SI9520092A

SI9520092A - Spirostanyl glycosidal crystals

Info

Publication number: SI9520092A
Application number: SI9520092A
Authority: SI
Inventors: Douglas J Allen; Richard A Buzon; Michel P Dennino; Harry A Watson; Jonathan B Zung
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1995-05-04
Publication date: 1997-12-31
Also published as: HRP950459A2; AU2265395A; PL318937A1; FI970828A0; PE47696A1; OA10402A; MX9701525A; CO4480032A1; WO1996006854A1; NO970910D0; BR9503827A; FI970828A; IL115062A0; MA23651A1; JPH09510735A; EP0778846A1; CA2198097A1; US5804562A; KR970705574A; NO970910L

Description

SPIROSTANILNI GLIKOZIDNI KRISTALI

OZADJE IZUMA

Ta izum se nanaša na steroidne glikozide in metode za uporabo teh, še posebej kot hipoholesterolemne in antiaterosklerotične agense pri sesalcih.

Mnogo znanih produktov, ki imajo hipoholeserolemno aktivnost so prečno povezani sintetični derivati polimerov kakršen je na primer polistiren. Prečno povezane, v vodi netopne na polistirenu osnovane smole s sposobnostjo vezanja žolčnih kislin, t.j, agensi Cholestyramine (Blag. znamka; Op. prev.) agensi imajo zrnat občutek v ustih ter zaradi tega slab okus. Dodatno, imajo te spojine osnovane na smolah navadno slabo in vivo učinkovitost. Tako mora biti učinkovita doza teh hipoholesterolemičnih agensov ekscesivna, tipično od 18 do 24 gramov formuliranega produkta na dan. Drugi znani polimeri, ki imajo hipoholesterolemično aktivnost pa vključujejo naravni produkt kitosan in njegove derivate, kakor je bilo že opisano v objavljenem EP št. 0212145. Prav tako pa velja tudi za te, da mora biti učinkovita doza zelo visoka.

Drugi znani agensi, ki lahko nadzorujejo hiperholesterolemijo vključujejo izvlečke rastlin, kakršni so alfalfa saponini. Ti ekstrakti pa imajo različne kompozicije in vsebujejo znatne količine neuporabnih kemičnih spojin. Zaradi teh variacij v kompoziciji je težko določiti standardno dozo ali napovedati prisotne nečistosti. Tako ti ekstrakti niso posebej primerni za uporabo pri ljudeh. Nadalje velja tudi, da bi bilo prečiščevanje teh ekstraktov zelo drago. Kakor alternativa temu, lahko določene, sintetično izdelane, čiste iz sapogenina pridobljene spojine, t.j. substance sestavljene iz spirostana, spirostena ali iz sterola pridobljene spojine, znižajo absorbiranje holesterola bolj učinkovito kakor alfalfa ekstrakti na osnovi teže in jih lahko zaradi tega vnašamo v zmernih dozah. Ker so kemične formule teh spojih znane in ker jih lahko sintetiziramo pri veliki stopnji čistosti so ustrezne za uporabo pri toplokrvnih živalih vključno z ljudmi.

Toda, če teh čistih sapogenov ne vnesemo v velikih dozah, le ti ne inhibirajo absorbcije holesterola v znatnih merah. Le če jih zamešamo z dodatnimi sestavinami, bodo imeli željen učinek. Primeri takih sapogenskih zmesi so zmesi tigogena in diosgenina, še posebej pa glikozidi teh. P.K. Kintia, lu. Vasilenko, G.M. Gorianu, V.A. Bobeiko, I.V. Suetina, N.E. Mashchenko, Kirn. Pharm. Zh., 1981, 15(9), 55 je prikazal 3-0 (β-D-galaktopiranozil)hekogenin in njegovo uporabo v obliki hipoholesterolemičnega agensa. U.S. patent Nos. 4,602,003 in 4,602,005 prikazujeta določene steroidne glikozide, še posebej 3-0-(β-D-glukopiranozil)tigogenin ter 3-0-(β-Dcelobiozil)tigogenin in njuno uporabo pri nadzorovanju hiperholesterolemije. 3-0-(β-D-celobiozil)tigogenin ima boljšo hiperholesterolemično aktivnost kakor , na primer, holesiramin.

V skupno označeni PCT aplikaciji PCT/US93/04092, izdani kakor W0 94/00480 (ki jo tukaj navajamo kakor referenco) so bili prikazani drugi steroidni glikozidi z boljšo hipoholesterolemično aktivnostjo, ter v skupno označeni U.S. patentni aplikaciji s serijsko številko 08/054,449, ki je bila vložena 28 Aprila 1993 (sedaj PCT/US/00446) kjer je bil prikazan kristalni monohidrat od (3β, 5α, 25R)-3-((β-Dcelobiozil) oksi) spirostan-ll-on in njegova uporaba kako hipoholesterolemični agens in antiaterosklerotik.

Dodatno, je skupno označena U.S. patentna aplikacija s serijskimi številkami 08/174,100 in 08/174,099 (ki so tukaj navedene kakor reference), prikazujejo dodatne steroidne glikozide (t.j. (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis-(2fluorofenilkarbamoil)celobiozil)oksi)-spirostan-12-on), ki ima boljšo hipoholesterolemično aktivnost.

