SK10112003A3 - Použitie 4-Fluór-N-indan-2-ylbenzamidu na výrobu liečiva - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu vzorca I a jeho použitia ako farmaceutického prostriedku.

Podstata vynálezu

Endotelová NO syntáza (eNOS, NOS-III) patrí do skupiny troch izoenzýmov, ktoré produkujú oxid dusnatý (NO) oxidáciou arginínu. Endoteliálne uvoľňovaný NO má centrálnu dôležitosť v rade kľúčových kardiovaskulárnych mechanizmov. Má vazcčilatačný účinok a potláča agregáciu doštičiek, adhéziu leukocytov k endotelu a proliferáciu buniek intimálneho hladkého svalstva.

Doterajší stav techniky

Endotelová NO syntáza podlieha fyziologickej a patofyziologickej regulácii tak na transkripčnej, ako aj na pcsttranskripčnej úrovni. Enzým už prítomný v endoteli môže podliehať aktivácii závislej od vápnika a nezávislej od vápnika fosforyláciou špecifických aminokyselín, ale aj priamymi interakciami so špecifickými proteínmi. Stimulátormi tohto zvyčajne prechodného uvoľňovania NO sú extracelulárny arginín, 17-p~estrogén a mechanický stimul pôsobiaci na luminárny povrch endotelu krvným prietokom (strihovým napätím). Toto ďalej vedie k regulácii eNOS na transkripčnej úrovni. Tak napríklad Sessa a kol. (Circ. Research, 74, 349-353 (1994)) sa podarilo pomocou trénovania cvičení a s tým spojeného zvýšenia strihového napätia dosiahnuť zreteľné zvýšenie eNOS.

Či je regulácia na transkripčnej úrovni relevantná in vivo, sa jednoznačne nepreukázalo. Tak napríklad podanie vysokej dávky arginínu je nasledované v prípade pacientov s koronárnou srdcovou chorobou iba prechodným zlepšením na endoteli závislej vazorelaxácie.

Na druhej strane význam zvýšenej regulácie eNOS proteínu je vedecky prijatý. Existujú teda nálezy, ktoré preukazujú, že ochranné vlastnosti inhibitora HMG-CoA reduktázy simvastatínu sa môžu pričítať okrem znižovania lipidov sčasti aj zvýšeniu expresie eNOS in vivo (Endres a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8880-8885 (1998)). Ďalej je známe, že mutácia jediného bodu v 5'-oboj stranne priliehajúcej oblasti eNOS génu („eNOS promótor) a s tým spojené zníženie rýchlosti transkripcie eNOS génu v japonskej populácii je spojené s rizikom koronárnych spazmov (Nakayama a kol., Circulation, 99, 2864-2870 (1999)).

V súčasnosti sa predpokladá, že transkripčné a posttranskripčné mechanizmy regulácie eNOS sú vážne narušené pri velkom počte porúch, najmä pri kardiovaskulárnych poruchách. Aj vo veľmi raných štádiách najrôznejších kardiovaskulárnych porúch je možné, aby porušená funkcia tohto typu v endotelovej výstelke ciev viedla k nedostatku bioaktívneho NO, čo sa prejavuje pri rozvoji poruchy vo forme merateľných patofyziologických a morfologických zmien. Tieto kritické stupne v ranej aterogenéze sú urýchlené znížením uvoľňovania endotelového NO, ako napríklad oxidáciou lipoproteínov s nízkou hustotou, doplnením a uložením monocytov v intime ciev a proliferáciou intimálnych buniek. Dôsledkom aterogenézy je tvorba plátov vo vnútri ciev, čo zasa môže viesť v dôsledku zmenšenia strihového napätia k ďalšiemu zníženiu uvoľňovania endotelového NO a ďalšiemu zhoršeniu patológie. Pretože endotelový NO je aj vazodilatátorom, jeho zníženie často vedie aj k hypertenzii, čo môže ako nezávislý rizikový faktor spôsobovať ďalšie poškodenie orgánov.

Cielom terapeutického prístupu k liečbe týchto porúch musí preto byť prerušenie tohto reťazca eventualít zvýšením expresie endotelového NO. Pokusy s transferom génov, ktoré vedú in vitro k zvýšenej expresii syntázy NO v skôr poškodených cievach, sú de facto schopné čeliť opísaným procesom a sú teda dôkazom správnosti tohto prístupu (Varenne a kol., Gene Ther., 11, 1329 (2000)).

