. Spojovník se kinazuje v podstatô zpúsobem podie príkladu 3A2. DNA spojovník má následujici strukturu:

5'-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3'

3'-ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5' (sekv. ID ôíslo 5) (sekv. ID čislo 6)

Shora uvedený spojovník se syntetizuje z deoxyo1igonukleotidú s jednoduchým ŕetôzcem o sobó známým zpúsobem. Deoxyoligonukleotidy s jednoduchým ŕetôzcem se mohou syntetizovat za použití komerčné dostupných zarízení, jako je napríklad syntetizátor 380 DNA Syntetizer 3polečnosti Applide Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404),, který využivá fosforamiditové chemie. Jinó procesy pro syntézu DNA jsou v oboru rovnôž známy. Bôžnô modifikovaný fosfortriesterový zpúsob syntetzy DNA s jednoduchým ŕetôzcem popsal Itakura a kol., 1977, Science 198:1056 and Crea a kol., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:576. Kromé toho popsal špeciálni zpúsob DNA syntézy Hsiung a kol., 1983, Nucleic Acid Research 11:3227 a Narang a kol., 1980, Methods in Enzymology 68:90.

Spojovník a BglII-Xhol átôpený plasmid pKC283PX se ligatuje v podstatô zpúsobem podie príkladu 3A2. Ligatovaná DNA konštituuje žádaný plasmid pKC283PX. Reštrikční místo a funkční mapa plaš50 mídu pKC283-L jsou na obr. 3. Plasmid pKC203-L DNA ss použivá k transfonnaoi E. coli KI2 M0( 1 ambda^f) a rezultujiol E. ooli K12 MO(1ambda¹)/pKC283-L transformanty se identifikuj! v podstaté z pás obe m podlá príkladu 3A3.

Príklad 3.A.5.

Konstrukce E. coli K12 Í1O( 1 ambda ')/pKC283-LB

Približné 10 pg plasmidu pKC283-L DNA, pripraveného v podstata zpásohem podie príkladu 29Λ1, se rozpustí ve 20 μΐ 10X vy5059 slaného pufru, 20 μϊ 1 mg/ml BSA, 5 μϊ (približné 50 jednotek restrikôniho enzýmu Xhol a 155 μΐ vody a získaná reakční smés se inkubuje pri teplotô 37 ’C po dobu dvou hodin. Xhol stépený plasmid pKC2ô3-L DNA se pak vysráží z reakční smési pŕidáním tri objemá 95¾ ethanolu a jodné desetiny objemu 3 M octanu sodného, inkubuje se v iázni suchý led - ethanol pc dobu 5 minút a odstredí se, Získaná DNA peleta se premyje 70¾ ethariolom, vysuší se a resuspenduje se ve 2 μΐ 10X zlomového translaóního pufru (0,5 M Tris-HCI, hodnota pH 7,2, 0,1 M síranu horečnatého a 1 mM DTT), v i μΐ roztoku 2 ml! v každém deozynukieotidtrifosfátu, 15 μΐ vody. 1 μΐ (približné 6 jednotek podlo P-L Biochemicals) Klenow, ktorý je veikým fragmentom E. coli DNA polymerasy la v 1 μϊ 1 mg/ml BSA. Získaná reakční smés se inkubuje pri teploté 25 'C po dobu 30 minút. reakce so ukončí inkubací roztoku pri teploté 70 ‘C po dobu 5 minút. '/ a r n HΪ spo j o v niky kinusnije a ligatuje na pKC283-L DNA v podstate

7) se plasmid i igaôní (5'CGGGÄTCCCG-3')(sokv. ID čislo Xhol štepený, Kionowem spracovaný zpásobam podie príkladu 3A2. Po

r b a k o i s e D N A	v x U ._. 1J	pŕi bi i žné	100	jednotkami BamHI	po dobu
pribi iáné dvou	hodin pri	teploté 3	7 ’ C	v© vyaooe alanóm pufru. Po
BamHI Stépení	se pŕipr	avi DNA	pro	ligaoi v podstaté	stojným

zpásebem jako podie príkladu 3Λ2

Približné 5,9 kb Buml-JI reotrikôni fragment ae cirkulavizuje ligací a transformuje se na E. coli Κ12 MO(lambda^) v podstaté stejnýni zpásobem jako podie príkladu 3A2 a 3A3. E. ooli K12 MO (1ambda*)/pKC283-LB transformanty se identifikuj! a pak se pri5.1 praví plasmid pKC283-L DNA v podstaté zpúsobem podie príkladu 3A1. Reštrikční misto a funkční mapa plasmidu pKC283-LB jsou na obr. 4.

Príklad 3.A.6

Konstrukce E. coli K12 MO(1ambda*)/pL32

Približné 10 pg plasmidu pKC233PX se ôtépí restričnim enzýmom Sali ve vysoce sianéin pufru, zpracuje se Klenowem a ligatuje 36 na EcoRI spojovník (5'6AGGAATTCCTC-3')(sekv. ID číslo 8) v podstaté stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A5 s výjimkou používaného výchoziho plasmidu, restrikôniho enzýmu a spojovníku. Po štépení s restrikčnim enzymem EcoRI, které vede k odštépení približné 2,1 kb DNA, približné 4,0 kb EcoRI se reštrikční fragment cirkularizuje ligaci na výsledný plasmid pKC283PRS. Ligatované DNA se použivá k transformaci E. coli K12 M0(lambda¹) v podstaté stejným zpúsobem jako podie, príkladu 3A3. E. coli K12 M0(iambda*)/pKC283-LB transformanty se identifikuji a pak se pripraví plasmid pKC283PRS DNA v podstaté zpúsobem podie príkladu 3A1. Reštrikční misto a funkční mapa plasmidu pKC283PRS js’ou na obr. 5,

Približné 10 pg plasmidu pI<C283PRS se StÔpi ve 200 pl vysooe slaného pufru s približné 50 jednotkami každého z restrikônioh enzymú PstI a Sphl. Po inkubasci reakční smési pri teploté 37 'C po dobu približné dvou hodin se reakční smés podrobuje elektroforeze na 0,6% agarozovém gélu s nízkou teplotou gelováni (společnosti FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rookland, Maine 04841) po dobu 2 až 34 hodin pri približné 130 V. a približné 75 mA v Tris-acetátovém pufru.

Gel se zabarví ve zŕedéném roztoku ethidiumbromidu a pás DNA, koristi tuuj ioi približné 0,85 kb Pstl-Sphl reštrikční fragment,, který se zviditelni v dlouhovlnném ultrafialovém svétie, se odŕizne od gélu ve formé malého segmentu. Objem segmentu se stanoví podie hmotnosti a hustoty segmentu a pridá se stejný objem 10 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,6 do zkumavky obsahujici segment. Segment se pak roztavi inkubaoi pri teploté 72 ‘C. Ziská se približné 1 g približné 0,85 ' kb Pstl-Sphl ?PS restrikčniho fragmentu piasmidu pKC283-' v objemu asi 100 pi. Analogicky 30 átôpi plasmid pKC283-LB a restrikónimi ©nzymy PstI a äphl, a výsledný približné 3,0 kb reštrikční fragment se izoluje elektroforôzou agarosováho gélu a pripraví se k ligaci.

Približné 0,85 kb Pstl-äphl reštrikční fragment plasmidu pKC383PRS se iigatuje na približné 3,0 kb Pstl-Sphl reštrikční fragment plasmidu pKC283~LB v podstatô zpúeobem podie príkladu 3A2. Ľigatovaná DNA konštituuje žádaný plasmid pL32. Reštrikční m i.-31 o a funkční mapa plasmidu pt.32 jsou na obr. 6. Plasmid pL32 se transformuje na buftky É. coli K12 MO (lambda⁴-) v podstatô stojným -púsobem jako podie príkladu 3A3. Plasmid pL32 DNA se pripravuje z E. coli K12 M0(1ambda') /'pĽ32 transformantú v podstatô zpúsobeiri podie príkladu 3A1 . Analýza plasmidu pL32 DNA dokiádá, že vloe než jeden EcoRI spojovník je vázán na Klenowem spracovaná Sali zakončení plasmidu pKC283PX. Obsah vioe než jednoho E00RI spojovníku neovlivftuje použite!nost plasmidu pL32 nebo derivátu plasmidu pL32 a môže se zjistit podie prítomnosti Xhol restrikčniho mista, které se generuje, kdykoliv jsou spolu vázány dva spojovníky EcoRI. Alternatívne se múže konstruovat plasrníd pL32 odštôpením Sall-EcoRI a ligaci podie prvniho odstavce tohoto p ŕ í k i a d. u na plasmid pKC 2 S 3 - LB.

Príklad 3.A.7

\.v /

Konstrukce E. coli K12 MO(1 ambdai)/pL47

E. coli K12 RV3G8/pNľI789 se múže ziskat. od Northern Regional. Research Laboratories, kde je uloženo pod čí3lem NRRL B-18216 v iyofi 1izovanóm stavu. Reštrikční misto a funkční mapa pNM789 jsou na obr. 7. Plasmid DNA se extrahuje z kultury v podstatô stojným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 1, pŕičemž však inkubační teplota je 37 C. Suspenduje se 10 pg pNM789 ve 200 pl PvuII pufru (30 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 60 mM chloridu sodného a 6 mM chloridu horečnatého). Pridá se jedna jednotka PvuII a reakční smôs se inkubuje po dobu 5 minút pri teploté 37 ‘C. Enzým se inaktivujo udržovánim na teploté 65 ‘C po dobu 10 minút. Pak se pridá 30 pl BamHI pufru ((200 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0, IM chloridu sodného a 70 mM chloridu hoŕečnatého), 70 μΐ vody a 10 jednotek BamHI a reakčn-i smôs se inkubuje po dobu jednó hodiny pri teploté 37 C. Pak se pridá 5 jednotek alkalické fosfatasy a inkubuje se po dobu jednó hodiny pri teploté 65 “C. Oddôli se fragmenty DNA na 1¾ agarozovóm gélu a čistí se DNA jednoduchý rez fragmentu (obr. 8).

