SK154795A3 - O6-substituted guanine derivatives, manufacturing process and their use in tumour cells therapy - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka O^s-substituované derivátov guanínu, spôsobov ich výroby a ich použitia pri terapii buniek nádoru. Predovšetkým sa týka derivátov guanínu, ktoré majú heteroarylalkylové alebo naftylalkylové substituenty v polohe 0^€, tieto zlúčeniny umožňujú znížiť aktivitu O⁶-guanín-DNA-alkyltransferázy (Atázy) v bunkách nádoru.

Doterajší stav techniky

Bolo navrhované použitie O⁶-substituovaných derivátov guanínu, ktoré majú deplečnú aktivitu voči O^e-alkylguanín-DNA-alkyltransferáze, aby zvýšili účinnosť chemoterapeutických alkylačných činidiel použitých na usmrtenie buniek nádoru. Sú tu znaky toho, že v bunkách cicavcov toxické a mutagénne účinky alkylačných činidiel sú do značnej miery dôsledkom alkylácie v 0^e polohe guanínu v DNA. Reparácia O^e-alkylguanínu je sprostredkovaná Atázou, reparačným proteinom, ktorý pôsobí na O^s-alkylované zvyšky guanínu pomocou stechiometrického prenosu alkylovej skupiny na zvyšok cysteínu na aktívnom centre reparačného proteínu v autoinaktivačnom procese. Význam Atázy v ochranných bunkách proteínu proti biologickým účinkom alkylačných činidiel bol jasne preukázaný prenosom a expresiou klonovaných génov alebo cDNA Atázy do buniek bez Atázy: táto poskytuje rezistenciu na rad činidiel, predovšetkým takých, ktoré metylujú alebo chlóretylujú DNA. Zatiaľ čo mechanizmus bunkového usmrtenia pomocou O⁶-metylguanínu v bunkách bez Atázy nie je ešte objasnený, usmrtenie pomocou O⁶-chlóretylguanínu sa uskutočňuje vo vnútri jedného reťazca DNA vytváraním väzby k cytostatínovému zvyšku na opačnom reťazci cez intermediárny cyklický etanoguanín. Tomuto procesu zabraňuje Atázou sprostredkované odstránenie chlóretylovej skupiny alebo tvorba komplexu.

Použitie O⁶-metylguanínu a O^s-butylguanínu na znižovanie Atázy opísali Dolan a kol., Cancer Res., 46, 4500, (1986); Dolan a kol., Cancer Chemoter. Pharmacol., 26, 103, (1989). Deriváty O⁶-benzylguanínu boli navrhnuté na znižovanie aktivity Atázy, s cieľom zvýšenia citlivosti buniek exprimujúcich cytotoxickým účinkom chlóretylačných činidiel kol., J. Med. Chem., 35. 4486, (1992)). Americký patent 5 091 430 a medzinárodná patentová prihláška č. WO 91/13898, Moschel a kol., opisujú spôsob znižovania hladiny O^e-alkylguanín-DNA-alkyltransferázy v bunkách nádoru hostiteľa, ktorý zahrňuje podanie hostiteľovi účinné množstvo zmesi obsahujúcej deriváty 0⁶-benzylovaného všeobecného vzorca:

Atázu ku (Moschel a guanínu nasledovného

kde

a R^a predstavuje benzylovú skupinu alebo substituovanú benzylovú skupinu. Benzylová skupina môže byť substituovaná v polohe orto, metá alebo para substituentom ako je halogén, nitroskupina, arylová skupina ako je fenylová skupina alebo substituovaná fenylová skupina, alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, alkoxylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, alkenylová skupina obsahujúca až 4 atómy uhlíka, aminoskupina, monoalkylaminoskupina, dialkylaminoskupina, trifluórmetylová skupina, hydroxyskupina, hydroxymetylová skupina a SO R^to, kde n predstavuje 0, 1, 2 alebo 3 a R^to

Λ predstavuje vodík, alkylovú skupinu obsahujúcu l až 4 atómy uhlíka alebo arylovú skupinu. Mi-Young Chae a kol., J. Med. Chem. 37, 342 - 347, (1994) - publikované po dátume priority tejto prihlášky - opisuje skúšky na analógoch O⁶-benzylguanínu nesúceho stále viac a viac veľkých substitučných skupín na benzénovom kruhu alebo v polohe 9. Tam opísaná zlúčenina č. 6 je 0⁶-(2-pyridylmetyl)guanín, ktorou je v tejto prihláške nazvaný 0⁶-(2-pikolyl)guanín. Napriek tomu vo výsledkoch «

a v diskusii na stranách 342 - 343 práce Chaea a kol., zlúčenina č. 6 nie je uvedená ako zaujímavá, ale je zoskupená medzi Zostávajúce zlúčeniny, ktoré vykazujú strednú aktivitu (str. 343, riadky 12 - 15 textu). Autori potvrdzujú svoje skôr uvedené pozorovania (J. Med. Chem. 35, 4486, (1992)), že iba alkylový alebo benzylový substituent v O⁶ polohe guanínu účinne inaktivuje Atázu (str. 343, riadky 21 - 23 textu).

O⁶-benzylguanín má vo svojom použití obmedzenie ako aktivátor Atázy. Je stabilnejší ako by bolo žiadúce, čo má za následok, že zostáva dlhý čas vo zvierati, ktorému sa podal. Má stupeň možnej toxicity sámotný i v kombinácii s chloračnými činidlami, čo je tiež nežiadúce a čo sa môže týkať času . prežitia.

• Podstata vynálezu

Zlúčeniny tejto prihlášky vykazujú odlišné charakteristiky inaktivácie Atázy ako O^s-benzylguanín a v niektorých prípadoch aktivita je až osemkrát väčšia ako pre O⁶-benzylguanín. Pozorovali sa tiež rôzne charakteristiky polčasu a toxicity. Predmetom vynálezu je teda získanie nových zlúčenín užitočných pre znižovanie aktivity Atázy, aby sa zabránilo účinkom chemoterapeutických činidiel ako sú chlóretylačné alebo metylačné protinádorové činidlá.

Medzi ďalšie predmety vynálezu patria farmaceutické prostriedky obsahujúce zlúčeniny, ktoré sú užitočné pre znižovanie aktivity Atázy. Ďalším predmetom vynálezu je spôsob znižovania aktivity Atázy v bunkách. A ešte ďalším predmetom vynálezu je spôsob liečenia buniek nádoru hostiteľa.

Vynález opisuje 0^e-substituované deriváty guanínu všeobecného vzorca I:

kde

Y predstavuje vodík, ribozylovú skupinu, deoxyribozylovú skupinu alebo R’^CHR''', kde X predstavuje kyslík alebo síru, R' ' a R''¹ predstavujú alkylovú skupinu alebo ich substituované deriváty.

R' predstavuje vodík, alkylovú skupinu alebo hydroxyalkylovú skupinu,

R predstavuje (i) cyklickú skupinu, ktorá má najmenej jeden 5- alebo 6-členný heterocyklický kruh, na ktorý je prípadne nakondenzovaný karbocyklický alebo heterocyklický kruh, pričom uvedený jeden alebo všetky heterocyklické kruhy majú najmenej jeden heteroatóm zvolený z kyslíka, dusíka alebo síry, alebo jej substituovaný derivát, alebo (ii) naftylovú skupinu alebo jej substituovaný derivát, a ich farmaceutický prijateľné soli.

R môže vhodne byť 5- alebo 6-členný heterocyklický kruh alebo jeho benzoderivát, kde v poslednom prípade O^e-alkylguanínový zvyšok môže byť pripojený na R na každom heterocyklickom alebo benzénovom kruhu.

Vo vhodných uskutočneniach vynálezu R predstavuje

5-členný kruh obsahujúci síru alebo kyslík, na ktorý je alebo nie je nakondenzovaný druhý kruh.

R s výhodou predstavuje heterocyklický kruh, ktorý má najmenej jeden atóm síry, výhodnejšie R predstavuje 5-členný kruh, ktorý má najmenej jeden atóm síry, a R predstavuje tiofénový kruh alebo jeho heterocyklický naj výhodne j š i e substituovaný derivát.

Alternatívne R môže byť heterocyklický kruh, ktorý má najmenej jeden atóm kyslíka, predovšetkým 5-členný heterocyklický kruh, ktorý má najmenej jeden atóm kyslíka a najmä R môže predstavovať furánový kruh alebo jeho substituovaný derivát.

Ako ďalšia alternatíva R môže byt heterocyklický kruh, ktorý má najmenej jeden atóm dusíka, R môže byt predovšetkým 6-členný heterocyklický kruh, ktorý má najmenej jeden atóm dusíka a najmä R môže byť pyridínový kruh. V definícii Y termín substituovaný derivát zahrňuje substitúciu jednou alebo viacerými nasledujúcimi skupinami: hydroxyskupinou, alkoxylovou skupinou, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, amidoskupinou alebo ureidoskupinou.

V definícii R termín substituovaný derivát zahrňuje substitúciu heterocyklických kruhov a/alebo karbocyklických kruhov jednou alebo viacerými nasledujúcimi skupinami: alkylovou skupinou, alkenylovou skupinou, alkinylovou skupinou, halogénom, halogénalkylovou skupinou, nitroskupinou, kyanoskupinou, hydroxylovou skupinou, SO^R'^{1 1} ' ¹ , kde R*'’ * predstavuje alkylovú skupinu a n predstavuje 0, 1 alebo 2 alebo karboxylovou skupinou alebo esterovou skupinou všeobecného vzorca -COOR^S, kde R^s predstavuje vodíka alebo alkylovú skupinu. Výhodnými substituentami sú halogén, halogénalkylová skupina, kyanoskupina, SO R’''' (ako je definované vyššie) rx a -COOR⁵, kde R⁵ predstavuje alkylovú skupinu.

Alkylová, alkenylová alebo alkinylová skupina s výhodou obsahuje od 1 do 20 atómov uhlíka, výhodnejšie 1 až 10 atómov uhlíka a najvýhodnejšie 1 až 5 atómov uhlíka, patrí jód, bróm, chlór alebo fluór.

Príklady zlúčenín podľa vynálezu (spoločne B.4214 a B.4218, ktoré nie sú zahrnuté touto uvedené v tabuľke 1.

Medzi halogény so zlúčeninami prihláškou) sú

B.4203

B. 4205

B.4206

B.4209

B.4210

Tabuľka 1

O⁶-furfurylguanín

O^e-tenylguanín

O^e-(3-tienylmetyl)guanín

O^e-(3-furylmetyl)guanín

O⁶-(2-pikolyl)guanín

I

OG

L OG

Tabuľka 1 (pokračovanie)

B.4211

O^e-(3-pikolyl)guanín

B.4212

O^e-piperonylguanín

B.4213

O^s-(2-naftylmetyl)guanín

B.4214

DL-O^e-(α-metylbenzy1)guanín

OG

B.4217

DL-O^S-(α-metylteny1)guanín

S

OG

B. 4218

B.4219

B.4220

B.4221

B.4222

B.4226

Tabuľka 1 (pokračovanie)

O*⁵- ( 2-metylbenzyl) guanín

DL-O⁶-[l-(3-tienyl)etyl]guanín

O⁶-(5-metyltenyl)guanín

O^e-(5-metylfurfuryl)guanín

O^s-(3-mety1teny1)guanín

O⁶-(2-benzo[b]tienylmety1)guanín

OG

O G.

OG

Tabulka 1 (pokračovanie)

B.4229

0^e-(5-metoxykarbonylfurfuryl)guanín

OG'·

B.4234

0^G-(5-karboxyfurfuryl)guanín

B.4265

0^G- (1-naftylmetyl)guanín

B.4266

0^G-(2-benzofuránylmetyl)guanín

B.4268

O^e-piperonylguanozín

C H.O—C ^J u O

HO„C

CH_nOG

OG

OH OH

Tabuľka 1 (pokračovanie)

B.4269

O^e-(5-brómtenyl)guanín

Br

OG

B.4271

O⁶-(5-azapiperonyl)guanín

B.4273

O^e-(5-kyánfurfuryl)guanín

OG

B.4274

O⁶-(5-oxazolylmetyl)guanín

B.4275

O⁶-(5-tiazolylmetyl)guanín

B.4276

Tabulka 1 (pokračovanie)

B.4277

0⁶-(4-pikolyl)guanín

NO

B.4278

0⁶-(l-metyl-4-nitropyrol-2-ylmetyl)guanín

B.4279

0⁶-tenylguanozín

O.

HO

HO

OH*

CH

Medzi zlúčeninami v tabuľke 1, zlúčeniny B.4214 a B.4218 nie sú zlúčeninami podľa vynálezu. Zlúčenina B.4210 (t.j. zlúčenina všeobecného vzorca I, kde predstavuje 2-pyridylovú skupinu, R' predstavuje vodík a Y predstavuje vodík) nie je výhodnou zlúčeninou podľa vynálezu.

Medzi predovšetkým výhodné zlúčeniny podľa vynálezu patrí:

B. 4 205 O^s-tenylguanín

B.4206 0^e-(3-tienylmetyl)guanín

B.4212 0⁶-piperonylguanín

B.4226 0⁶-(2-benzo[b]tienylmetyl)guanín

B.4266 0⁶-(2-benzofuranylmetyl)guanín

B.4275 O^e-(5-tiazolylmetyl)guanín a medzi zlúčeniny substituované na heterocyklickom kruhu v symbole R halogénom, kyanoskupinou alebo esterovou skupinou patrí

B.4229 0⁶-(5-metoxykarbonylfurfuryl)guanín

B.4269 0⁶-(5-brómtenyl)guanín

B.4273 o⁶-(5-kyánfurfuryl)guanín

Medzi ďalšie výhodné zlúčeniny patrí:

B.4209 0⁶-(3-furylmetyl)guanín

B. 4276 O⁶-(2-benzo[b]tienylmetyl)guanozín

B.4277 O⁶-(4-pikolyl)guanín

Najvýhodnejšie zlúčeniny podľa vynálezu sú tie, ktoré inaktivujú Atázu in vitro a/alebo v cicavčích bunkách a/alebo nádorových štepoch účinnejšie ako O^e-benzylguanín (BeG) a ktoré zvyšujú citlivosť cicavčích buniek a/alebo nádorových štepov na usmrtenie alebo inhibičné účinky na rast nitrózomočovín alebo metylačných činidiel účinnejšie ako BeG. Výhodné zlúčeniny by mali mať, v porovnaní s BeG, zníženú toxicitu voči normálnym tkanivám a/alebo k celému organizmu, ak sa použijú v kombinácii s takýmito činidlami. Výhodné zlúčeniny by samy o sebe nemali byť toxické ani mať viac ako minimálnu toxicitu v požadovaných dávkach pre inaktiváciu Atázy, ani by žiadne hydrolýzne produkty výhodnej zlúčeniny, ktorá je chemicky nestabilná, nemali byť toxické. I keď vynález nie je obmedzený žiadnou teóriou, výhodné zlúčeniny pravdepodobne musia byť menej stabilné ako BeG tak, aby u nich nastala spontánna chemická degradácia čoskoro po dosiahnutí maximálnej inaktivácie Atázy: takto sa akékolvek kroky metabolických postupov, ktoré by mohli pôsobiť na činidlo vytvorením toxických zložiek, minimalizovali. Výhodné zlúčeniny by mali byt menej schopné zvyšovať citlivosť ľudskej kostnej drene alebo iných normálnych typov buniek na toxické účinky alkylačných činidiel, aby neexacerbovali známu toxicitu alebo nevytvárali nové toxicity týchto činidiel v normálnom ľudskom tkanive.