Niektoré nízkomolekulárne zlúčeniny, ktoré v bunkových kultúrach môžu viesť k priamemu účinku na transkripciu eNOS a na expresiu, sa opisujú v literatúre. Statiny, ktoré sa tu už uviedli, sú však jedinými substanciami, pri ktorých doteraz bolo možné preukázať takéto zvýšenie eNOS in vivo ako vedľajší účinok. Vzhľadom na známy rozsah vedľajších účinkov tejto triedy substancií je však nejasné, aký veľký je tento účinok v prípade toxikologický neproblematickej dávke.

Liao a kol. nárokujú vo WO 99/47153 a WO 00/03746 použitie inhibítorov rhoGTPázy a prostriedkov, ktoré ovplyvňujú organizáciu cytoskeletonu aktínu na zvýšenie eNOS v endotelových bunkách a na liečbu rôznych porúch, napríklad náhlej mozgovej príhody alebo pulmonálnej hypertenzie, bez toho aby však naznačili špecifickú cestu na dosiahnutie tohto cieľa.

Podstata vynálezu

Existuje teda veľká potreba liečiva, ktoré by regulovalo expresiu eNOS v endotelových bunkách. Cielom vynálezu je získať zlúčeninu, ktorá by mala túto vlastnosť.

Tento ciel sa dosahuje použitím 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu vzorca I

F (I) na výrobu liečiva na stimuláciu expresie endotelovej NO syntázy.

Tento ciel sa dosahuje aj farmaceutickým prípravkom na stimuláciu exprese endotelovej NO syntázy obsahujúcim účinnú dávku 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu a farmaceuticky prijateľný nosič.

Vynález zahŕňa ďalej použitie všetkých solvátov zlúčeniny vzorca I, napríklad hydrátov, aduktov so všetkými alkoholmi, aktívnych metabolitov zlúčeniny vzorca I, ako aj derivátov a prekurzorov liekov zlúčeniny vzorca I, ktoré obsahujú fyziologicky prijatelné a odštiepitelné skupiny, napríklad estery, amidy a zlúčeniny, v prípade ktorých skupina NH, znázornená vo vzorci I je nahradená N-alkylovou skupinou, ako je N-metylová skupina, alebo N-acylovou skupinou, ako je N-acetylová skupina alebo N-argininylová skupina, vrátane farmaceutický prijateľných solí vytvorených na funkčných skupinách prítomných v N-acylovej skupine .

WO 00/51970 opisuje výrobu a použitie 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu ako liečiva. Táto zlúčenina má schopnosť silne potenciovať cholínergickú aktivitu a je užitočná pri liečbe alebo/a prevencii porúch centrálneho nervového systému v prípade cicavcov, a najmä amnézie, demencie, napríklad senilnej demencie, Alzheimerovej demencie, demencie v spojitosti s rôznymi chorobami, ako je cerebrálna vaskulárna demencia, cerebrálna posttraumatická demencia, demencia v dôsledku nádoru na mozgu, demencia v dôsledku chronického subdurálneho hematómu, demencia v dôsledku normálneho tlaku hydrocefalu, postmeningitická demencia, demencia Parkinsonovho typu a podobne. Očakáva sa, že zlúčenina bude užitočná ako terapeutický alebo/a preventívny prostriedok pri schizofrénii, depresii, náhlej mozgovej príhode, poranení hlavy, odvykaní nikotínu, poranení miechy, úzkosti, polakiúrii, inkontinencii moču, myotickej dystrofii, poruche pozornosti, poruche hyperaktivity, prílišnej ospalosti v priebehu dňa (narkolepsii), Parkinsonovej chorobe alebo autizme. WO 00/51970 neopisuje alebo nenavrhuje použitie 4-fluór-N-indan-25

-ylbenzamidu na regulovanie expresie endotelovej NO syntázy, najmä pri liečbe kardiovaskulárnych chorôb, stabilnej alebo nestabilnej angíny pectoris, koronárnej srdcovej choroby, Prinzmetalovej angíny, akútneho koronárneho syndrómu, zlyhania srdca, infarktu myokardu, náhlej príhody mozgovej, trombózy, oklúzneho ochorenia periférnych tepien, endotelovej dysfunkcie, aterosklerózy, restenózy, poškodenia endotelu po perkutánnej transluminárnej koronárnej angioplastike (PTCA), hypertenzie, esenciálnej hypertenzie, pulmonálnej hypertenzie, sekundárnej hypertenzie, renovaskulárnej hypertenzie, chronickej glomerulonefritídy, erektilnej dysfunkcie, ventrikulárnej arytmie, diabetu alebo komplikácií diabetu, nefropatie, retinopatie, angiogenézy, bronchiálnej astmy, chronického zlyhania obličiek, cirhózy pečene, osteoporózy, obmedzenej schopnosti pamäti, obmedzenej schopnosti učenia alebo zníženia kardiovaskulárneho rizika v prípade žien po prechode alebo po užívaní antikoncepcie.