DNA spojovník s chybôjicim zakončením a BamHI zakončením se syntetizuje v podstatô zpúsobem podie príkladu 3A4. Tento spojovník (na 118 v obr. 8) má následujicí strukturu:

5'-CTGTGCCTTCTAG-3'

I I I I I I I I N I I I ' -GACACGGAAGATCCTAG- 5 ' (sekv. ID čislo 9) (sekv. ID ôisló 10)

Shora uvedený spojovník je kinasován a ligatován do BamHI-PvuII ôtôpenóho plasmidu pNM789 v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A2. Tóto ligačni smôsi se použivá k transformaci bunôk E. coli K12 RV3O8 a izolace plasmidu se provádi na tôchto transformantech v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A3. Selektuji se nôkteró plasmidy, které obsahuj i vhodný PvuII fragment (494bp) a Xbal-BamHI fragment (628bp). Sekvence alespoft dvou z nich se stanovuje sekvencovánim z polohy BamHI se zŕetelem na polohu Smal a selektuje se jeden kloň s žádanou sekvenci. Tento piasmid jakožto meziprodukt se označuje jako piasmid 120. Sohema tohoto postupu a reštrikční >

misto a funkční mapa plasmidu 120 jsou na obŕ. 8.

K izolaoi EK-BGH kodujici DNA se ôtôpi približné 10 plasmidu 120 ve 200 μϊ vysoce slaného pufru obsahujioiho 50 jednotek každého z restrikônich enzymú Xbal a BamHI. Štôpné produkty se oddôli na agarozovóm gélu e 1ektroforezou a približné 0,6 kb Xbal-BamHI reštrikční fragment, který zakodovává EK-BGH, se izoluje a pripraví pro ligaoi v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 29A6.

Piasmid pL32 se také ôtôpi restrikônimi enzymy Xball a BamHI a približné 3,9 kb reštrikční fragment se izoluje a pripraví pro ligaci. Približné 3,9 kb Xbal-BamHI reštrikční fragment plaš54 midu pL32 se liguje na pŕ ib1 i žn# 0,6 kb XBal-BamHI reštrikční fragunent plasmidu 120 v podstate stojným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A2, čirnž se ziská pi nsmid. pL47. Reštrikční misto a funkční mapa plasmidu pL47 jsou na obr, 9. Plašmld pL47 se pak transformuj® na E. coli K12 MO(lambda·· ) v podstate s tajným zpúsobem jako podie príkladu 3A3 a identifikuji ss E. coli K12 MC'( i ambda··')/pL47 transf ormeiity . Pl&smld pL.47 DNA se pripravuje z t r a ľ; s f o r m a n t ú v p o d s t a t č z p ft s o b e m podie p f 1 k 1 a d u 3 A1 ,

Príklad 3.Λ.6

4Ľ i 5 ma p

Približné

t. ucič i eném 13 •t κι 2 jsou ιίϊι obr.

1O μ g s približné 5C 200 μ) vysooe slaného átépený plasmid pPR12

Kor.strkos E. coli K12 RV3C-8/pPP.12AP.l

Plasmid pI^}R12 obsahuje k teplôt# citlivý pi. represorový gen cI957 a plasmid pBR322 a gen p ŕ í s; pí va j í o í k odoinoctí k tetracyklínu. Plasmid' pPR12 je pope ôn v sme r í okám patent-ovém spise číslo bi'-.!?.na 1984). Reštrikční misto á funkční 10.

p 1 » s rn í d ·.’. pP R J. 2 a e š t é p í j o dne f .k.·· m i reštrikčního enzýmu EcoRI ve pufru p?í teplôt# 37 “c dvou hodín. EcoRI DNA se vysráži a zpr&covává se činidlám Klenot* v podstát# zpôsobero podlo príkladu 3A5. Po Klenow# reakcl se EooRI Ôtépi, Klenoví e m zpracovaný plasmid pPR12 DNA so reoirkulari2uje ligaoi zpúsoborr. v pcdstaté stojným, jako j® pop3áno v príkladu 3A2. Ligovaná DNA , ktorá konštituuje žádaný plasmid ^zpPR12ARl, se použlvá k tran.eformaoi E. coli K12 R.V3GS v podstát# stojným zpúsobem, jako je pcpsáno v pŕlkludu 3A3, aväak sebkce je založená na odolnosti tetracyklínu (5 pg/ml) nikoliv na odolnosti ampioilinu. E. coli K12 RV308 je dostupný v NRRL pod čislem NRRL. B-15624. Po identi f l.kaci transform&ntú ,E.col i K12 RV3O8/pPR12ÁRl se pripravuje pi 3.5mi tí pPR12ARl DNA z tr as f o rroantú v podstát# stejným z pús obem, jako je popsáno v príkladu 3Α1Ί.

Približné 10 pg plasmidu pPR12ARl se ôtôpi približné 50 jednotkami restrikôniho enzýmu Aval ve 200 μΐ stredné slaného pufru pri teploté 37 ‘C po dobu dvou hodín. Plasmid pPR12ÓRl DNA ätépený Aval se vysráži a zpracuje se ôinidlem Klenov; v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A5. Po Klenowô reakci se Aval Stôpený, Ôinidlem Klenow zpracovaný plasmid pPR12<oRl DNA ligatuje na EcoRI spojovníky (5'-GAGGAATTCCTC-3') v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A2. Po' legaoi spojovníku se DNA vysráži a pak se resuspenduje v približné 200 μΐ vysoce slaného pufru, obsahujioiho približné 50 jednotek restrikôního enzýmu EooRl. Získané, reakôni smés se inkubuje pri teploitô 37 ’C po dobu približné dvou hodin. Po EooRl ôtôpení se reakční smés vnes© na agarozový gel a približné 5,1 kb EooRl restrikôniho fragmentu se čisti v podstatô zpúsobem podie príkladu 3A6. Približné 5,1 kb EooRl reštrikční fragment reoirkularizuje ligaci v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A2. Ligatovaná DNA konštituuje žádaný plasmid pPR12ARl. Plasmid pPR12ARl se transformuje na E. coli K12 RV3O8 v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A3, pŕičemž je však selekoe založená na odolnosti teracyklinu a nikoliv na odolnosti ampicilinu. Po idsntifikaci E. coli K12 RV3O8/pPR12ARl tranformantú se pripraví plasmid pPR12ARl DNA v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A1.Reštrikční místo a funkční mapa plasmidu pPR12ARl je na obr. 11.

Príklad 3.A.9

Konstrukce E. coli K12 RV308/pL110

Približné 10 pg plasmidu pPR12ARl DNA se suspenduje v približné 200 μΐ vysoce slaného pufru, obsahujioiho približné 50 jednotek každého z rest.rtikônioh enzymú PstI a EcoRI a ôtôpici reakční smôs se inkubuje pri teploté 37 ’C po dobu približné dvou hodin. Restikční smés se pak vnese na agarozový gel a izoluje se približné 2,9 kb Pstl-EcoRl restrikôniho fragmentu a pripraví se pro ligaci v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A6.

ciho k odolnosti stojným zpúsobem, akoi se približné

Približné 10 μς plasmidu pL47 se štépi restrikônlmi enzymy PstI a BamHI ve 200 pl vysoce slaného pufru pri teploté 37 ’C po dobu dvou hodin.' PstI a BamHI ätôpená DNA sa vnes® na agarozový gel a izoluje se približné 2,7 kb Pstl-BamHI restrikčního fragmentu, který obsahuje počátek replikaoe a část génu, pŕisplvajiampioilinu a pripraví se pro ligaoi v podstatô jako je popsáno v príkladu 3A6. V oddôlené re10 μ$ plasmidu pL47 DNA ätôpi restrikčnimi enzymy EcoRI a BamHI v 200 pl vysoce slaného pufru pri teploté 37 ‘C po dobu dvou hodin a izoluje se približné 1,03 kb EcoRI a' BamHI reštrikční fragment, který obsahuje novou transkripčni a translační aktivační sekvenoi a EK-BGH kodujioi DNA a pripraví se pro ligaoi v podstaté stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A6. Približné 2 pg približné 1,03 kb EooRI a BamHI restrikčního fragmentmentu se použije pri konstrukci plasmidu pLUO.

Približné 2,7 kb Pstl-BamHI a približné 1,03 kb EooRI a BamHI restrikčnioh fregmentmentú plasmidu pLUO se ligátuje na približné 2,9 kb Pstl-EcoRI reštrikční fragment plasmidu pPR12ARl ke konstrukci plasmidu pLUO a ligatované DNA se použije k tránsformaci E. coli K12 RV3O8 v podstaté stejném zpúsobu, jako j© popsáno v príkladu 3A2 a 3A3, pŕičemž se však využívá odolnosti k tetracykiinu a nikoliv odolnosti k ampioilinu jakožto báze pro selekci transformantú.

Dvé PstI reštrikční enzymy rozpoznávací místa jsou v EK-BGH kodujioi oblasti, která neni vyznačená v restrikčnim mistu a na funkčnioh mapách na obr. Reštrikční místo a funkční mapa plasmidu pLUO je na obr. 12.

