NO313331B1 - O6-alkylguaninderivater, fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav samt farmasöytiske preparater - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører 0<6->

alkylguaninderivater, fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav, samt farmasøytiske preparater. Spesielt gjelder den guaninderivater som har heteroarylalkyl- eller naftylalkyl-substituenter i 0 -stillingen, idet disse forbindelser har evnen til sterkt å redusere aktiviteten av 0<6 >-alkylguanin-DNA alkyltransferase (ATase) i tumorceller.

Bakgrunnsteknologi

Det er blitt foreslått å anvende 0<6->alkylguaninderiveter

som har O^-alkylguanin-DNA alkyltransferase-utarmende aktivi-

tet for å øke effektiviteten av kjemoterapeutiske alkyleringsmidler som anvendes til å drepe tumorceller. Det er økende beviser for at i pattedyrceller de toksiske og mutagene effek-

ter av alkyleringsmidler i stor utstrekning er en konsekvens av alkylering i 0<6->stillingen av guanin i DNA. Reparasjonen av 0<6->alkylguanin blir mediert av ATase, et reparasjonsprotein som virker på de 0<6->alkylerte guaninrester ved støkiometrisk overføring av alkylgruppen til en cysteinrest i det aktive sete av reparasjonsproteinet i en autoinaktiveringsprosess. Viktigheten av ATase til beskyttelse av celler mot de biolo-

giske virkninger av alkyleringsmidler er blitt helt klart demonstrert ved overføringen og ekspresjonen av klonede ATase-gener eller cDNA inn i celler med underskudd på ATase: dette gir resistens mot flere forskjellige midler, hovedsakelig slike som metylerer eller kloretylerer DNA. Selv om mekanis-

men for celledreping med 0<6->metylguanin i ATase-manglende celler enda ikke er klar, foregå• r drepingen ved 0 6-kloretyl-guanin gjennom DNA-tverrbindingsdannelse mellom strengene til en cytosinrest på den motsatte streng via et cyklisk etan-guanin-mellomprodukt, en fremgangsmåte som forebygges ved ATase-mediert kloretylgruppefjerning eller kompleksdannelse.

Anvendelsen av 0 -metylguanin og 0 -n-butylguanin for

sterkt å redusere ATase-aktiviteten er blitt undersøkt (Dolan et al., Cancer Res., (1986) 46, s. 4500; Dolan et al., Cancer Chemother. Pharmacol., (1989) 25, s. 103). O<6->benzylguanin-

derivater er blitt foreslått for sterkt å redusere ATase-aktiviteten for å gjøre ATase-uttrykkende celler mer følsomme for de cytotoksiske effekter av kloretyleringsmidler (Mochel et al., . t. M<p>H. r. hpm., 1992, 35, 4486). US-patent 5.091.430 og internasjonal patentsøknad nr. WO 91/13898 Mochel et. al., beskriver en fremgangsmåte for utarming av nivået av Q -alkylguanin-DNA alkyltransferase i tumorceller hos en vert som omfatter administrering til verten av en effektiv mengde av et preparat inneholdende Q -benzylerte guaninderivater med føl-gende formel: hvor Z er hydrogen, eller

og Ra er en benzylgruppe eller en substituert benzylgruppe.

En benzylgruppe kan være substituert i nrtn, m<p>fa eller paxa-stillingen med en substituentgruppe såsom halogen, nitro, aryl såsom fenyl eller substituert fenyl, alkyl med 1-4 karbonatomer, alkoksy med 1-4 karbonatomer, alkenyl med opp til 4 karbonatomer, alkynyl med opp til 4 karbonatomer, amino, mono-alkylamino, dialkylamino, trifluormetyl, hydroksy, hydroksy-metyl, og SOnR hvor n er 0, 1, 2 eller 3 og R er hydrogen,

alkyl med 1-4 karbonatomer eller aryl. Mi-Young Chae et al., J. Med. rthPTTi. r 1994, 37, 342-447 - publisert etter prioritets-datoen for den foreliggende søknad - beskriver tester på cft-

benzylguaninanaloger som har stadig mer plass-krevende substi-tuentgrupper på benzenringen eller i stilling 9. Forbindelse nr. 6 beskrevet deri er Q^-(2-pyridylmetyl)guanin, som i denne søknad kalles Q -(2-picolyl)guanin. I resultatene og disku-sjonen på sidene 342 - 343 i publikasjonen til Chae et al., er forbindelse nr. 6 imidlertid ikke fremhevet som en forbindelse av interesse, men er gruppert blant "gjenværende forbindelser" som "hadde midlere aktivitet" (side 343, linjer 12 - 15 i

teksten). Forfatterne bekrefter sine tidligere observasjoner (J_ Med. Chem., 1992, 35 4486) at bare allyl eller benzyl-substituenter i 6-stillingen av guanin effektivt ville inaktivere ATase (s. 343, 1. 21 - 23 i teksten).

Q CL-benzylguanin har begrensninger ved sin anvendelse som ATase-inaktivator. Det er mere stabilt enn ønskelig, hvilket resulterer i lang overlevingstid i et dyr som det administre-res til. Det har et nivå av potensiell toksisitet både alene og i kombinasjon med kloretyleningsmidler som også er uønsket og som kan ha relasjon til overlevingstiden.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har ATase-inaktiveringsegenskaper som er forskjellige fra Q -benzylguanin, og i noen tilfeller er aktiviteten opp til 8 ganger høyere enn aktiviteten av Q -benzylguanin. Det er også observert forskjellige toksisitetsegenskaper og halveringstider. Det er derfor et formål ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye forbindelser som er anvendelige til utarming av ATase-aktiviteten for å øke effektene av kjemoterapeutiske midler såsom anti-tumormidler for kloretylering eller metyler-ing.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig cfc-alkylguaninderivater, kjennetegnet ved formelen I:

hvor

Y er H, ribosyl,

R' er H eller q-Cgalkyl,

R er

(i) en cyklisk gruppe med én 5- eller 6-leddet heterocyklisk ring, eventuelt med en 6-leddet karbocyklisk eller 5-eller 6-leddet heterocyklisk ring sammensmeltet dermed, eller idet den ene eller hver heterocyklisk ring har minst ett heteroatom valgt fra 0, N eller S, eller et substituert derivat derav med substitusjon i den heterocykliske ring(er) og/eller karbocykliske ring(er) med en eller flere av halogen, cyano eller S0nR' " hvor R"" er C^-C^-alkyl og

n = 0, 1 eller 2; eller

(ii) naftyl

og farmasøytisk akseptable salter derav.

Et annet formål ifølge denne oppfinnelse er å tilveiebringe farmasøytiske preparater kjennetegnet ved at det omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, og en farmasøytisk akseptabel eksipient som inneholder forbindelser som er anvendelige til utarming av ATase-aktiviteten. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den omfatter omsetning av natriumhydrid med en løsning av RR'CH0H (hvor R og R<1> er som definert i krav 1) i et organisk løsningsmiddel, tilsetning av 2-amino-N,N,N-trimetyl-1H-purin-6-aminiumklorid eller 2-amino-6-klorpurinribosid, behandling med en svak syre og eter, og ekstrahering av ønsket produkt. Et ytterligere formål ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en forbindelse for utarming av ATase-aktivitene i tumorceller.

R kan passende være en 5- eller 6-leddet heterocyklisk ring eller et benzoderivat derav, i hvilket sistnevnte tilfel-le 0^-alkylguaningruppen kan være bundet til R i enten den heterocykliske eller benzenringen.'

I foretrukne utførelser skal R være en 5-leddet heterocyklisk ring som har minst ett S-atom deri.