Tako obstaja kljub temu, da imamo veliko število različnih hipoholesterolemnih agensov na tem področju, še nadaljnje iskanje alternativnih agensov.

POVZETEK IZUMA

Eden izmed aspektov tega izuma je usmerjen na dve visoko kristalizirani obliki (v nadaljnem besedilu bosta označevani kot oblika A in oblika B) spirostanilnega glikozida, ki sta uporabni kakor hipoholesterolemična agensa ali antiaterosklerotična agensa. Spojina je (3β, 5α, 25Κ.)-3-((βD-4, 6-bis-(fluorofenilkarbamoil)celobiozil)oksi)spirostan-12-on) lom žarkov X pa ima naslednji interval-d:

OBLIKA A interval-d 20 NAJVIŠJIH VRHOV

21.10

17.46

13.58

10.49

6.98

6.78

6.34

5.77 5.52

5.35

5.12

4.82 4.53

4.37

4.12

3.82 3.55 3.44

3.37 ali

OBLIKA B interval-d 12 NAJVIŠJIH VRHOV

19.96

17.11

15.14

9.97

7.57 6.62 6.09 5.36 5.15 4.90

4.57

3.77

Kristalna oblika A spirostanilnega glikozida je prednostna in ima naslednji interval-d:

OBLIKA A interval-d 20 NAJVIŠJIH VRHOV

21.10

17.46

13.58

10.49

6.98

6.78

6.60

6.34

5.77

5.52

5.35

5.12

4.82

4.53

4.37

4.12

3.82 3.55 3.44

3.37

Kristalna oblika B spirostanilnega glikozida je drugi aspekt tega izuma in ima naslednji interval-d:

OBLIKA B interval-d 12 NAJVIŠJIH VRHOV

19.96

17.11

15.14

9.97

7.57 6.62 6.09 5.36 5.15 4.90

4.57

3.77

Še eden izmed nadaljnjih ciljev tega izuma je usmerjen na farmacevtske zmesi za zdravljenje hiperholesterolemije ali ateroskleroze pri sesalcih, kjer vsebuje omenjena zmes kristalno spojino, ki je bila opisana zgoraj pomešano s farmacevtsko sprejemljivim prenašalcem.

Nadaljnji cilj tega izuma je usmerjen na metodo zdravljenja hiperholesterolemi je ali ateroskleroze pri sesalcih, z vnašanjem terapevtsko učinkujočih količin kristalne spojine, ki je bila že opisana, v bolnega sesalca.

Nadaljnji cilj tega izuma je tudi proces za pripravo kristalne spojine, ki je bila opisana zgoraj. Ta proces zajema kristalizacijo iz ustreznega topila, za katerega se priporoča etilni acetat ali acetonitril. V priporočenem aspektu tega izuma se (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis-(2fluorofenilkarbamoil)celobiozil)oksi)-spirostan-12-on zameša v dovolj veliki količini etilnega acetata ali acetonitrila, kjer ga mešamo dovolj dolgo, da tako dobimo, po hlajenju, kristalni (3β, 5α, 25R )-3-((β-Ώ-4, 6-bis-(2fluorofenilkarbamoil)celobiozil)oksi)-spirostan-12-on.

Tako je ta izum znaten napredek v umetnosti pridobivanja prve (oblika A) nehigroskopične, termodinamično stabilne, visoko kristalne oblike (3β, 5α, 25R)-3-((β-Ώ-4, 6-bis-(2fluorofenilkarbamoil)celobiozil)-oksi)-spirostan-12-on) in druge (oblika B) kristalne oblike imenovane spojine, ki je bolj termodinamično stabilna kakor tretja, prej kristalna oblika imenovane spojine. Ti kristali olajšajo razvoj in regulatorni pregled spojine. Dodatno, ima izbrana kristalna oblika tega izuma boljše ravnalne in formulacijske (t.j. tabeliranje) karakteristike zaradi svoje nehigroskopične narave. Za primerjavo, je tretja, predhodna oblika spojine mikrokristal brez razločnih navad. Ta zadnja oblika ni tako termostabilna, saj je kristal z elementom nereda, ter ima voskasto konsistenco (zaradi svoje higroskopične narave), zaradi česar se upira filtriranju, ravnanju z njo ter formulacij i.

Druge lastnosti in prednosti bodo postale jasne iz specifikacij in patentnih zahtevkov ter priloženih slik, ki ilustrirajo realizacije tega izuma.

KRATEK OPIS SLIK

Slika 1 ilustrira rentgenski difrakcijski vzorec praška prve izbrane kristalne oblike A tega izuma;

Slika 2 ilustrira rentgenski difrakcijski vzorec praška druge izbrane kristalne oblike B tega izuma.

PODROBEN OPIS IZUMA (3β, 5α, 25R)-3-((β-β-4, 6-bis-(2-fluorofenilkarbamoil) celobiozil)-oksi)-spirostan-12-on) ima formulo: H

Spojina s formulo I je tu definirana kot enojna enantiomera, ki ima absolutno stereokemijo, ki je prikazana v formuli I. Glede na ta izum obstajata dve visoko kristalizirani obliki spojine iz formule I. Razumevanje tega izuma se lahko pridobi z referenco na slike 1 (oblika A) in 2 (oblika B), ki ilustrirata vzorec loma X žarkov praška visoko kristaliziranih oblik tega izuma. V obeh slikah, je intenzivnost (Y) v cps opisana na grafu napram dva theta (X) v stopinjah. Lom žarkov je bil izveden s Siemens-ovim Difraktomerom Model 5000 (Madison, Wisconsin) pri pogojih okolice.