Príklad 3.A.10

Konstrukce E. coli K12 RV303/pL110C

Pŕiklad 3.A.10.a

Konstrukce E, coli K12 RV3O3/pLl10CÄ

Približné 1 pg plasmidu p'LllO DNA s© Štépi s restrikčnim enzyrasra Ndel ve 20 pl celkového objemu, obsahujiciho 2 pl 10X vyso-’ oe slaného pufru (1,0 M chloridu sodného, 0,50 M Tris-HCl, hod57 nota pH 7,5, 0,10 M chloridu horečnatého a 10 mM dithiothreito 1 u) a 3 jednotky Ndel enzýmu po dobu jedné hodiny pri teploté 37 ‘C. Reakční smés se extrahuje systómem fenol/ohloroform a DNA se vysráži ethanolem. Ndel étépený plasmid pLUO DNA se rozpustí V 50 μΐ IX Klenow pufru (40 mM fosforečnanu draselného, hodnota pH 7,5, 6,6 mM chloridu horečnatého, 1,0 mM 2-merkaptoethanolu, 33 μΜ dATP, 33 μΜ dCTP, 33 μΜ dGTP sa 33 μΜ TTP). Pŕidaji se 2 μΐ New England Biolabs) velkého fragmentu E. známé jakožto činidlo Klenow, a smial se smés se inkubuje pri teploté 16 ’C po dose ukončí extrakoi fenolem a DNA se čisti béžným zpúsobem. Ndel štépená, činidlem Klenow zpracovaná DNA se pak j iciatuje s T4 DNA ligasou pri teploté 4 ’C po dobu 16 hodin. Získaná DNA se použije k béžné transformaoi E. ooli 1(12 kmeň RV3O8 (NRRL B-15624). Transformanty se selektuj! na L-agarových destičkách, obsahujíclch 100 pg/ml ampicilinu a plasmidy se izoluji z resistentnioh kolonii zpúsobem rychlé alkalické extrakce, kterou popsali Birnboim a Doly. Selektuje se plasmid (pLUOA podie obr. 13) prostý místa Ndel.

(približné 10 jednotek, ooli PNA polymeraay I, s DNA a získaná reakční bu jedné hodinv. Reakoe

Príklad 3.A.10.b

Konstrukoe fágu pLUOB mistné špecifickou mutageneai

Protokol pro eliminaoi BamHl místa v génu udôlujíoim odoinost proti tetracyklínu pri mistné špecifické mutagenese je na pravé strané obr. 13.

Príklad 3.A.lO.bfi)

Konstrukoe fágu M13Tc3

Plasmid pLllO slouží jakožto zdroj génu dodávajioiho odolnosť proti tetracyklínu. Približné 50 pg plasmidu pLUO v 50 pl TE pufru se pridá do 25 μΐ 10X HindlII pufru a 170 μΐ vody. Približné 5 pl (približné 50 jednotek) restrikčniho enzýmu HindlII se pridá do roztoku plasmidu pLUO DNA a získaná reakční smés se inkubuje pri teploté 37 ’C po dobu dvou hodin. Približné 13 pl 2 M Tris-HCl, hodnota pH 7,4 a 5 μΐ (približné 50 jednotek) restri'kčniho enzýmu EcoRI se pridá do HindlI štôpeného plasmidu pLUO DNA a reakční smôs se inkubuje po dobu dvou dalôioh hodin pri teploté 37 ’C. Reakce se ukonči extrakoí reakční smési TE nasyoeným fenolem, načež se fenol odstráni chloroformovou extrakcí. EcoRI-HindlII štépený piasmid pLUO DNA se pak ziská vysráženim a odstŕedénim, vnese se na 1¾ agarozový gel a izolouje se velký, približné 4,3 kb EooRI-HindlII reštrikční fragment a čisti se.

Približné 5 pg fágu ml3mpl8 (New England Biolabs) se rozpustí v 50 pl TE pufru a pak se Stépí HindlII a EcoRI shora popsaným zpúsobem. HindlII - EooRI excizni fág M13mpl8 DNA se čistí zpúsobem popsaným pre pLUO š tou výjimkou, že se izoluje a čisti približné 7,25 bk reštrikční fragment.

Približné 100 nanogramú približné 4,3 kb HindlII - EooRI fragmentu plasmidu pLUO se srnísí s približné 100 nanogramy približné 7,25 kb HindlII - EcoRI fragmentu fágu M13mpl8, 2 pl 10X ligasovôho pufru, 1 pl (približné 100 jednotek) T4 DNA ligasy a 14 pl vody. Ligační reakce se inkubuje pri teploté 15 ’C po dobu 1,5 hodin. Ligatovaná DNA konštituuje žádaný fág ml3Tc3 DNA. Reštrikční misto a funkční mapa fágu ml3Tc3 je na obr. 13.

Jednoho ml pŕes noc pestované kultury E. ooli K12 JM109 (E. coli K12 JM101 od společnosti New England Biolabs se múže použlt misto E. coli K12 JM109) se používá k naočkování 50 ml živné púdy L a získaná kultura se inkubuje pri teploté 37 ”C za provzduôftování tak dlouho, až je 0,3 až 0,4. Buftky se resuspenduji ve 25 ml 10 mM chloridu sodného, inkubují sena ledu po dobu 10 minút a oddéll se odstŕedénim. Buftky se resuspenduji ve 1,15 ml 75 mM chloridu vápenatém. 200 pl podíl bunék se odstráni, pridá se do 1O pl ligatované DNA, shora pripravené, a inkubuje se na ledu po dobu približné 40 ruinut. Smés bunék a DNA se inkubuje pri teploté 42 ‘0 po dobu dvou minút a rúzné podily (1, 10 a 100 pl) se odstráni a pŕ'idají se do 3 ml horního agaru ( púda L s 0,5 % agaru se udržuje roztavená pri teploté 45 ‘C), který obsahuje také 50 pl 2% X-Gal, 50 pl 100 mM IPTG a 200 pl E. ooli K12 JM109 v logaritmické rústové fázi.Smés bunék a horního agaru se pak nanese na L-agarové destičky, obsahujici 40 mg/ml X-Gal (5-brom-4- . ohlor-3-indo1 y1-B-D-thiogalaktosid) a 0,1 mM IPTG (isopropyl-8-Dthiogalaktosid) a destičky se inkubuji pri teploté 37 ’C pŕes noo.

Následujici ráno se jednotlivé použivá nékterých proti modré čirých plaketek k naoôkování 2 ml živná púdy L a získané kultúry se inkubujl pri teploté 37 ’C za provzduäňováni po dobu dvou ť

hodin. Absence modré barvy naznačuje, že došlo k žádouoi inzeroi DNA. Potom se kul tury odstredí a pridá se 200 pl získaného super- ' natantu do XO ml kultur (O.D,- ) E, coli K12JM109 rostoucioh pri teploté 37 ’C za provzdušhováni. Tyto kul tury se.inkubuji.po dobu daláích 30 minút pri teploté 37 ’C. Potom se buftky peleti- ' zuji odstŕedénim a. používá se jioh pro prípravu replikaôni formy rekombinantniho fágu, který obsahují. Dvouŕetézcová replikaôni forma fágu DNA se izoluje z bunék za použití obrácené verz'e zpúsobu podie príkladu 1. Transformanty, obsahujioi fág M13Tc3 DNA,, se identifikují reštrikční enzymóvou analýzou jejloh fágu DNA.

Pri klad 3.A.10.B(ii) ;

Príprava fágu m!3Tc3 DNA s jednoduchým ŕetôzcem

Odstredí se 1,5 ml pŕes noc pôstovanó kuitury É. coli K12 • í

JM109/ml3Tc3 a 1200 pl supernatantu, obsahujlcího fág ml3Tc3, ,se použije naočkováni 25 ml kuitury E. coli K12JM1O9 pri O. D. ,óc- \ približné 0,4 až 0,5. Kultura se inkubuje po dobu 6 hodin/ pfi j‘ teploté 37 ’C za provzduäňováni, odstredí se a získaný superna*- ; tant·, približné 20 ml, so prenose do nové žkumavky. Pribi i žné 2 \ ' ¹ \ *\·. í' ¹ ml roztoku, obsahujiciho .20 % po 1yethylenglyko 1 u (PEG) 6000 \\ <

a 14,6 % chloridu sodného, se pridá do supernatantu, který/se pak' inkubuje po dobu 20 minút. / \

Supernatant se odstŕeduje po dobu 25 minút pri počtu otáček ' \

7000/min a získaná peleta, která obsahuje fág ml3Tc3 DNA.s jedno-i duchým ŕetôzcem, se resuspenduje v 500 pl TE pufru. DNA roztok se’ extrahuje dvakrát TE-nasyoeným fenoiem a dvakrát chloroformem.

' . · 1.

DNA s jednoduchým ŕetôzcem se pak vysráži zá použití' octanu sod-· ného a ethanolu a odstredí se, Získaná peleta se promyje 70% eťp.. hanolem, vysuái se a pak se rozpustí v 60 pl vody. ' i ' ' 1 ' ,

Príklad 3.A.lO.b(iii) . ;

Mutagenese · - ^v

Fragment DNA s jednoduchým ŕetôzcem, používaný v mutagéne- ’ >, ! ' : ^;· 1' ' : . '. · , · ' · .

•si 39 syntetizuje na automatickom systetizeru DNA. Fragment má sekvenoi 5 ' •-CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGÄ-S' (sekv. ID čislo 11) a je homologický k oblasti obklupujíoi BamHI polohu (5 -GGATCC-3') v génu pŕispivajíoim k odolnosti proti tetracyklínu plasmidu pBR322 a tou výjlmkou, že A zbytek druhý od zakončení 5' (nebo tretí od zakončení 3') je C v plasmidu pBR322. Tato obména neméní aminokyselinové složení bílkoviny prispívajici k odolnosti proti tetracyklínu, eliminuje však místo BamHI.