Zlúčenina vzorca I sa môže pripraviť z 2-indanylamínu, ktorý je známy z literatúry. 2-indanylamín sa môže nechať reagovať vo forme voľnej bázy alebo vo forme svojej soli so 4-fluórbenzoylchloridom v prítomnosti bázy, ako napríklad trietylamínu. Reakcia sa zvyčajne uskutočňuje v rozpúšťadle, ako je dichlórmetán, tetrahydrofurán, toluén alebo dioxán, a výhodne pri teplote miestnosti. Zlúčenina vzorca I sa môže získať aj kondenzačnou reakciou uvedeného 2-indanylamínu s kyselinou 4-fluórbenzcovou v prítomnosti bázy, ako je napríklad diizopropyletylamín, a' použitím vhodného kondenzačného reakčného činidla, ako sú napríklad karbodiimidy, HATU alebo TOTU (0-[(kyanoetoxykarbonylmerylén)-amino] -1,1, 3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborát).

Ďalšie reakcie na syntézu zlúčeniny vzorca I sú zrejmé alebo dobre známe odborníkovi a môžu sa uskutočniť použitím štandardných podmienok alebo analogicky s postupmi opísanými v literatúre, napríklad v Houben-Weyl, Methoden der organíschen Chemie, Thieme-Verlag, Stuttgart alebo Organic Reactions, John Wiley and Sons, New York. Prípadne sa môže zlúčenina vzorca I prečistiť štandardnými čistiacimi postupmi, napríklad prekryštalizovaním alebo chromatografiou. Východiskové zlúčeniny na prípravu zlúčeniny vzorca I sú komerčne dostupné alebo sa môžu pripraviť analogicky s postupmi opísanými v literatúre.

Zlúčenina vzorca I sa môže použiť na regulovanie expresie endotelovej NO syntázy a je užitočnou zlúčeninou pri liečbe rôznych chorôb. V súvislosti s vynálezom liečba zahŕňa terapiu, ako aj profylaxiu príslušných chorôb.

Príklady chorôb, ktoré sa môžu liečiť zlúčeninou vzorca I podlá vynálezu, zahŕňajú kardiovaskulárne choroby, ako je stabilná a nestabilná angína pectorís, koronárna srdcová choroba, Prinzmetalova angína (spazmus), akútny koronárny syndróm, zlyhanie srdca, infarkt myokardu, náhla príhoda mozgová, trombóza, oklúzne ochorenie periférnych tepien (PAOD) , endotelová dysfunkcia, ateroskleróza, restenóza, poškodenie endotelu po perkutánnej transluminárnej koronárnej angioplastike (PCTA), hypertenzia, vrátane esenciálnej hypertenzie, pulmonálnej hypertenzie a sekundárnej hypertenzie (renovaskulárna hypertenzia, chronická glomerulonefritída) , erektilná dysfunkcia, ventrikulárna arytmia a zníženie kardiovaskulárneho rizika v prípade žien po prechode alebo po užívaní antikoncepčných prostriedkov.

Zlúčenina vzorca I sa môže okrem toho použiť pri terapii alebo profylaxii diabetu a komplikácií diabetu (nefropatie, retinopatie) , angiogenézy, bronchiálnej astmy, chronického' zlyhania obličiek, cirhózy pečene, osteoporózy, obmedzenej výkonnosti pamäti alebo obmedzenej schopnosti učenia.

Výhodnými indikáciami sú stabilná angína pectorís, koronárna srdcová choroba, hypertenzia, endotelová dysfunkcia, ateroskleróza a komplikácie diabetu.

Zlúčenina vzorca I sa môže použiť aj v kombinácii s inými farmaceutický aktívnymi zlúčeninami, ktoré sú schopné zvýšiť účinok zlúčeniny vzorca I. Príklady takýchto zlúčenín zahŕňajú statíny, ACE-inhibítory, ATl-antagonisty, inhibítory argininázy, PDE V-inhibítory, Ca-antagonisty, a-blokátory, metimazol a analogické zlúčeniny, arginín, tetrahydrobiopterín, vitamíny, najmä vitamín C a vitamín B6 (niacín).

Zlúčenina vzorca I, prípadne v kombinácii s inými farmaceutický aktívnymi zlúčeninami, sa môže podať živočíchom, výhodne cicavcom, a najmä ľuďom, ako farmaceutický prostriedok ako taký alebo vo forme farmaceutických prípravkov. Ďalším predmetom vynálezu sú farmaceutické prípravky (alebo farmaceutické prostriedky) , ktoré obsahujú účinnú dávku zlúčeniny vzorca I a farmaceutický prijateľný nosič, t. j. jeden alebo niekoľko farmaceutický prijateľných substancií slúžiacich ako nosiče alebo/a pomocné látky. Tieto farmaceutické prípravky slúžia na stimuláciu expresie endotelovej NO syntázy a najmä ako liečivo na terapiu a profylaxiu uvedených syndrómov.