Tako oblika A kakor B sta pravzaprav dvojno zaključeni rezili. Izbrana oblika A je bila opazovana kakor mešanica paličastih ali dvojno zaključenih rezil čeprav verjamemo, da je paličasta oblika le vmesna, oblika rezila pa je končna.

Ker obstaja oblika A v dveh kristalnih oblikah a ima pri tem še vedno eno samo kristalno ogrodje verjamemo, da bi lahko izolirali obe posamični kristalni obliki. Izbrana oblika B je nehigroskopična. Oblika B obstaja v hidrirani ali raztopljeni obliki. Dodatno smo obe kristalni obliki opazili kakor tanke madeže.

Izbrano visoko kristalizirano obliko A zgoraj opisane spojine lahko pridobimo z naslednjo proceduro. Precej čisto (manj kakor 10% nečistoč, če izključimo rezidualna topila, kakršna je voda) amorfno ali kristalizirano (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis-(2-fluorofenilkarbamoil)celobiozil)-oksi)-spirostan12-on) pretvorimo v visoko kristalizirano obliko A z mešanjem (t.j. s topljenjem, oziroma mešanjem v blato) amorfnega ali kristaliziranega materiala v ustreznem topilu (čeprav jasno konverzija v željeno fazo vključuje topljenje kristalnega ali amorfnega materiala in percipitacijo željene kristalne oblike), pri čemer priporočamo etilni acetat ali acetonitril, čemur sledi (re)kristalizacija.

Priporočljiva koncentracija spojine napram topilu je okoli 1:100 do okoli 1:1 po teža/volumen. Še posebej pa priporočamo koncentracijo okoli 5:100 do okoli 20:100.

Temperatura pri topljenju variira od ambienta (t.j. 17°C do 30°C) do temperature refluksa, s temperaturami okoli 60°C do temperature refluksa, ki so bolj učinkovite. Tipično, se te povišane temperature vzdržujejo okoli pol do 24 ur. Če te višje temperature uporabljamo za topljenje dovolimo, da se rezultantna suspenzija ohladi do temperature okolja, nakar se kristali granulirajo okoli polovico do 60 ur, čemur sledi hlajenje s konvencionalnimi metodami, pri čemer priporočamo filtracijsko in vakuumsko sušenje.

Alternativno, lahko začetna sredstva raztopimo v prvem topilu, kakršni so (Οι-Οθ)alkilketoni, THF/cikloheksan, (Ci— CJalkanoli ali klorirani hidrokarboni, kakršen je metilen klorid, priporočljivo tetrahidrofuran/cikloheksan 3:1, čemur sledi (re)kristalizacija ob izpostavljanju etilnemu acetatu ali acetonitrilu (t.j. zamenjava prvega topila z drugim med destilacijo).

Drugo visoko kristalizirano obliko B zgoraj opisane spojine pripravimo na analogen način glede na zgornjo proceduro (vključno z alternativno proceduro v predhodnem odstavku) z izjemo tega, da uporabimo alkanol (C1-C4) neobvezno z do 70% vode, kakršen je etanol, izopropanol ali n-propanol (30 do 70% )/vode(70 do 30%) kakor rekristalizacijsko topilo.

(3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis-(2-fluorofenilkarbamoil) celobiozil)-oksi)-spirostan-12-on) pripravimo glede na postopek, ki je bil opisan v ZDA patentni prijavi s serijsko številko 08/174,100, ki je bila vložena 28. decembra 1993 (katerega predstavitev je tukaj podana kakor referenca). Razkrito spojino lahko pripravimo tudi na naslednji način:

(3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis-(2-fluorofenilkarbamoil)2',2,3',3,6'-pentakloroacetil-celobiozil)-oksi)-spirostan12-on deacetiliramo s kombinacijo z nukleofilno bazo, kakršna je natrijev metoksid ali kalcijev cianid v polarnem topilu, kakršen je metanol, tetrahidrofuran, n-propanol ali mešanicami teh pri temperaturah od okoli 0°C p do 100°C (navadno pa pri sobni temperaturi) ter tlakom okoli 3.4475 KPa do 344,75 KPa (navadno pa pri normalnem tlaku) v trajanju 0.25 ur do 2 uri (navadno pa 0.5 ure), da bi tako dobili (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis-(2fluorofenilkarbamoil)celobiozil)-oksi)-spirostan-12-on).

(3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-2',2,3',3,6-penta-kloroacetilcelobiozil)-oksi)-spirostan-12-on pretvorimo v karbamoilni del s kombinacijo z ustrezajočim izocianatom (t.j. 2fluorofenilizocianat) v prisotnosti bakrovega klorida v polarnem aprotičnem topilu, kakršnen je dimetil formamid pri sobni temperaturi v trajanju 2 do 10 ur, da bi dobili (3β,

5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis(2-fluorofenil karbamoil)2',2,3',3,6'-penta-kloroacetil-celobiozil)oksi)spirostan-12-on).

((β—D—4, 6-O-(4-metoksibenziliden)-2', 2, 3', 3, 6'-pentakloro-acetilcelobiozil)oksi)-spirostan-12-on obravnavamo s trifluoroocetno kislino v mešanici diklorometana in metanola pri sobni temperaturi v trajanju 2 do približno 8 ur, da bi tako pripravili (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-2',2,3',3,6'-pentakloroacetilcelobiozil)oksi)-spirostan-12-on.