Približné 10 pikomoí mutagenního primeru a H13 univerzálni primér (Bethesda Research· Laboratories (BRL)), P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20760) se individuálni zpraoovávaji 10 jednotkami (BRL) T4 po 1ynuk1eotidkinasy ve 2o pl IX kinasovóho pufru (60 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 15 mM 2-merkaptoethano1 u, 10 mM chloridu horečnatého a 0,41 pM ATP) po dobu 30 minút pri teploté 37 ‘'C, Kinasou zpz'aoovaných DNA se použivá v dále popsaném procesu mutagenese.

Teplotní hybridizační reakoe se provádi vzájemným mišenim 300 nanogramú (1,2 pl) fágu mi3Tc3 s jednoduchým ŕetézcem, 1 pikomoí (2 pl ) univerzáiníhc primeru, i plkomol (2 pl) mutagenního primeru, 2 pl 10X pufru pro teplotní hydridizaci (100 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA a 500 mM chloridu sodného) a 12,8 pl vody. Reakční smés se inkubuje pri teploté 80 “C po dobu dvou minút, pri teploté 50 C po dobu 5 minút a pak se nechá ochiadit na teplotu mistnosti.

Exfenzni reakce se provádi pŕidáním 5 pl 10X extenzniho pufru (500 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0, 1 mM EDTA a 120 mM chloridu horečnatého), 5 pl 2 mM dATP, 1 pl roztoku 6 mM v kaádém dGTP, TTP & dCTP; 1 pl približné 2 jednotky, Pharmaoia P-L Bioohemicals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08854) enzýmu Klenow, i pl (100 jednotek) T4 DNA ligasy a 17 pi vody do smési tepelné hybrídované DNA. Extenznl reakční smés se inkubuje pri teploté mistnosti po dobu jedné hodiny, pak pri teploté 37 “C po dobu 2,5 hodín a pak pŕes noc pri teploté 4 ^äC.

Reak.ee se ukonči dvéma extrakcemi TE-nasyoeným fenolem a následnými dvéma extrakcemi chloroformom. DNA se vysráži etha nolem a octanem sodným. DNA se odéii odstŕedénim a resuspend'· \

v 50 μΐ vody a 6 μΐ 10X SI pufru se pak pridá do roztoku DNA.

Roztok DNA se rozdéii do tri zkumavek. Pridá se približné 200 jednotek (Miles Laboratories) SI nukieasy do dvou zkumavek. Jedna 31 reakční smés se inkubuje pri teploté místnosti po dobu 5 minút, druhá po dobu 1O minút. Reakce se ukonči ©xtrakcí reakční smési dvakrát TE-nasyceným fenolem. Po fenolovýoh extrakcích následují dvé extrakoe chloroformom. Pak se DNA vysráži z reakôni smési ootanem sodným a ethanoiem. Nezpracovaný vzorek DNA slouži jako negatívni kontrola. Si zpracovanó vzorky se udržujl od sebe oddlélené po dobu zbylé procedúry, poskytují však podobné výsledkyDNA pelety se resuspenduji ve 20 μΐ vody a 10 μΐ získaného roztoku se použije k transf crrnaci E. coli K12 JM109 (múže se však rovné* použit E. coli K12 JM101) v souhlase s postupem používaným pri konstrukoi fágu ml3Tc-3, pŕičemž se však na destiôky nepŕidává •ani IPT7.G sni X—Gal .

Replíkativni forma DNA s dvojím ŕetôzcem z približné 48 plakete!; se izoluje shora popsaným zpúsobem a zkoumá se na prítomnosť BamHI restrikôniho mista. Izoláty bez BamHI mista se dále trieli pri pŕipravé DNA s jednoduchým ŕetôzcem, jak shora popsáno. DNA s jednoduchým ŕetôzcem se sekvencuje za použití di-deoxysekvimírilho zpúsobu (J.H. Smith, 1960, Methods in Enzymology 65: str. 560 až 580). Žádaný izciát se označuje jako pLUOB (obr. 13).

Príklad 3.A.10.c

Konstrukce plasmidu pLUOC

Približné 50 μ% replikaôní formy fágu pLUOB DNA se ätépl ve- 250 μϊ IX NheI pufru (50 mM chloridu sodného, 6 mM Tris-HCl,. hodnota pH 7,5, 6 mM chloridu horečnatého a 6 mM 2-mekaptoethanolu) obsahujioiho približné 50 jednotek NheI restrikôniho enzýmu pri teploté 37 *C po dobu dvou hodín. Pak se pridá 5 μΐ 5M chloridu sodného do NheI ätépeného fágu pLUOB DNA, naôež se pridá 5 μΐ (približné 50 jednotek) Sali restrikôniho enzýmu. Štépeni se provádi po dobu dvou hodin pri teploté 37 ’C. Žádaný pribiižnô

422 bp NheI - Sali fragment, obsahujici mutátovaná oblast génu zpúsobujiciho odolnosť proti tetracyklínu, se pak izoluje z akrylamidováho gélu o sobé známym zpúsobem v oboru.

Pxacmiú pLUOA DNA se átépi NheI a Sali za identických p·; iruxnek s tou výjimkou, že plasmíd pLUOA se nahrazuje pro fág pLilOb. Približné 6,1 kb NheI - 3A1I reštrikční fragment plasmidu pLUOA se Čistí od agarozy.

á U e. n ý pla&mid pLiJ.CC ss konštruuje ligaol spolu se 100 nancgi &rny každého z NheI ·· Sali kb) fc pillOB (.približné 422 2 p i·, s o b u . Pestri k č n i mi s t o fragment ú pLUOA (približné 6,1 bp) za použití o sobé známýoh a i.unkční mapa plasmidu pLUOC je na obr. 13. Zadaný pl&smid pLUOC dodává odolnosť proti tetracyklínu 10 pg/nu tetracyklínu v E. coli avžak BamHI misto v génu, dodávajíclm odolnosť proti tetracyklínu, chybí.

Pri klad 3. A..11

Konstrukoe plasmidu pCZRill

Piasmid pLUOC obsahuje jednoduchá Clai reštrikční misto, které se odstráni v prúbehu nás 1edujicich reakoi. Približné 1 pg plasmidu pLUOC ae étépí s Clai v podstaté zpúsobem podie príkladu 3A2 s tou výjimkou, že se použije restrikčního enzýmu Clai a 10X puťru. (500 mM chloridu sodného. 100 mM Tris-HCl , hodnota pH 7,9 & 100 mM chloridu horečnatého). Clai ätépená DNA se pak zpracovává ôinidlem Klenow v podstatô zpúsobem, který je popsán v pŕíkiadu 3A5 jediné s tou výjimkou, že ' ae pridá jediné dCTP misto vše ch čtyr dNTP.

DNA se pak vysráží a resuspenduje s© v 50 μΙ Mung Bean nukleasuvénc pufru (50 mM octanu sodného, hodnota pH 5,0, 30 mM chloridu sodného a 1 mM síranu z ineftnatého). Pridá se jedna jednotka Mung .Bean nukleasy (obchodné dostupné od New England Biolabs) a reakční smés se inkubuje pri teplotô . 30.‘C po dobu 30 minút. Skúmavka se pak urnísti do ledu a pridá se chlorid sodný do 0,2 M a smés se pak extrahuje systémem f’eno 1 /chloroform, vysráží se ethanoiem a resuspenduje se v 10 mM Tris-HCl (hodnota pH 8,0). DNA se pak spontánné ligatuje a transformuje do bunék E. coli v pocistaté zpúsobem podie príkladu 3A3 ä 3A4. Výsledný plasmid .se o z η a Č u je j ak o p1 a smid pC ZR111

Príklad 3.A.12

K o n a t r u k o & p i a s m i d u p C 2 R12 6 S

Približné 26 pg plasmidu pCZRlll se štépi pftsobením Xbal náá i e duj í o í m spúsobam. 1OX Xbal puŕr, sestává z 600 mM Tris-HCl, 100 mM chloridu, horečnatého, IM chloridu sodného a 10 mM 2-merkaptoethano.lu, hodnota pH 7,5 (a má teplotu 37 ’C). 50 pl 10X Xbal pufru, 15 pl Xbaľ (10 J(pl) a 185 pl vody se pridá do 250 pl vody obsahujíoí približné 25 pg plasmidu pCZRlll. Štépení ?e p.vovádí. pri teploté 37 ’C po dobu jedné hodiny. Xbal Mt-épený pCZRlll s·:- pak extrahuje fenolem. pridá se 1/10 objemu 3M octanu sodného, a 3 objemy ethanolu. Srnés s? inkubujs v lézni suchého ledu a?tba.no 1 u po dobu 5 minút a pak ss odstredí. Vysvätená DNA se re-: usper.duje v 50 pl vody,

Xbal Žtépaný plasmid zpôsctem: 0,2 pl BamHI ílC pCZRlll se J//.;l), 10

Tris-HCl, 50 mM chloridu horečnatého, 1 M chloridu sodného a 10 mM 2-merkapotoethano 1 u, hodnota pH R,O, o teploté 37 ’C a 90 pl, vody s··: pridá do, 50 p] Xbal. étépenéhc· pLUO, získaného, jak shora uvedeno. Štépení se provádi po dobu 5 minút pri teploté 37 ’C.

se extrahuje do fenolu a pridá se 1/10 objemu a pak 3 objemy ethanolu.. vysrážená DNA se resuapendujs· v 50 pl 10 mM Trio. 1 mM EDTA, hodnota pH 8,0.