Farmaceutický prostriedok podlá vynálezu sa môže podávať orálne, napríklad vo forme práškov, tabliet, lakovaných tabliet, cukrom potiahnutých tabliet, granúl, tvrdých a mäkkých želatínových toboliek, vodných, alkoholických alebo olejových roztokov, sirupov, emulzií alebo suspenzií, alebo rektálne, napríklad vo forme čapíkov. Aplikácia sa môže uskutočňovať aj parenterálne, napríklad subkutánne, intramuskulárne alebo intravenózne, vo forme roztokov pre injekcie alebo infúziu. Inými vhodnými aplikačnými formami sú napríklad perkutánna alebo topická aplikácia, napríklad vo forme mastí, tinktúr, sprejov alebo transdermálnych terapeutických systémov, alebo inhalačná aplikácia vo forme nazálnych sprejov alebo aerosólových zmesí, alebo napríklad mikrokapsulí, implantátov alebo tyčiniek. Výhodná aplikačná forma závisí napríklad od choroby, ktorá sa má liečiť, a od jej závažnosti.

Množstvo zlúčeniny vzorca I vo farmaceutických prípravkoch sa normálne pohybuje od 0,2 do 800 mg, výhodne od 0,5 do 500 mg, najmä od 1 do 200 mg, na dávku, ale v závislosti od typu farma8 ceutického prípravku môže byť aj vyššie. Farmaceutické prípravky zvyčajne obsahujú 0,5 až 90 % hmotnostných zlúčeniny vzorca I. Príprava farmaceutických prípravkov sa môže uskutočniť známym spôsobom. Na tento účel sa zlúčenina vzorca I spoločne s jedným alebo s niekoľkými tuhými alebo kvapalnými farmaceutickými nosičmi alebo/a prísadami (alebo pomocnými látkami) a prípadne v kombinácii s inými farmaceutický aktívnymi zlúčeninami, ktoré majú terapeutický alebo profylaktický účinok, privedú do vhodnej aplikačnej formy, ktorá sa môže použiť ako liečivo v humánnej alebo veterinárnej medicíne.

Na výrobu práškov, tabliet, tabliet potiahnutých cukrom a tvrdých želatínových toboliek sa môže použiť napríklad laktóza, škrob, napríklad kukuričný škrob, alebo deriváty škrobu, mastenec, kyselina stearová alebo jej soli a tak ďalej. Nosičmi pre mäkké želatínové tobolky a čapíky sú napríklad tuky, vosky, polotekuté a tekuté polyoly, prírodné alebo tvrdené oleje a tak ďalej. Vhodnými nosičmi na prípravu roztokov, napríklad roztokov pre injekcie, alebo emulzií alebo sirupov sú napríklad voda, fyziologický roztok chloridu sodného, alkoholy, ako je etanol, glycerol, polyoly, sacharóza, invertný cukor, glukóza, manitol, rastlinné oleje a tak ďalej. Zlúčenina vzorca I sa môže aj lyofilizovať a výsledné lyofilizáty použiť napríklad na prípravu prípravkov pre injekcie alebo infúziu. Vhodnými nosičmi pre mikrokapsule, implantáty alebo tyčinky sú napríklad kopolyméry kyseliny glykolovej a kyseliny mliečnej.

Okrem zlúčeniny vzorca I a nosičov môžu farmaceutické prípravky obsahovať aj prísady, napríklad plnidlá, dezintegračné prostriedky, spájadlá, lubrikanty, zmáčadlá, stabilizátory, emulgátory, dispergačné prostriedky, konzervačné prostriedky, sladidlá, farbivá, ochuťovadlá, aromatizačné prostriedky, zahusťovadlá, riedidlá, pufre, rozpúšťadlá, solubilizátory, prostriedky na dosiahnutie depotného účinku, soli na zmenu osmotického tlaku, povliekacie prostriedky alebo antioxidačné prostriedky.