(3β, 5α, 25R)-3-((β-D-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on zreagiramo z anisaldehid dimetil acetalom v prisotnosti katalitične količine močne kisline kakršna je kafrno sulfonska kislina v anhidridnem, aprotičnem topilu, kakršen je kloroform ali dikloroetan pri pogojih refluksa v trajanju 2 do 6 ur pri tlaku okolice. Po zaključeni katalizaciji dodamo bazo, za katero priporočamo aminsko bazo, kakršna je piridin, ter acilirni agens, kakršen je kloro ocetni anhidrid in sicer pri temperaturi od okoli -20°C do 10°C, čemur sledi mešanje pri sobni temperaturi v trajanju 1 do 12 ur (tipično pa 2 uri), da bi tako pripravili (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-0-(4-metoksibenziliden)-2',2,3',3,6'-penta-kloroacetilbiozil)oksi)-spirostan-12-on.

(3β, 5α, 25R)-3-((heptaacetil-^-D-celobiozil)oksi)-spirostan12-on deacetiliramo s kombinacijo z nukleofilno bazo, kakršna je natrijev metoksid ali kalcijev cianid v topilu, kakršno je metanol, tetrahidrofuran, n-propanol ali mešanice teh, pri povišanih temperaturah od 40°C pa do 100°C ter pri tlakih od 3,4475 KPa do 344,75 KPa (tipično pa pri običajnem tlaku okolice) v trajanju 0.25 ure do okoli 3 ure, da bi tako pridobili (3β, 5α, 25R)-3-((β-D-celobiozil)-oksi)-spirostan12-on.

(3β, 5α, 25R) -3- ( (heptaacetil^-D-celobiozil) -oksi) spirostan-12-on pripravimo s spajanjem heptaacetil^-Dcelobiozil bromida in (3β, 5α, 25R)-3-hidroksi-spirostan-12on v ne-protični, anhidridni reakciji inertnega topila (t.j. acetonitril) pri temperaturi od 20°C do okoli 100°C v trajanju 0.5 do 12 ur v prisotnosti 0.5 do 4 ekvivalentov cinkovega fluorida.

Začetni materiali zgoraj opisanih reakcij (t.j.

peracetiliran sladkorni halid) so na voljo ali pa jih lahko z lahkoto sintetizirajo tisti, ki so seznanjeni s konvencionalnimi metodami organske kemije. Še posebej, (3β, 5α, 25R)-3-hidroksispirostan-12-on (t.j. hekogenin) je nabavij iv pri Sigma Chemical Company, St. Louis, MO ali Steraloids Inc., Wilton, N.H. Sicer pa je bila njegova izolacija in prečiščevanje že opisana v Rodd-ovem Chemistry of Carbon Compounds, S. Coffey ed., Vol. II, Del E, str. 153, 1971.

Spojina tega izuma je močan inhibitor absorbcije holesterola in jo tako lahko uporabljamo v terapevtske namene pri hiperholesterolemiji kakor nadzorovalni agens pri sesalcih, še posebej ljudeh. Ker je hiperholesterolemija tesno povezana z razvijanjem splošnih kardiovaskularnih, možganskih vaskularnih ali perifernih vaskularnih težav, lahko ta spojina sekundarno prepreči tudi nastajanje ateroskleroze. Nadzorovalna aktivnost hiperholesterolemije te spojine se lahko demonstrira z metodami, ki so bile osnovane na standardnih procedurah. Na primer, in vivo aktivnost te spojine pri inhibiciji intestinalne absorbcije holesterola se lahko določi s proceduro po Melchoir and Harwell (J. Lipid Res., 1985, 26, 306-315).

Aktivnost lahko določimo s količino hiperholesterolemičnega agensa, ki zniža absorbcijo holesterola, relativno glede na kontrolo, pri moških samcih zlatih sirijskih hrčkov. Tem hrčkom dajemo bodisi hrano brez holesterola (kontrolne živali) ali pa dieto, suplementirano z 1% holesterola in 0.5% holične kisline, v trajanju 4 dni. Naslednji dan živali postimo 18 ur, nato pa vanje oralno vnesemo 1.8 ml bolusa vode, ki vsebuje 0.25% metilceluloze, 0.6% Tween 80 (Blag. znamka; Op. prev.) in 10% etanola (kontrolne živali) ali pa oralni bolus, ki vsebuje, dodatno, še želj eno koncentracijo spojine, ki jo želimo testirati. Takoj po vnosu bolusa prejmejo živali tudi drugi 1.5 ml oralni bolus tekočega hranila za hrčke, ki pa vsebuje 1%(H³) holesterola (2.0 pCi/žival; 210 dpm/nmol) in 0.5% holične kisline, nakar jih postimo dodatnih 24 ur. Na koncu tega drugega postnega obdobja, živali žrtvujemo, izrežemo jetra ter jih saponificiramo, alikvote dekoloriziramo z dodajanjem vodikovega peroksida, nato pa izmerimo radioaktivnost.

Celotna jeterna radioaktivnost se izračuna glede na izmerjeno težo jeter. Stopnjo absorbcije holesterola izrazimo kakor procentualnost celotne radioaktivnosti vnesene kakor oralni bolus, ki je bila prisotna v 24 urah, ki so sledile administraciji bolusa.