Fortrinnsvis er R valgt fra en tiofenring, en furanring eller et substituert derivat derav som definert i krav 1.

Alternativt skal R være valgt fra en tiofenring, en furanring og substituerte derivater derav valgt fra brom- og cyano-subsituterte derivater derav.

Eksempler på forbindelser ifølge denne oppfinnelse (sammen med forbindelsene B.4214 og B.4218 ikke dekket av foreliggende søknad) er vist i tabell 1.

Blant forbindelsene i tabell 1 er forbindelsene B.4214 og B.4218 ikke forbindelser ifølge denne oppfinnelse. Forbindelse B.4210 (d.v.s. forbindelsen med formel I hvor R er 2-pyrid-yl, R<1> er H og Y er H) er ikke en foretrukket forbindelse

ifølge denne oppfinnelse.

Spesielt foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen omfatter: Q 6 -tenylguanin, Q 6 -(3-tienylmetyl)guanin, Q 6-piperonylguanin,

Q 6 -furfuryl-guanin, Q 6 -(2-benzo[b]tienylmetyl)guanin, Q 6-(2-benzofuranylmetyl)guanin, Q 6 -(5-tiazolylmetyl)guanin, Q. 6-(bromtenyl)guanin, Q6 -(5-cyanofurfuryl)guanin og Q 6-(2-naftylmetyl)guanin.

De mest foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er de som inaktiverer ATase ln vi tro og/eller i pattedyrceller og/eller tumor-xenografter mer effektivt enn Q f.-benzylguanin (BeG) og som sensibiliserer pattedyrceller og/eller tumor-xenografter for de drepende eller vekst-inhiberende effekter av nitroso-ureaforbindelser og/eller metyleringsmidler mer effektivt enn BeG. Foretrukne forbindelser bør også, sammenlignet: med BeG, ha redusert toksisitet for normale vev og/eller for hele organismen når de anvendes i kombinasjon med slike midler. Foretrukne forbindelser bør ikke selv være toksiske eller ha mer enn minimal toksisitet i de doser som kreves for å inaktivere ATase og heller ikke bør eventuelle hydrolyse-produkter av en foretrukket forbindelse som var kjemisk ustabil være toksisk. Selv om oppfinnelsen ikke er begrenset av noen teori, kan det være nødvendig at foretrukne forbindelser er mindre stabile enn BeG slik at de undergår spontan kjemisk nedbrytning straks etter at de oppnår maksimal inaktivering av ATase: på denne måte ville man minimalisere en eventuell virkning av metaboliske prosesser som kunne virke på midlet til å danne toksiske forbindelser. Foretrukne forbindelser bør være mindre i stand til å sensibilisere human benmarg eller andre normale celletyper for de toksiske effekter av alkyleringsmidler, slik at de ikke ville forverre den kjente toksisitet eller danne nye toksisiteter av disse midler

i normale humane vev.

Foretrukne forbindelser ifølge denne oppfinnelse omfatter slike som har en relativt lav I5Q-verdi i tabell 4 her (f .eks.

under 1,0 uM, nærmere bestemt under 0,04 uM) og/eller som har en relativt kort halveringstid i buffer I (som representerer betingelser for en in vitro-analyse) og/eller fosfatbufret saltløsning (PBS) (som representerer betingelser i fysiologisk medium) i tabell 4 her (f.eks. under 20 timer i buffer I eller under 16 timer i PBS).

En relativt kort halveringstid kan betraktes som indika-tor på at en forbindelse ifølge oppfinnelsen ville være mindre stabil enn O -benzylguanin på grunn av reaktiviteten av RR'CH-og ville ha tendens til å brytes ned ved hydrolyse i fysiologisk medium.

Innvirkningen av gruppen RR'CH- i forbindelsene med formel I som gjør dem i stand til å virke som ATase-inhibi-torer bestemmes av elektroniske, steriske og fysikalsk-kjemiske faktorer. Steriske faktorer kan relateres til karakteren av omgivelsene av cystein-reseptorsetet i ATase. Fortrinnsvis vil R' være H. Et sekundært karbonat om bundet til O<6> (som i DL-forbindelsene B.4214 eller B.4217) er blitt funnet i betydelig grad å redusere inaktiveringsaktiviteten, sannsynligvis på grunn av substituentens omfang.

Fortrinnsvis vil den cykliske gruppe i R ikke ha en metylgruppe i nabostilling (som i B.4222) selv om påvirkningen av nabosubstitusjon åpenbart er mye mindre når R er heterocyklisk, enn i naftyl-isomerene B.4213 og B.4265.

Fysikalsk-kjemiske faktorer såsom stabilitet, løselighet og vann/lipid-fordeling er relevante for seleksjonen av forbindelser for anvendelse in vivo, og påvirker f.eks. formule-ring, absorpsjon og transport. Seleksjon av forbindelser kan også påvirkes av deres forskjellige fordeling i forskjellige vev.

Én utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10,

for fremstilling av et medikament for utarming av O -

alkylguanin-DNA alkyl-transferase-aktivitet i tumorceller.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10 og et alkyleringsmiddel for fremstilling av et en- eller to-del farmasøytisk preparat for behandling av tumorceller.

Det er følgelig mulig å behandle tumorceller hos en vert. Det er også mulig å behandle neoplasmer innbefattet dem som er kjent for å være følsomme for virkningen av alkyleringsmidler, f.eks. melanomer og gliomer og andre hvis resistens mot behandling med alkyleringsmidler alene kan overvinnes ved anvendelse av en inaktivator ifølge denne oppfinnelse.

Kort hsskrivplsp av 1-p.qningpr

Oppfinnelsen skal beskrives i større detalj med referanse til de vedlagte tegninger hvor: Fig. 1 er et diagram av prosent residual aktivitet av renset rekombinant human ATase etter inkubering med forskjellige konsentrasjoner av forskjellige inaktivatorer. Hvert punkt viser gjennomsnittet av 3 målinger. Linjen ved 50% residual aktivitet anvendes for beregning av I^g-verdier, d.v.s. den konsentrasjon av inaktivator som er nødvendig for å gi en 50% reduksjon i ATase-aktiviteten. Fig. 2 er to diagrammer av prosent cellevekst mot alkyleringsmiddelkonsentrasjonen (ug/ml), som viser sensibiliser-ingseffekten av Q ar -benzylguanin (BeG) og Q C-tenylguanin (B.4205) ved to forskjellige konsentrasjoner (0,1 og 1,0UM) på sensibilisering av Raji-celler for BCNU. Linjen ved 90% vekst anvendes for beregning av D^Q-verdier d.v.s. den dose av BCNU som ga 90% vekst sammenlignet med ubehandlede kontroller d.v.s.. 10% vekst-inhibering. Fig. 3 er fire diagrammer av prosent cellevekst mot alkyleringsmiddelkonsentrasjonen (PM), som viser effekten av BeG og B.4205 ved fire forskjellige konsentrasjoner (0,1, 0,5, 1,0 og 5,0UM) på sensibilisering av Raji-celler mot temozolomid. Fig. 4 er et diagram ekstrapolert fra.fig. 3 av verdier for D,-g ( P- M) (d.v.s. den dose av temozolimid som ga 50% vekst sammenlignet med ubehandlede kontroller) mot inaktivatorkonsentrasjonen (UM). Fig. 5 er to diagrammer av prosent cellevekst mot inaktivatorkonsentrasjonen, og som viser vekstinhiberingseffekten av Q<6->furfurylguanin (B.4203) og B.4205 på kinesisk hamster V79-celler (RJKO) og en underlinje derav (+120) . Fig. 6 er to diagrammer av prosent cellevekst mot inaktivatorkonsentrasjonen, og som viser vekstinhiberingseffekten av B.4203 og B.4205 på to Xernrtcrma pi gmpnro. siim subkloner. Fig. 7 er fire diagrammer av prosent cellevekst mot inaktivatorkonsentrasjonen (UM) og som viser effekten av nedbrytningsprodukter av inaktivatorene B.4203, B.4205, B.4212 (Q -piperonylduanin) og B.4226

(Q -[2-benzo(b)tienylmetyl]guanin) på Raji cellevekst.