Medzi -výhodné zlúčeniny podľa vynálezu patria tie, ktoré nižšiu hodnotu I v

SO majú relatívne 1,0 μΜ, predovšetkým pod 0,04 μΜ) kratší polčas v pufrovacom systéme pre skúšku in vitro) a/alebo tabuľke 4 (napríklad pod a/alebo majú relatívne I (predstavujú podmienky vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom (Phosphate buffered saline, PBS) (predstavuje podmienky vo fyziologickom prostredí) v tabuľke 4 (napríklad menej ako 20 hodín v pufrovacom systéme I alebo menej ako 16 hodín v PBS).

Relatívne krátky polčas sa môže považovať za indikátor, že zlúčenina podľa vynálezu by bola menej stabilná ako O⁶-benzylguanín zásluhou reaktivity RR'CH- a mala by sklon ku rozkladu hydrolýzou vo fyziologickom prostredí.

Vplyv skupiny RR'CH- v zlúčeninách všeobecného vzorca I, ktorý im umožňuje byť inhibítormi Atázy sa stanovuje elektronickými, stérickými a fyzikálno-chemickými faktormi. Stérické faktory sa môžu týkať povahy okolia receptorového miesta pre cysteín v Atáze. Výhodné R¹ predstavuje vodík. Pre druhý atóm pripojený k O⁶ (ako v DL-zlúčeninách B.4214 alebo B.2417) sa zistilo, že značne znižuje inaktivačnú aktivitu, pravdepodobne vďaka veľkosti substituenta.

Výhodná cyklická skupina v R nemá metylovú skupinu v susednej polohe (ako v B.4222), hoci vplyv susednej substitúcie je evidentne menší, keď R predstavuje heterocyklický zvyšok ako v naftylových izoméroch B.4213 a B.4265.

Fyzikálno-chemické faktory ako je stabilita, rozpustnosť a rozdelenie medzi vodu a lipid sa týkajú výberu zlúčenín pre použitie in vivo, ovplyvňujú napríklad formuláciu, absorpciu a transport. Výber zlúčenín môže byť ovplyvnený tiež ich rozličnou distribúciou v rôznych tkanivách.

Jedným uskutočnením vynálezu je farmaceutický prostriedok obsahujúci zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde Y R a R' sú definované vyššie alebo ich a farmaceutický prijateľné prostriedok tiež obsahovať chlóretylačné alebo metylačné činidlo.

farmaceutický prijateľnú soľ vehikulum. Voliteľne môže alkylačné činidlo, ako je

Ďalšie uskutočnenie vynálezu zahrňuje spôsob zníženia aktivity Atázy u hostiteľa, ktorý zahrňuje podanie hostiteľovi účinné množstvo prostriedku obsahujúceho zlúčeninu všeobecného vzorca I, kde Y, R a R' sú definované vyššie alebo jej farmaceutický prijateľnú sol, predovšetkým farmaceutické prostriedky definované vyššie. Tento spôsob môže byť alternatívne formulovaný ako spôsob znižovania reparačnej aktivity DNA sprostredkovanej Atázou u hostitela.

Vynález ďalej zahrňuje spôsob liečenia buniek nádoru hostiteľa, zahrňujúce podanie hostiteľovi účinného množstva prostriedku obsahujúceho zlúčeninu všeobecného vzorca I, kde Y, R a R' sú vyššie definované alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ, predovšetkým farmaceutické prostriedky definované vyššie a podanie hostiteľovi účinného množstva prostriedku obsahujúceho alkylačné činidlo. Spôsob sa môže použiť na liečbu nádorov vrátane tých, o ktorých je známe, že sú citlivé na pôsobenie alkylačných činidiel, napríklad melanóm a glióm a iné, ktoré sú ako také rezistentné na liečbu alkylačnými činidlami, ale môžu byť zdolané použitím inaktivátora podľa vynálezu.

Ďalej vynález zahrňuje spôsob prípravy zlúčenín všeobecného vzorca I zahrňujúceho kroky: reakciu hydridu sodného s roztokom RR'CHOH (kde R a R' sú definované vyššie) v organickom rozpúšťadle, výhodne pri alebo okolo laboratórnej teploty; pridanie 2-amino-N,N-trimetyl-lH-purín-6-amínium-chloridu alebo 2-amino-6-chlórpurín-ribozidu; pôsobenie slabej kyseliny a éteru na reakčnú zmes; a extrakciu požadovaného produktu.

Opis obrázkov

Vynález bude opísaný podrobnejšie s odkazmi na priložené obrázky, v ktorých:

Obrázok 1 znázorňuje graf percenta zostávajúcej aktivity čistej rekombinantnej ľudskej Atázy nasledovanej inkubáciou rozličnými koncentráciami rôznych inaktivátorov. Každý bod ukazuje strednú hodnotu z troch meraní. Priamka 50 % zostatkovej aktivity sa použije na počítanie hodnôt I , t.j požadovanej koncentrácie inaktivátora pre vznik 50 % zníženia aktivity Atázy.

Obrázok 1 znázorňuje výsledok skúšky inaktivácie Atázy in vitro pomocou 4 zlúčenín. B.4206 bola o niečo účinnejšia ako BeG, ale B.4212 a B.4205 boli oveľa lepšie pri použitých podmienkach skúšky. B.4203 nebola taká účinná ako BeG.

C na obrázku 1 znamená koncentráciu inaktivátora, PZA znamená percento zostatkovej aktivity.

Obrázok 2 znázorňuje 2 grafy percenta rastu buniek oproti koncentrácii alkylačného činidla (gg/ml), ktorý ukazuje účinok senzibilizácie O^s-benzylguanínom (BeG) a O^e-tienylguanínom (B.4205) pri dvoch rôznych koncentráciách (0,1 a 1,0 μΜ) na senzibilizáciu buniek Raji na 1,3-bis-(2-chlóretyl)-1-nitrózomočovinu (BONU). Priamka 90 % rastu sa použila na počítanie hodnôt D_go, t.j. dávky BONU, pri ktorej bol 90 % rast v porovnaní s neošetrenými kontrolami, t.j. 10 % inhibícia rastu.

Obrázok 2 znázorňuje, že pri koncentrácii inaktivátora

0,1 μΜ, B. 4205 bola účinnejšia ako BeG v senzibilizácii buniek Raji voči rastovým inhibičným účinkom BCNU: pri koncentrácii inaktivátora 1,0 μΜ B.4205 a BeG boli v tomto ohľade rovnako účinné.

% G znamená percento rastu.

Obrázok 3 znázorňuje štyri grafy percenta rastu buniek oproti koncentrácii alkylačného činidla (μΜ), ktoré ukazuje účinok BeG a B.4205 na štyroch rôznych koncentráciách (0.1, 0,5, 1,0 a 5,0 μΜ) na senzibilizáciu buniek Raji na temozolomid.

Obrázok 3 ukazuje, že pri koncentrácii inaktivátora 0,1 μΜ, B.4205 bola účinnejšia ako BeG v senzibilizácii buniek Raji ku rastovým inhibičným účinkom temozolomidu, ale ako sa zvyšovali dávky inaktivátorov, senzibilizácia pomocou BeG sa stala účinnejšou, zatiaľ čo v prípade B.4205 zostala rovnaká. Tento nedostatok odpovede na dávku v prípade B.4205, ale zreteľná odpoveď na dávku v prípade BeG je zrejmejšie znázornená na obrázku 4.

% G znamená percento rastu a T znamená temozolomid.

Obrázok 4 znázorňuje graf, extrapolovaný z obrázku 3, hodnôt pre D_so (μΜ) (t.j. dávka temozolomidu, pri ktorej bol 50 % rast v porovnaní s neošetrenou kontrolou) oproti koncentrácii inaktivátora (μΜ).

C znamená koncentráciu inaktivátora.

Obrázok 5 znázorňuje dva grafy percenta rastu buniek oproti koncentrácii inaktivátora, ktorý ukazuje rastový inhibičný účinok O⁶-furfurylguanínu (B.4203) a B.4205 v bunkách V79 čínskeho škrečka (RJKO) a ich sublíniu (+ 120).

Obrázok 5 znázorňuje, že zatiaľ čo určité inhibície rastu buniek V79 boli spôsobené B.4203 pri dávkach presahujúcich 100 μΜ (t. j. najmenej lOOx vyšších ako je dávka I tejto zlúčeniny), žiadne takéto účinky sa nepozorovali pri B.4205 až po maximálne použitú koncentráciu.

% G znamená percento rastu.

Obrázok 6 znázorňuje dva grafy percenta rastu buniek oproti koncentrácii inaktivátora, ktorý ukazuje rastový inhibičný účinok B.4203 a B.4205 na dvoch subklonoch Xeroderma pigmentosum.

Obrázok 6 ukazuje, že bunky Xeroderma pigmentosum boli rovnako vnímavé voči rastovým inhibičným účinkom B.4203, avšak tieto bunky boli citlivejšie ako bunky V79 voči účinkom B.4205. Napriek tomu požadované dávky pre inhibíciu rastu boli najmenej stokrát vyššie ako dávky požadované pre inhibíciu Atázy. Z tohto sa dá vyvodiť, že základné rastové inhibičné účinky týchto inaktivátorov by nemohli zistitelnou mierou prispieť ku senzibilizácii buniek na rastové inhibičné účinky alkylačných činidiel.

% G znamená percento rastu.

Obrázok 7 znázorňuje štyri grafy percenta rastu buniek oproti koncentrácii inaktivátora (μΜ), ktorý ukazuje účinok produktov degradácie inaktivátorov B.4203, B.4205,· B.4212 (0⁶-piperonylguaninu) a B.4226 (0⁶-(2-benzo[b]tienylmetyl)guanín) na rast Raji.

Obrázok 7 ukazuje, že žiadne podstatné inhibičné účinky rastu nevznikli v bunkách Raji, keď sa podané zlúčeniny podrobili hydrolýze (pozri Metódy) predtým, ako sa pridali k bunkám bez ďalšieho pridania alkylačných činidiel. Preto pri týchto experimentálnych podmienkach sa nedá očakávať, že produkty rozkladu týchto činidiel prispievajú k inhibícii rastu stanovenej pri použití kombinácií týchto činidiel a alkylačných činidiel.

% G znamená percento rastu a C znamená koncentráciu inaktivátora .

Obrázok 8 znázorňuje diagram oproti času (hod), ktorý ukazuje v štepoch A375 na bezsrstej myši kukuričným olejom ošetrené kontroly (30 mg/kg) ošetrené extrakty.

aktivity Atázy (fm/mg) zníženie aktivity Atázy pre neošetrené kontroly, a BeG (30 mg/kg) a B.4205

AA znamená aktivitu Atázy, C znamená kontrolnú skupinu, CO znamená kontrolu ošetrenú kukuričným olejom a T znamená čas.

Obrázky 9-13 znázorňujú grafy výsledkov štúdií štepov. Na každom obrázku horný graf ukazuje percento nádorového objemu oproti času (dni) pre nádorové štepy A375 na bezsrstej myši liečenej samotnou BCNU, liečenej BeG v kombinácii s BONU a liečenou B.4205 v kombinácii s BCNU. Dolný graf na každom obrázku ukazuje počet myší, ktoré prežili, v každej liečenej skupine oproti času (dni), po ošetreniach uvedených v hornom grafe.

Podrobnosti pre každý obrázok sú nasledujúce:

Obrázok Myš Koncentrácia BCNU Inaktivátor (mg/kg) (mg/kg)

9	ASU	približne 15	60
10	ASU	25	60
11	OLAC	10	30
12	ASU	16	60
13	ASU	16	60
	Obrázky 8	13 ukazujú výsledky	štúdie štepu detailnej
šie.	Zníženie a	obnovenie aktivity	Atázy nasledované vysta

veniu O⁶-benzylguanínu alebo B.4205 sa meria v extraktoch nádorového štepu A375 (obr. 8) pripravených z tkanív zvierat usmrtených 2 alebo 24 hodín po podaní inaktivátora. Obrázky 9-13 udávajú senzibilizáciu nádorových štepov A375 u bezsrstých myší buď O^e-benzylguanínom alebo B.4205 v kombinácii s BCNU, ako je opísané v Metódach. Na každom obrázku horný graf ukazuje percento rastu objemu nádora počas experimentu. Dolný graf ukazuje počet zvierat v každej liečenej skupine a počet, ktorý prežil nasledujúcu liečbu. Grafy ukazujú, že B.4205 je porovnateľná s 0⁶-benzylguanínom (BeG) v znížení objemu nádora a je podstatne menej toxická v kombinácii s BCNU ako s BeG v kombinácii s BCNU. U ľudských pacientov sa kožný maligný melanóm lieči BCNU, predovšetkým v USA (C. M. Balch, A. Houghton a L. Peters ''Cutaneous Melanoma v Cancer: Principles and Practise of Oncology, V. T. De Vitá, S. Helman a S. A. Rosenberg (Eds) s.1499 - 1542, Lipincott: Philadelphia (1989)) tak, že ľudský štep melanómu rastúci na bezsrstej myši je modelový zvierací systém, ktorý je klinicky vysoko relevantný .