Xbal a BamHI Stépený pCZRlll s? pak vnes© na agaresový gel a iroluje s e DNA pás pfí približné 5,8 kb. Plasmid pCZR126S se produk¹'jt> 1 igaci p/ihl ižr-é 5.3 kb

Ndc-ľ spojovník =;. syntetický gen horrnon, který obsahuje Mdeľ míst-; na zakončení .5' a BamHI místo na z e. k o n č e r. i 3’ .Xbal až Ndel sekvenoe c® produkuj© za použití s+?.nd.a>.':!ní o 1 igonukl eoti dr ví xekvenčni metodiky a sesévá z náís 1 e du j í o í oh sskvoncí. (pozitívni ŕetézec: sekv, ID číslo 12, negatívni ŕetézec = sekv. ID číslo 13).

átôpí BamHI. následujíoím pl BamHI pufru (100 mM

Stépená pCZRlll octanu sodného fragmentu pCZRlll na Xbal na kodujioi EKm hovézi rástový

5’ CTAGAGGGTATTAATAATGTATAlTGATTrTAATAAGGAGGAATAATCA 3'

11111 111 11111 I 11111 11 11 11 I 11 111 11 111 I 111 11 I M

TCCCATAAITATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTAGTAT 5

Uvedené sekvence se konštruuje chemickou syntézou obou ŕe tézcú a mišenim k umožnéni hydridizace. Gen, zakodujici EK bGH se konštruuje z 16 chemnicky syntetizovaných kusú DNA s jednoduchým ŕetôzcem o délce 71 až 83 nukleotidú, které zahrnuji dohromady oba komplementárni ŕetčzce celého génu. Jeho syntéza se provádi za použití zaŕízeni Applied Biosystems (ABS) a sestává z následujici sekvence (sekv. ID číslo 2 a 3).

' TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCIT I I I I I I I I I I I | I I I I I | I I I I I I I Π I | | | I | I I I f | | I | | | ACAAGGGTTkACCTACTACTÄGTATTCAAGGGTCGGTACAGGAA

GTCCGGCCTGirTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I | I I I I H I | | I H | | | | | | | | | | | CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACT

GACCTTCAAAGAG1TTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGÄTACTCCATCCAGAA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 11 I I I I I I 11 I I I I I I I 11 I I 11 11 I I I I I I 11 11 11 I GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATCTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTT

CACCCÄGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCG

CCAGCAGAAATCAGACITGGAGCTGCTTCX3CATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I | I | | | I | I | I 11111111111111111 I I I I I I I I I GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACOAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGA

TCGGCCCCľTCGAGTTCCTCAGCAGAGTC'rrCACCTkACAGCTrGGTGTrrGGCACCTCGGA

II N H I H llllll HIHI HIHI II llll HIHI III II llll II III |||| |||

ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCT

CCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT I I I I I I I I I I I 11 11 I 11 I I I 11 1111 I I 11 I I I 11 11 I I I I I I I 11 I I I I I 11 I I I I I I GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGA

GGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC

I I I 11 I I 11 I I I I I I I I 11 11 I 11 11 I I I 11 I I 11 I I I I I I 1111 I 11 11 I I I I I I I 11 I CCTTCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTG

AAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCľGGAA

IIIII1111 f IIIIIllll II í 111 llllll IIIII m llllll llllll llllll III

TTTGTACX3CGTCACTGCTGXľGCGACGAGTTCTrGATGCCAGACG7U3AGGACGAAGGCCTr

GGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC

Ί 11111111 111111111111 111111111111 111111111III 111111111111111 CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTAC1^rrCACGGCGGCGM GCCCCTCCG

CAGCTGTGCCTTCTAG 3'

1.1 I I I I I I I I I I I I I I GTCGACACGGAAGATCCTAG 5’

Konstrukce plasmidu pCZR12óS_ ae provádí ligaci následujicioh 3iožek približné 0,28 pg 5,8 fragmentu, získaného z plasmidu pLllO po kompletnim štépeni s Xbal a parciálnim štépeni 3 BamHI v oelkovém objemu 2 pl, približné 0,18 pg syntetický gen ltodujioiho derivátu hovôziho rústového faktoru, který mé 5' zakončení odpovídajíci Xbal místu a 3' zakončení odpovídající BamHI mistu v ceikovóm objemu 2,5 pi, 8,75 pikomol chemicky syntetizovaného Xbal na Ndel spojovník v 1 pi . Piasmidové sic-žky se vnesou do 6 pi 5x ligačniho pufru: 250 mM Tris-HCl, 50 mM chloridu horečnatého, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25¾ (objem/objem) po 1yethylenglyko1 u 8000, hodnota pH 7,6, 2 pl iigasy a 16,5 pl vody. Ligační smôs se inkubuje pŕes noc pri teploté 16 ⁴C. Cirkularizovsný plasmid pCZR126S se pak použivé ke transformaoi buriék E. coli RV3O8 v podstatô stejným zpúsobem, jako je popsáno v príkladu 3A3. reštrikční místo a funkční mapa plasmidu pCZR126S je na obr. 14.

Príklad 4

Konstrukce plasmidu pRB182

Približné 20 pg piasmidu ρΕΒΙΘΙ, pripraveného zpúsobem podlo príkladu 2, se suspenduje ve 20 pi 10X Ndel pufru, 5 pl Ndel restrikčniho enzýmu (Boehringer-Mannheim, 40 jednotek), 175 pl vody, mirné se míchá a inkubuje se pri teploté 37 ^:C po dobu jedno hodiny. Pak se do reakční stnési pridá 4 pi BamHI restrikčniho enzýmu (Boehringer-Mannheim, 40 jednotek) a' inkubuje se pri teploté 37 ^JC po dobu daläíoh dvou hodin. DNA se vysráží tŕemi objemy ethanolu a O,3M octanu sodného a provede se elektroforeza na 1,2% agarozovém gélu o nízkó teploté tánl. Menši (približné 265 bp) Ndel/BamHI reštrikční fragment, zakodujíci ACB lidský proinzulinový gen, 3Θ odŕizne od gélu a DNA se ziská vedením sloupoem Eiutíp-d zpôsobern, popsaným v príkladu so DNA ukládá v 25 pl 10 mM Tris-HCl, o

Približné 15 pg piasmidu pCZR126S (jehož konstrukce je ahora uvedená v príkladu 3) se suspenduje ve 20 pl 10X Ndel pufru, 5 pl Ndel restrikčniho enzýmu (40 jednotek) a 175 pl vody, mirné se michá a inkubuje se pri teploté 37 ⁴C po dobu dvou hodin. Po in2, Po vysráženi a usušení hodnoté pH 8,0.

kubaoi se DNA vysráži tŕerni objemy ethanolu, jak ahora uvedeno, vysuš! se a resusponduje se ve 20 μϊ 10X BamHI pufru, 2,5 μϊ BamHT. re 3 ti? i kčn i ho enzýmu (25 jednotek) a 17Θ μϊ vody. Mirné se mi e há a pak se reakční smôa iiikubuje pri teploté 37 ‘C po dobu dvou hodín. PNA se opét vysráži tromi objemy ethanolu a podrobí se elektroťoreze na 1% agarczováru gélu o nizké teplotô táni. Vétfragment. odpovidajici vektoru DNA 30 odŕízne od thototo gélu x DNA se zlská na slupcí Elutlp-d zpúaobem, popaaným v príkladu

2. Po vysráženi a usušení so vektor DNA uklôdá pri teplotô 4 “C v 35 μϊ 10 mM Tris-HCl o hodnotô pH 8,0.

Približné 2,5 μϊ vektoru DNA se srolchá s 12 μϊ Čiéténého ACB-proinzulinového génového fragmentu, jak shora uvedeno, 4 μΐ 10 inN ATF, 0,5 μϊ 2M di thí o thre i to l u, 5 μΐ 10X iigasového pufru (500 míl Tris-HCl, hodnota píl 7,6, 100 raM chloridu horečnatého), μϊ vody a 0,5 μϊ. T4 ΕΝΑ iigasy (Pharmacia, Ono., Θ00 Centennií .Avenue , Pisoataway, N. J. 08854, 3,5 jednotek) . Reakční smôs se ínkubuje pri teplotô 4 ’C pc dobu 16 hodín. Ligatovaná smôs se zŕedi 60 pi 1.0 mM Tris-HCl (hodnota pH 7,6) a 3 μϊ IM chloridu sodného e mís 1ednô se transformuje do E. coli K12 RV3O8 zp&sobem podie shora uvedeného príkladu 3Λ3. Buftky se nanesou na agarové doštičky dopi nôr,é 5 pg/mi tetracyklínu a inkubuji se pras noc pri f i'í p 1 c v 1 3 2 C.

označuje jako

PI a sbi i. d y s 3 rnL kul tur se izoluj! z kolonii odolných tetracyklínu zpGsoterr, ryohlé alkalické .extrakoe, .popsané v Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982). vydal ''Maniatis T., Fritsch E.F. a S s rob r o o k )., Cold d pri n g Harbor Publ loations, New York,str. 368 ?,*. 367. Ft t temnos k správného lidského ACB-proinzul inového génové h; fragmentu se stanovuje minitMdioí operaoi, ktorou popsal Bi r n bo í m H.C., Edo 3. y J. (1979) hucioic Aoids Res . 1, str. 1513 až 1523. za použití, polnkryiarnidové golovď elektroforesy k analýze XbaT/BditiHX stopeného fragmentu. Tylo plasmidové inzertv se správnym rozmčrem (približne 314 bp) se sel&ktuji zesllením a Ôiäténim. Expresní plasmíd obsahujicí lidský ACB proinzulinový gen se pRB182, Reštrikční misto a funkční mapa plasmidu pRB182 je na obr. 20.