Anti-aterosklerotski učinki te spojine (t.j. aktivnost in torej doze) lahko določimo s količino agensa tega izuma, ki zniža odlaganje lipidov, relativno glede na kontrolo, v aorti samcev Novo zelandskih belih zajčkov. Te hranimo s hranivom, ki vsebuje 0.4% holesterola, 5% kikirikijevega olja 1 teden (hranimo jih le enkrat na dan). Po 1 tednu pri nekaterih zajcih (kontrolna skupina) nadaljujemo s hranjenjem, ostali pa sprejmejo dodatek z izbrano koncentracijo spojine, ki jo želimo testirati. Po 8.5 tednih tretma z zdravili prekinemo, živali pa pustimo na holesterolni dieti še dodatna 2 tedna, nakar preklopimo na hranjenje brez holesterola, kar traja 5 tednov. Živali nato žrtvujemo, odstranimo aorte od prsnega loka do vejanja iliačnih arterij. Aortam nato odstranimo najbolj zunanjo, adventicijsko plast, jih odpremo podolgem ter jih obarvamo s Sudan IV, kakor je bilo opisano v Holman et al. (Lab. Invet. 1985, 7, 42-47). Procent obarvane površine kvantiziramo z merjenjem gostote, kjer uporabimo Optimas Image Analyzing System (Image Processing SystemsSistem za obdelavo slik; Op. prev.). Znanjšano odlaganje maščob je nakazano z znižanjem procenta površine, ki se v zdravljeni skupini zajcev obarva v primerjavi s kontrolnimi zajci.

Vnašanje spojine tega izuma lahko opravimo preko katerekoli metode, ki spojino dostavi naravnost v prebavni lumen. Metode vključujejo oralne poti, intraduodenalne poti, itd.

Količina vnešenega steroidnega glikozida bo odvisna od subjekta, ki ga zdravimo, od resnosti prizadetosti, od načina vnašanja ter od presoje zdravnika, ki osebo zdravi.

Učinkovita doza leži v obsegu od 0.005 do 20 mg/kg/dan, priporočljivo pa pd 0.01 do 5 mg/kg/dan, najbolje pa od 0.01 do 1 mg/kg/dan. Za povprečno 70 kg težkega človeka bi to znašalo 0.00035 do 1.4 g/dan, priporočljivo od 0.0007 do 0.35 do 0.35 g/dan, ter najbolje od 0.0007 do 0.07 g/dan.

Pri oralnem vnašanju, ki je najbolj priporočljivo, lahko farmacevtska zmes prevzame obliko raztopine, suspenzije, tablet, pilul, kapsul, praškov, formulacij z zadržanim izločanjem ter podobnih.

V odvisnosti od željenega načina vnašanja, so lahko farmacevtske zmesi v obliki trdne snovi, pol trdne snovi ali tekoče dozirne oblike, kakršne so na primer, tablete, pilule, kapsule, praški, tekočine, suspenzije in podobne, najbolje v dozirnih enotah, ki so primerne za enkratno administracijo točno določene doze. Farmacevtske zmesi bodo vključevale konvencionalen farmacevtski prenašalec ali ekscipient ter spojino taga izuma, ki pa je aktivna sestavina omenjene zmesi. Dodatno, se lahko doda tudi druge medicinske ali farmacevtske dodatke, prenašalce, adjuvante, ipd.

Farmacevtske zmesi lahko, glede na ta izum, vključujejo 0.1%95% spojine, najbolje okoli l%-70%. V vseh primerih pa bo zmes formulacije za vnašanje taka, da bo vsebovala količino spojine glede na ta izum v anti-hiperholesterolemijski ali anti-aterosklerotični količini.

Pri trdnih farmacevtskih zmeseh vključujejo konvencionalni ne-toksični prenašalci na primer, farmacevtske vrste manitola, laktoze, škroba, magnezijevega stearata, natrijevega saharina, talka, celuloze, glukoze, cukroze, magnezijevega karbonata in podobnih.

Tekoče farmacevtske zmesi se lahko pripravijo s topljenjem ali disperzijo ali drugačnim načinom priprave steroidnih glikozidov tega izuma, ter z mešanjem teh (neobvezno) z farmacevtskimi adjuvanti v prenašalcu, kakršni so na primer, voda, solna raztopina, vodna dekstroza, gllicerol, etanol in podobne, da bi tako oblikovali raztopino ali suspenzijo. Metode za pripravljanje različnih farmacevtskih zmesi z določeno količino aktivne spojine so znane ali pa bodo postale očitne tistim, ki so v tej stroki usposobljeni. Primeri teh so podani v Remington-ovi Pharmaceutical Sciences., Mack-Publishing Company, Easter, Pa., 15^th edition (1975) .