% TV znamená percento nádorového objemu, NSM znamená počet myší, ktoré prežili a T znamená čas.

Obrázok 14 znázorňuje tri grafy percenta preživších oproti koncentrácii temozolomidu (μΜ), znázorňujúce preživšie bunky kostnej drene po liečbe inaktivátorom (10 μΜ) alebo dimetylsulfoxidom (kontrola) v kombinácii so zvyšujúcimi sa dávkami temozolomidu.

Obrázok 14 ukazuje výsledky testov senzibilizácie buniek ľudskej kostnej drene na temozolomid, ako je opísané v Metódach. Bunky kostnej drene sa získali od troch pacientov označených C, D a E. Uvedené krivky preživších sa vzťahujú na cytotoxický účinok kombinovanej liečby inaktivátor/temozolomid. Je žiadúce, aby tento účinok bol znížený. Výsledky pre pacientov C a E ukazujú, že B.4205 mal menší senzibilný účinok ako O^e-benzylguanín (0⁶BeG); pre pacienta D tu nebol žiadny rozdiel, ale tento výsledok je považovaný ako logická variácia vo vedeckom testovaní ľudského materiálu.

% S znamená percento preživších a C znamená koncentrácie temozolomidu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Deriváty 0⁶-heteroarylalkylguanínu, ktoré majú charakteristiky inaktivácie Atázy sa môžu syntetizovať príslušným upravením štandardných postupov prípravy uvedených nižšie.

2-amino-N,N,N-trimetyl-lH-purín-6-amónium-chlorid sa pripraví postupom, ktorý opísali Kiburis a kol., J. Chem. Soc.

(C), 3942 (1971). Podrobnosti podmienok reakcie tejto kvartérnej soli s benzyloxidom sodným (za vzniku O⁶-benzylguanínu), ktoré nie sú opísané v MacCoss, Chen a Tolman, Tetrahedron Lett., 26., 1815, (1985), boli uvedené v MacCoss, Tolman, Wagner a Hannah, európska patentová prihláška č. 184 473, ale tieto neboli vhodné na prípravu relatívne citlivých analógov a nižšie opísanú štandardnú prípravu navrhli vynálezcovia.

Štandardná príprava O^e-heteroarylalkylguanínov (všeobecný vzorec I, Y znamená vodík) % hydridu sodného v oleji (0,8 g, 20 mmol) sa pridá do asi 5 ml 56 mmol roztoku RR'CHOH v 5 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa mieša pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny. Pre pevné látky alebo alkoholy s vyššou molekulovou hmotnosťou sa môže použiť až 10 ml dimetylsulfoxidu namiesto 5 ml. Pridá sa 2,29 g 10 mmol 2-amino-N,N,N-trimetyl-lH-6-amínium-chloridu a v miešaní sa pokračuje počas ďalšej hodiny. Zmena spektra ultrafialového žiarenia sa potom dokončí (lambda z 312 na 284 nm) a na skoro čistý roztok sa nechá pôsobiť 1,7 ml kyseliny octovej. Po ochladení a zriedení 300 ml éteru sa zmes nechá stáť počas 2 hodín a izoluje sa pevná látka (A). Trituráciou s vodou vzniká produkt. Druhá frakcia sa môže získať odparením éter-dimetylsulfoxidového filtrátu a následnou trituráciou zvyšku s éterom a vodou. Alternatívne sa produkt môže extrahovať z pevnej látky (A) teplým acetonitrilom. Rekryštalizované zlúčeniny vykazujú jedinú škvrnu pri chromatografii na tenkej vrstve pri použití zmesi benzénu a metanolu v pomere 4 : 1 ako elučného činidla a sú charakterizované analýzou a NMR spektrom. Často obsahujú rozpúšťadlo z kryštalizácie. Teploty topenia a analytické údaje sú uvedené v tabuľke 2, spektrum UV a ^ΧΗ NMR v tabuľke 3. Spektrum NMR sa meria na prístrojoch Bruker WP80 alebo MSL 300.

Tento štandardný postup prípravy (s indikovanými obmenami pomocou symbolov v tabulke 2) sa použil pre prípravu zlúčenín opísaných v tabuľkách 2a a 3a. V zlúčeninách B.4217 a B.4219 R' predstavuje metylovú skupinu; v zostávajúcich zlúčeninách R' predstavuje vodík. O⁶-benzylguanín a zlúčeniny B.4214,

B.4218 a B.4231 v tabuľke 4 vznikli tiež pomocou tohto štandardného postupu prípravy pre porovnávacie testovacie účely.

Označené variácie symbolov v tabuľke 2 sú nasledujúce:

a) 5 mmol hydridu sodného na 1 mmol kvartérnej soli sa použije v prípade tejto zlúčeniny. Ak sa použije štandardné množstvo 2 mmol, dá sa pri spracovaní spätne izolovať 40 % kvartérnej soli.

b) Táto zlúčenina vzniká hydrolýzou 145 mg 0,5 mmol metylesteru B.4229 v 2,5 ml 2-metoxyetanolu a 2,5 ml vody pôsobením 2,5 ml 2M hydroxidu sodného počas 4 hodín pri laboratórnej teplote. Neutralizuje sa 0,32 ml 5,5 mmol kyselinou octovou, mierne sa odparí, trituruje sa s 3 ml vody a prefiltruje sa za vzniku pevnej látky, z ktorej sa extrakciou horúcim metanolom získa kyselina B.4234.

c) Vypočítané hodnoty sú založené na monohydráte zmesi zo 4 dielov sodnej soli kyseliny a 3 dielov kyseliny. Vypočítané: Na, 4,3 %. Nájdené: Na, 4,44 %.

d) Použije sa 3 mmol alkoholu RCH₂OH na 1 mmol kvartérnej soli namiesto štandardných 5,6 mmol.

e) Pre alkoholy, ktoré sú príliš citlivé na hydrid sodný v dimetylsulfoxide pri laboratórnej teplote, sa pripravuje RCH₂ONa v dimetylfuráne (2,5 ml, pri teplote -10 'C, 3 mmol RCH^OH, 2 mmol hydridu sodného). Pridá sa 1 mmol kvartérnej soli po 15 - 20 minútach a v miešaní sa pokračuje počas 2-3 hodín pri laboratórnej teplote.

f) Produkty sa extrahujú acetonitrilom.

Príprava ribozidov (všeobecný vzorec I, Y predstavuje ribozyl)

Na roztok alkoxidu, pripraveného podľa vyššie opísaného štandardného postupu z 60 % hydridu sodného v oleji (120 mg, mmol) a 4,6 mmol RR'CHOH v 2 ml suchého dimetylsulfoxidu sa počas 1 hodiny pôsobí 302 mg 1 mmol 2-amino-6-chlór-purín-ribozidu a mieša sa počas 5 minút pri laboratórnej teplote a potom 15 minút pri teplote 60 - 65 C. Reakcia sa potom ukončí, ako ukazuje zmena v UV spektre (lambda^^ z 311 na 284 nm). Ochladením, dôkladnou trituráciou so 100 + 15 ml éteru a prefiltrovaním sa získa pevná látka, na ktorú sa pôsobí 10 ml vody. Hodnota pH sa upraví z 11 na 8 rýchlym prebublávaním CO₂. Filtrácia odstráni anorganický materiál a vysušený zvyšok sa extrahuje pri laboratórnej teplote 4 x po 10 ml metanolu, pričom vždy obsahuje kvapku pyridínu. Odparením takmer všetkého metanolu a pridaním malého množstva éteru sa získa produkt, takmer čistý pri chromatografii na tenkej vrstve, pri použití zmesi benzénu a metanolu v pomere : 1 ako elučného činidla. Rekryštalizuje sa z metanolu a stopy pyridínu, rozpustí sa a zahustí pri teplote od 40 ’C, niekedy s konečným pridaním malého množstva éteru.

Tento postup sa použil na prípravu zlúčenín opísaných v tabuľke 2b a 3b. Stopy nečistôt sa ťažko odstraňujú, ale spektrum NMR ukazuje, že nukleozidy sú asi z 90 % čisté. Výťažky predstavujú rádovo 30 - 40 %.

rz

N rz

C <

o

d) kO

N >

		o-	LP	γρ	Γ	θ'	LP	CO	CO		o
tfp	CO	r—		kO	kO	o	04	OJ	o*		lP
-b—·	«1»	«.		bb	bb	•b	«·»	*.		«b
z	O	CO	kO	kO	in	LP	O	O	Ol	ΓΡ	04
	OJ	OJ	OJ	Ol	Ol	04	γρ	rp	ΓΡ	rp	ΓΡ

σΡ

C O r- OJ

C *- kO OJ *r -^7 «τ

CO o CO kC kO OJ — O ro — o co — r* 'ξγ m <r ’g* «ςτ

—-

’σ*

—

c

CO

θ'

ΓΡ

lP

c

ΓΡ

o

cP

«—

c

θ'

kO

CP

O

CO

CO

kO

LP

kO

>—*

*

«.

•b

«b

«b

b.

«b

b.

b.

b.

b.

b.

U

C

o

CO

CO

Ο»

θ'

OJ

f—

OJ

OJ

OJ

OJ

LP

lP

•^r

iP

LP

LP

LP

LP

LP

C <21

Ό •r-» '(fl

Z >0 a

>>

c ai a

•m

Ί0

Ľ γρ

Q lO

Z co >0 a

>1 >

c

Φ •a •1-1 'ta c· φ

x ω

<O >O a

>

c

Φ •n •r—i '(ti 2 >O

S >1 >

S >y

Ό •|—>

'03

S a

>.

>

c

Φ

Ί3 •1—1 '(0 >U a

>

CM

CM

co

4)

4J

Φ

U

N n

oo

Φ c

AJ Qj

Q) □ kJ AJ n ω Φ ‘ c

kO iP o

OJ

OJ b* in

G>

<o

O kC

O

O kO

O οι oi i

o

Ol

OJ

CO

OJ

OJ

I kD

OJ

OJ

0 1
rH	>(0 3
Ό
(0	M U
P	ϋ '(0
>10	Φ N
>3	U -H
a	r—1
N	Φ (0
0	M -P
2	a
oV>	č G
X	x: >io
0	(0 >
>N	•H <—1
(0	P 0
P	N Ifl
>>, >
>	d

C

LP

CO

OJ

Γ o<-p lP

AJ				>1	r-1
r- Φ —í				P Q)	>1 -P
				e	OJ
•«P				r—1	g
		•«A
ω ŕP □	Λ	>. U 3	r-f >1	C Φ	>í P
tn	o	La-i	c	•H
1		U	(U	-P	y-t
3 O	CC	□ LAU	-P	1 CP	1 (-)
•		rp	n	kO	CTI
»ϋ		O	o	o	o
'□		OJ	CM	Ol	CM
H			'T		O
N		CO	a	cd	m

Λί •Ά a

I

Ol o

Ol co >1 o

··—i

Qa

I rp

Ol

W

CO

B.4212 piperonyl 74 EtOlI 195-197 C_] 3/4I1₂o Ná jden: 52,22 4,48 23,64

Vypoč: 52,25 4,22 23,44 ae

o	LP	VO	O	O	p*	VO	p*	VO	VO
o	O	σ»	CO	·—		m	ΤΓ	CN	CO
*	*»	«.	·.		·»	*.	kk
m		vo	vo	P-	r-	p-	—	r—
CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN

(C

N '>

i—l (Z c

<

CO o o lP LP ty <N ty rp rp — kO CO Pc\ c\ — vo

LP CN ty ty ty ty ty dP

Ó

«—	P*	o	P*	σν	CO	00	m	O	CO	P*
O	σν	rp	LP	lP	*—	O	O	VO	CO	LP
*	·*	··	—	*.		«k	«.	,»	kk
lP	tP	O	o	o	CN	f—	m	’TT	LP	LP
VO	vo	ip	in	LP	LP	LP	lP	LP		’T
.,		..		>.	C		C	..	c	t e
C	··	c	··	C	φ	>0	0)	>o	Φ	>C
Φ TJ	>o Q	OJ TJ	>o 0	Q) TJ	Ό •o	a	TJ •r-v	a	TJ •m	S
T»	Cti	•ΓΊ	CD	•f—i	'03	>-	'(0	>-	'í0
'ffl		'í0	>	'Π3	2	>	2	>	2	>
2	>	2	>	2

O o

CN CN

Tabul'ka 2a (pokračovanie) u

Φ u

o

N >

CD

Ή	VO
σ ιϋ (O	CN
4J ·Η H	CM
0 C 44	1
rP (U N	<5*
o. a o	CN
Φ 0 P	CN
H +J —

o I

H I«1 3 Ό >--i Π3 S-ι U +J 44 '« >w <u n

-H

D. Ή N dl (0 O D D Ctí Q. o\o · —

C D 44 D '(0 in o

d) cn

C m

cn

CN

O m

cn cn

C o in in

2 tr

CN o c m tr

N

Q)

O

N

Q) υ

•<c o

Φ u

N

Φ

2	2	2	2
U	U	U	O
d)	ω	Φ	ω
2	2	2	2

O CJ

Π3

C

Φ

4-1 o

cn

CO

CN (ES

2 'CO	tr	P*	p-	o	CO
0 Φ > >N -H r-l	n-	CN	LP	CN	m	CN
fl ť 0 +j n in
'í* >			Ή
> *— Φ		Ί4	r—(
C		r—1			rH
			-P		>1
	r-i	C	Φ	m	M
íj	>1	Φ		r-l	3
C	4->	P	r-H		m	>1
δ	Φ	rH	>1	C	Su	C
0	E	>1	c	Φ	3	Φ
-i-j •	f—1	+4	Φ	4->	M-t	+J
4-1	>»	Φ	•rd	r—1	i—1
cn	4->	e	4J	>1	>1	>1
Ώ 2		1	1	4-1	4-J	4J
D — cn U	<n C	(0 <w	n	Φ E	Φ E	Φ £
id Ctí	1	f-H	1	1	1	|
o a	CN	ra	rH	in	m	CP
	m	r-	σν	o		CN
>0	—	*—	,—	CN	CN	CN
'3	CN	CN	CN	CN	fN	CN
—i	tr			tr	’T	ty
N	CQ	CQ	CQ	CQ	CQ	CO

CD

O

CD

CD

P

OJ s

c <D •H •P

XJ \

o

N c

Φ

D

I (NCD

CN

CN

T

Λ

CN 5 — ;cn

m •^· >1

C o

X3

M V (0 · 44 «I >i ι-H X > o μ +j o Φ M e m I o in tw σ'

CN

CN •q·

Q

	CO
0#>	kO	0>	CO
-		«,
Z	CM	CM	CM
	CM	CM	CM

O>	m	LTl
r-	in	cc	CO	7
*	*·	*	«»
CM	CM	CM	0
CM	CM	CM	CM	CM

*7 CM O CM r**· co CM CM (C

N «—I <υ c

<

x
cŕP	CM		uc
'XX	lC	*7	CO

	m	rc	*7
	O vo	CM	Γ CC
dP	«.	»»
	CM	rc	’T
u	<7	<7	VO
	C		c
	Q)	>0	Q)
	Ό •ΓΊ	ä	Ό •ΓΊ
	*<0	>	'<Ú
	z	>	2

CM O	co r*	Γ-Ί CO	52	Γ- <7
<7	*7	*7	CM	CM

kO OA CO CO rc m

00	«—	O		CM
*7	c''	iT>	CC	CO
»»	·»	«*	w	„»
	Γ-	c-	vo	vo
VO	LD	uc	m	m
..	C	..	c
>υ £	Q) Ό	>O	Φ Ό	>O Q
	•r*i		•t-1	CL
	'«3		Kfi3	>
>	2	>	2	>

c- O cm

O C m tn

C

Q)

Ό •m 'tú >O

S >

Tabulka 2a (pokračovanie) o

D

U

O

N >

Γ4 •5Γ

C iD

Z <Tl

O _C4

Ú5 c' ó

m

Z n

>X3 ó^-

ifl (0 (0	C
44 -H ,—|	vo	CM
0 C Λ4	CM
r—1 Q) N	1	N
ϋ O> O	C	<1>
Φ 0 M	CM	U
H -P —

O I r-| >01 3 TJ >i-H (0 M u +J X! '(Ú >01 (U N '3 M -H £X 1—I

N Q) (ti O *4 +j (Z Ά ₀\o .