Fig. 8 er et diagram av ATase-aktivitet (fm/mg) mot tiden (timer) og som viser utarmingen av ATase-aktiviteten i A375 xenografter i nakne mus for ubehandlede kontroller, maisolje-behandlede kontroller og ekstrakter behandlet med BeG

(30 mg/kg) og B.4205 (30 mg/kg).

Fig. 9 - 13 er diagrammer av resultater av xenograftstudier. I hver figur viser det øvre diagram prosent tumorvolum mot tiden (dager) for A375-tumor-xenografter hos nakne mus behandlet med BCNU alene, med BeG i kombinasjon med BCNU, og B.4205 i kombinasjon med BCNU. Det nedre diagram i hver figur viser antallet overlevende mus i hver behandlingsgruppe mot tiden (dager) etter behandlingene illustrert i det øvre diagram.

Detaljene for hver figur er som følger:

Fig. 14 er 3 diagrammer av prosent overleving mot temozolomid-konsentrasjonen (<U>M), og som viser overlevingen av benmargceller etter behandling med inaktivator (10UM) eller DMSO (kontroll) i kombinasjon med økende doser av temozolomid.

Fremgånggmår pr for nr f orp 1 sp. av oppf i nnpl sp. n

Q f.-hetarylalkylguanin-derivater som har ATase-inaktiver-ende egenskapet kan syntetiseres ved tilpasning av standardfremstillingen presentert nedenfor som hensiktsmessig.

2-amino-N,M,M-trimetyl-lH-purin-6-aminiumklorid fremstilles ifølge fremgangsmåten beskrevet av Kiburis et al., J.. Chem. Soc- ( C .) , 1971, 3942. Detaljer av betingelsene for omsetning av dette kvaternære salt med natriumbenzyloksyd (for a gi Q 6-benzylguanin) ikke beskrevet hos MacCoss, Chen og Tolman, T<p>1-rah<p>Hrnn T.Ptr . r 1985, 26, 1815, ble gitt i MacCoss, Tolman, Wagner og Hannah, europeisk patentsøknad nr. 184.473, men disse var ikke egnet for fremstilling av relativt følsomme analoger, og standardfremstillingen nedenfor ble utformet av oppfinnerne.

Standardfremstilling av Q_ g-hetarylalkylguaniner

(formel I, y = H)

Natriumhydrid (60% i olje; 0,8 g, 20 mmol) settes til en løsning av RR<1>CHOH (56 mmol, ca. 5 ml) i DMSO (5 ml) og blandingen omrøres ved romtemperatur i 1 time. For faste eller høyere-molekylære alkoholer kan det anvendes opp til 10 ml DMSO istedenfor 5 ml. 2-amino-M,M,M-trimetyl-lH-purin-6-aminiumklorid (2,29 g, 10 mmol) tilsettes, og omrøringen fortsettes i ytterligere 1 time. Forandringen i UV-spektrum er da fullstendig (^^g 312->284 nm) og den nesten klare løsning behandles med eddiksyre (1,7 ml). Etter avkjøling og fortynning med eter (300 ml) blir blandingen satt til side 2 timer og det faste stoff (A) oppsamlet. Utgnidning med vann gir produktet. En andre fraksjon kan fremstilles ved inndamp-ning av eter-DMSO-filtratet og utgnidning av resten i rekke-følge med eter og vann. Alternativt kan produktet ekstraheres fra det faste stoff (A) med varm acetonitril. De omkrystalli-serte forbindelser viser en enkelt flekk i TLC (CgHg-MeOH,

4:1) og karakteriseres ved analyse og sine NMR-spektra. Ofte vil de inneholde løsningsmiddel fra krystalliseringen. Smelt-epunkter og analytiske data er gitt i tabell 2, UV og H NMR-data i tabell 3. NMR-spektra ble målt på et Bruker WP80 eller MSL 300 instrument.

Denne standard fremstillingsfremgangsmåte (med variasjo-ner angitt ved symboler i tabell 2) ble anvendt til fremstilling av forbindelsene oppført i tabellene 2a og 3a. I forbindelsene B.4217 og B.4219, skal R' være metyl; i de gjenværende forbindelser skal R' være H. Q g-benzylguanin og forbindelsene B.4214, B.4218 og B.4231 oppført i tabell 4 nedenfor ble også laget ved denne standard fremstillingsfremgangsmåte for kompa-rative testingsformål.

Variasjonene angitt med symbolene i tabell 2 er som følger: a 5 mmol natriumhydrid pr. mmol kvaternært salt anvendes ved fremstilling av denne forbindelse. Når standardmeng-den (2 mmol) anvendes, kan 40% av det kvaternære salt

gjenvinnes i den opparbeidede reaksjon.

h Denne forbindelse lages ved hydrolyse av metylesteren B.4229 (145 mg, 0,5 mmol) i 2-metoksyetanol (2,5 ml) og vann (2,5 ml) ved behandling med 2M NaOH (2,5 ml) i 4 timer ved romtemperatur. Nøytralisering med eddiksyre (0,32 ml, 5,5 mmol), forsiktig inndamping, utgnidning med vann (3 ml) og filtrering gir et fast stoff som ved ekstraksjon med varm metanol gir syren B.4234.

a De nødvendige tall er basert på monohydratet av en blan-ding av 4 deler av natriumsaltet av syren og 3 deler av

syren, hvilket krever Na, 4,3%. Funnet: Na, 4,44%.

d 3 mmol alkohol RCr^OH pr. mmol kvaternært salt anvendes

istedenfor standarden 5,6 mmol,

b. For alkoholer som er for følsomme for natriumhydrid i DMSO ved romtemperatur, fremstilles RCH20Na i DMF (2,5 ml

ved -10°C; 3 mmol RCH2OH; 2 mmol natriumhydrid) . 1 mmol kvaternært salt tilsettes etter 15-20 min. og omrøringen fortsettes i 2-3 timer ved romtemperatur.

£ Produktene ekstraheres med acetonitril.

Fremstilling av ribosider (formel I, Y = ribosyl)

En løsning av alkoksyd laget som i standardfremgangsmåten ovenfor fra natriumhydrid (60% i olje; 120 mg, 3 mmol) og RR'CHOH (4,6 mmol) i tørr DMSO (2 ml) i løpet av 1 time, behandles med 2-amino-6-klorpurin-ribosid (302 mg, 1 mmol) og omrøres i 5 min. ved romtemperatur, deretter i 15 min. ved 60-65°C. Omsetningen er da fullstendig som angitt ved forandringen i UV-spektrum (^maks3H-»284 nm) . Avkjøling og inngående utgnidning med eter (100 + 15 ml) og filtrering gir et fast stoff som behandles med vann (10 ml). pH bringes fra 11 til 8 ved kort å lede gjennom CO2. Filtrering fjerner uorganisk materiale, og den tørkede rest ekstraheres ved romtemperatur med metanol (4 x 10 ml porsjoner, hver inneholdende en dråpe pyridin). Fordampning av nesten all metanol og tilsetning av litt eter gir produktet, nesten rent ved TLC (CgHg-MeOH 4:1).