PRIMER 1

Kristalni (3β, 5α, 25R)-3-((β—D—4, 6-bis(2fluorofenilkarbamoil)-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on (468 g) smo rekristalizirali iz THF/cikloheksana (3:1), kakor je opisano spodaj (glej Pripravo Al). Po rekristalizaciji smo dobljeno maso raztopili v 8.4 1 tetrahidrofuranu (THF) pri 30°C, nato filtrirali in nazadnje atmosfersko destilirali (t.j. pri atmosferskem tlaku) in s tem nadomestili destilat z etilnim acetatom. Ko smo tako dosegli končni volumen 12 1 in je imel destilat refrakcijski indeks etilnega acetata, smo mešanico ohladili na 20-25°C, granulirali preko noči, filtrirali in osušili. Tako smo v obliki bele trdne spojine A dobili 363.3 g naslovne spojine, v kateri sta bili prisotni tako paličasta kakor tudi dvojno zaključena oblika bodal. Reprezentativen difrakcijski vzorec (vzorec loma žarkov) tega kristala je prikazan na sliki 1.

Na analogen način je bil pripravljen tudi produkt Primera 1,

t.j. s substitucijo acetonitrila z etilnim acetatom.

PRIMER 2

Kristalni (3β, 5α, 25R)-3-((p-D-4, 6-bis(2fluorofenilkarbamoil)-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on (3β, 5α, 25R)-3-((β-Ώ-4, 6-bis(2-fluorofenil karbamoil)celobiozil)oksi)-spirostan-12-on (5g) smo raztopili v 50 ml THF in 100 ml etanola pri 30°C, nakar smo vse skupaj atmosfersko destilirali. Ko je bil dosežen končni volumen 75 ml, smo mešanico ohladili na 0-5°C, granulirali eno uro, ter nato filtrirali in posušili, ter s tem dobili 4.82 g naslovne spojine, ki je bila dobljena v obliki bele trdne oblike B, katere molekule so bile oblikovane z dvojnim zaključkom. Reprezentativni rentgenski difrakcijski vzorec tega kristala (narejenega v večji meri po zgoraj opisanem postopku) je prikazan na sliki 2.

Na analogen način smo z zamenjavo izopropanola z etanolom naredili tudi produkt primera 2.

PRIPRAVA Al (3β, 5α, 25R)-3-((β—D—4, 6-bis(2-fluorofenilkarbamoil)celobiozil)oksi)-spirostan-12-on

DEPROTEKCIJA KLOROACETATOV

Natrijev metoksid (250 mg) smo dodali raztopini (3β, 5α,

25R)-3-((β-D-4,6-bis(2-fluorofenilkarbamoil)2',2,3',3,6'-penta-kloroacetil-celobiozil)oksi)-spirostan12-on (25 g, 17.7 mol) v THF (75 ml) in metanolu (75 ml). PO 20 minutah na sobni temperaturi smo reakcijo prekinili z dodatkom ocetne kisline (0.5 ml). Volumen topila smo nato zmanjšali na polovico v vakuumu, nakar smo dodali dodatnih 75 ml metanola. Ob močnem mešanju smo z dodajanjem vode (75 ml) percipitirali produkt. Trdno snov smo filtrirali, izprali z 1:1 metanol:voda in posušili, ter tako dobili 15 g grobega produkta. Tega smo nato prečistili z rekristalizacijo iz THF/cikloheksan/ocetna kislina (3:1:0.1). m.p. 272-273°C. FAB MS: 1051 (M + Na) ⁺ . Analizni izračun za C53H70F2N2O16 + 2H₂O: C 59.76; H 7.03; N 2.62. Dobljeno je bilo: C 59.91; H 7.32; N 2.61.

PRIPRAVA BI (3β, 5α, 25R)-3-((β—D—4, 6-bis(2-fluorofenilkarbamoil)2',2,3',3,6'-penta-kloroacetil-celobiozil)oksi)-spirostan12-on

KARBAMOILACIJA Z UPORABO BAKROVEGA KLORIDA

Bakrov klorid (3.48 g, 36 mmol) smo dodali raztopini (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-2',2,3',3,6'-penta-kloroacetilcelobiozil) oksi) -spirostan-12-on (10.0 g, 8.8 mmol) in 2fluorofenilizocianata (4 ml, 36 mmol) v suhem dimetil formamidu (60 ml) pri sobni temperaturi. Po 3 urah smo mešanico razredčili z etilnim acetatom (100 ml) in izprali z IN HCI (2x) in slano vodo (lx), ter nato osušili (Na2SO₄), filtrirali in koncentrirali v vakuumu. Preostanek smo raztopili v metilen kloridu (50 ml) nakar smo dodali metanol (75 ml). Metilen klorid smo nato odstranili in vacuo trdno snov pa smo nato percipitirali iz metanola. Trdno snov smo nato filtrirali, izprali z metanolom in posušili ter tako pridobili 10.6 g produkta v obliki trdne snovi brez barve

(86%	) . m	.p. 212-21	4°C. FAB MS:	1433 (M +	Na)⁺. ^XH NMR (250
MHz,	CDC	1₃) δ 7.9 i	(m, 2H);7.05	(m, 8H)	; 5	.35 (dd, IH, J=8.0,
7.0	Hz) ;	5.28 (dd,	IH, J=9.0,	8.0 Hz)	; 5.	.15 (dd, IH, J=9.0,
9.0	Hz) ;	5.05 (dd,	IH, J=9.0,	8.0 Hz)	; 4,	.98 (dd, IH, J=8.0,
7.0	Hz) ;	4.72 (d,	IH, J=9.0 Hz	:); 4.6	(m,	3H); 4.4-3.4 (m,
18H)	; 3.	35 (dd, IH	, J=10.0, 9.	0 Hz) ;	2.5	(dd, IH, J=8.0, 7.0
Hz) ;	2.3	5 (dd, IH,	J=13.0, 12.	0 Hz) ;	2.1	(m, IH); 2.1-1.1 (m,
22H)	; 1.	05 (d, 3H,	J=7.0 Hz);	1.02 (s	, 3H); 0.85 (s, 3H);
0.77	(d;	3H, J=7.0	Hz) .