C 4-1 aí x: 'to O (Ú > >N -H r-4 (0 4-1 O 4-> N 01 '> >

> (0 c

OJ f~~ \O o

4)

Lí~l r~ >1

r· $	44 Φ
4_J		1		K
^-1		>		rH
4-1		x		>í
cn x: Z3		5 u	> □	4-i Ψ4
ω	ô	03		rú
1	’—		5-1	C
3	tx			I
O	CZ	m		rH
.		*7		lT)
>0		m		VO
a		CM		CM
r-H		7		*7
N		CQ		Q

CM

O m

Z

CC

O

0Ί z

rť'

JľO “o un

CM rc

O vO

Z o

CM

CC o

I kO σ>

C

CO o

I o

CC

CM

CC m

OJ

Θ f-H >1

C (Ú

M m

o

N

C

Φ

XI

CM vO vo

CM *7

CQ ’H >í c

Q)

44
e
Ό	,C,
	03
XI I	N 03
in	l i_n
0
<0	c-
Γ4	CM
3·	7
a	03

	cfP Z	CN CO K cn CN	LO VO O ΓΊ	o lP s tn m	CN tn in m	m ’S' CN ΓΊ	r* VO •k CN m	CO m	r- *k m	cn *«T K CN m
		O	Γ*	O	CN	Γ*Ί	m	cn	VO	r*
<z	—*	n*	VO	r*	vo	r*	m	,—
N	cP	·.	«k			k	V	..
		m	m	m	m	m	m			T
1—
ra
c.	—	m	o	CO	VO		CN	(N	m	r-
	ciP	CN	·-	m	VO		O	CO	m
				*.	v	•k	K	k.
	Ό	CO	CO	in	m	CN	CN	•^r	•o·
		“’T			•^r			m	m

Q)	>o	Φ	>0	fc-. Φ	>o
TJ	p	Ό	p	TJ	p
•n	a	•i™»	t-kj	•ΓΊ	a
vo		’gj	>.	'Π3
2	>	2	>	2	>

c

0)

Ό •n 'W &

CM

Tabul'ka 2a (pokračovanie)

O

u	O	m	_JN
d	CN	CN	in
u
O		c	o
N	CN	•
>	c	CN	cn
	>45	O	Q
	Z	vo	VO
	CO	Z	Z
		CO	__co
		ON	“c>
	o	O	Ό

u o

(0 (0 4J -H 22 o r—I

Φ ‘ a a Q) O Eh +J

O I >ω O

Ό >rH (0 M O +J 42 x0 >0] Φ N '0 M -H a i—I N φ (C O M 4-> « a _o\o .

C 4-> 42 X3 '(0 in

O a

Z o

ΓΊ

O r—

Z

c	m	c	aa m	o
' ŕJ		CN	CN
c Φ	CN 1	CN 1		CN }
	C	C	N	o
□	CO	cn	Φ
>Cfi	r—	·—	n

O

G)

O (0 >	m	CN
>N ·Η r—f	<—	m
(0 4-1 0
+J N W		Ή
'>·, >
> «3 C	Vu^	Ό rd
	—1	4J
2—!	(—(	φ
<— i	>	e r-H
	U-;	>1
	U	rd
2-1	2	o
cn ci i	U-i c	N
□ z	'T	(Ú
cn o	>	x
1 *“·		0
VO Z	1	i
O —	m	1 in
	m
>0	Γ'·	n·
	CN	CN
w
f—1	.
N	£2	C2

4->

Φ e

o

N (Ú •H

4-1

I in in r~ nj ^r

CQ

ΓΜ

ΓCM

CM •H a

I

I

O

M

4•H

C

I

I >-1 >1 4-> Φ e

I pyrol-2-ylmetyl^'^e Vypoč: 44,29 4,06 32,87 pCM 'T

DQ oo (CM a

z

04	LA	CA	lA	CD	ΓΑ
’—	tr	CO	VO	tr	O
*·	*.	K	K		e.
LA	LA	LO	lA	CO	CO
		r—		»—	·—

Tabuľka 2b ľO

N r—4 (fl c <

af>

dP

U

CO	T—	r**	ΓΑ	C	O-
la	«—	tr	o-	o	VO
»-	·«·	*.	·»	«»
tr	LA	tr	tr	LA	tr

CO	O>	LA	CO	o·	O
O	VO	O*	o	vo	m
*»	—	v	%»
r-	r**·	O	o	vo	vo
tr	tr	LA	in	tr	tr
c		C		C
Φ	>O	Φ	>O	Φ	)ϋ
TJ	Q	Ί3	C	Ό	Q
Ό	u,	•ΓΊ	Q,	TA	ČL
MÚ		'd	>1	MÚ	>
2	>	2	>	2	>

O (N

O

CN

C

CN

U

Φ ó

N >

« t <0 (0 (0

CN

ΓO m

Z σ' en m

O m

Z σ' m

C cn m

C m

z r~

CO σ'

P -H H
O	C 44	O
<“}	Q) N	LA
a a) H	Oj 0 O P -P -—·

E c

xn la

LA t

O tr □

>ω

0 1
j—1	>tfl 3
Ό	>i-H
(0	P ϋ
P	44 '3
>(fl	a) N
'3	P -H
Oj	rp
N	<U (fl
0	P -P
a	Oj
o\°	C -P
44	C '3
O	(0 >
>N	•H i-H
(fl	4-> 0
4J	N (fl
> 4-J C 0 o -LJ •H 4J cn	(0 C
.Q	1
□
(fl	u
1	r—
kO	CZ
O >U '3 r-1 N	cz

P

Q)

-P '<U

P

Q)

4J 'Φ >1

Ό •H

N o

Λ •H

K

Zlúč. O -substituenĽ lambda (MeOH) delta /ppni z 'IMS, perdeuterodimetylsulfoxid/, J (Hz) ľp ŕ-)|

TZ rm ^1 kO kO lP m

’nl ď

'TZ čľ\ kO cn

- -C cn

CN cn m * * CN to cn cn m ,— ’T CO ip rLP

CN m

T (N ’sO un

ΊΖ τ;

m r^

cn			CO
Ό		cn	K
*—’	cn	-Q	r—-
CN	-Ω
to		r-	c\
K	ΓΡ	T
Γ-	CO	«.
-	*. CC*	CN
O
			·.. ŕ
(N	cn	CN
		·»
co	CN
*	CO	*	C
’T	*	CO
TJ	Γ·	’T	co

’T

LP

1^

CN — ω τ r' lp —* rj| •Ol r*«. «57

Ό 'O cn ’T σι

cn rtO p

LP ’T

CO

CN ’T

CN >

1 C CO	03 U-; U □ U-i	r—| c (U 4-1
	m	in
	O	O
	CN	cm
	’T	π-
	d	ω

(Λ cn to

CN f-* cn o

in r** *r (N ·* CN O — cn cn

Γ*' o ’T CO x K lP n* cn .Q r*

ΓΡ

CN

’T	’T	CN
CO	co	tC
CN	CN	(N
*
CN	lP	T
’T	’T	’T
CN	CN	CN

tP
CO	T	P,
CN	cn	co
		CN	r*-	CN
-	50		00	CO
/—	CN	C*^	CN	CN
cn	»	cn
CT\	P	e	(N	’T
<0	T		’T	T
CN	CN	CN	CN	(N

4J

Φ e

>í c

Q)

Ή

-P

I n

<0 c

CN ’T m

>-4				rH
>1				>1
4-J				44
Φ				Q)
e				e
iH	ΓΊ	í—		rH
>1		>1	>·	>1
b 3	0	r* C	c 0 Lj	44 <44
q-t	—1		(b	<0
1		a	tí	C
n	1	1	•Ή	1
	CN	m	Cl,	<N
	C
σ> o	O	7	CM	cn
CM	CN	CN	CM	CM
	τ	’T	’T
03	Ú2	d	a	co

o>

Tabufka 3a (pokračovanie)

Ό

H x

o <4-1 r—d í“d >1

4-)

Φ

S •H

Ό

O

M

Q)

P

Φ

T3

P (P a

cn

r*·	cn	O
	*»	·»
*—·				TJ		1—
e						CO		in
·>—θ’						w
		o		CO		r-		T)l
Ν’		tn		o
CN		·»
*		r-		r-		,—»		Ί3
r*						o
		·.				«h
-				*—M		m		n ·
-		e		Ν'				N
ε		—				T)f
		n·		m				r*
»—		CN		T)l		TJ
C		*»
«»		r*		K
r*				TJ		m		a
		*·				n
*·						<		tn
-“'c		m		o		kO
								T ]
•		kO		<w
kO				kO
		T)|				cn		Ό
1		«.		s,
		σ		cn		p*·
C?						CN
—c						·»
		n*		m		kO		10
Ν’		in		CN
r*		K		·»		H
*.		kC		kc
kO						S		cn
		».		x
—		cn		cn		t—		n
cn				—·		t—		CN
-—*
		CZ		r*		\£>
n“	—-c	CN		n	—~<.
CN	tn	•u	cn	«.	cn				cn
*	Γ)	kO	r\	n	r	—-»			r\
kO					---	tn		tn	.
		*		·.		«ΜΤ
*	O		r--	—C					n*
	n·	n	m	n*	n·	Γ''·		c	Ν'
kO	*	*»	·.		·»	m		'sC
	(N	kD	CN	m	CN				CN
kO	r—	ÍOl			··	tn		n
T)1	*·		*		*.		tn
*»	·—c	·>.		«,				—L	,—
TJ	cn	T3	tn	Ό	cn	cn		tn	cn
		'‘T			***’				s-'
ν’	*—	r*	CN	CN	<—	co	n	r*
Γ	CC	10	CO	Ν’	CO	(N		N	00
*·	·»	*	*c	*	*»	«.	CN
1—	r-		r-	CN	r-	CN		CN	r-'

^r

CC

CM

CC

CO 00

CM CM

CC CC co co

CM CM <ΰ

CC CM MO =3· cr

CM CM CM

C <T cr cr

CM CM

C (U

Cfl

Ό I 3 = tn u

MO oc O CO >1 c

tu

P r—( >, P Φ e

I <0 <w rtJ

>1 JJ	H >1
Φ		P
	H	3	r4
r—	>1	<4-1
>3	C	P	c
c	Φ	3	Φ
Φ	•P	<P	p
•H	a	f—4
4J	>1	>1	>1
1	-P	P	Jj
cn	Φ	Φ	Φ
	ε I	ε 1	e
1 cd	in	tn	1 m

>0 >3

CM cr ca

<T\	O		CN
	CN	CN	CN
CN	CN	CN	CN
•^r	N·	Ν'	N
CQ	CQ	CQ	CC

<D •H q

(0 >

o >0 (C b

X

O a

CT3 m

á á

Π3 cn

X

	^7			e
	*
	ΓΜ	—,
	——	T	—*	<r
			cn	co
	««	rc
N				r*
w	C	^1	Ud
			CO	«.
		«»
Hcl	Ld	73	C-	cn
•Jl	CO
	«»
*»	Γ-	CM	—v	CT
		rc	rc	c-
73	*	*	*	«.
•H	cn	c-	rc	C·
X			O 1
O		>—-
<X	rc		*.	00
«—1	CO	*	73
q	C	rc	'	MO
ω		j	c-	—» ]
ι—1	«t		CO
>1
+J	cn	73	MO	rr-
Φ				·*—'
e.	c	C-		CM
•rH	MC	CC	rc	C-
73	*	>.
0	C*	MO	rc	r-
M			.
Φ		,__	1
X	C	cn	73	c
			'—'	—'
(U Ί3	CO	(T	CC	CO
M	rc	rc	MO	id
Φ	d-	MC	MO	C
a

*-D| xJ 'O

cn

S-\ * CO fC *ζΓ

X

Γ** CM ~0| j-> cn nO ' in r* cc CM cn

CO rc o “ crr*CM

Ld co rrw

X)

MO cn rc

CO

-i ’ST ccn

CC rc

MO cn

Z s

c

2.·

CL

XJ

Φ x

Í3

Έ ε

*	·.	cn
—·		Q	—-x		v
cn	cn	S	cn		<n
		Ld
CO	c		Ld		MO
rc	Ld	»	rc		rc
*	<K	CM
MO	Ud	r—	MO		MO
*		*	<»	cn
	—	<—·	r—*	c
cn	cn	cn	cn	-—r	cn
				rc
CO	CM	rc	rc	d	MO
d-	co	CC	*57		0
*»	•o	·»		CM
ud	rc	d*	Ld	—	ld

cn r>

^r

CM

CO

	e—	O rc	__L	MC	cn
CM	^7			(T		Ud	rc
CO	CM	«.		Ld		CM	<T
CM		3		di			CM
»	·	<T	cn	.·		.·
d*	*	CO	c	7	C	—	rc
MO	O	CM	CO	O	CO	C	CO
CM	dl	.»	CM	_CM	d4	_CM	CM
C	mJ	CM	—	O	O	O	•tľ
«Τ	rs	MO	ld	C—	id	n·*·	’T
CM		CM	CM	--	CM		CM

cn ud

O MO <T *

C MO

MO m

cn

CC

MO cn rc

CM

MO rc

LíC CCM

MO

5T

LC

S

CT		rc CO CM
CO cn
*.	··	3
CO		Ld
	G	C^
CM	CM	ΓΜ
MO	ϋ	MO
^7		CT
CM		CM

MO ^7

CM

CO Q CM CM

C*vT

CM mJ ď

^7

CC

CM ^7 <Ύ>.

