SI9110782A - 1,3-oksatiolanski nukleozidni analogi - Google Patents

Abstract

Opisani so (-)-4-amino-1-(2-hidroksimetil-1,3- oksatio-lan-5-il)-(1H) -pirimidin-2-on, njegovi farmacevtsko sprejemljivi derivati, njegove farmacevtske formulacije, postopki za njegovo pripravo in njegova uporaba kot antivirusno sredstvo.

Description

Predloženi izum se nanaša na nukleozidne analoge in na njihovo uporabo v medicini. Natančneje se izum nanaša na 1,3-oksatiolanske nukleotiozidne analoge, na njihove farmacevtske formulacije in njihovo uporabo v zdravljenju virusnih infekcij.

Opisano je, da ima spojina s formulo (I):

znana tudi kot BCH-189 ali NGPB-21 antivirusno aktivnost, posebno proti virusom človeške imunske pomanjkljivosti (HIV), sredstvom, ki povzročajo AIDS (5th AntiAids Conference, Montreal, Canada 5.-9. junij 1989: Abstracts T.C.0.1 in M.C.P 63; Evropska patentna prijava, objava št. 0382562). Spojina s formulo (I) je racemna zmes dveh enantiomerov s formulama (1-1) in (1-2):

S in opisana in testirana je v obliki svojega racemata. Edina spojina, ki je trenutno sprejeta za zdravljenje stanj, povzročenih s HIV, je 3’-azido-31-deoksitimidin (AZT, zidovudin, BW 5090). Vendar pa ima ta spojina znatno nagnjenost k stranskim učinkom in je zato ali ne moremo uporabljati ali pa jo moramo, ko jo enkrat uporabimo, vzeti iz terapije pri znatnem številu pacientov. Posledica je nenehna potreba po zagotovitvi spojin, ki so učinkovite proti HIV, ali ki imajo istočasno znatno boljši terapevtski indeks.

Sedaj smo nepričakovano ugotovili, da so enantiomeri spojine s formulo (I) enako močni proti HIV, toda da ima en enantiomer, (-)-enantiomer, znatno nižjo citotoksičnost od drugega enantiomera. Tako v prvem vidiku izuma zagotavljamo (-) (ali levosučni) enantiomer spojine s formulo (I) in njegove farmacevtsko sprejemljive derivate.

(-) enantiomer ima kemijsko ime (-)-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)(lH)-pirimidin-2-on (ki ga tu kasneje imenujemo spojina (A)). Ima absolutno stereokemijo spojine s formulo (1-1), ki se imenuje (2R,cis))-4-amino-l-(2hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on.

Prednostno zagotovimo spojino A v bistvu brez ustreznega (+)-enantiomera, se pravi, da ni prisotno več kot okoli 5% m/m (+)-enantiomera, prednostno ne več kot okoli 2%, zlasti manj kot okoli 1% m/m.

Pod farmacevtsko sprejemljivim derivatom razumemo katerokoli farmacevtsko sprejemljivo sol, ester ali sol takšnega estra spojine (A) ali neke druge spojine, ki lahko, po dajanju pacientu, zagotovi (direktno ali indirektno) spojino (A) ali njen antivirusno aktiven metabolit ali ostanek.

Strokovnjakom bo jasno, da lahko spojino (A), za zagotovitev njenih farmacevtsko sprejemljivih derivatov, modificiramo na funkcionalnih skupinah tako v osnovnem delu, kot na hidroksimetilni skupini oksatiolanskega obroča. Modifikacije vseh takšnih funkcionalnih skupin so vključene v obseg izuma. Vendar so zlasti zanimivi farmacevtsko sprejemljivi derivati, ki jih dobimo z modifikacijo 2-hidroksimetilne skupine oksatiolanskega obroča.

Prednostni estri spojine (A) vključujejo spojine, v katerih je vodik 2-hidroksimetilne skupine zamenjan z acilno funkcijo R-C=O, v kateri je ne-karbonilni del R estra

izbran izmed vodika, alkilne skupine z nerazvejeno ali razvejeno verigo (npr. metil, etil, n-propil, t-butil), alkoksialkila (npr. metoksimetila), aralkila (npr. benzila), ariloksialkila (npr. fenoksimetila), arila (npr. fenila, ki je v danem primeru substituiran s halogenom, C₇ ^alkilom ali C_; ^alkoksi); sulfonatnih estrov, kot sta alkil- ali aralkilsulfonil (npr. metansulfonil); aminokislinskih estrov (npr. L-valila ali L-izolevcila) in mono, di- ali tri-fosfatnih estrov.