Det omkrystalliseres fra metanol og et spor av pyridin, ved oppløsning og konsentrering under 4 0°C, noen ganger med endelig tilsetning av litt eter.

Denne fremgangsmåte ble anvendt til fremstilling av forbindelsene oppført i tabellene 2b og 3b. Spor av forurens-ninger er vanskelig å fjerne, men NMR-spektra viser at nukleo-sidene er ca. 90% rene. Utbyttene er av størrelsesorden 30-40%.

Utgangsalkoholene RR'CHOH ble vanligvis laget ved reduksjon av de tilsvarende aldehyder, ofte kommersielt tilgjengelige, med natriumborhydrid. En annerledes fremgangsmåte ble anvendt for forløperne av esteren B.4229 og nitrilen B.4273. Sukrose ble omdannet''" vi a 5-klormetylf urf ural til 5-hydroksymetylf urf ural. Oksydasjon av dette aldehyd ga karboksylsyren som ble forestret ved fremgangsmåten til Bocchi et al.<3> til metyl-5-(hydroksymetyl)furoat<4 >, krevet for B.422 9. Oksimet c. av aldehydet ble dehydrert ved fremgangsmåten til Carotti et al. g; det rå reaksjonsprodukt ble behandlet med konsentrert vandig ammoniakk i metanol før ekstraksjon over i diklormetan. Destillasjon ga 5-cyanofurfurylalkohol , krevet for B.4273.

For B.4266 ga Vilsmeier-reaksjon Q av benzofuran, 2-aldehydet, redusert til den nødvendige alkohol Q, mens for B.4226 litiering og behandling med dimetylformamid ga 2-aldehydet og i sin tur alkoholen 10

For B.4274 ble dimetyltartrat oksydert"<1>"<1> til metylglyoksylat som reagerte 1 9 med tosylmetylisocyanid under dannelse av metyloksazol-5-karboksylat . Dette ble redusert med litium-aluminiumhydrid ved fremgangsmåten til Fallab14 til

alkoholen<15>.

For B.4275 ga brom-malonaldehyd 1 6 og tiourea, 2-aminotiazol-5-karboksaldehyd i 7 . Deaminering med amylnitritt 17etterfulgt av natriumborhydrid-reduksjon ga 5-hydroksymetyl-

tiazol<14>.

For B.4271 ble 5-azapiperonyl-alkohol (smp. 82-84°C; funnet: C, 54, 60; H, 4,58; N, 9,09; C-^NC^ krever: C, 54, 90; H, 4,61; N,

9,15%) fremstilt fra det tilsvarende aldehyd18

For B.4278 ble l-metylpyrrol-2-karboksaldehyd nitrert 1 9 og redusert til alkoholen 2 0 med natriumborhydrid.

Som et spesifikt eksempel skal fremstillingen av Q g-tenylguanin (B.4205) nå beskrives:

Fremstilling av Q g-tenylguanin

En løsning av tenylalkohol (3,18 ml, 33,6 mmol) i DMSO

(3 ml) ble behandlet med natriumhydrid (60% i olje; 0,48 g,

12 mmol), først ved forsiktig omrøring. Etter 1 time ble tilsatt amino-N,N,N-trimetyl-lH-purin-6-aminiumklorid (1,37 g, 6 mmol) og omrøring fortsatte i ytterligere 1 time. Eddiksyre (1,0 ml) ble tilsatt, det ble avkjølt kort, og blandingen fortynnet med eter (] ml). Det faste stoff (2,09 g) ble oppsamlet etter 1-2 timer. Fordampning av eter fra filtratet og destillasjon av DMSO og overskudd av tenylalkohol (kp. 48-57°C/0,2 mm) etterlot en rest so ved utgnidning med eter ga en andre fast fraksjon (0,36 g) . De

samlede faste stoffer ble gnidd (utgnidning) med vann (6 ml) undei dannelse av produktet (1,335 g, 90%) som viste en kraftig flekk i TLC (CgHg-MeOH, 4:1) med bare spor av forurensning. Oppløsning i varm etanol (30 ml), klaring ved filtrering gjennom celitt, og konsentrering (til 10 ml) ved anvendelse av en rotasjonsfordamper B.4205 (1,125 g, 71% materiale inneholdende 1/3 EtOH pr. mol som solvat).

Forbindelser med formel I hvor Y er R"XCHR"<1> (seco-nukleoside kan fremstilles ved en analog fremstilling med reaksjonen av 0<6->benzylguanin med a-kloretere (MacCoss et al., Tetrahedron Lett.; europeisk patentsøknad nr. 184.473, loe. eit.) eller med alkylbromider (f.eks. Kjellberg, Liljenberg og Johansson, Tetrahedron Lett., 1986, 27, 877; Moschel,

McDougall, Dolan, Stine og Pegg, J. Med. Chem., 1992, 35, 4486).

Typiske "sukker"-komponenter svarende til R"XCHR"<1>, som førei til seco-nukleosider, blir laget ved fremgangsmåter beskrevet i f.eks. McCormick og McElhinney, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1985, 93; Lucey, McCormick og McElhinney, J. Chem. Soc. Perkin Trans■ 1, 1990, 795.

Forbindelser med formel I hvor Y er ribosyl eller deoksyribos (nukleosider) kan fremstilles ved fremgangsmåter analoge med syntesene av O<6->benzylguanin-ribosid og 2-deoksyribosid (Mochel et al., 1992; kfr. Gao, Fathi, Gaffney. et al., J. Org. Chem., 1992, 57, 6954; Mochel, Hudgins og Dipple, J. Amer. Chem. Soc, 1981, 103 5489) (se fremstilling av ribosider ovenfor).

Industriell anvendelighet

Den mengde av forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse son skal anvendes, vil variere etter den effektive mengde som kreves for behandling av tumorceller. En egnet dosering er den som vil resultere i en konsentrasjon av forbindelsen ifølge oppfinnelsen i tumorcellene som skal behandles, og som resulterer i utarming av ATase-aktiviteten, f.eks. ca. 1 til 2000 mg/kg, og fortrinnsvis 1 til 800 mg/kg, spesielt 1 til 120 mg/kg, før kjemoterapi med et alkyleringsmiddel.

Det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen kan formuleres i konvensjonelle former med konvensjonelle eksipienter, som beskrevet f.eks. i WO 91/13898, hvis innhold er inkorporert heri ved referanse. Preparatet kan inneholde inaktivatoren ifølge denne oppfinnelse sammen med et alkyleringsmiddel; eller preparatet kan omfatte to deler, én som inneholder inaktivatoren og den andre som inneholder alkyleringsmidlet. Fremgangsmåten for administrering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen til en vert kan også være en konvensjonell fremgangsmåte, som beskrevet f.eks. i WO 91/13898.

For administrering av en inaktivator ifølge oppfinnelsen til pasienter, kan det farmasøytiske preparat hensiktsmessig inneholde inaktivatoren i en egnet bærer såsom 40% polyetylenglykol 400 i saltløsning, eller i saltløsning eller 3% etanol (i saltløsning), for intravenøs injeksjon, eller i pulverform i egnede kapsler for oral administrering.