CM

O — <r c CM CM ’ŇT dl • I

	r-1 c Φ		1—) >1 q 0		(-J > Mj	rH	.1 X X
XJ r- Φ □ XJ XJ	•H -P \ XJ \ 0		X! q φ 42 >1 X	i—r	iu MU X	>í -P Φ E X >1	c 03 q q <q 0		i-l X q φ x p*	0 á
cn X) O cn 1	N c Φ XJ	r-1 >1 4J ΛΙ	O +J Φ E	>«. U O MU u	3 u rc -X	-P <P Λ q	N q φ x	(-H x x	R Ό q x 1	d. rc N rC
MO O	1 OJ	e	1 Lf)	O lu	l Ld	1 t—1	1 CN	Φ E	Ld	I ld
>O '3 r-H	<0 ÍN CM 'T		O CM CN		rc CM •*T	in kO CN	<0 N3 CN 'T		CT MO CM <3·	C* CM *T
ÍS3	CQ		a		a	m	uC		G

cn

Tabuľka 3a (pokračovanie)

	7)
	·		-—x
N			cn
T*	r-'
Um	CC
m·
	r*		CC
h)l			•^r
	*»
M	m		OJ
Ό	r-m
•H
X	Ti		cn
0
m	T5		m
rH			’T
3
ifl	o*		CC
i—1 >Ί	kC r*-
P			cn
Φ	*·		—-
g	m		m
T3	m		G
0			o-
P	m
Φ			*
4->	t·.		cn
3
Φ
Ό	CO
M	Oh		•sr
Φ a	kC		r-
	·.
ω	cn		cn
ž.
N	OJ		CC
		m
	k
d,	kD		kO
ŕT		71
		n
	cn	*—	cn
Π3		OJ
XJ	z-*·»	LO	kC
i—:	in		m
0	«.	OJ
T	LD	—	n

σ\

θ'	OJ
cn	Lfh
_Q	Tt		cn
o ’T	T		CO
»	•—Μ-		o
OJ	α		CO
	kO
—'	CC
cn			cn
fO	cn
—	—r		CO
Ck	CO		θ'
	CO
-—-x	o-
cn			cn
«^r	θ'		CO
•~			Ch
-	m		«.
J-	TI		kO
ffí	T		cn
	—'
m	θ'		o
CC			*^r
*
o*	θ'		kC
-
*—»	—k
cn	cn		cn
	—’
OJ			kO
	m		’C*
*·	·.
kO	kC		m
		cn	v
	·*->·	Q.	-—s.
cn	cn	S—*	cn
kC	CO	LO	CO
o*	LO		Γ
*·	*»	OJ
LO	lO		ΓΟ

Θ
<X		——*
—'		CC
X		OJ
§		··
	kC		kD
íT3“	CC	zO	CC
e -S3 U	04	2pj	OJ
£Z '	CO	y	m
lu	<^r
	04		OJ

		r—1
		>1
		-P
XJ	r—	Φ
z— Φ	U	g ŕ—1
XJ	□
• -H	u	í—i
XJ	□	0
cn j2	u_ r-	N
čn	>-	10 X
1	-X	0
kO	1	1
O	LO	in

	o
			OJ
	kO	(“	m
	CD	cn
	OJ	o	G
	'	OJ	CO
	/“·	m	OJ
	cn
kC	n	in	T-
CO	kO	CO
OJ	OJ	OJ	oj
		^7	O
		«ζΓ	CO
OJ	OJ	04
r-l		1 0
>1		P	>1
«Ρ		-P	-P
W		•H	Φ
s		C	g
r-l		1	rH
> rH	r—*	1	>1 1
0		r-l	OJ
N	rH		I
ťO Ή	0 •H	-P Φ	H 0
P	a	E	P
1	1	1	>,
in	•*r	<—1	a

•	m
Ό	θ'	r·-
	OJ	OJ
r—1		’T
N	G	G

n o* 04 •=r	θ' θ' οι *τ	CO θ' 04
G	G	G

Tabulka 3b

N

K hli

Ί3 •H x

o m

rH ω

rH +J w

s •H

Ό

M

Φ

P

Φ

T3

L

Φ a

co

S

N “J

D

T!

- σι

	J-	CM	TJ T!	o
·.		m		£			«.		o
TJ		·»					m
TJ	Tl				*.			o
				MO	x“·*		T|		CM
	·.	»»		v—	en		|	n*	r—
o	Ό	r-		*.	«—-
r—	*—*	*.		m
«Α		r*			en		<7	x^,	x>>.
’íf	CO			*.	kO			en	en
		Tl		x—»	«»
	*			CM	r*		en
—»	m	TJ		·»				r-
in		TJ		m	-			in	*—
*.	«.				χ—·		<T	«.
en	χ—*			Ti	c			kO	CC
	m	O			-~_x
T|	X	O
		*.		σ	o			X-^	X—S
*.	CO	r*			^r				en
σ	en
	·»	·*		CM	C		en	kO
	in	x—*		r—
0>		r-		*				TI	TI
co	*»	*»			x—		^r
K		r-			en
en	en			*	•—			TJ	TJ
	X)	Ti		x-*·			x—s
*	—'			kO			in
-—·		*		*	kO			x—	o
m	x—	TJ		CC			e'c	co	kO
r-	»»	-—χ			<c
»»	m			Ti			j	m
en		en			w
	*·	O		-	x-—'
*		«-		σ	£	.—-		x-^	X--
σ	m	kO				en		en	σ'
·*	*»				-¼	>—x		-^_x
	m	*	x'-s	1—			m		c
*—		x—*	en	σ	en	kC	o	o
	Tl	en	·—	<u	o^x		«.	c*	n*. |
ti				en			en
1	*·		c		en	CC		LD	«.
»*	4-J			*.	CC				TJ
TJ	·—χ	in	·»	x—s	«.	s.
T		*	co	c	m	x—»		x—K
x	iTi nr	kO		X			X	3	•ΞΤ en
	*►	»»	x“».		X—A.
CM	*T	-—·	m	CM	CM	Γ	CM	m	C-
		en	*»	«—x·	-	o	^_x
		-—x			kO	«,			,,
CM	x—'			C*		c-	•*r	m
kC	m	CM	m	kC	T f		<2		i_n
*»	*	O		-		•w	M.		«»
m	m	*	·.	en	x	X—K	c^.	X-K.	en
			TJ		T	s		c
m	·*		x	03	•—X	•>_x	fO	T·
	o	«*							__
m	*	x-“	o	Γ-*	m	CC	c*	k£3
m	*T	o		m	-nr	CC	m		in
*		»	•A	«.	<K	«.
m	Tl	<0	r-	en	in	n*	en	m	T

t>l <c m

x s

(C n;

ST	3
					CM	C
		x—s			«·	c
c-		CO	CM	C'	—“	en	in
CC	O	CO	m	CO	o		CC
CM	CM	CM	CM	CM	CM		CM
*>	F—	*		s.
kC	U	O	r—	σ	O	σ	kC
	e<	^3*	*ÍT	<0		CC	*T
CM	*—’	CM	CsJ	CM	—	CM	CM

c

Q)

AJ σι

XJ □

ω i

Ά>

O >

r· č

&

n.

>G '3 r-M

N >,

Ό •H

N

O

Λ •H «

>1 c

Φ

-H +J n

o

N

C

Φ

XI

I

CM +J

Φ e

c

Φ +J ao <O

CM •3·

C3

MO

Γ·

CM

T

CC r~CM 'T

CQ

Počiatočné alkoholy RR'CHOH sa zvyčajne získali redukciou zodpovedajúcich aldehydov, často bežne dostupných, nátriumbórhydridom. Pre prekurzory esteru B.4229 a nitrilu B.4273 sa použili rôzne metódy. Sacharóza sa previedla¹ cez 5-chlórmetylfurfural na 5-hydroxymetylfurfural. Oxidáciou² tohto aldehydu vznikla kyselina karboxylová, ktorá sa esterifikovala, postupom opísaným Bocchim a kol.,³ na metyl-5-(hydroxymetyl)furoát,⁴ ktorý sa vyžadoval pre B.4229. Oxím⁵ aldehydu sa dehydratoval postupom opísaným Carottim a kol.,⁶ na surový reakčný produkt sa pôsobilo koncentrovaným vodným amoniakom v metanole pred extrakciou dichlórmetánom. Destiláciou sa získal alkohol 5-kyánfurfuryl,⁷ potrebný pre B.4273.

Pre B. 4266 sa Vilsmeierovou reakciou¹³ benzofuránu získal

2-aldehyd, ktorý sa redukoval na požadovaný alkohol,® zatiaľ čo pre B.4226 sa litiáciou a pôsobením dimetylformamidu získal

2-aldehyd a previedol sa na alkohol.¹⁰

Pre B.4274 sa dimetyltartrát oxidoval¹¹ na metylglyoxylát, ktorý reagoval¹² s tozylmetyl-izokyanidom za vzniku metyl-oxazol-5-karboxylátu.¹³ Tento sa redukoval lítiumalumíniumhydridom postupom, ktorý opísal Fallab,¹⁴ na alkohol.¹⁵

Pre B.4275 sa z brómmalónaldehydu¹⁶ a tiomočoviny získal

2-aminotiazol-5-karboxaldehyd.¹⁷ Deamináciou amylnitritom,¹⁷ s následnou redukciou nátriumbórhydridom vznikol 5-hydroxymetyltiazol.¹⁴

Pre B.4271 sa alkohol 5-azapiperonyl (teplota topenia 82 -84 C) pripravil zo zodpovedajúceho aldehydu.¹®

Analýza pre C^H^NO.^:

vypočítané: 54,90 % C, 4,61 % H, 9,15 % N; nájdené: 54,60 % C, 4,58 % H, 9,09 % N.

Pre B.4278 sa nitroval¹® l-metylpyrol-2-karboxaldehyd a redukoval na alkohol²⁰ nátriumboridom.

Ako konkrétny príklad bude teraz opísaná príprava O⁶-tenylguanínu (B.4205).

Príprava 0⁶-tenylguanínu

Na roztok 3,18 ml (33,6 mmol) tenylalkoholu v 3 ml dimetylsulfoxidu sa pôsobí 60 % hydridom sodným v oleji (0,48 g, 12 mmol), najskôr za opatreného miešania. Po 1 hodine sa pridá 1,37 g (6 mmol) 2-amino-N,N,N-trimetyl-lH-purín-6-amóniumchloridu a v miešaní sa pokračuje ďalšiu hodinu. Pridá sa 1,0 ml kyseliny octovej, krátko sa ochladí a zmes sa zriedi so 180 ml éteru. Po 1 - 2 hodinách sa izoluje 2,09 g pevnej látky. Odparením éteru z filtrátu a destiláciou dimetylsulfoxidu a nadbytku tenylakoholu ( s teplotou varu 48 - 57 'C, pri tlaku 26,7 Pa) zostane zvyšok, ktorý sa trituruje éterom a získa sa 0,36 g druhej pevnej frakcie. Zmiešané pevné látky sa rozotrú (triturujú) so 6 ml vody, čím sa získa 1,335 g produktu (výťažok 90 %) vykazujúceho silnú škvrnu pri chromatografii na tenkej vrstve pri použití zmesi benzénu a metanolu v pomere 4 : 1 ako elučného činidla s ojedinelými stopami nečistôt. Rozpustením v 30 ml horúceho, etanolu, vyčerením filtráciou cez Celit a zahustením na 10 ml pri použití rotačnej odparky sa získa 1,125 g B.4205 vo forme solvátu obsahujúceho 71 % materiálu a 1/3 etanolu na mol.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde Y predstavuje R''XCHR''' (seco-nukleozidy) sa môžu pripraviť analogicky prípravou na reakciu O⁶-benzylguanínu s α-chlórétermi (MacCoss a kol., Tetrahedron Lett.; európska patentová prihláška č. 184 473, loc. cit.) alebo s alkylbromidmi (napríklad Kjellberg, Liljenberg a Johansson, Tetrahedron Lett., 27., 877, (1986); Moschel, McDougall, Dolan, Stine a Pegg, J. Med. Chem., 35, 4486 (1992)).

Typické cukrové zložky zopovedajúce R''XCHR''', ktoré vedú k seco-nukleožidom, vznikajú postupmi, ktoré opísali napríklad McCormick a McElhinney, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 93, (1985); Lucey, McCormick a McElhinney, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 795, (1990).

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde Y predstavuje ribozylovú alebo deoxyribozylovú zlúčeninu (nukleozidy), sa môžu pripraviť postupmi analogickými ku syntézam O⁶-benzylguaninu-ribozidu a 2-deoxyribozidu (Moschel a kol., (1992); porovnaj Gao, Fathi, Gaffney a kol., J. Org. Chem. 57, 6954 (1992); Moschel, Hudgins a Dipple, J. Amer. Chem. Soc., 103. 5489, (1981)) (pozri vyššie príprava ribozidov).