Dávkovanie zlúčeniny vzorca I, ktorá sa má aplikovať, je závislé od individuálneho prípadu a musí byť, ako zvyčajne, prispôsobené individuálnym okolnostiam na docielenie optimálneho účinku. Závisí teda od charakteru a závažnosti poruchy, ktorá sa má liečiť, ako aj od pohlavia, veku, hmotnosti a individuálnej vnímavosti človeka alebo zvieraťa, ktoré sa má liečiť, od trvania pôsobenia zlúčeniny vzorca I, od toho, či liečba je akútna alebo chronická alebo profylaktická alebo od toho, či sa podávajú iné aktívne zlúčeniny okrem zlúčeniny vzorca I. Vo všeobecnosti je denná dávka približne 0,01 až 100 mg/kg, výhodne 0,1 až 10 mg/kg, najmä 0,3 až 5 mg/kg (v každom prípade mg na kg telesnej hmotnosti) vyhovujúca na aplikáciu dospelému pacientovi s hmotnosťou približne 75 kg na dosiahnutie požadovaných výsledkov. Denná dávka sa môže aplikovať v jedinej dávke alebo, najmä keď sa aplikujú veľké množstvá, sa môže rozdeliť na niekolko, napríklad dve, tri alebo štyri, jednotlivé dávky. V niektorých prípadoch, v závislosti od individuálnej odpovede, môže byť potrebné odchýliť sa od danej dennej dávky smerom nahor alebo nadol .

Zlúčenina vzorca I sa môže použiť aj na iné účely, než aké sa uviedli v predošlom texte. Neobmedzujúce príklady zahŕňajú diagnostické účely, použitie ako biochemické nástroje a ako medziprodukty na prípravu ďalších zlúčenín, napríklad farmaceutický aktívnych zlúčenín.

Vynález sa teraz objasní nasledovným príkladom.

Príklad uskutočnenia vynálezu

Príprava 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu

Zmiešalo sa 43,70 g (258 mmol) 2-aminoindán hydrochloridu a 53,43 g (528 mmol) trietylaminu s 250 ml tetrahydrofuránu, pridalo sa 42,89 g (270 mmol) 4-fluórbenzoylchloridu a zmes sa miešala počas 2 hodín pri teplote miestnosti.

Výsledná zmes sa potom naliala na zmes ľadu a kyseliny chlorovodíkovej, získaná zrazenina sa odfiltrovala, premyla sa roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vodou a vysušila sa vo vákuu. Surový produkt sa prekryštalizoval z metanolu. Získalo sa 47,8 g (73 %) bieleho kryštalického prášku.

Teplota topenia: 167 °C;

MS: 256,1 (M+H)⁺;

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-dg): 2,96 (dd, 2H, H-l/H-3) , 3,25 (dd, 2H, H-3/H-1), 4,70 (sext., 1H, H-2), 7,12-7,19 (m, 2H, H-4, H-7/H-5, H-6), 7,20-7,28 (m, 2H, H-5, H-6/H-4, H-7), 7,30 (t, 2H, H-3, H-5), 7,95 (dd, 2H, H-2, H-6), 8,68 (d, 1H, NH).

Meranie aktivácie eNOS transkripcie

Aktivácia eNOS transkripcie sa merala podlá postupu opísaného detailne v Li a kol. „Aktivácia proteínkinázy C a alebo/a ε zvyšuje transkripciu ludského génu endotelovej syntázy oxidu dusnatého, Mol. Pharmacol., 53, 630-637 (1998).

V krátkosti sa 3,5 kB dlhý fragment 5' štartovacieho kodónu eNOS génu klonoval, sekvenoval a klonoval v plazmidoch exprimujúcich luciferázu svetlušiek s cielom monitorovať aktiváciu eNOS promótora aktivitou reportergénu. Na testovanie zlúčeniny sa použila ľudská endotelová bunková línia so stabilnou transfekciou a exprimujúca túto konštrukciu promótor/reportér. Bunky sa inkubovali počas 18 hodín so zlúčeninou vzorca I.

Zlúčenina sa vopred rozpustila v dimetylsulfoxide (DMSO). Povolená bola konečná koncentrácia 0,5 % DMSO v kompletnom médiu. Zavedenie expresie reportérového génu do týchto buniek sa zmeralo použitím systému štandardného testu s luciferázou (Promega, Cat. No E150) podľa inštrukcií výrobcu. Bunky so zavedenou luciferázou inkubované so zlúčeninou vzorca I sa porovnali s bunkami inkubovanými s rozpúšťadlom samotným. Pomer oboch aktivít (pomer transkripcie a zavedenia, TIR) sa vyniesol ako funkcia koncentrácie zlúčeniny. Typicky začínali hodnoty TIR pri nízkych koncentráciách pri pomere 1, čo naznačuje, že zlúčenina nemá žiadny účinok, a postúpili až k maximálnej hodnote TIR označenú ako TIR(max), ktorá naznačuje zvýšenie transkripcie eNOS. Hodnoty EC50 pomerov transkripcie a zavedenia ako funkcia koncentrácie zlúčeniny sa stanovili graficky.