Príklad 5

Femeniace

Prevozní výroba bunák pro extrakci a číôtôni rekombinantniho ACB-proinzulinu ae provádi za použití BioFlo stolní fermentaôni nádoby (obchodné dostupné u společnosti New Brunswick Scientifio Co., Inc. P.O.Box 986, 44 Talmadgs Road, Edison, NJ 08817). Naočkovávé se 5 litrú 2X TY púdy, obsahujici 5 pg/ml tetracyklínu (získano u společnosti Sigma Chemical Co.) plus 1,0 ml protipôniciho prostŕedku SAG 5693 (obchodné dostupného u společnosti Union Carbide, Specialty Chemical Division, Danbury, CT 06817-0001) za použití 100 ml bakteriálni kultury E. coli K12 RV 308 bunék, obsahuj íci piasmid pRB182 a nechá se rúst pŕes noo pri teploté 30 ‘C, Buŕiky se nechaj! rúst pri teploté 32 ’C až do konce exponenciálni rústové fáze. Pak 3e pŕidaji glukóza a aminokyseliny do konoentrace 0,2% a 0,1% a teplote se zvýši na 42 “C k navození syntézy biikoviny. Buŕiky se ziskaji z rfistového prostredí dvé hodiny po navození odstŕedováním pri 500 g po dobu 10 minút pri teplotu 4 ^;C. Supernatant se vyhodí a peleta se promyje jednou ledové chladným TE puŕrem (10 mM tris-HCl, hodnota pH 8,0, 1 mM EDTA).

Exprese a akumuiace ACB-PI se stanoví zviditeinénim celkové bunôčrié biikoviny s následným oddôlenim do 10 až 20% polyakrylamidovóho gélu zpúsobem, který popsal Laemmli, U.K. (1970) Náture (London), 227, str. 680 až 685. Provede se^lyze peletizovanýoh bunék pŕidánim modifikovaného vzorku pufru (0,125 M Tris-HCl, hodnota pH 6,8, 2% SDS, 30% glycerol, IM 2-merkaptoethano1 5M močovina) a vari ae po dobu 5 minút. Pásy se zjiôťují zabarvením modri Coomassle Blue kvantitativním sejmutím.

Špecifická identifikace ACB-proinzulinu se stanoví analýzou Western Bloť’ v podstaté jak popisuje Johnson D.A. a kol. (1984) Gene Anál. Techn., svazek 1, str. 3 až 8 za použití koziho anti-HPl, činmž se zjisti C-peptid, načež se pridá biotinylovaná druhá antilátka ( oslí antikozi IgG) a zviditelni se s -bllkovinovou detekční soupravou Vectastain (obchodné dostupná u spoleônosti Vector Laboratories, Inc., 30 Ingold Rd., Burlingam, CA

- 68 \

94010^ v podstatô podie návodu prodejoe.

Príklad 6

Čišténí a charakterizace rDMA ACB-proinzulinu

Suspenduje se 43,5 g bunék E.coli (mokrá hmotnost) v 400 ml mM Tris-HCl, hodnota pH 7,6, obsahujioim 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% sacharózu a ÍOO pg/ml lysozymu. Smés se intenzivné míchá pri teploté miatnosti po dobu 1,5 hodin (približné 25 'C), chladí so na ledu po dobu 30 minút a buftky se rozruší púsobenim zvuku. Granule se oddéií odstŕedovánim pri 200 g pri teploté 4 ^!C po dobu jedná hodiny. Granule se potom promyji 20 mM Tris-HCl, IM chloridu sodného, hodnota pH 7,6. Granule se rozpusti za mioháni ve 200 mi 20 mM Tris-HCl, 8 M guanidin-HCl, hodnota pH 8,C. Pak s© pridá 7 g slŕíčítanu sodného a 5 g Na^SuOs, a roztok se miohá po dobu tri hodin pri teploté místnosti. Po odstŕedéni se supernatant dialyzuje za použití 1000 MWCO dlalyzačniho vaku (obchodné dostupný u společnosti Spectrum Medioal Industries, Inc. Los Angel es, CA 90060) proti tŕem zménám 2 1 i trú 10 mM octanu amonnáho, hodnota pH 7,4. Vzniklá sraženina se oddélí odstŕedovánim pri 2200 g pri teploté 40 ’C po dobu jedná hodiny. Supernstčint se okyselí na. hodnotu pH 3,6 6 N kyselinou chlorovodíkovou s vytvorená sraženina se shromáždí a pridá, se do sraŽenlny z din1 y z á t u .

Príklad 7

Číáténí ACB-proinzulin-S-sui fonátu

Paleta, získaná zpúsobem podie príkladu 6, obsahujíci

ACB-proinzulin-S-3ulfonát, se rozpusti ve 20 mM Tris-HCl, 7,5 M močoviny, hodnota pH 7,6 a vnese se na sloupec Mono Q HR 10/10 (obchodné dostupný u společnosti Pharmacia LKB Bioteohnology, 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854). Sloupeo se e.luujo rýchlosti 0,5/min za použití 760 minútového gradientu 0,05 až 0,2 M chloridu sodného obsahujioiho 20 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,6, 7,5 M močoviny. Frakce se analyzuji RP-HPLC za použití gradientu systému 30 až 42 % CH₃CN do 0,1 M monohydrogenfosforeô69 n a n u amenného, hodnota pH O, 3.5 ml/min na 0,46 x 25 om sloupci

Λ,

Zorbax C8 (obchodné dostupný u spoločnosti DuPont, Wílmington, DE 19808). pŕičemž se udržuje teplota 45 ‘C.. RP-HPLC separB.ee se •provádi :a použití Rainin HP reverzní fázové HPLC aparatúry (obchodné dostupná u společnosti Rainin Instruments., Woburn, MA 01601). Na základé anaiyzy obsahu frakcí RP-HPLC se shromáždi dva fondy odpovid sjioi ACB-proinzu1 in-S-sulfonátu Monoo Q sloupoe a odsotí se na sloupci Zorbax 06 použitím RP-HPLC za použití gradientu 30 až 35 % CH.?CN do 0.1 M hydrogenuhličitanu amónného, hodnota pH 8.0, zmrazí s'e v kapalném dusíku a lyofilizuje se.

Rŕiklad 3

Konverze ACB-proinzul insu.lfonátu ne ACB-pro inzul in

ACB-proinzul irisul fonátový lyofilizét, pripravený podie príkladu 7, se rozpustí v 50 mM glycínu, hodnota pH 10,5, pri teploté 4 'c: ua koncantraci približné 0,2 mg/ml. Do tohoto roztoku se pridaj 1 dva akvivalanty oysteín-HCl. Nechá se štát po dobu tri dr.ô pŕičemž se ACB-proinzuli n vytvorí v približné 75% výtéžku.

Bi i k c .vinový roztok se pak okyselí kyselinou octovou na hodnotí., pH 2,0, vnese se nn s 1 o «pec RP-HPLC 2,2 x 25 cm Vydac C,18 ĺ: beh·., d fič d·:,? tupný u společnosti The Seperations Group, Hespéria, CA 9 234 5) a sluu jo se ísoktratu okým pufrem 0,1% tri f1uorootová k y s a i na v systému H;O:CH;CH (7?, : :>β) ζε 1,5 ml/min. Frakoe, obenhujíci žádaný materiál. se shremáždi RP-HPLC do fondu, zmrazí se v hepu í n -5 m dusíku a lyofíllzujt .

Pl 1 h ' a i '?

Stanovaní párú disulfidiokých azeb v ACB-proinzulinu

250 mg bilkoviny se 'rozpusti v 250 ml 0,05 hydrogenuhličitanu amonného, hodnota pH 9,0. Pridá se 25 /.tl 0.1 mg/ml roztoku vepŕcvahc trypsinu (obchodné dostupný u spoločnosti Sigma Chemical Cc., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) ve vodé a inkubuje se za át&peni po dobu dvou hodín pri teploté 25 'C. Toto trypsinové Stôpani, které uvolftuje N-zakončení ŕetézoe B, se ukonči pŕidáním 280 μϊ O,1 N kyseliny chlorovodíkové. Pak se pridá 25 μ'ί 0,1 mg/ml roztoku pepsinu (obchodné dostupného od spoleônosti Bo e'-it i n g e r-Hannb í im Biochemioal , 'P.O.Box 50816, Indianopolis, Indiána 46230) v o.oi N kyseliné chlorovodíková'. · Štôpioi smés se inkubuje po dobu 22 hodin pri teploté 25 ‘C, pŕiÓemŽ se átépení ukončí pŕidáním 25 μϊ 0,1 mg/ml roztoku pepatatinu (obchodné· dos* tupný u spoleônosti Sigma Chemical Co.) v 10¾ kyselIné octové a

900 u! vody, Reakční swiéa se pak vnese na 4,6 x 450 mm sloupeo • Zjťbax CO, udržo.vaný na teploté 45 ’C, který je vyvážený 0,1 ľl fosforečnanom sodným, hodnota · pH ‘2,1, 1 ml/mi n a peptidy se eluuji iineárrilm gradientem 15 až 30 % methy í kyanidu ve výchozim pufru. Vétši e i učni pík p? i 25 -¾ methy i kyanidu, se shrornáždi, zŕeii ž.;· vodou, odaol í s& na Sep-Pak patroné (obchodné dostupná u spc-íečnosti Wators) a iyoŕiiizuje se. ShromáŽdéný materiál se pak ‘Analyzuje ami nokysel i novo u analýzou na analyzátoru Model 6300 t obchodné dostupný o. spoleônosti Beokmar» Instruments, Fulior ton, CA 92634j .