Priemyselná využiteľnosť

Množstvo zlúčeniny podlá vynálezu, ktoré sa má použiť sa líši v závislosti od účinného množstva požadovaného na liečbu buniek nádoru. Vhodná dávka je taká, ktorá bude viesť ku koncentrácii zlúčeniny podľa vynálezu v bunkách nádoru, ktoré sú liečené, ktorá povedie ku zníženiu aktivity Atázy, napríklad asi 1 - 2000 mg/kg, s výhodou 1 - 800 mg/kg, predovšetkým 1 - 120 mg/kg, pred chemoterapiou alkylačným činidlom.

Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu sa môže vyrábať v bežných formách s bežnými vehikulami, ako bolo opísané napríklad vo WO 91/13898, ktorej obsah je týmto včlenený do prihlášky. Prostriedok môže obsahovať inaktivátor podľa vynálezu spoločne s alkylačným činidlom; alebo sa prostriedok môže skladať z dvoch častí, jedna obsahuje inaktivátor a druhá alkylačné činidlo. Postup podania zlúčenín podľa vynálezu hostiteľovi môže byť tiež bežným postupom, ako bolo napríklad opísané vo WO 91/13898. Pre podanie inaktivátora podľa vynálezu pacientom, farmaceutický prostriedok môže výhodne obsahovať inaktivátor vo vhodnom vehikule, ako je 40 % polyetylénglykol 400 vo fyziologickom roztoku, alebo vo fyziologickom roztoku alebo 3 % etanole (vo fyziologickom roztoku), pre intravenózne injekcie alebo môže byt vo forme práškov vo vhodných kapsulách pre perorálne podanie.

Alkylačné činidlá sa môžu podať podľa známych spôsobov a bežných foriem podania, ako je opísané napríklad vo WO 91/13898 alebo s výhodou ako jednotlivá dávka bezprostredne po podaní alebo do 24 hodín, ale výhodne okolo 2 hodín po podaní inaktivačných činidiel Atázy a tiež v nižších dávkach ako sa použijú, v štandardnom liečebnom režime. Redukcia dávky môže byť nutná, pretože o inaktivátoroch sa vo všeobecnosti predpokladá, že vedú ku zvýšeniu toxicity alkylačných činidiel. Medzi príklady chlóretylačných činidiel patrí l,3-bis-(2-chlóretyl)-1-nitrózomočovina (BCNU), l-(2-chlóretyl)-3-cyklohexyl-l-nitrózomočovina (CCNLJ), fotemustín, mitozolomid a klomeson a tie, ktoré opísali McCormick, McElhinney, McMurry a Maxwell, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 877, (1991) a Bibby, Double, McCormick, McElhinney, Radacic, Pratesi a Dumont, Anti-Cancer Drug Design, 8., 115 (1993). Medzi príklady metylačných činidiel patrí temozolomid (britský patent GB 2 104 522) a dakarbazín, prokarbazín a streptozocín.

Metódy

Purifikácia rekombinantnej Atázy

Klonovanie cDNA a prílišná expresia (overexpression) ľudskej Atázy bola už prv opísaná'²³ Purifikácia rekombinantných proteínov sa dosiahla alebo afinitnou chromatografiou na DNA-celulózovom stĺpci, ako opísali Wilkinson a kol.,^2S'^2S alebo pomocou iónomeničov na DEAE-celulóze. V prípade posledne uvedeného postupu sa proteín Atázy čiastočne purifikoval precipitáciou síranom amónnym (30 - 60 %) a dialyzoval oproti 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT (ditiotreitol) 2 mM EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová), 10 % glycerolu, pred nanesením na stĺpec DEAE-celulózy. Atáza sa potom eluovala s gradientom 0 - 0,1 M chloridom sodným. Purifikovaný ľudský proteín Atáza si zachováva aktivitu počas viac ako roka, ak sa skladuje pri vyššej koncentrácii ako pri teplote -20 ’C v pufrovacom systéme I [50 mM-Tris/HCl (pH 8,3/3 mM-ditiotreitol/-/1 mM-EDTA] a mohol sa rozmraziť a zmraziť niekoľkokrát bez zjavnej straty aktivity.

Inkubácia s inaktivátormi a skúška Atázy

Testované zlúčeniny sa rozpustili v dimetylsulfoxide na konečnú koncentráciu 10 mM a rozriedili sa tesne pred použitím v pufrovacom systéme I obsahujúcom 1 mg/ml hovädzieho sérového albumínu (IBSA). Rekombinantná Atáza sa rozriedila v IBSA a titrovala sa, aby reakcia prebiehala pri podmienkach limitovaných Atázou a nie substrátom. V každej skúške sa stanovené množstvá Atázy (60 - 75 fmol) inkubovali s rozličnými množstvami O^e-benzylguanínu alebo testovanej zlúčeniny v celkovom objeme 200 μΐ IBSA obsahujúcom 10 gg DNA teľacieho týmu pri teplote 37 ’C počas 1 hodiny. Pridal sa [³H]-metylovaný DNA substrát (100 μΐ obsahuje 6,7 μg DNA a 10 fmol O⁶-benzylguanlnu) a inkubácia pokračovala pri teplote 37 °C počas 1 hodiny, až sa reakcia ukončila. Nasledovala kyslá hydrolýza DNA, ako bolo prv opísané,²¹ [³H]-metylovaný proteín sa izoloval a množstvo sa určilo pomocou scintilácie v kvapaline. Vzorky sa typicky skúšali v duplikáte a experimenty sa opakovali niekoľkokrát. I je požadovaná koncentrácia inaktivátora pre dosiahnutie 50 % zníženia aktivity Atázy.

Bunková kultúra a príprava extraktov

Cicavčie bunky sa kultivovali pri štandardných podmienkach. Napríklad bunky Raji (ľudská lýmfoblastoidná bunková línia z Burkittovho lymfómu) rástli v suspenznej kultúre v médiu RPMI zásobenom 10 % konským sérom. Bunky A375 sú ľudské bunky melanómu, z ktorých sa vytvorili nižšie opísané štepy po subkutánnej injekcii do bezsrstých myší: bunky WiDr sú ľudská bunková línia karcinómu hrubého čreva: škrečok + 120 bunky sú mitozolomidom selektovaná sublínia bunkovej línie V79 pľúcneho fibroblastu čínskeho škrečka zvané RJKO: bunky Yoshida sú bunková línia karcinosarkómu krysy a YR je ich sublínia rezistentná voči busulfánu: XP bunky sú bunkovou líniou SV40-transformovaného fibroblastu pôvodne z kože pacienta s Xeroderma pigmentosum, pHMGhAT2b bunky sú klonom týchto buniek, ktoré boli tranfektované expresívnym vektorom pre cicavčie bunky obsahujúcim cDNA ľudskej Atázy a pHMGla bunky sú klonom, ktorý bol transfektovaný len expresívnym vektorom (t.j. neobsahujúci cDNA ľudskej Atázy. Bunkové granuly sa resuspendovali v chladnom pufrovacom systéme I (4 ’C) obsahujúcim 2 μg/ml leupeptínu a sonikovali sa počas 10 s pri vlnovej dĺžke 12 μιη. Po ochladení v ľade sa bunky sonikovali počas ďalších 10 s pri vlnovej dĺžke 18 μιη. Bezprostredne po sonikácii sa pridalo 0,01 objemu 8,7 mg/ml fenylmetánsulfonylfluoridu v etanole a sonikáty sa centrifugovali pri 15 000 g počas 10 minút pri teplote 4 'C pre vytvorenie granúl zo zvyškov buniek. Pre supernatant sa stanovila aktivita Atázy (pozri nižšie).

Stabilita inaktivátorov pri teplote 37 ‘C mM inaktivátorov v dimetylsulfoxide sa zriedilo na 0,1 mM predhriatím v odplynenom pufrovacom systéme I (1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,3) alebo v PBS (pH 7 - 7,2). PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrom) obsahuje 0,8 % NaCl, 0,02 % KC1, 0,15 % Na H PO , 0,02 % KH PO , s pH 7,2. Vzorky sa bezprostredne preniesli na spektrofotometer CARY13 (kyvetový blok udržiavaný pri teplote 37 °C) a skúmali sa pri príslušnej vlnovej dĺžke (podía spektrálnych vlastností zlúčeniny) v 3 - 10 minútových intervaloch počas až 80 hodín. Výsledky sa zaznamenali ako percento zmeny absorbancie oproti času a z tohto sa extrapolovali hodnoty T 1/2 (polčas).

Inaktivácia aktivity Atázy v cicavčích bunkách

Bunky sa rozriedili na 10⁶/ml v kultivačnom médiu obsahujúcom alebo príslušnú koncentráciu inaktivátora alebo ekvivalentný objem vehikula (dimetylsulfoxid). Nasledovala inkubácia pri teplote 37 C počas 2 hodín, bunky sa izolovali centrifugáciou, premyli dvakrát v PBS a výsledné bunkové granuly (medzi 1 - 2 x 10⁷ v granule) sa uskladnili pri teplote -20 'C. Aktivita Atázy sa určila, ako bolo opísané vyššie, v dvakrát sonikovaných extraktoch buniek a zaznamenala sa ako percento zostatkovej aktivity vztiahnuté na aktivitu v neošetrených kontrolách (napríklad 350 - 450 fm/mg v bunkách Raji). Hodnoty I (t.j. koncentrácia inaktivátora požadovaného na zníženie aktivita Atázy na 50 %) sa extrapolovali z týchto údajov.

Senzibilizácia buniek Raji a A375M na BCNXJ a temozolomid

Senzibilizácia buniek Raji na cytotoxické účinky BCNU a temozolomidu po 2 hodinách predošetreni inaktivátorom sa analyzovala pomocou XTT-testu.²² V krátkosti, bunky sa naniesli na doštičky s 96 jamkami v množstve 1000 buniek na jamku a inkubovali sa pri teplote 37 ’C počas 30 minút pred pridaním média obsahujúceho alebo príslušnú koncentráciu inaktivátora alebo ekvivalentný objem vehikula. Nasledovala 2 hodinová inkubácia pri teplote 37 ’C, pridalo sa médium obsahujúce buď zvyšujúce sa dávky BCNU, temozolomidu alebo ekvivalentné vehikulum a bunkám sa umožnil rast počas 6 dní. V tomto čase sa pridal roztok XTT a bunky sa inkubovali počas ďalších 4 hodín pri teplote 37 ’C. Výsledný červenooranžový formazanový reakčný produkt sa kvantifikoval pomocou merania absorpcie pri 450 nm na zariadení na meranie v mikrotitračných doštičkách.

Senzibilizácia buniek YA375M na cytotoxické účinky BCNU sa analyzovala MTT-testom,^2X1, líšiacim sa od XTT-testu opísaného vyššie nasledovne. Bunky A375M (1000 na jamku) rástli počas 24 hodín, potom sa na ne pôsobilo inaktivátorom a o 2 hodiny neskoršie BCNU. Po 6 dňoch sa pridal roztok MTT (4 mg/ml) a bunky sa inkubovali počas 3 hodín pri teplote 37 ’C. Médium sa odsalo a výsledné nachové formazanové kryštály sa rozpustili v 120 μΐ dimetylsulfoxidu a životaschoponosť buniek sa stanovila meraním absorpcie pri 540 nm pri použití zariadenia na meranie v mikrotitračných doštičkách .

Z týchto údajov sa stanoví percento rastu buniek vzhľadom k rastu v kontrolných jamkách, pre rad dávok BCNU alebo temozolomidu, alebo v prítomnosti alebo neprítomnosti inaktivátora. Senzibilizácia Raji na BCNU (D_go.C/D_gQ.l) sa určila delením D_go (t.j. dávka, pri ktorej bol 90 % rast oproti neošetrenej kontrole, t.j. 10 % inhibícia rastu) vypočítané z údajov pri použití samotnej BCNU (D_gQ.C) hodnotou BCNU plus inaktivátor (D_go.I)???. Hodnota (1) teda označovala, že nenastala žiadna senzibilizácia inaktivátorom. Senzibilizácia buniek Raji na temozolomid a senzibilizácia buniek A375M na

BCNU sa určila pri použití zodpovedajúcich hodnôt D_so (t.j. dávky, pri ktorej bola 50 % inhibícia rastu).

Citlivosť cicavčích buniek na inaktivátory alebo produkty ich hydrolýzy

Na stanovenie účinkov samotných inaktivátorov na rast buniek sa bunky Xeroderma pigmentosum a bunky V79 čínskeho škrečka vystavili zvyšujúcim sa koncentráciám (až do 600 μΜ) vybraných inaktivátorov počas 2 hodín pri teplote 37 ’C.

V niektorých prípadoch sa inaktivátory podrobili hydrolýze pri teplote 37 ’C počas 20 hodín a potom sa pridali k bunkám Raji, s cieľom stanovenia rozsahu, v ktorom môžu produkty rozkladu činidiel inhibovat rast buniek. Po 6 dňoch sa určil rozsah rastu buniek, ako bolo opísané vyššie.

Senzibilizácia buniek kostnej drene na temozolomid (GM-CFC test)

Pre test buniek tvoriacich granulocytárne makrofágové kolónie (granulocyte/macrophage colony forming celí assay, GM-CFC test) sa získali vzorky primárnej kostnej drene od pacientov podstupujúcich kardiotorakálnu operáciu. Nasledovalo odstránenie erytrocytov zo vzorky, bunky sa naniesli na doštičky v množstve 1 - 2 x 10^s/ml v 30 mOsM média Iscoves obsahujúceho 10 μΜ inaktivátora alebo ekvivalentný objem dimetylsulfoxidu, 20 % fetálneho teľacieho séra, 10 % média upraveného 5637 ako zdroj rastových faktorov a 0,3 % inertného agaru, v 1 ml Petriho miskách obsahujúcich príslušnú dávku temozolomidu a inkubovali sa pri teplote 37 ’C v atmosfére 5 % CO^ a 95 % vzduchu. Po 9 dňoch sa spočítavali kolónie obsahujúce viac ako 50 buniek. Kolónie predstavovali prekurzor buniek granulocytárnej mikrofágovej línie (huGM-CFC). Prežité sa zaznamenali ako percento počtu kolónií pri nulovej dávke temozolomidu.