PRIPRAVA Cl (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-2',2,3',3,6'-pentakloroacetilcelobiozil)oksi)-spirostan-12-on

PARAMETOKSI BENZILIDENSKA HIDROLIZA

Trifluoroocetno kislino (19 ml) smo dodali raztopini (3β,

5α, 25R)-3-((β—D—4, 6-0-(4-metoksibenziliden)2', 2,3',3,6'-penta-kloro-acetilcelobiozil)oksi)-spirostan12-on (23.7 g, 0.019 mol) v diklorometanu (150 ml) in metanolu (50 ml). PO 4 urah smo mešanico sprali z vodo (3x), NaHCO₃(2x) ter slano vodo (lx), jo nato posušili (Na₂SO₄), filtrirali in koncentrirali. Preostanek smo nato raztopili v minimalni količini etilnega acetata in percipitirali s heksani. Trdno snov smo filtrirali in izprali s heksani, ter nato posušili, s čimer smo dobili 19.2 g produktov v obliki brezbarvne trdne snovi (90%) . m.p. 224-226°C. FAB MS: 1159 (M + Na) ⁺ . ^ΤΗ NMR (250 MHz, CDC1₃) 5 5.2 (dd, IH, J=9.0, 9.0 Hz); 5.1 (dd, IH, J=9.0, 9.0 Hz); 4.95 (m, 2H); 4.6 (m, 3H); 4.23.4 (m, 21H); 3.35 (dd, IH, J=9.0, 9.0 Hz); 3.1 (bs, IH); 2.5 (dd; IH, J=8.0, 7.0 Hz); 2.35 (dd, IH, J=13.0, 12.0 Hz); 2.1 (m, IH); 1.9-1.1 (m, 22H); 1.05 (d, 3H, J=7.0 Hz); 1.02 (s, 3H); 0.85 (s, 3H); 0.77 (d, 3H, J=7.0 Hz).

PRIPRAVA Dl (3β, 5α, 25R)-3-((β—D—4, 6-0-(4-metoksibenziliden)2',2,3',3,6'-penta-kloro-acetilcelobiozil)oksi)-spirostan12-on

FORMIRANJE PARAMETOKSIBENZILIDENA IN KLOROACETILACIJA

Kafrno sulfonsko kislino (3g) smo dodali mešanici (3β, 5α, 25R)-3-((β-D-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on (50 g, 0.066 mol) in anisaldehidnega dimetil acetala (50 ml, 0.29 mol) v l, 2-dikloroetanu (1500 ml). Suspenzijo smo nato segreli na temperaturo refluksa, ter oddestilirali 200 ml topila. Po 4 urah na tej temperaturi smo želatinozno mešanico ohladili na 0°C in obravnavali z piridinom (160 ml, 1.99 mol) ter kloroacetnim anhidridom (170 g, 1 mmol). Reakciji smo nato dovolili, da se je segrela do sobne temperature, nakar smo po 2 urah mešanico izprali z IN HCI (3x), NaHCO₃ (lx) in slano vodo (lx), ter nato posušili (Na₂SO₄), filtrirali in koncentrirali in vacuo. Preostanek smo raztopili v minimalni količini etilnega acetata, produkt pa smo percipitirali s heksani. Trdno snov smo nato filtrirali, izprali s heksani ter posušili in tako dobili 78.7 g produkta v obliki brezbarvne trdne snovi (95%).

m. p. 249-251°C. FAB MS: 1277 (M + Na)⁺. ^ΧΗ NMR (250 MHz,

CDC1₃) δ 7.35 (d, 2H, J=9.0 Hz); 6.88 (d, 2H, J=9.0 Hz); 5.45 (s, IH); 5.3 (m, 2H); 5.0 (m, 2H); 4.7 (d, IH, J=7.0 Hz); 4.6 (m, 2H); 4.3 (m, 2H); 4.2 (dd, IH, J=11.0, 6.0 Hz); 4.2-3.5 (m, 14H); 3.8 (s, 3H); 3.35 (dd, IH, J=11.0, 10.0 Hz); 2.5 (dd, IH, J=8.0, 7.0 Hz); 2.35 (dd; IH, J=13.0, 12.0 Hz); 2.1 (m, IH); 2.1-1.0 (m, 25H); 1.05 (d, 3H, J=7.0 Hz); 1.02 (s, 3H); 0.85 (s, 3H); 0.77 (d, 3H, J=7.0 Hz).