Alkyleringsmidler kan administeres ifølge kjente teknikker og i konvensjonelle administreringsformer, som beskrevet i f.eks. WO 91/13898 eller fortrinnsvis som en enkelt dose umiddelbart etter eller opp til 24 timer etter, men fortrinnsvis ca. 2 timer etter administrering av ATase-inaktiveringsmidlene og også i doser lavere enn dem som anvendes i standard behandlingsregimer. En reduksjon i dose kan være nødvendig fordi inaktivatorene generelt ville bli antatt å øke toksisiteten av alkyleringsmidlene. Eksempler på kloretyleringsmidler omfatter 1,3-bis-(2-kloretyl)-1-nitrosourea (BCNU), 1-(2-kloretyl)-3-cykloheksyl-l-nitrosourea (CCNU), fotemustin, mitozolomid og clomeson og dem beskrevet hos McCormick,

McElhinney, McMurry og Maxwell J. r. hpm. Sne. Pp. rlcin Trans. T, 1991, 877 og Bibby, Double, McCormick, McElhinney, Radacic, Pratesi og Dumont Anfi- flanrpr Drng nesign, 1993, 8, 115. Eksempler på metyleringsmidler omfatter temozolomid (britisk patant GB 2 104 522)

og dacarbazin, procarbazin og streptozocin.

Metoder

Rensing av rekombinante ATaser

cDNA-kloningen og overekspresjonen av den humane ATase er tidligere blitt rapportert 2 3. Rensing av de rekombinante protein* ble oppnådd enten ved affinitetskromatografi gjennom en DNA-cellulosekolonne som beskrevet av Wilkinson et al. , 25 ' ? f, eller 1 DEAE-cellulose-ionebytterkromatografi. For sistnevnte ble ATase-proteinet delvis renset ved ammonium-

sulfat-utfelling (30-60%) og dialysert mot 10 mM tris-HCl pH 7,5, mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glycerol, før påsetting på en DEAE-cellulosekolonne. ATasen ble deretter eluert med en 0-0,IM NaCl-gradient. Det rensede humane ATase-protein beholdt aktiviteten i mer enn 1 år når det ble lagret ved høy konsentrasjon ved -2 0°C i buffer I [50 mM-tris/HCl (pH 8,3)/3 mM ditiotreitol/l mM EDTA] og kunne tines og fryses igjen flere ganger uten betydelig tap av aktivitet.

Inkubering med inaktivatorer og ATase-assay

Forbindelser som skulle testes ble løst i DMSO til en sluttkonsentrasjon på 10 mM og fortynnet rett før anvendelse i buffer I inneholdende 1 mg/ml bovint serumalbumin (IBSA). Rekombinant ATase ble fortynnet i IBSA og titrert for at reaksjon* kunne gjennomføres under ATase-begrensende betingelser, og ikke substrat-begrensende betingelser. I hver analyse ble bestemte mengder ATase (60-75 fmol) inkubert med varierende mengder O<6->

benzylguanin, eller testforbindelse i et totalt volum på 200 ul

IBSA inneholdende 10 ug kalvethymus-DNA ved 37°C i 1 time. Det [<3 >metylerte DNA-substrat (100 ul inneholdende 6,7 ug DNA og 100 fmo!

av 0 -metylguanin) ble tilsatt, og inkuberingen fortsatt ved 3 7° i time, inntil reaksjonen var fullstendig. Etter syrehydrolyse av I

som tidligere beskrevet 21 ble det [ 3H]-metylerte protein gjenvunn* og kvantifisert ved væske-scintillasjonstelling. Prøvene ble typ: analysert i duplikat og eksperimentene gjentatt flere ganger.. I^q er den konsentrasjon av inaktivator som er nødvendig for å frembringe en 50% reduksjon i ATase-aktiviteten.

Cellekultur og fremstilling av ekstrakter

Pattedyrceller ble dyrket under standard betingelser. F.eks. ble Raji (en human lymfoblastoid-cellelinje fra et Burkitfs lymfoma) celler dyrket i suspensjonskultur i RPMI-medium supplementert med 10% hesteserum. A375M-celler er humane melanoma-celler hvor fra xenograftene beskrevet nedenfor ble etablert etter subkutan injeksjon i nakne mus: WiDr-celler er en human colon-karsinomacellelinje: Hamster+120-celler er en mitozolomid-selektert underlinje av en kinesisk hamster lungefibroblast V79-cellelinje kalt RJKO: Yoshida-celler er en rotte-karsinosarcomacellelinje og YRbus er en busulphan resistent underlinje derav: XP-celler er en SV40-transformert fibroblast-cellelinje opprinnelig fra huden av en Xpmdprma pi m& ntnsnm pasient, pHMGhAT2b-celler er en klon av disse celler som er blitt transfektert med en pattedyr-celle-ekspresjonsvektor inneholdende de humane ATase-cDNA og pHMGla-celler er en klon som er blitt transfektert utelukkende med ekspresjonsvektoren (d.v.s. én som ikke inneholder det humane ATase cDNA). Celle-pelleter ble slemmet opp igjen i kald (4°C) buffer I inneholdende 2 Ug/ml leupeptin og ultralyd-behandlet i 10 sek. ved en avstand mellom toppene på 12 Pm. Etter avkjøling i is ble cellene ultralydbehandlet i ytterligere 10 sek. ved 18 Pm. Umiddelbart etter ultralydbehandlingen ble tilsatt 0,01 volum av 8,7 mg/ml fenylmetansulfonylfluorid i etanol, og de ultralyd-behandlede celler sentrifugert ved 15 000 G i 10 min. ved 4°C til pellet-celleavfall. Supernatanten ble oppbevart for bestemmelse av ATase-aktivitet (se nedenfor).

Stabilitet av inaktivatorer ved 37°C.

Inaktivatorer (lOmM i DMSO) ble fortynnet til 0,lmM i forvarmet avgasset buffer I (ImM EDTA, 50mM tris pH 8,3) eller PBS (pH 7-7,2). PBS (fosfatbufret saltløsning) er 0,8% NaCl, 0,02% KC1, 0,15% Na2 HP04, 0,02% KH2P04, pH 7,2. Prøvene ble umiddelbart overført-til CARYl3-spektrofotometer (kuvette-blokken holdt ved 37°C) og scanne ved en hensiktsmessig bølgelengde i overensstemmelse med

forbindelsens spektral-egenskaper med 3-10 min. mellomrom i opp t;

80 timer. Resultatene ble uttrykt som prosent absorbansforandrinc mot tiden og Tl/2-verdier (halveringstid) ekstrapolert ut fra detl

Inaktivering av ATase-aktivitet i pattedyrceller

Celler ble fortynnet til 10^/ml i kulturmedium inneholdende enten den hensiktsmessige konsentrasjon av inaktivator eller et tilsvarende volum av bærer (DMSO). Etter inkubering ved 37°C i 2 timer ble cellene høstet ved sentrifugering, vasket to ganger med PBS og de resulterende cellepelleter (mellom 1-2 x 10 pr. pellet]

lagret ved -20°C. ATase-aktiviteten ble bestemt som beskrevet

ovenfor, i duplikate ultralyd-behandlede celle-ekstrakter og uttr? som prosent gjenværende aktivitet basert på aktiviteten til stede de ubehandlede kontroller (f.eks. 350-450 fm/mg i Raji-celler). -verdier (d.v.s. konsentrasjonen av inaktivator nødvendig for å redusere ATase-aktiviteten med 50%) ble ekstrapolert ut fra disse data.