Štúdia štepov

Zvieratá

Samci myší bez týmu odvodení z BALB-C (nu/nu arytmický) vážiaci medzi 25 - 35 g sa získali z kolónie Patersonovho inštitútu pre výskum rakoviny (Paterson Inštitúte for Cancer Research, Christie Hospital NHS Trust, Wilmslow Road, Manchester M20 9BX, Veľká Británia (ASU myš). Zvieratá sa umiestnili v sterilnom prostredí až do času požadovaných experimentov. V jednom experimente sa myši získali z Harlan-Olac, Harlan UK Limited, Shaw's Farm, Blackthorn, Bicester, Oxon. 0X6 OPT, Veľká Británia (OLAC myši). Tieto myši vážili medzi 17 - 23 g a následne sa zistilo, že sú podstatne viac citlivé na toxické účinky liečby kombináciou (inaktivátor a BCNU). Z toho dôvodu sa podali nižšie dávky.

Bunky

Bunky A375M (ľudského melanómu) rástli v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra. Bunky sa pripravili pre inokuláciu in vivo inkubáciou s 0,01 % trypsínom.

Nádory

Bunky (10⁶) v 100 μΐ PBS sa injektovali subkutánne do pravého boku 8-10 týždňových nu/nu atymických myší. Týmto bunkám sa umožnilo rozvinút sa na nádor v priebehu 3 - 4 týždňov s cieľom pasážovania do experimentálnych zvierat. Bloky nádoru s veľkosťou 2mmx2mmx2mm sa implantovali subkutánne do pravého boku. Tieto zvieratá boli pripravené na použitie v experimentoch s inaktivátorom za 7 - 10 dní.

Lieková liečba

Nu/nu myši sa ošetrili intraperitoneálne buď 30 alebo 60 mg/kg O^ä-benzylguanínu, alebo B.4205 a použili sa tiež príslušné kontroly s vehikulom, 60 - 90 minút pred intrape43 rineálnym podaním 10 - 25 mg/kg BCNU. O⁶-benzylguanín a B.4205 sa pripravili ako 5 mg/kg roztok v kukuričnom oleji a BCNU (2 mg/ml) v PBS + 3 % etanolu.

Meranie nádorov

Meranie nádorov sa uskutočňovalo každý deň až každý druhý deň pracovníkmi pri použití digitálnych kaliprov. Objem nádora sa spočítal pomocou vzorca (hĺbka x výska x dĺžka) π/6. Experimentálne zvieratá sa tiež vážili každý deň až každý druhý deň. Meranie pokračovalo do času, kým nádory kontrolných zvierat dosiahli maximálny prípustný objem (t.j. 1 cm x 1 cm x 1 cm) .

Výsledky

Tabuľka 4, 5 a 6 uvádzajú fyzikálne, biochemické a in vivo údaje pre každý z inaktivátorov. Uvedené testy sú vysvetlené v metódach.

rr n:

CO

CO m

X

A o m co o ao

VO CM cx >- x 24 3.

c m o

N ’CT c

c

CM x

CM c

o cn

C c

ó x

vo

CM vo m

CO —’ ' cn

CM C2 \ c. kO > A f*· c

vo o

vo

Λ vo

A vo

A

CL >

Φ £

'Φ

4J w

>

ω

VO

A vo

A lH

Φ o

ω c

ť—

CM c c θ’ o

VO <r>

CM

CO

A

in

Γ*Ί ’C c

— *“ o *T O rr

Al — CN

CM vo

CM o

ΓCM m

CM ir.

CM

LC

CM

K

O _CM

o -P w

c Ή c

o _ΓΜ

C _CM

,<\j

n

(Ú

ršj

ČM

\

1

3

\

H

r—i

cn

•

•

>

r-í

c

c

>-S

C

P)

v_

r·

c

£

Ή

ω

P

C

c

Ή

CO

C

e

x

φ

2

S

A

c rtj ľ3

C (C

□ CP

(0 3

r—I >1

o Φ

ε t—l

n cn r-A

σ

0

σ

3 cn

θ'

C

S

>1

>

AJ

rj

φ

rH

P

f-4

ί-

'Π3

>

rJ

□

>

•ri

□

0

ο

> •Ά AJ 44 (C

N C % I

>1 rj (0 1

m o AJ rr

(AJ Vu n Aj j

m o CM

C φ -P 1

vo o CM

4J 1 CP 1

c Ή C B

σ\ o CM

4-1 1 n I

o CM

44 •fH CU 1 CM

CM

44 • •A Cj 1 m

C H-f

VO O

<0 o

cn

VO O

cn

«0 o

'T cn

i 0 O

3 σ'

*T cn

Ό O

tn

1 VO O

cn

! kO O

m hj*

Φ •H c

(0 >

o >0 (0

Ll

O a

>3

4ť _c ο

cn §

b σ\ č?

m c

4>c

C

N <-* δ

ω r~ o>

C CM s

in“ o

P' CM

CM — cn

CM C \ a >

CM

P~

4>

Λ c

UC

=- > in

CM

O c

in r— o

o vo

Λ co iT) in co

OJ o

z ťu cn

Γ\ •a

C

JJ g

cn

CN lP tn

CN — 2P

VC _Lr

CN CN

VO

CN u

jj 'Π3 >

o >

r*

Q

P4 έ c

Ή

C (C b

w f—I >1 44 φ ε a p

M aj c

I

CC (-q >1

CM

C

Φ rH

Φ e

I (Ú M—I c

Φ rd

Φ ε

I «3 (44 c

Ή c

(ú cn

Π3

C

CM *T ca

C_

F \o

C

. í

C O (0 i C

CM cr

M	Ή	P'	M
O	C	—	0
1	(B	CN	I
J	3		)J
Q	tn	C	Q

Π3 c

Ή C (0 a

CM tt cH >n

CM

C

Φ £2 rd

Φ ε

I

I ΰ

O σ'

CM

C7

ΓΠ >1 c

Φ •rd

I cc q '-^'r4 I C rH CO \3 1 tn « \ O p-l I >1 J 44 Q Φ

B.4220

O⁶-(5-metyltenylJguanín 261

(N in

CH (fl z-sz >· s.

c

5. c

N

U3 ·— i.

N Z. r- .—' δ

ω c

HO

CH

Tabuľka 4 (pokračovanie) tn

CH C \ 2>

in <z

O . e

U 'OJ

> w

'.C (fl >

ιΟ

JU <fl >

4J u:

(fl c

HO

Ί\ vc

0\

LCí

CH

I

CH

CH

T d

rH
>
Xh
3
<w
M
3	O
tu	n
rH	X
	CH
+J!	x
<D	cH
g	•
1	c
m	Ή
	C
1	<a
ϋ	3
O	cn

>· \o m

O CH c e

Γ o

lA	CA	o
VO	O	o
	«.	*
c	O	o

O C·' \£ CH

CH C'

I

			>,
	c		44
	Ή		Φ
	C		g
	(fl		rH
	3
	σ		c
			Φ
	r4		Ή
			44
	C		\
	(U		Λ
	44		\
	r-j		0
	>4		N	CC
	44		C	Q
	<D		Φ	s
	g f		xs 1
AJ	1 CA	vO	t AJ	d	CA
AJ		AJ			AJ
AJ		AJ	1	C	AJ
<r	1	«a*	J	03	<r
	Ό		XJ	□	>
CC	O	CC	o	C1	CO

c

HC t£>

CC

I

H >1

U «U

S-l tu (—1 c

o

Ä

M (fl

CH

O

Q) e

i m

t e

O rH >,

N

C

Q)

		Λ O
		> (S
c CN		X x O CH
		44 \
LA		Φ H
*		g ·
		1 c
c	Η»	CH VH
'U	fA	- C	ΓΑ
c (fl —t	AJ	1 (0 « 3	AJ <r
-J σ	CO	o σι	C3

15-karboxyfur ftiryl )guani n

O o

Q í?

o;

> Z -X 3 C ĽV 3 **·

-Q O r'

Tabulka 4 (pokračovanie) ω

CM C2 \ o.

z>

VO

Λ c

uC

- — vo s c03

5- > U3 in cc

C

vo a

cc

CM '03 >

cn

C cc cc vo

CM

CO o

CM

LC.

CM u

4-1 '03 >

cc lc

c	1	O (S
Ή	r-t	S
C	>,	(N
m	4->	.
3	Φ	C
tP	e	>rt
	r-t	N
r-í	>1	0
>	C	C
4-1	(0	(0
Φ		3
ε	3	tP
r-f	M-t	r—t
> i 1	0	>1

N

C

S q

(0 &|

C

OJ

4-1

S '0

CP >

c o

u \3

m vo CM

c 1 c-!

š š

kO vo CM

Xí 1 (N —r

d c

00 vo CM

Φ £X •H a

vo

H Λ 1 m

c*

03 N 03 1 in

O 4-1 ω

CC Γ

'03 > T UC

7

1

7

1

03

7*

1

CM

|

CM

x

7

CM

--,

•

\o

*

'0

3

Ό

7

1

7

1

7

1

C2

o

ω

o

O

rf\

O

t0 o

C

kO O

CO

VO C

M

O

Q a

ra >· Σ 2í X S ^1/1 Ú c

N n

Tabuľka 4 (pokračovanie) ω

CN G \ t, >

in ra r*

'ra

^r r(N r'in ru

-T

LO ^r

CN ’T cm u

J-l '10 >

2Í (O c

>—t rr r— (M

TT <a

C

Ή

C (0 σ>

>1

P <U E r—I >, i—I O N (0 X O i in i

Ό

O o

CN 'T

>1

C

Q)

-P r-( •P

OJ

S i-l

-P

Φ

E

C

Φ m

Γ'

CM

Ό· £Q

rn	o		\ Λ
r-i	n		\	o
0	X		0	N
N	CM		N	x
03	\		C	•
•H			Φ	c
-P	•		XJ	Ή
1	c		|	N
m	M	50	CM	O
	c	f** CM		C
1	(0	*T	1	(0
ψ	□	•	Ό	3
O	cn	C3	O	cn

r· r* r* <N sr ω

r—í

O

2Í •Ή

CL, l

*3*

I \o

O

Π.4278

O^&-(l-metyl-4-nitropyrol-2-ylmetyl)guanín 298

(Z r*· >* 2 VZ — £

r c

N

Tabuľka A (pokračovanie) cn

CM C2 \ C>

IT.

CM \

Φ • 6

S- \<D ť

r* Ui

- >

> U) !Ti

C tn

	0 M X CM \ H
u		c Ή N 0 c (TJ 3
0		cr
XJ		i—1
'<n		>1
>		c
I-t	0	Φ
XJ	r**
4C	CM	4-1
(0	’T	1
C		«
1-*	C2	O

-3·

Φ r-i

Λ ro +J (0

Ό

C

Φ

Cr

Φ

J >

O

P c

Φ •H

Cl

Φ

Ch

X

Φ

JC

O c

4-i (0

4-1 o

E (0

U1 co

N

Cl

Φ

E

Q) •H

Ci a

'(0 c

φ

E c

c

N

X in

Talxil ka o

Ifl

H

4=

O '<0

C

J2 x: (0 O -H ή q >ο Ή > Ή (0 o '<α •h q o >o

OJ > c 3 03

N 'CO <

<0 •H o

'<0 >

•H q

C

H

VX3
44	U	CÍC	CO	CN
(0	a	o	o	C
Ό	• *H		«.
3	S	o	o	C
		Λ

'CO
44	•H	c	T
tn	•m		c
Ό	03
3	a	o	o
H

'<0 tn

Ό a

Q_.

X

CO c

c

CN

C

C

q	03
Ή	Ό
tn	•r4	T	Ό	CM
r~	r—	C	O
>	cn
L	0	O	C	O
*	>

(0

H

O q

>0

Q)

Í4

W c

ÍN

C cn m cn — σ o o c u

o

4J 'CO >

4J (0 c

C □

σ' i—l >

N

C cn

O

CM

T ω

un

O

CM

T

CQ

Inaktivátor

Tabulka 6

A375M senzibilizácia (D .C/D .1) '50 ' so *

0,5 μΜ 1,0 μΜ 5,0 μΜ

O⁶-benzylguanín O^s-alylguanín B.4203 B.4205 B.4206

B. 4209

B.4210

B.4212

B. 4213

B.4220

B. 4221

B.4222

B.4226

B.4229

B.4234

B.4266

3,1	2,3	4,2
1,3		1,9
2,0		2,5
2,8	2,3	3,5
3,3		4,6
	2,5
	1,5
2,3		2,5
	2,0
	1,3
	1,0
	1,4
3,8		4,5
	1,8
	0,8
6,3		6,3

Tabuľka 7 znázorňuje toxický účinok samotného inaktivátora na bunky kostnej drene získané od pacientov A E, vrátane rovnakých pacientov C - E na obrázku 17. Výsledky pre B.4205 sú porovnateľné s výsledkami pre O^ä-benzylguanín. Bunky pacienta B boli skoro dvakrát citlivejšie na BeG i B.4205 v porovnaní s ostatnými vzorkami.

Tabuľka 7

Toxicita inaktivátora (10 μΜ) v bunkách kostnej drene

Pacient	Dátum experiment	Počet kolónií ako % kontroly (t.j. bez inaktivátora)
O6-benzylguanín	B.4205
A	05/02/93	95	91
B	25/03/93	46	46
C	17/05/93	88	97
D	05/05/93	88	118
E	05/05/93	89	89

Zhrnutie '

1) Všetky zlúčeniny boli testované na schopnosť inaktivovať rekombinantnú ľudskú Atázu pri štandardných podmienkach v skúške in vitro. Pri týchto podmienkach dve zlúčeniny (B.4214 a B.4217) neinaktivovali Atázu až do najvyšších použitých koncentrácií, ale tu sa jedná o zlúčeniny, v ktorých R predstavuje metylovú skupinu. Zvyšok zlúčenín inaktivoval Atázu s hodnotami I v rozmedzí od 0,0045 až do 95 μΜ. Osem Zlúčenín (B.4205, B.4206, B.4212, B.4226, B.4266, B.4269, B.4273, B.4275) malo hodnoty I_so nižšie ako BeG (tabuľka 4).

2) Inaktivátory sa podrobili hydrolýze vo vodnom roztoku pri rôznych rýchlostiach (polčasy 0,17 až viac ako 80 hodín), ale toto nebolo vo vzťashu s ich účinnosťou ako inaktivátorov Atázy.