PRIPRAVA El (3β, 5α, 25R)-3-((β-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on

DEACILACIJA

Natrijev metoksid (50 mg) smo dodali raztopini (3β, 5α, 25R)3-((heptaacetil-^-D-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on (5g,

4.77 mol) v THF (75 ml) in metanola (25 ml). Raztopino smo nato segreli do blagega refluksa v 1 uri. Mešanico smo nato ohladili in koncentrirali do 25 ml. Metanol (10 ml) in vodo (10 ml) smo dodali in percipitat nato ohladili z vakuumsko filtracijo ter sprali z 1:1 metanol:voda. Produkt smo nato posušili v vakuumski pečici (80°C) da bi tako dobili 2.9 g (80%) naslovne spojine v obliki brezbarvne trdne snovi. m.p.>250°C. FAB MS: 7555 (M + H)⁺. Analizni izračun za C39H62O14 + 2H₂O: C 59.22; H 8.41. Najdeno: C 59.54; H 8.64

PRIPRAVA Fl (3β, 5α, 25R)-3-( (heptaacetil^-D-celobiozil) oksi)-spirostan12-on

GLIKOZIDACIJA POSPEŠENA S CINKOVIM FLUORIDOM

Suspenzijo (3β, 5α, 25R)-3-hidroksi-spirostan-12-on (3.0 g, 6.97 mmol) in anhidridni cinkov fluorid (2.88 g, 27.9 mmol) v suhem acetonitrilu (175 ml) smo posušili z odstranitvijo 75 ml acetonitrila z destilacijo. Suspenziji smo nato omogočili hlajenje, nakar smo dodali heptaacetil^-D-celobiozil bromid (9.75 g, 13.9 mmol), dobljeno suspenzijo pa smo segrevali na 65°C v trajanju 3 ur. Po hlajenju na sobno temperaturo smo dodali metilen klorid (150 ml), mešali še 10 minut in nato filtrirali. Filtrat smo koncentrirali in vacuo ter tako dobili 10 g grobega produkta. Ta material smo raztopili v 8:2 kloroform:metanol, preabsorbirali na silika gelu in prečistili z FLASH kromatografijo (eluant: 1:1 etilni acetatni heksani), da bi tako dobili 6.81 g (93%) naslovne spojine, m.p. 220-221°C. FAB MS: 1049 (M + H) ⁺ . analizni izračun za C53H76O21 + 0.5 H2O: C 60.11; H 7.34. Najdenih: C 59.90; H 7.24.

Razumeti je treba, da izum ni omejen na določene realizacije, ki so bile prikazane in opisane tukaj, ter da so možne različne spremembe in modifikacije, ne da bi se s tem oddaljili od področja tega izuma, kakor je le ta definiran v patentnih zahtevkih.

Claims

OBLIKA A interval-d 20 NAJVIŠJIH VRHOV

21.10

17.46

13.58

10.49

6.98

6.78

6.34

5.77

5.52

5.35

5.12

4.82

4.53

4.37

4.12

3.82 3.55 3.44

3.37 ali

OBLIKA B interval-d 12 NAJVIŠJIH VRHOV

19.96

17.11

15.14

9.97

7.57 6.62 6.09 5.36 5.15 4.90

4.57

3.77

2.Kristalni spirostanilni glikozid po zahtevku 1, značilen po tem, da ima lom žarkov X naslednji interval-d:

OBLIKA A interval-d 20 NAJVIŠJIH VRHOV

21 .10 17 .46 13 .58 10 .49 6. 98 6. 78 6. 34 5. 77 5. 52 5. 35

5.12

4.82 4.53

4.37

4.12

3.82 3.55 3.44

3.37

3. Kristalni spirostanilni glikozid po zahtevku 2, značilen po tem, da ima oblika A vzorec loma žarkov X, kot je prikazan na sliki 1.
4. Kristalni spirostanilni glikozid po zahtevku 1, značilen po tem, da ima lom žarkov X naslednji interval-d:

OBLIKA B interval-d 12 NAJVIŠJIH VRHOV

19.96

17.11

15.14

9.97

7.57 6.62 6.09 5.36 5.15 4.90

4.57

3.77
5. Kristalni spirostanilni glikozid po zahtevku 4, značilen po tem, da ima oblika B vzorec loma X žarkov, kot je prikazan na sliki 2.
6. Farmacevtska zmes za zdravljenje hiperholesterolemije ali ateroskleroze pri sesalcih, značilna po tem, da vsebuje farmacevtsko učinkovite količine kristalnega spirostanilnega glikozida po zahtevku 1 in ustrezen farmacevtski prenašalec.
7. Postopek za pripravljanje kristalnih spirostanilnih glikozidov, značilen po tem, da obsega mešanje (3β, 5α,

25R)-3-((β-D-4, 6-bis(2-fluorofenilkarbamoil)celobiozil)oksi)-spirostan-12-on v etilnem acetatu ali acetonitrilu ter nadaljnje omogočanje oblikovanja kristalnega (3β, 5α, 25R)—3—((β—D—4, 6-bis(2fluorofenilkarbamoil)-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on.
8. Postopek po zahtevku 7, značilen po tem, da etil acetatno ali acetonitrilno raztopino segrejemo, nakar se po nadaljnjem hlajenju oblikujejo kristali.
9. Postopek za pripravo kristalnih steroidnih glikozidov, značilen po tem,da obsega:

mešanje (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis(2fluorofenilkarbamoil)-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on v alkanolu (C1-C4) neobvezno z do 70% vode, nakar dovolimo oblikovanje kristalnega (3β, 5α, 25R)-3-((β-ϋ-4, 6-bis(2fluorofenilkarbamoil)-celobiozil)oksi)-spirostan-12-on.
10.Postopek po zahtevku 9, značilen po tem, da je topilo etanol, izopropanol ali n-propanol (30-70%)/voda(70-30%), nakar raztopino segrejemo, po hlajenju pa se oblikujejo kristali.