Sensibilisering av Raji og A375M-celler for BCNU og

temozolomid

Sensibilisering av Raji-celler for de cytotoksiske effekter i BCNU og temozolomid etter 2 timers forbehandling med inaktivator l

22

analysert ved anvendelse av en XTT-assay . I korthet ble cellen* platet ut ved 1000 celler/brønn i 96-brønners plater og inkubert

37°C i 30 min. før tilsetning av medium inneholdende enten den hensiktsmessige konsentrasjon av inaktivator eller et tilsvarende volum av bærer. Etter 2 timers inkubering ved 37°C ble tilsatt medium inneholdende enten økende doser av BCNU, temozolomid eller tilsvarende bærer, og cellene fikk vokse i 6 dager. På dette tidspunkt ble tilsatt XTT-løsning og cellene inkubert ytterligere

4 timer ved 37°C. Det resulterende røde/orange formazan-reak^ sjonsprodukt ble kvantifisert ved måling av absorpsjonen ved 450 nm på en mikrotiterplateleser. Sensibilisering av A375M-celler for de cytotoksiske effekter av BCNU ble analysert ved MTT-assay<24> som adskiller seg fra XTT-assay beskrevet ovenfor som følger. A375M-celler (1000 pr. brønn) fikk vokse i 24 timer og ble deretter behandlet med inaktivatoren, og 2 timer senere med BCNU. Etter 6 dager ble tilsatt MTT-løsning (4 mg/ml) og cellene inkubert i 3 timer ved 37°C. Medium ble aspirert, og de resulterende purpurfarvede formazankrystaller ble solubilisert i DMSO (120 pl) og cellenes levedyktighet ble kvantifisert ved måling av absorpsjonen ved 54 0 nm ved anvendelse av en mikrotiterplateleser. Ut fra disse data ble den prosentvise vekst av celler relativ til veksten i kontrollbrønner bestemt for et område av BCNU eller temozolomid-doser i både nærvær og fravær av inaktivator. Raji-sensibilisering for BCNU (DgQ.<C/>D9Q.<I>) ble bestemt ved å dividere D 90 (d.v.s. dosen hvor det var 90% vekst versus ubehandlede kontroller, d.v.s. 10% vekstinhibering) beregnet for data ved anvendelse av BCNU alene (Dgo. p) med veksten for BCNU pluss inaktivator (DgQ.<1>). En verdi på én (1) angir således ingen sensibilisering med inaktivatoren. Raji-sensibilisering for temozolomid og A375M-sensibilisering for BCNU ble bestemt ved anvendelse av de tilsvarende D5Q-verdier (d.v.s. de doser hvor det var 50% vekstinhibering).

Følsomhet av pattedyrceller for inaktivatorene eller deres hydrolyseprodukter

For å bestemme effekten på celleveksten alene ble

Xeroderma pigmentosum-celler og kinesisk hamster V79-celler eksponert for økende konsentrasjoner (opp til 600uM) av utvalgte inaktivatorer i 2 timer ved 37°. I noen tilfeller fikk inaktivatorene undergå hydrolyse ved 37°C i 20 timer, og ble deretter satt til Raji-celler for å bestemme den utstrekning hvori dekomponeringsproduktene av midlene kunne inhibere celleveksten. Etter 6 dager ble graden av cellevekst bestemt som beskrevet ovenfor.

Sensibilisering av benmargceller for temozolomid (GM-CFC-assay)

For den granulocytt/makrofag koloni-dannende celle-assay (GM-CFC) ble primære humane benmargprøver oppnådd fra pasienter som undergikk kardiothoraks-kirurgi. Etter fjerning av erytrocytter J

prøvene ble cellene platet ut i 1-2 x 10<5>/ml i 300mOsM Iscoves medium inneholdende 10uM inaktivator eller tilsvarende volum av DMSO, 20% føtalt kalveserum, 10% 5637 kondisjonert medium som kile for vekstfaktorer og 0,3% agar nobel, i 1 ml petriskåler inneholdende hensiktsmessige doser av temozolomid og inkubert ved 37°C i en atmosfære av 5% C02 og 95% luft. Etter 9 dager ble det tellet kolonier omfattende mer enn 50 celler. Koloniene representerte forløperceller for granulocytt/makrofag-linjene huGf CFC. Overleving ble uttrykt som prosent av antallet kolonier ved null dose av temozolomid.

Xenograftstudier

Dyr

BALB-C-avledede athymiske hannmus (nu/nu athymisk) som veide mellom 25 og 35 g ble mottatt fra avlingskolonien ved Paterson Institute for Cancer Research, Christie Hospital NHS Trust, Wilms! Road, Manchester M20 9BX, England (ASU-mus). Dyrene ble oppbevart sterilt miljø inntil de var nødvendige for eksperimenter. I ett eksperiment ble musene levert fra Harlan-Olac, Harlan UK Limited, Shaw's Farm, Blackthorn, Bicester, Oxon. 0X6 OPT, England (OLAC-mus). Disse musene veide mellom 17 og 23 g og ble siden funnet å være mer følsomme for de toksiske effekter av kombinasjons (inaktivator og BCNU)-behandlingen. Av denne grunn ble det administrert lavere doser.

Celler

A375M-celler (humant melanoma) ble dyrket i DMEM inneholdende 10% føtalt bovinserum. Cellene ble fremstilt for ±n vi vn inokulering ved inkubering med 0,01% trypsin.

Tumorer

Celler (IO<6>) i 100 Ul PBS ble injisert subkutant i den høyre hånds flanke på 8-10 uker gamle nu/nu athymiske mus. Disse celler fikk utvikle seg til en tumor i 3-4 uker for overføring til eksperimentelle dyr. Tumorblokker som målte 2 mm x 2 mm x 2 mm ble implantert subkutant på høyre hånds flanke. Disse dyrene var klare for anvendelse i inaktivatoreksperimenter på 7-10 dager.

Medikamentbehandling

Nu/nu-mus ble behandlet med enten 30 eller 60 mg/kg Q6-benzylguanin, eller B.4205 og den hensiktsmessige bærerkontroll (i.p), 60-90 min. før 10-25 mg/kg BCNU (i.p). Q<6->benzylguanin og B.4205 ble fremstilt som en 5 mg/kg løsning i maisolje og BCNU (2 mg/ml) i PBS + 3% etanol.

Tumormålinger

Xenograft-tumormålinger ble tatt hver 1-2 dager av arbeidere som brukte digitale krompassere. Tumorvolum ble beregnet ved anvendelse av formelen (h x w x 1) <n>/6. Eksperimentdyrene ble også veiet hver 1-2 dager. Målingene fortsatte inntil tumorene i kontrolldyrene nådde det maksimalt tillatte volum (d.v.s. 1 cm x 1 cm x 1 cm) .

Resultater

Tabellene 4, 5 og 6 viser de fysikalske, biokjemiske og in v<_>Lv_Q-data for hver av inaktivatorene. De oppførte tester er forklart i Metodeavsnittet.