(tabuľka 4)

3) Zlúčeniny, ktoré boli účinné pri inaktivácii Atázy in vitro (IC_so je nižšie ako 1,0 μΜ), tiež inaktivovali Atázu v ľudských bunkách s hodnotami IC_so, ktoré boli vo všeobecnosti len málo (v priemere približne 1,5 x) vyššie ako sa zistili pri použití rekombinantného proteínu v skúške in vitro.

(tabuľka 4)

4) B.4205 inaktivovala Atázu v bunkách ľudí, krýs a čínskeho škrečka s podobnou účinnosťou (hodnoty I_so 0,02 0,03). Pre B.4203 bolo rozmedzie 0,04 - 0,12. V bunkových líniách, kde sa použili B.2405 a B.4203 boli tieto až sedemkrát účinnejšie ako BeG (tabuľka 5).

5) B.4203 a B.4205 boli toxické pre študované bunky XP a B. 4203 bola toxická pre študované bunky V79, ale iba pri koncentráciách, ktoré boli najmenej 100 x vyššie ako tie, pri ktorých sa pozorovala senzibilizácia na BCNU (obr. 5 a 6).

6) Zlúčeniny, ktoré boli účinné pri inaktivácii Atázy in vitro (I je menšie ako 10 μΜ) a v bunkách Raji (I_so je menšie ako 1,0 μΜ), taktiež senzibilovali bunky Raji a A375M na rastové inhibičné účinky BCNU, ak sa toto testovalo (tabuľka 4).

7) Pri koncentráciách inaktivátora 0,1 μΜ, B.4205 bola účinnejšia ako BeG pri senzibilizácii buniek Raji na rastové inhibičné účinky temozolomidu (obrázok 3).

8) Skúška in vitro sa môže použiť na to, aby predpovedala, ktoré zlúčeniny sú najpravdepodobnejšie ako účinné senzibilizátory cicavčích buniek na rastové inhibičné účinky BCNU a príbuzných cytotoxických činidiel.

9) B.4205 bola rovnaká alebo o niečo účinnejšia ako BeG pri senzibilizácii štepov ľudského melanómu rastúcich v bezsrstej myši na rastové inhibičné účinky BCNU (obr. 9 - 13).

10) B.4205 bola rovnako účinná ako BeG pri inaktivácii Atázy v štepoch ľudského melanómu rastúcich v bezsrstej myši (obr. 8).

11) Test in vitro a/alebo test znižovania aktivity Atázy v štepoch sa môže použiť ako predpoveď, ktoré zlúčeniny sú najpravdepodobnejšie účinnými stabilizátormi štepov melanómu na rastové inhibičné účinky BCNU a príbuzných cytotoxických činidiel.

12) Na rozdiel od BeG, ktorý zapríčiňuje smrť až 70 % . liečených zvierat, má B.4205 veľmi malý účinok na senzibilizáciu bezsrstej myši nesúcej štepy ľudského melanómu • na akútne toxické účinky BCNU pri použitých podmienkach (obr.

- 13) .

13) BeG senzibilizuje bunky GM-CFC v troch vzorkách ľudskej kostnej drene testovaných na toxické účinky temozolomidu ale vo dvoch z týchto vzoriek nastala účinkom B.4205 malá alebo žiadna senzibilizácia. Táto skúška by sa teda mohla použiť pre predpovedanie možných myelosupresívnych účinkov inaktivátorov Atázy pri klinickom použití v kombinácii s BCNU a príbuznými činidlami (obr. 14).

Literárne odkazy

1. W.N. Haworth a W.G.M. Jones, J. Chem. Soc., 667, 1944.

2. T. Reichstein, Hlev. Chim. Acta, 9, 1066, 1926.

3. V. Bocchi, G. Casnati, A. Dossena a R. Marchelli, Synthesis, 961, 1979.

4. P.A. Finan, J. Chem. Soc., 3917, 1963; J.A. Moore a J.E. Kelly, J. Polym. Sci., Polymér. Chem. Ed. , 22., 863, 1984.

5. J. Kiermayer, Chemiker-Zeitung, 19, 1004, 1895.

6. A. Carotti, F. Campagna a R. Ballini, Synthesis, 56, 1979.

7. A.J. Floyyd, R.G. Kinsman, Y. Roshan-Ali a D.W. Brown, Tetrahedron, 39 . 3881, 1983.

8. V.T. Suu, N.P. Buu-Hoi a N.D. Xuong, Bull. Soc. Chim. Francie, 1875, 1962.

9. T. Reichstein a L. Reichstein, Helv. Chim. Acta, 13., 1275, 1930.

10. H. Takeshita, H. Mametsuka a H. Motomura, J. Heterocycl. Chim., 23, 1211, 1986.

11. F.J. Wolf a J. Weijlard, Org. Synth., Coll. 4, 124, 1963.

12. A.M. van Leusen, B.E. Hoogenboom a H. Siderius, Tetrahedron Lett., 2369, 1972.

13. A. Maquestiau, R. Flammang a F.B. Abdelouahab, Heterocycles, 29, 103, 1989.

14. S. Fallab, Helv. Chim. Acta, 35, 215, 1952.

15. A. S. Kende, K. Kawamura a R. J. DeVita, J. Amer. Chem. Soc., 112, 4070, 1990.

16. S. Trofimenko, J. Org. Chem., 28, 3243, 1963.

17. I. Sawhney a J.R.H. Wilson (Shell Internationale), EP 395 174, 1989, (Chem. Abs. 114, 143410S).

18. F. Dallecker, P. Fechter a V. Mues, Z. Naturforsch., 34b. 1729, 1979.

19. P. Fournari, Bull. SOc. Chim. Francie, 488, 1963.

20. L. Grehn, Chem. Scr., 16., 72, 1980.

21. J.E.N. Morten a G.P. Margison, Carcinogenesis 9, 45-49, 1988.

22. D.A. Scuderio, R.J.Shoemaker, K.D. Paull, A. Monks, S. Tierney, T.H. Mofzigeer, M.J. Currens, D. Seniff a M.R. Boyd, Cancer Research 48. 4827-4833, 1988.

23. C.-Y. Fan, P.M. Potter, J.A. Rafferty, A.J. Warson, L. Cawkwell, P.F. Searle, P.J. O'Connor a G.P. Margison, Nucleic Acids Res. 18, 5723-5727, 1991.

24. J. Carmichael, W.G. DeGraff, A.F. Gazdar, J.D. Minna a

J.B. Mitchell, Evaluation of a tetrazoliu based semiautomatic colorimetric assay: assesment of chemosensitivity testing. Cancer. Res., 47. 936-942, 1987.

25. M.C. Wilkinson, P.M. Potter, L. Cawkwell, P. Georgiadis, D. Patel, P.F. Swann a G.P. Margison, Nucleic Acids Res., 17, 8475-8484, 1989.

26. M.C. Wilkinson, D.P. Cooper, C. Southan, P.M. Potter a G.P. Margison, Nucleic Acids Res., 18, 13-16, 1990.

Obr. 1 p v ι/ίι-ιγ

ΡΖΑ v B4203 • BéG

C (μΜ)

Obr. 2

W tr^-v

Obr. 3

T (pM)

T (μΜ)

Obr. 4

C (μΜ)

Obr. 5

B4203 (μΜ)

Obr. 6

W 1ÍV4-1

100 200 300 400 500 600

B4203 (μΜ)

B4205 (μΜ)

Obr. 7

1. B4203

2. B4205

C (μΜ)

3. B4212

C (μΜ)

4. B4226

C (μΜ) tu ο ο σ> _ CD

Ž £ tu

Ο

X iQ

		Obr. 8
		AA
	_U	_x.	ΓΌ	ΓΟ	l_t)
cn	o	cn	O	cn	O
o	o	o	O	o	O
1—1.-.1-.1 i	' i ΐ_l l	1 , 1 1 t 1	-1... Lj-u	i > »

CO

Λ.

NJ σ

tn

Η or

Obr. 9 ην»· - *5

T (dni)

Obr. 10

Obr. 11 r* w- *c

η 16 ^J 14 12 ς 10á í 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 1012141618202224262830 v—v—v----V—V~V

00-00----O-OO—o—O-----0—00

I ¹ t ¹ I ¹Ί ¹ t ‘ i i ‘T ^r~ í~‘ f ¹' η⁷ i i i |

T (dni)

BCNU

BCNU + B4205

BCNU + BeG

BCNU + BeG BCNU + B4205

BCNU

Obr. 12

AL%

V BCNU + B4205 • BCNU + BeG O BCNU

Obr. 13

BCNU

BCNU + BeG

BCNU + B4205

NSM

O BCNU V BCNU + B4205 • BCNU + BeG

T (dni)

Obr. 14 pif

Kontrola

B4205

C (μΜ)

C (μΜ)

C (μΜ) rv m-f - Ty

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Deriváty O^e-alkylguanínu všeobecného vzorca I:

   OCHRR'

   Y kde

   Y predstavuje vodík, ribozylovú skupinu, deoxyribozylovú skupinu alebo R¹’XCHR¹¹', kde X predstavuje kyslík alebo síru, R'’ a R’’’ predstavujú alkylovú skupinu alebo ich substituované deriváty,

   R' predstavuje vodík alebo alkylovú skupinu alebo hydroxyalkylovú skupinu,

   R predstavuje (i) cyklickú skupinu, ktorá má najmenej jeden 5- alebo 6-členný heterocyklický kruh, na ktorý je prípadne nakondenzovaný karbocyklický alebo heterocyklický kruh, pričom uvedený jeden alebo všetky heterocyklické kruhy majú najmenej jeden heteroatóm zvolený z kyslíka, dusíka alebo síry, alebo jej substituovaný derivát, alebo (ii) naftylovú skupinu alebo jej substituovaný derivát, a ich farmaceutický prijateľné soli.
2. 2. Zlúčenina podía nároku 1, kde R predstavuje (a) 5- alebo 6-členný heterocyklický kruh alebo (b) jeho benzoderivát, kde 0⁶-alkylguaninový zvyšok je pripojený na R buď na heterocyklický kruh alebo na benzénový kruh.
3. 3. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo 2, kde R predstavuje heterocyklický kruh, ktorý má najmenej jeden atóm síry.
4. 4. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo 2, kde R predstavuje heterocyklický kruh, ktorý má najmenej jeden atóm kyslíka.
5. 5. Zlúčenina podľa nároku 1 až 4, kde R predstavuje 5-členný kruh, na ktorý je alebo nie je nakondenzovaný druhý kruh.
6. 6. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo 2, kde R predstavuje tiofénový kruh alebo jeho substituovaný derivát.
7. 7. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo 2, kde R predstavuje furánový kruh alebo jeho substituovaný derivát.
8. 8. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R zahrňuje heterocyklický a/alebo karbocyklický kruh substituovaný halogénom, halogénalkylovou skupinou, kyanoskupinou, SO R'¹’', kde R'''' n

   predstavuje alkylovú skupinu a n predstavuje 0, 1 alebo 2, alebo -COOR^S, kde R^s predstavuje alkylovú skupinu.
9. 9. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O^e-tenylguanín.
10. 10. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O⁶-(3-tienylmetyl)guanín.
11. 11. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O⁶-piperonylguanín.
12. 12. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O⁶-furfurylguanín.
13. 13. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O^e-(3-furylmetyl)gua59 nín.
14. 14. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je 0^e-(2-benzo[b]tienylmetyl)guanín.
15. 15. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je 0⁶-(2-benzofuránylmety 1 )guanín.
16. 16. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je 0^e-(5-tiazolymetyl)guanín.
17. 17. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O⁶-(5-metoxykarbonylfurfury1)guanín.
18. 18. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je 0^e-(5-brómtenyl)guanín.
19. 19. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je 0⁶-(5-kyánfurfuryl)guanín.
20. 20. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je 0⁶-(2-benzo[b]tienylmetyl)guanozín.
21. 21. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O⁶-(4-pikolyl)guanín.
22. 22. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je O⁶-(2-naftylmety1)guanín.
23. 23. Farmaceutický prostriedok, vyznačený tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nárokov 1 - 22 a farmaceutický prijateľné vehikulum.
24. 24. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, vyznačený tým, že ďalej obsahuje alkylačné činidlo.
25. 25. Prostriedok podľa nároku 24, vyznačený tým, že alkylačným činidlom je 1,3-bis-(2-chlóretyl)-l-nitrózomočovina.
26. 26. Prostriedok podľa nároku 24,vyznačený tým, že alkylačným činidlom je temozolomid.
27. 27. Spôsob zniženia aktivity O^e-alkylguanín-DNA-alkyltransferázy v hostiteľovi, vyznačený tým, že zahrňuje podanie účinného množstva prostriedku, ktorý obsahuje zlúčeninu podľa nárokov 1-22, hostiteľovi.
28. 28. Spôsob podľa nároku 27,vyznačený tým, že zahrňuje podanie účinného množstva prostriedku, ktorý obsahuje O^-tenylguanín, hostiteľovi.
29. 29. Použitie zlúčeniny podľa nárokov 1 - 22, na výrobu lieku na zníženie aktivity O⁶-alkylguanín-DNA-alkyltransferázy v bunkách nádoru.
30. 30. Spôsob liečenia buniek nádoru v hostiteľovi, vyznačený tým, že zahrňuje podanie účinného množstva prostriedku, ktorý obsahuje zlúčeninu podľa nárokov 1-22 hostiteľovi, a podanie účinného množstva prostriedku, ktorý obsahuje alkylačné činidlo, hostiteľovi.
31. 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačený tým, že zahrňuje podanie účinného množstva prostriedku, ktorý obsahuje O^e-tenylguanín, hostiteľovi, a podanie účinného množstva prostriedku, ktorý obsahuje alkylačné činidlo, hostiteľovi.
32. 32. Spôsob podľa nároku 30 alebo 31, vyznačený tým, že alkylačným činidlom je 1,3-bis-(2-chlóretyl)-l-nitrózomočovina
33. 33. Spôsob podľa nároku 30 alebo 31, vyznačený tým, že alkylačným činidlom je temozolomid.
34. 34. Spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1,vyznačený tým, že zahrňuje reakciu hydridu sodného s roztokom RR'CHOH (kde R a R' sú definované v nároku 1) v organickom rozpúšťadle, pridanie

    2-amino-N, N, N- tr imety 1-lH-pur ín-6-amínium-chlor idu alebo

    2-amino-6-chlórpurín-ribozidu, pôsobenie slabej kyseliny a éteru a extrakciu požadovaného produktu.