Účinok zlúčeniny vzorca I na transkripciu eNOS sa potvrdil pri druhom pokuse založenom na detekcii eNOS proteínu. Primárne ľudské endotelové bunky zo žily pupočnej šnúry (HUVEC) sa izolovali a kultivovali štandardnými postupmi. Bunky súvislej vrstvy sa inkubovali so zlúčeninou vzorca I počas 18 hodín a účinok na expresiu proteínu eNOS sa stanovil kvantitatívnym westernovým postupom. Po inkubácii zlúčeniny vzorca I sa HUVEC lyžovali v ľadovo studenom lýzovom pufri obsahujúcom 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % SDS a inhibítory proteázy. Lyzát sa podrobil štandardnej denaturačnej elektroforéze polyakrylamidovým gélom a naniesol sa na nitroceiulózové membrány. Použitím špecifickej primárnej monoklonálnej protilátky (Transduction Laboratories, UK) a alkalickou fosfatázou značenej sekundárnej protilátky (Jackson Labs.) sa vizualizoval špecifický eNOS proteínový pás a kvantifikoval sa na báze chemiflurescenčnej detekčnej metódy.

Pre zlúčeninu vzorca I hodnota EC50 bola 0,8 μΜ, hodnota TIR(max) bola 4,10.

Zvieracie modely

Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočnili v súlade s nemeckým zákonom na ochranu zvierat a so smernicami na použitie pokusných zvierat, ako je stanovené Pravidlom pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat US National Institutes of Health.

Zvieratá a starostlivosť o ne (Pokusy A až C)

Použili sa ApoE a eNOS deficitné myši (pôvod C57BL/6J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me) . Všetky zvieratá boli staré 10 až 12 týždňov a mali hmotnosť 22 až 28 g. 3 dni pred operáciou sa myši rozdelili do 4 skupín (kontrola ApoE, n = 10 až 12, ApoE so zlúčeninou vzorca I, n = 10 až 12, kontrola eNOS, n = 10 až 12, eNOS so zlúčeninou vzorca I, n = 10 až 12) a dostali buď štandardnú potravu pre hlodavce (obsahujúcu 4 % tuku a 0,001 % cholesterolu, ďalej uvedená ako skupina liečená placebom) alebo štandardnú potravu pre hlodavce a zlúčeninu vzorca I (10 alebo 30 mg/kg/deň p. o.)

A. Antihypertenzívny účinok v prípade uspaných myší ApoE

Krvný tlak sa stanovil v prípade myší, ktoré nadobúdali vedomie, použitím komputerizovaného systému pomocou manžety na chvostíku.

Pri použití zlúčeniny vzorca I sa po 4 mesiacoch liečby ApoE deficitných myší krvný tlak významne znížil (p < 0,05) v prípade skupiny, ktorá dostávala 30 mg/kg/deň v porovnaní so skupinou liečenou placebom (12 kPa ± 0,67 kPa oproti 15,3 kPa ± 0,27 kPa). Žiadne zníženie krvného tlaku sa nepozorovalo pri podobnom dávkovaní v prípade eNOS deficitných myší po 4 týždňoch liečby.

B. Inhibícia tvorby neointimy a aterogenézy (krúžok na femorálnej tepne)

Po 3 dňoch liečby ApoE deficitných myší zlúčeninou vzorca I (10 mg/kg/deň zlisovanej v potrave) sa zvieratá anestetizovali intraperitoneálnou injekciou pentobarbitalu (60 mg/kg) nasledovanou intramuskulárnou injekciou xylazínu (2 mg/kg) a okolo femorálnej tepny sa umiestnil krúžok podľa postupu opísaného v Moroi a kol., J. Clin. Invest., 101, 1225-1232 (1998). V krátkosti sa femorálna tepna vypreparovala, okolo tepny sa umiestnil neokludujúci 2,0 mm polyetylénový krúžok vyrobený z PE 50 rúrky (vnútorný priemer 0,56 mm, vonkajší priemer 0,965 mm, Becton Dickinson, Moutain View, Ca) a zakotvil sa na mieste dvoma ste13 hami 7-0. Pravá femorálna tepna sa izolovala od okolitého tkaniva, ale krúžok sa na ňu neumiestnil. V podávaní zlúčeniny vzorca I sa pokračovalo počas 14 dní po operácii. Potom sa zvieratá usmrtili. Aorty sa odobrali na stanovenie vaskulárnych eNOS expresií kvantitatívnym westernovým postupom. Obe femorálne tepny sa odobrali, fixovali sa vo formalíne a zabudovali sa do parafínu. 20 priečnych vzoriek v rozsahu obvodu tepny (10 v prípade m) sa odobralo z časti lavej femorálnej tepny opatrenej krúžkom a zo zodpovedájúceho segmentu pravej tepny. Vzorky sa podrobili štandardnému vyfarbeniu hematoxylínom a eozínom. Uskutočnili sa morfometrické analýzy použitím počítačového programu analýzy obrazu (LeicaQWin, Leica Imaging Systems, Cambridge, GB). Pre každú vzorku sa stanovila plocha lumenu, neointimy a medie. Na tento účel sa definovala neointima ako plocha medzi lumenom a vnútornou elastickou laminou a média sa definovala ako plocha medzi vnútornou a vonkajšou elastickou laminou. Pomer medzi plochou neointimy a plochou medie sa vyjadril ako pomer neointima/media.