Fig. 1 viser resultatet av in vi trn ATase-inaktiverings-assay ved anvendelse av 4 av forbindelsene. B.4206 var noe mer effektiv enn BeG, men B.4212 og B.4205 var betydelig bedre under de anvendte assay-betingelser. B.4203 var ikke så effektiv som BeG. Fig. 2 viser at 0,1UM inaktivator, B.4205 var mer effektiv enn BeG ved sensibilisering av Raji-celler for de vekst-inhiberende effekter av BCNU: ved 1,0UM inaktivator var B.4205 og BeG like effektive i denne henseende. Fig. 3 viser at 0,1UM inaktivator, B.4205 var mer effektiv enn BeG til sensibilisering av Raji-celler for de vekst-inhiberende effekter av temozolomid, men at ettersom dosene av inaktivatorene ble øket, ble sensibiliseringen ved BeG mer effektiv, mens den ved B.4205 forble den samme. Denne mangel på doserespons med B.4205 men klar doserespons med BeG er vist klarere i fig. 4. Fig. 5 viser at mens en viss vekstinhibering av B79-celler ble frembragt av B.4203 ved doser i overskudd av 100UM (d.v.s. minst 100x høyere enn I^g-dosen for denne forbindel se), ble ingen slike effekter sett med B.4205 opp til den anvendte maksimumkonsentrasjon. Fig. 6 viser at XP-celler var like mottagelige for de vekst-inhiberende effekter av B.4203, men at disse celler var mer følsomme enn V79-celler for effektene av B.4205. De nødvendige doser for vekst-inhibering var imidlertid minst lOOx den som var nødvendig for ATase-inaktivering. Det kan konkluderes at de iboende vekst-inhibitoriske effekter av disse inaktivatorer ikke ville bidra påvisbart til sensibiliseringen av celler for de vekst-inhibitoriske effekter av alkyleringsmidlene. Fig. 7 viser at ingen betydelige vekst-inhibitoriske

effekter ble frembragt i Raji-celler når de gitte forbindelser fikk undergå hydrolyse (se metoder) før de ble tilsatt cellene uten ytterligere tilsetning av alkyleringsmidler. Under disse eksperimentelle betingelser ville dekomponeringsproduktene av midlene derfor ikke bli ventet å bidra til de vekst-inhiber-inger som ble observert ved anvendelse av kombinasjoner av

disse midler og alkyleringsmidler.

Fig. 8-13 viser resultatene av xenograftstudien i større detalj. Utarmingen og gjenvinningen av ATase-aktivitet etter eksponering for Q. -benzylguanin eller B.4205 ble målt i A375 tumor-xenograft-ekstrakter (fig. 8) fremstilt fra vev av dyr avlivet 2 eller 24 timer etter administering av inaktivator. Fig. 9-13 angir sensibiliseringen av A375-tumor-xenografter i nakne mus for enten Q -benzylguanin eller B.4205 i kombinasjon med BCNU som beskrevet i Metodeavsnittet. I hver figur skal det øvre diagram vise prosent økning i tumorvolum over eksperimentets tidsforløp. Det nedre diagram viser antallet dyr i hver behandlingsgruppe, og antallet overlevende etter behandling. Diagrammene viser at B.4205 er sammenlign-bar med Q -benzylguanin (BeG) til å redusere tumorvolumet, og er betydelig mindre toksisk i kombinasjon med BCNU enn BeG i kombinasjon med BCNU. I humane pasienter blir kutant malig-nant melanoma behandlet med BCNU, særlig i USA (CM. Balch, A. Houghton & L. Peters (1989) "Cutaneous Melanoma", i Cancer: Prinr. iplps and Prar.tis<p> of Onr-.nl ogy, V.T. De Vita, S. Helman & S.A. Rosenberg, (utg.), s. 1499-1542, Lipincott: Philadelphia) slik at det humane melanoma-xenograft dyrket i nakne mus er et dyremodellsystem som er klinisk høyst relevant.

Fig. 14 viser resultatene av testene av sensibilisering av humane benmargceller for temozolomid som beskrevet i Metodeavsnittet ovenfor. Benmargcellene ble levert fra tre pasienter identifisert som henholdsvis C, D og E. De viste overlevingskurver relaterer til den cytotoksiske effekt av kombinert behandling med inaktivator/temozolomid. Det er ønskelig at denne effekt burde reduseres. Resultatene for pasientene C og E viser at B.4205 hadde en mindre sensibili-seringseffekt enn Q -benzylguanin (Q BeG); for pasient D var det ingen forskjell, men dette resultat blir ansett som en rimelig variasjon ved vitenskapelig testing med humant materiale .

Tabell 7 viser den toksiske virkning av inaktivator alene på benmargceller levert fra 5 pasienter A-E, innbefattet de samme pasienter C-E som i fig. 17. Resultatene for B.4205 er sammenlignbare med dem for 0. -benzylguanin. Bemerk at cellene fra pasient B var nesten dobbelt så følsomme for både BeG og B.4205 sammenlignet med de andre prøver.

Sammendrag av funnene

1) Alle forbindelsene er blitt testet for sin evne til å inaktivere rekombinant human ATase under standardbetingelser i en in vJ_txo-assay. Under disse betingelser ville to av forbindelsene B.4214 og B.4217 ikke inaktivere ATase opp til den høyeste anvendte konsentrasjon, men disse var forbindelser hvor R<*> er metyl. Resten av forbindelsene inaktiverte ATase med I^Q-verdier i området fra 0,0045 til 95 Umolar. 8 forbindelser (B.4205, B.4206, B.4212, B.4226, B.4266, B.4269, B.4273, B.4275) hadde I5Q-verdier lavere enn den for BeG

(tabell 4) .

2) Inaktivatorene undergikk hydrolyse i vandig løsning med forskjellige hastigheter (halveringstider 0,17 til >80 timer) men dette var ikke relatert til deres effektivitet som ATase-inaktivatorer (tabell 4). 3) Forbindelser som var effektive ved inaktiveringen av ATase in vi tro (I50 <1/0UM) inaktiverte også ATase i humane celler med I^g-verdier som generelt var bare svakt høyere (gjennomsnittlig ca. l,5x) enn dem som ble funnet ved anvendelse av rekombinant protein i ±n iitxa-assay (tabell 4). 4) B.4205 inaktiverte ATase i menneskeceller, rotteceller og kinesisk hamster-celler med lignende effektivitet (I^g-verdier 0, 02-0, 03). For B.4203 var området 0,04-0,12.. I de anvendte cellelinjer var B.4205 og B.4203 opp til 7x mer effektive enn BeG (tabell 5). 5) B.4203 og B.4205 var toksiske overfor de studerte XP-celler, og B.4203 var toksisk overfor de studerte V79-celler, men bare ved konsentrasjoner som var minst 100x høyere enn dem hvorved sensibilisering for BCNU ble observert (fig. 5 og 6). 6) Forbindelser som var effektive ved inaktiveringen av ATase in vit rn (i5Q <1,0UM) og i Raji-celler (I5Q <<1>,0PM) ville også sensibilisere Raji og A375M-celler for de vekst-inhibitoriske effekter av BCNU hvor dette ble testet (tabell 4) . 7) Ved inaktivatorkonsentrasjoner på 0,1UM var B.4205 mer effektiv enn BeG til sensibilisering av Raji-celler for de vekst-inhiberende" effekter av temozolomid (fig. 3). 8) in vj_tra-analysen kan anvendes til å forutsi hvilke forbindelser som mest sannsynlig vil være effektive sensibilisatorer av pattedyrceller for de vekst-inhiberende virkninger av BCNU og beslektede cytotoksiske midler. 9) B.4205 var lignende eller noe mer effektiv enn BeG til å sensibilisere humane melanoma-xenografter dyrket i nakne mus for de vekst-inhiberende virkninger av BCNU (fig. 9-13). 10) B.4205 var like effektiv som BeG til å inaktivere ATase i humane melanoma-xenografter dyrket i nakne mus (fig. 8). 11) ln vj_txni-analysen og/eller xenograft ATase-utarmingsana-lysen kan anvendes til å forutsi hvilke forbindelser som mest sannsynlig vil være effektive sensibilisatorer av melanoma-xenografter for de vekst-inhiberende virkninger av BCNU og beslektede cytotoksiske midler. 12) I motsetning til BeG, som forårsaket død i opp til 70% av de behandlede dyr, hadde B.4205 svært liten effekt på følsom-heten av nakne mus med humane melanoma-xenografter for de akutte toksiske effekter av BCNU under de anvendte betingelser

(fig. 9-13).