Uspoŕádáni disul fidickýoh vazeb ACB-proinzul iná ae potvrzuje trypsin/pepsínovým ätépenim molekúl a následnou HPLC analýzou, jak popisuje Terén. P a kol., í 198-3) Anál Bioohem.,,roôník 169, ⁴ str. 2G7 až 299.

Príklad 10 f

Transtcrmaoe ACB-prolnzuiinu na lidský inzulín

Zpracovává se 1,03 mg ACB-proinzulinu 1 pg trypsinu (spola Čnosti Sigma Chemical CO) a 10 μ$ karboxypeptidasy B (Lilly, vyôiiíténá z vopŕového pankreas i ve 2 ml hydrogenuhliôitanu amorinóhb hodnota pH Q, 3, po dobu 23 hodin pri teplotô 23 ’C. Roakoe j pak ukončí pŕidáním '2,0 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkové a vzorek se vnese vs formé dvou 2 ml vstŕikú na sloupeo Vydao C18 (obchodné dostupný u spoločnosti The Separations Group, Hesperia, CA 92345), vyvážený 0,1¾ vodnou trifiuorootovou kyselinou pri udržovaní teploty 45 - c a eluuje .se gradientovým programom po dobu 5 minút 17 až 26,25%, po dobu 5 minút 26,23 až 31,25% a po dobu 35 minút 31,25 až 42,5% methylkyamidem clo 0,1% vodné kyseliny

- 71 tr1 f1uoroctové rýchlosti 1 ml/min. Eluované peptidy se shromáždi a analyzuji se FAB-MS, aminokysel(novou analýzou a v pŕipadô inzulin obsahujicího piku .biologickou analýzou a, mapováním peptidu.

f

Príklad 11

Biologická analýza ACB-proinzulinu

Inzulínová a IGF-I zkcučka receptorovóho vázáni za použití lidské placentální membrány se provádi v podstatô zpftsobem, který ;

pcpsai Grappuso P.A. a kol. (1988) J. Clín. Endocrinol. Metab., í ročník 67, str. 194 až 197 s tou výjimkou, že se inkubace provádi pri teplotô 4 “C po dobu 18 hodín s membrány se shromáždi na jednote© Ske.tron C-ell Hsrvester (obchodné dostupné u spoločnosti ί l

Skatron, Inc., Šterling. VA) . Provádi se zkouška transportu glú- , ¹ .! kozy v krysích adipooytsoh v podstaté zpúsobem, který popsal Kas- J 1 i hwagi M. a kol., (1903), J. Clín. Invest. , ročník 72, str. 1246 -..;\;.f až 1254. .

In vivo účlnnost ACB-proinzulinu se stanoví na vyhladovô1ých i krysách. Sameôek hubené krysy Sprague-Dawley (dostupný u společ- ·, nosti Charles River Laboratories, Wilmington, MA 01887) o tôlesné t . h hmotnosti 190 až 210 g se nechá bez potravy 16 hodín; Náhodné,se · vôli 10 zvíŕat a rozdélí se do dvou skupín po péti krysách. Kontrolní skupine se subkutannô vstŕikne fysiologický. roztok (0,1 ml ne 100 g tôlesné hmotnosti) zytimco experimentálni skupinô se vstŕikne tentýž slaný roztok obsahujici zkouäený peptid. Odebere se krev (0,1 ml) z ooasu každé krysy pro stanovení obsahu glukózy (Sigma Diagncstics, gluoose [Trinder], adress) pred podáním peptidu a potom 30 minút, 1, 2, 3 a 4 hodiny po podání peptidu. k

Výpočte se strední procentová 2ména od chvíle nula plus nebo mínus S.E.M. krevni glukózy u kontrolní skupiny a oäetŕné skupiny ' krýs a konečná výsledky se vyjádŕi podlo zmôn u experimentálni a j kontrolní skupiny. Stanovuje se púsobeni 5 až 7 rúzných dévek. '

Sekvenční pŕehled _r;_s :

(1) Obecná informace: . · .

- 72 (i) Autori: Beiagaje, Rama M

BiMarchi, Richard D.

Heath, Wi 1 i i strň F Long, Harian D (ii) Názov vynálezu: Polypeptid, zpúsob jeho prípravy, farmaceutický prostŕedek, který ho. obsahuje'¹ a jeho -použití jakožto mezi produktu pro prípravu inzulínu (iii) Počet sekvencl: 13

Adresa:
(A)	Název	: Eli Lilly and Company
(B)	u 1 i. c e	: Lilly Corporate Center
(C)	mésto	: Indianopo1 ís
(D)	štát:	Indiane
(E)	zem:	USA
(F)	ZIP:	46285

(v) údaje pro počítač (A) typ média:floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C,) operační systém: PC-POS/MS-DOS i D) Software: Paterrtln release # 1,0, verše #1,25 (vi) Údaje pro prihlášku, vynálezu (A) čisto prihlášky vynálezu (B; dátum podáni (C) zatŕidéni (vili) Údaje zástupe* (A) jméno: Conrad William A (B) registrační číslo . 32.039

CO číslo : X-78866 (ix) te 1 ekomi nukační. spojení fA( telefón: 317-276-6013 (2) Informace pre sekv, ID čislo: 1 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 86 aminokyselín (B) typ: aminokyselina \ .

(C) ŕetôzce: jednoduchý (D) topologie: lineárni (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID čislo 1

Gly íle val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyŕ Glii Leu 1 5 10 .15,

Glu Asn Tyr Cys Asn Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin 20 25 30

Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro_;Leu Ala; 35 , 40 45 .

” . ·· --''I

Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu. Cys Gly

55 60

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe,

65	70	7 5	' .80
Phe	Tyr Thr Pro Lys Thr 85
(2)	Informace pro sekv. ID číslo: 2

(i) sekvenční charakteristiky (A) dólka: 278 párú bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) ŕetôzce: jednoduchý (D) topologie: lineárni (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID čislo,2

AGCTTCATAT GGGCATTGTG GAACAATGCT GTACCAGCAT CTGCTCCCTG TACCAGCTGG 60

AGAACTACTG CAACCGCCGT GAGGCAGAGG ACCTGCAGGT GGGTCAGGTG GAGCTGGGCG 120

GTGGCCCGGG TGCAGGCAGC CTGCAGCCGC TGGCCCTGGA GGGTTCCCTG CAGAAGCGTT 180

TTTTGAACCA ACACCTGTGC GGCTCCCACC TGGTGGAAGC TCTGTACCTG GTGTGCGGTG 240

AACGTGGCTT CTTCTACACC CCGAAGACCT AGGATCCG 27 8 (2) Informace pro sekv. ID číslo: 3

- 74 \ (i) sekvenční charakteristiky (A) dólka: 277 párú bází ·«, (B) typ: nukleová kyselina (C) ŕetôzce: jednoduchý (D) topologie: lineárni (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID čislo 3

AATTCGGATC CTAGGTCTTC GGGTGTAGAA GAAGCCACGT TCACCGCACA CCAGGTACAG ·* ·

AGCTTCCACC AGGTGGGAGC CGCACAGGTG TTGGTTCAAA AAACGCTTCT GCAGGGAACC

CTCCAGGGCC AGCGGCTGCA GGCTGCCTGC ACCCGGGCCA CCGCCCAGCT CCACCTGACC

CACCTGCAGG TCCTCTGCCT CACGGCGGTT GCAGTAGTTC TCCAGCTGGT ACAGGGAGCA

GATGCTGGTA CAGCATTGTT CCACAATGCC CATATGA

120

180

240

277 (2) Informace pro sekv. ID čislo: 4 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 8 párú bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) ŕetôzce: jednoduchý (D) topologie: lineárni (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID čislo 4

CCTCGAGG 8 (2) Informace pro sekv. ID čislo: 5 (i) sekvenční charakteristiky (A) dólka: 22 párú bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) ŕetôzce: jednoduchý (D) topologie: lineárni (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) < j < á \· (ľíi. ) sekvenční deskx i p c esekv. ID číslo 5 G.ATCTATTAA CTCAATCTAG AC (:?.) inforni9.ce pro aekv. ID číslo: 6 -;i) sekvenční charakteristiky í P.) délke: 22 pár ú báz i (B) typ: nukleová kyselina (C) letäzoa: jednoduchý ( D) !: o po i o g í e : i i n e á t: n i (, j i j Typ molekuly: DNA > (genoim. cká) (z t ) eakvenôrd. des-kr tpc·? sekv, i D číslo 6

TCGAGTCTAG ATTGAGTTAA TA (2) intormaoe pro sekv. ID číslo: ť i : sekvenční charakteristiky

	de i k a	: .1.0 pá r ď báz i
'..B,'	• y p	nukleová k y:? e i
(C)	f e téz	o e: jednoduchý
i D)	t. o p o í	cgí n: lineárni.
\ i i > Tyi	d ľt<0 i ú·	koly; D d ?! (gen
i..·.:) sŕl-	..Vé f: i',	1 k r j p:·· : ·.·!
.í<';\'J. '· .'í ’».»
í ľ,) 1 d :L	;<t p r c	·:; ŕj 1'. V , x D č í S Í.
t i .i sekvenční	c ha ?; u k h o v i. n t i.
í A 1	,b‘t Í k,·,	. 12 p á r-y báz!
(β)	typ:	nukleová kysel
( O )	ľ -'«i	ce: jednoduchý
(P)	+ :íí i,	ogte: lineárni

t i 1 Typ mo·.!.ekol y : DNA (gsnotňickát) (xi) sekvenční deskripcie: sekv. ID číslo ô

GAGGAATTCC TC (2) Informace pro sekv. ID číslo: 9 (i) sekvenční charakteristiky (A) dólka: 13 párú bázi (B) typ: nukleová kyseline (C) Aetčzce: jednoduchý (D) topologie: lineárni (i 1) Typ molekuly: DMA (genomieká) (xi ) sekvenční deskiĺpce: sekv. ID číslo 9

CTGTGCCTTC TAG (2) Tnfoririace pro sekv. ID Sialo: IO (í) sekvenční, charakteristiky (A) délka: 17 párú báz?