Zlúčenina vzorca I znížila tvorbu zle prispôsobivej neointimy o faktor 2 znížením pomeru neointimy k medii z 0,39 ± 0,07 v skupine liečenej placebom na 0,170 ±0,04 v skupine liečenej zlúčeninou vzorca I. Paralelne sa zvýšila expresia vaskulárnej eNOS o faktor 2,1. Žiadny účinok zlúčeniny vzorca I sa nepreukázal v podobnom usporiadaní, kedy sa použili eNOS deficitné myši miesto uspaných ApoE myší.

C. Prevencia tvorby aterosklerotického plátu pri chronickej liečbe

ApoE deficitné myši sa liečili počas 16 týždňov zlúčeninou vzorca I zlisovanou v potrave pre hlodavce a nakoniec sa usmrtili. Z každej myši sa vybrala aorta, ktorá sa fixovala vo formalíne a zabudovala sa do parafínu. Tvorba plátu sa zmerala pomocou tvorby lipidových léz v aortách (od oblúku aorty k bránici) a analyzovala sa vyfarbením olejovou červeňou O. S cielom kvantifikovať účinok príslušnej zlúčeniny na expresiu vaskulárneho eNOS sa pri tomto pokuse použili femorálne tepny.

Zlúčenina vzorca I podľa vynálezu významne znížila tvorbu plátu (5,2 + 1 % oproti 13,3 + 2,6 % v skupine liečenej placebom, hodnoty celkového rozmeru plátu v % celkového povrchu). Zistilo sa, že expresia vaskulárneho eNOS je 1,75-krát vyššia v liečenej skupine.

D. Zlepšenie koronárnej funkcie v prípade uhynutých ApoE deficitných myší

Pri pokusoch sa použili samce myší divého typu (Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld) a ApoE deficitné myši (pôvod C57BL/6J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me) staré 6 mesiacov s hmotnosťou 28 až 36 g. Myši sa rozdelili do 3 skupín (C57BL/6, n = 8, ApoE kontrola, n = 8, ApoE so zlúčeninou vzorca I, n = 8) a dostávali počas 8 týždňov buď štandardnú potravu pre hlodavce (obsahujúcu 4 % tuku a 0,001 % cholesterolu) alebo štandardnú potravu pre hlodavce a zlúčeninu vzorca I (30 mg/kg/deň, p. o.).

Myši sa uspali pentobarbitonom sodným (100 mg/kg, i. p.) a rýchlo sa excidovali srdcia, ktoré sa umiestnili do ľadom chladeného perfúzneho pufra. Aorta sa kanylovala a pripojila sa k perfúznemu prístroju (Hugo Sachs Electronics, Freiburg, Nemecko) , ktorý sa ihneď naštartoval pri konštantnom perfúznom tlaku 7,9 kPa. Srdcia sa perfundovali retrográdnym spôsobom s modifikovaným Krebsovým hydrogenuhličitanovým pufrom ekvilibrovaným 95 % O2 a 5 % CO2 a udržiavaným pri teplote 37,5 °C.

Úzka rúrka (PE 50) sa zaviedla pľúcnou žilou do ľavej srdcovej komory a pretiahla sa stenou komory, zakotvila sa na hrote srdca pomocou ryhovaných koncov a pripojila sa k mikromanometru (Millar 1,4 French). Ľavá sieň sa kanylovala rovnakou pľúcnou žilou a srdce sa nastavilo na pracovný rytmus s konštantným predzaťažením tlaku 1,33 kPa a následnom zaťažení tlaku 7,9 kPa. Výtok z aorty a prítok do siene sa merali kontinuálne použitím ultrazvukových sond prietoku (HSE/Transonic Systems, Inc.). Koronárny prietok sa vypočítal ako rozdiel medzi prietokom v sieni a prietokom v aorte. Všetky hemodynamické údaje sa digitalizovali vzorkovacou rýchlosťou 1000 Hz a zaznamenali sa počítačom, pričom sa použil špecializovaný program (HEM, Notocord).