13) BeG sensibiliserte GM-CFC i de tre humane benmargprøver testet på de toksiske effekter av temozolomid, men i to av disse prøver ble det frembragt liten eller ingen sensibilisering av B.4205. Denne assay kan derfor anvendes til å forutsi de mulige myelosuppressive effekter av ATase-inaktivatorer når de anvendes i klinikken i kombinasjon med BCNU og beslektede midler (fig. 14).

R<p>f<p>.r^nfi<p>r

1. W.N. Haworth og W.G.M. Jones, J. rhpm. Snr. s 1944, 667.

2. T. Reichstein, Heiv.Chim.Acta, 9, 1926, 1066.

3. V. Bocchi, G. Casnati, A. Dossena og R. Marchelli,

SynthPsis, 1979, 961.

4. P.A. Finan, J- Ch<p>m. Snr. f 1963, 3917; J.A. Moore og J.E.

Kelly, J.Polym.Sei., Polym.Chem.Ed., 22, 1984, 863.

5. J. Kiermayer, r.hpmi Vpr-7,Pi tung, 19, 1895, 1004.

6. A. Carotti, F. Campagna og R. Ballani, Synhe. si s, 1979,

56. 7. A.J. Floyd, R.G. Kinsman, Y. Roshan-Ali og D.W. Brown,

TPtr^h<p>rirnn, 39, 1983, 3881.

8. V.T. Suu, N.P. Buu-Hoi og N.D. Xuong,

Rnl 1 . Snr. rhiin. FranrP, 1962, 1875.

9. T. Reichstein og L. Reichstein Hel v. Chim. Acta, 13, 1930, 1275.

10. H. Takeshita, H. Mametsuka og H. Motomura,

J. HPtPrnr. yrl Chim. f 23, 1986, 1211.

11. F.J. Wolf og J. Weijlard, nrg. Synth . r r . nl i Vnl .& r 1963,

124 . 12. A.M. van Leusen, B.E. Hoogenboom og H. Siderius,

TPtrah<p>Hrnn Lett., 1972, 2369.

13. A. Maquestiau, R. Flammang og F.B. Abdelouahab,

HptPrnryrlpsf 29, 1989, 103.

14. S. Fallab, Hplv. nhim. Arta, 35, 1952, 215.

15. A.S. Kende, K. Kawamura og R.J. DeVita, J. Ampr. chem. Sn r., 112, 1990, 4070.

16. S. Trofimenko, J. nrg. rhpm f 28, 1963, 3243.

17. I. Sawhney og J.R.H. Wilson (Shell Internationale),

EP.395.174, 1989, ( rhpm. Ahs , 114, 143410s).

18. F. Dallacker, P. Fechter og V. Mues, Z. Natnrfnrsrh.,

34b, 1979, 1729.

19. P. Fournari, Bnl 1 . finr ; . Chim. Franr. P, 1963,488.

20. L. Grehn, P. hPm. Srr. f 16, 1980, 72.

21. Morten, J.E.N. & Margison, G.P. (1988) Carcinogenesis 9, 45-49. 22. Scudiero, D.A. Shoemaker R.J., Pauli K.D., Monks A.,

Tierney S., Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D. & Boyd

M.R. (1988), Cancer Research 48, 4827-4833.

23) Fan, C-Y, Potter, P.M., Rafferty, J.A., Watson, A.J., Cawkwell, L., Searle, P.F., 0'Connor, P.J. og Margison,

G.P. (1991) Nucleic Acids Res. 18, 5723-5727.

24) Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D., Mitchell J.B., (1987). Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay : assessment of chemo-sensitivity testing. Cancer Res. Al : 936-942. 25) Wilkinson, M.C, Potter, P.M., Cawkwell, L., Georgiadis, P., Patel, D., Swann, P.F. og Margison, G.P. (1989)

Nucleic Acids Res. 17, 8475-8484.

26) Wilkinson, M.C, Cooper, D.P., Southan, C, Potter, P.M. & Margison, G.P. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 13-16.

I beskrivelsen skal forkortelsene "lh" eller "2h" o.s.v. bety "1 time", "2-timer" o.s.v.

Claims (18)

1. Q -alkylguaninderivater, karakterisert ved formelen I: hvor Y er H, ribosyl, R<1> er H eller Ci-C5alkyl, R er (i) . en cyklisk gruppe med én 5- eller 6-leddet heterocyklisk ring, eventuelt med en 6-leddet karbocyklisk eller 5-eller 6-leddet heterocyklisk ring sammensmeltet dermed, eller idet den ene eller hver heterocyklisk ring har minst ett heteroatom valgt fra 0, N eller S, eller et substituert derivat derav med substitusjon i den heterocykliske ring(er) og/eller karbocykliske ring(er) med en eller flere av halogen, cyano eller S0nR hvor R"" er Ci-C5-alkyl og n = 0, 1 eller 2; eller (ii) naftyl og farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R er: (a) en 5- eller 6-leddet heterocyklisk ring, eller (b) et benzoderivat derav, idet Q -alkylguanin-gruppen er bundet til R i enten den heterocykliske eller benzenringen.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R er en 5-leddet hetero cyklisk ring som har minst ett S-atom deri.

4. Forbindelse ifølge krav 1-3, karakterisert ved at R er valgt fra en tiofenring, en furanring eller et substituert derivat derav som definert i krav 1.

5. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R innbefatter en heterocyklisk ring substituert med halogen eller cyano.

6. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at R er valgt fra en tiofenring, en furanring og substituerte derivater derav valgt fra brom- og cyano-subsituterte derivater derav.

7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at -CHRR' er tenyl eller et bromsubstituert derivat derav.

8. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at den er Q<6->tenylguanin eller et bromsubstituert derivat derav.

9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved atR' er H.

10. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra fi f f Q. -tenylguanin, Q - (3-tienylmetyl) guanin, Q. - piperonylguanin, Q<6->furfuryl-guanin, Q<6->(2-benzo[b]tienylmetyl)guanin, Q c-(2-benzofuranylmetyl)guanin, Q - (5-tiazolylmetyl) guanin, Q. - (bromtenyl) guanin, Q -(5-cyanofurfuryl)guanin og Q<6->(2-naftylmetyl)guanin.

11. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, og en farmasøytisk akseptabel eksipient.

12. Farmasøytisk preparat følge krav 11, karakterisert ved at det videre omfatter et alkyleringsmiddel.

13. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, karakterisert ved at den skal anvendes i en fremgangsmåte for utarming av Q -alkylguanin-DNA alkyltransferase-aktivitet i en vert.

14. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, for fremstilling av et medikament for utarming av Q_ -alkylguanin-DNA alkyl-transferase-aktivitet i tumorceller.

15. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10 og et alkyleringsmiddel for fremstilling av et en- eller to-del farmasøytisk preparat for behandling av tumorceller.

16. Anvendelse ifølge krav 14 eller 15 hvor forbindelsen ifølge hvilke som helst av kravene 1-10 er Q^-tenylguanin eller et brom-substituert derivat derav.

17. Preparat ifølge krav 12, karakterisert ved at alkyleringsmidlet er valgt fra 1,3-bis-(2-kloretyl)-1-nitrosourea (BCNU) og temozolomid.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter omsetning av natriumhydrid med en løsning av RR'CHOH (hvor R og R' er som definert i krav 1) i et organisk løsningsmiddel, tilsetning av 2-amino-N.,M,N-trimetyl-lH-purin-6-aminiumklorid eller 2-amino-6-klorpurinribosid, behandling med en svak syre og eter, og ekstrahering av ønsket produkt.