(B) typ: nukleová kyse1 ina (O) Aotôzco: jednoduchý (D) topologie: lineárni f i.i) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi 1 sekvenční deskripce: .«ekv. ID číslo 10

G ATO7TΛGAA GOCAC AG (2) Γ. nformr.ee pro sekv. ID čiel-?: 11 i':i ) sekvenční charakteristiky (A) délka: 26 pá r ô báz í (BI typ: nukleová, kyselina ! c í Aetčzce: jednoduchý f P) topologie: lineárni fi.il. Typ molekuly: DNA (gene mi c ká) {':<! ) sekvenční deskripce: sekv. ID čiel o/ 11

CCCGTGCTGT GGATAGTGTA GGGGGA (2) Informace pro sekv. Τ.Ρ číslo: 1.2 <1) sekvenční charakteristiky (Λ1 flélka: 49 párft bár í f D) typ: nukleová kyselina (O) A e t č r. c e : jednoduchý f P) topologie: lineárni.

(ii) Typ molekuly: DMA (gencmická) (xi) sekvenční deskripce: sekv, ID číslo 12

CTAGAGGGTA TTAATAATGT ATATTGATTT TAATAAGGAG GAATAATCA (2) Inŕorinace pro sekv. ID Čislo: 13 (i) sekvenční charakteristiky (A) dálka: 47 páru bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) ŕetázoe: jednoduchý (D) topologie: lineárni (ii) Typ molekuly: DNA (genomiokáj (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID Čislo 13 TATGATTATT CCTCCTTATT ÄAÄATCAATA TACATTATTA ATACCCT

Prúmyslová využite! nos t

Ι·)

Nová molekuly odvozená od složek proinzulihu rekombinantni yDNA:· technológii. Sloučeniny podobná inzulínu, vhodné pró oôetŕóváni^! diabetes meilitus, nezávislé na inzulínu. Nový zpúsob rekombinantní produkoe inzulínu. ‘

Claims (1)

1. Polypeptid obecného vzorce I

Hotχ-A-C-B (I) kde znamená

Met aminokyselinu methionin.

x O nebo 1,

A ŕetézec A inzulínu nebo jeho funkční derivát,

B ŕetézeo B inzulínu nebo jeho funkční derivát,

C C-peptíd inzullrľu nebo peptid obecného vzorce x, - ,X_?- p - X ..J- X., kde znamená

X_t,X~,Xi a X* bázické aminokyseliny, které jsou stejné nebo odlišné a

P peptid obsahujici 4 až 35 aminokyselín s výjlmkou cyste inu, a jeho farmaceutický vhodné soli.

O l-i . Polypeptid podie nároku 1 obecného vzorce I, kde aminoky- s e 1. .1 n a Ale, Ae v po 1 o z e 21 ip, a Asn. A-ŕetézoe je volená z© souboru z ahrnujíoiho Gly « 3 . s s 1 i n a Po 1ypeptid v poloze 10 podie nároku 2 obecného vzorce B-ŕetÔzce je Asp. I, kde aminoky- Λ 4. s e i j. ιΊ·^:ι Po 1ypeptid v poloze 30 podie nároku 3 obecného vzorce B-ŕetézce je Aia nebo chybí. I, kde aminoky- 5 . s e 1 1 n s Po 1ypeptid v poloze 29 podie nároku 3 obecného vzorce B-fetézce je Pro, I , kde aminoky- 6 . s e i 1 n a Po 1ypeptid v poloze 26 podie nároku 5 obecného vzorce B-ŕetézce je Olu nebo Lys. I, kde aminoky- 7 . s e 1 í n a Po 1ypepti d v po 1 oz e 27 podie nároku 2 obecného vzorce B-ŕetôzce je Arg. 1, kde aminoky- 8 . s e 1 í n a Po 1ypeptid v poloze 13 podie nároku 7 obecného vzorce B-ŕetézce je Gin. I, kde aminoky- 9 . s e i í n a Po 1ypeptid v poloze 1,7 podie nároku 7 obecného vzorce A~ŕ©téze© je G1 u. I, kde aminoky- 10, Po 1ypeptid podie nároku 7 obecného V2orce l, kde aminoky- s e 1 i n a v p.;. 1 o z e 21 A-ŕetôzce je Gly a aminokyselina v poloze 30 B-

ŕôtôzce j© Thr-NH?.

11. Polypeptid podie nároku 2 obecného vzorca I, kde aminokyselina v poloz© 29 B-fetôzce ie Pro,

12. Polypeptid podie nároku 11 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloz© 28 B-ŕôtézo© je Glu nebo Lys.

13. Polypeptid podie nároku 12 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloz© 30 B-ŕôtézoe je ň.ia.

14. Polypeptid podie nároku 2 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 30 B-ŕetézce je Ala.

15. Polypeptid podie, nároku 1 obecného vzorce 1, kde aminokyselina v poloze 10 B-ŕetézci? je A.©p nebo His.

16. Polypeptid podie nároku 15 obecného vzorce X, kde aminokyselina v poloze 28 B-ŕetázoe je Asp.

17. Polypeptid podlo nároku 15 obecného vzoroe I, kde aminokyselina v poloz© 30 B-ŕetôzce je vypuSténa18. Polypeptid podie nároku 1 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 28 B-ŕetôzce je Lys a aminokyselina v poloz© 29 Bŕetézoe je Pro.

19. Polypeptid podie nároku 1 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloz© 29 a 30 B-ŕôtézo© je vypužtôna.

20. DNA s loučeninn zakódu j ť c í kteroukoliv slouôeninu podie nároku 1 až 19.

21 . po d i e 22 . až 19 a . s e až

b. tato DNA sekvence s s vná%l dc vhodného vektoru obsahujlciho promotor operátorovou r a gi oná), n J íun'ltoi v hostujioi buftoe.

c. orientuje se DMA sekverioe ve vektoru k dosaženi trans kr i po© a translace DNA sekvence za transkrjpčniho ŕizenl promotor opera to.ro vébo regiónu,

d. tranŕormuje se hostujíol bučky vektorom.

e. kultivuje se hostujici bučka za podmínok vhodných k navození transkripoe a translace génu a

Rekombinantní DNA vektor obsahujici DNA slouôeninu náreku 20.

ZpĎsob r e k c m b i n » n t n i p ŕ i p r · ·. v γ p o 1 y p s p tí d u podie nároku 1 v y z n í! Č 1.1 j Í f: 1 s e t 1 m , že vytváŕi DNA sekvence zske du.jici polypeptid podie nároku 1

i. ziská a čistí se produkovaný peptid zakódovaný DNA sekvenoi.

23. Zpúsob prípravy polypeptidu obecného vzorce I podie nároku 1 až 19, vyznač u j i o 1 s e t 1 m , že se postupuje syntézou peptidu v pevné ťázi.

24. Zpúsob prípravy inzulínu, v'yznačujioi se t i m , ž e

a. se pripravuje polypeptid obecného vzorce I poodle nároku 1 až 19 a

b. átépi se vhodnými peptirlasami nebo chemickámi činidiy k odŠtépeni C-peptidu.

25. Zpúsob prípravy inzulínu, vyznačuj ioi s e tím. že

a. se konštruuje DNA sekvence zakodujici polypeptid obecného vzorce í, podie nároku 1 až 19,

b. tato DNA sekvence se vnáši do vhodného vektoru obsahujioiho prornotor operátorovou regionálni funkcl v hoatujioi buňee,

o. DNA sekvence se orientuje ve vektoru k dosaženi transkripce s trans1ace·DNA sekvence a transkripôní kontroly prornotoroperátorove oblasti,

d. hostujloí .bučka se transformuje vektorem,

e. t r 3.113 ťo rmo vaná hostujicl bučka se kultivuje za podminek vhodn ý o h k na v o z © n i t r a n s k r í. p c e a trans) a o e g e n u

ť. polypeptid zakódovaný DNA sekvenoi se ziská a čiôtl,

g. polypeptid zakódovaný genein se ätépl vhodnými peptidazami nebo chemickými činidiy, takže se C-peptid odátépl.

26. Farmaceutický prostŕedek pro oáetŕováni dlabete s, NIĽDM a pre stimulaoi proiiferace bunék hladkého svalstva, v y z n a Ô uj J. o 1 s · e t i či obecného ti rn , že jako účinnou složku obsahuje polypepvzorce 1 podie nároku 1 až 19 spolu s jednim nebo n é k o 1 1 ka farmaceuti cky v ho d n ý n i i. n o s í č i , exolpíentv nebo ŕedidly,

27 .

PotrfltÍK polypeptidu obecného vzor-ďe I podie nároku 1 až/ o š e t ŕ o vá n i\d i a be t e s . P o u Žití po Py p e ρ t .1 d u o b e c n é ho/ v zo r ce I po dl é\ nároku ly 'až ošetŕováni NIDDM. Použití polypepbidu obecného vzorce I podie nároku / ' 1 až stimulaoi proliferace bunék hladského svalstva _t ^x'—

ÚŔAD