Srdcia sa nechali stabilizovať počas 30 minút. Všetky hemodynamické údaje sa zmerali v priebehu rovnovážneho stavu a v priebehu zaťaženia objemom a tlakom.

Krivky funkcie lávej siene sa zostrojili pri meniacom sa predzaťažení. S cieľom získať krivky predzaťaženia sa následné zaťaženie nastavilo na 7,9 kPa a predzaťaženie sa upravilo v stupňoch po 0,67 kPa v rozsahu 0,67 až 3,33 kPa. Srdcia sa nechali stabilizovať na východiskových podmienkach medzi zaťažením tlakom a objemom.

V izolovaných srdciach z ApoE deficitných zvierat došlo v tomto usporiadaní k nižšiemu koronárnemu prietoku v porovnaní s divým typom myší C57B16 (3,6 ml/min oproti 4,95 ml/min). Liečba ApoE deficitných myší zlúčeninou vzorca I podía vynálezu zvýšila koronárny prietok na 5 ml/min v porovnaní s hladinami neusmrtených myší divého typu. Zlúčenina vzorca I zlepšila aj na predzaťažení závislý koronárny prietok a znížila výskyt ventrikulárnych arytmií, čo je indikátorom antiischemickej účinnoszi.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu vzorca I na výrobu liečiva na stimuláciu expresie endotelovej NO syntázy.
2. 2. Použitie 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu na výrobu liečiva na liečbu kardiovaskulárnych chorôb, ako je stabilná alebo nestabilná angína pectoris, koronárna srdcová choroba, Prinzmetalova angína, akútny koronárny syndróm, zlyhanie srdca, infarkt myokardu, trombóza, oklúzne ochorenie periférnych tepien, endotelová dysfunkcia, ateroskleróza, restenóza, poškodenie endoteiu po perkutánnej transluminálnej koronárnej angioplastike, hypertenzia, esenciálna hypertenzia, pulmonálna hypertenzia, sekundárna hypertenzia, renovaskulárna hypertenzia, chronická glomerulonefritída, erektilná dysfunkcia, ventrikulárna arytmia, diabetes alebo komplikácie diabetu, nefropatia, retinopatia, angiogenéza, bronchiálna astma, chronické zlyhanie obličiek, cirhóza pečene, osteoporóza alebo zníženie kardiovaskulárneho rizika v prípade žien po prechode alebo po užívaní antikoncepčných prostriedkov .
3. 3. Použitie podlá nárokov 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že liečivo je na liečbu endotelovej dysfunkcie, hypertenzie, koronárnej srdcovej choroby, stabilnej angíny pectoris, komplikácií diabetu alebo aterosklerózy.
4. 4. Farmaceutický prípravok na stimuláciu expresie endotelovej NO syntázy, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinnú dávku 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu a farmaceutický prijatel17 ný nosič.
5. 5. Farmaceutický prípravok na liečbu kardiovaskulárnych chorôb, stabilnej alebo nestabilnej angíny pectoris, koronárnej srdcovej choroby, Prinzmetalovej angíny, akútneho koronárneho syndrómu, zlyhania srdca, infarktu myokardu, trombózy, oklúzneho ochorenia periférnych tepien, endotelovej dysfunkcie, aterosklerózy, restenózy, poškodenia endotelu po perkutánnej transluminálnej koronárnej angioplastike, hypertenzie, esenciálnej hypertenzie, pulmonálnej hypertenzie, sekundárnej hypertenzie, renovaskulárnej hypertenzie, chronickej glomerulonefritídy, erektilnej dysfunkcie, ventrikulárnej arytmie, diabetu alebo komplikácií diabetu, nefropatie, retinopatie, angiogenézy, bronchiálnej astmy, chronického zlyhania obličiek, cirhózy pečene, osteoporózy alebo zníženia kardiovaskulárneho rizika v prípade žien po prechode alebo po užívaní antikoncepčných prostriedkov, pričom tento prípravok obsahuje účinnú dávku 4-fluór-N-indan-2-ylbenzamidu a farmaceutický prijateľný nosič.
6. 6. Farmaceutický prípravok podľa nárokov 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický prípravok je vo forme prášku, tablety, lakovanej tablety, tablety potiahnutej cukrom, granule, tvrdej alebo mäkkej želatínovej tobolky, vodného, alkoholického alebo olejového roztoku, sirupu, emulzie alebo suspenzie, čapíku, roztoku pre injekcie alebo infúziu, masti, tinktúry, spreja alebo transdermálneho terapeutického systému, nazálneho spreja, aerosólovej zmesi, mikrokapsule, implantátu alebo tyčinky.