Glede na zgoraj opisane estre, če ni drugače označeno, vsebuje katerakoli prisotna alkilna skupina primerno 1 do 16 ogljikovih atomov, zlasti 1 do 4 ogljikove atome. Katerakoli prisotna arilna skupina v takšnih estrih primerno obsega fenilno skupino.

Estri so lahko zlasti C_{7 76}alkilester, nesubstituirani benzilester ali benzilester, ki je substituiran z najmanj enim halogenom (bromom, klorom, fluorom ali jodom),

C_{7 6}alkilom, C_;^alkoksi, nitro ali trifluormetilnimi skupinami.

Farmacevtsko sprejemljive soli spojine (A) vključujejo tiste, ki so izvedene iz farmacevtsko sprejemljivih anorganskih in organskih kislin in baz. Primeri primernih kislin vključujejo klorovodikovo, bromovodikovo, žveplovo, dušikovo, perklorno, fumarno, maleinsko, fosforno, glikolno, mlečno, salicilno, jantarno, toluen-psulfonsko, vinsko, ocetno, limonsko, metansulfonsko, mravljinčno, benzojsko, malonsko, naftalen-2-sulfonsko in benzensulfonsko kislino. Druge kisline, kot je oksalna, ki same po sebi sicer niso farmacevtsko sprejemljive, so lahko uporabne kot intermediati za pridobivanje spojin v smislu izuma in njihovih farmacevtsko sprejemljivih kislinskih adicijskih soli.

Soli, ki so izvedene iz ustreznih baz, vključujejo alkalijske (npr. natrijeve), zemljoalkalijske (npr. magnezijeve), amonijeve in NR₄ ⁺, (kjer je R C_; ^alkil).

Kasnejša sklicevanja na spojino v smislu izuma vključujejo tako spojino (A), kot njene farmacevtsko sprejemljive derivate.

Spojine v smislu izuma posedujejo antivirusno aktivnost ali same po sebi, ali pa se lahko metabolirajo v takšne spojine. Še zlasti so te spojine učinkovite za inhibiranje replikacije retrovirusov, vključno človeških retrovirusov, kot so virusi človeške imunske pomanjkljivosti (HIV), sredstev, ki povzročajo AIDS.

Tako je kot nadaljnji vidik izuma zagotovljena spojina (A) ali njen farmacevtsko

sprejemljiv derivat za uporabo kot aktivno terapevtsko sredstvo, zlasti kot antivirusno sredstvo, npr. za zdravljenje retrovirusnih infekcij.

V nadaljnjem alternativnem vidiku je zagotovljen postopek za zdravljenje virusne infekcije, zlasti infekcije, ki jo izzove takšen retrovirus kot je HIV, na sesalcu, vključno tudi človeku, ki obsega dajanje učinkovite količine spojine (A) ali njenega farmacevtsko sprejemljivega derivata.

V nadaljnjem alternativnem vidiku je prav tako zagotovljena uporaba spojine (A) ali njenega farmacevtsko sprejemljivega derivata za proizvodnjo zdravila za zdravljenje virusne infekcije.

Spojine iz izuma so prav tako koristne v zdravljenju stanj, ki so sorodna AIDS-u, kot je kompleks soroden AIDS-u (ARC), progresivna generalizirana limfadenopatija (PGL), nevrološke bolezni podobne AIDS-u (kot je demenca ali tropska parapareza), anti-HIV protitelesa pozitivna in HlV-pozitivna stanja, Kaposijev sarkom, trombocitopenija purpurea in spremljajoče oportunistične infekcije, npr. Pneumocistitis carinil.

Spojine iz izuma so prav tako koristne pri preprečevanju progresije klinične bolezni posameznikov, ki so anti-HIV protitelesa ali HlV-antigen pozitivni in v profilaksi po izpostavitvi HIV.

Spojine (A) ali njihove farmacevtsko sprejemljive derivate lahko prav tako uporabljamo za preprečevanje virusne kontaminacije takšnih fizioloških tekočin, kot sta kri ali seme in vitro.

Strokovnjakom bo jasno, da se tukajšnja navedba zdravljenja nanaša tako na profilakso, kot na zdravljenje vzpostavljenih infekcij ali simptomov.

Nadalje bo jasno, da količina spojine v smislu izuma, ki je potrebna za uporabo v zdravljenju, ne bo variirala samo z izbrano spojino, temveč prav tako tudi z načinom dajanja, naravo stanja, ki ga zdravimo in starostjo in stanjem pacienta, in obvezno jo bo določil lečeči zdravnik ali veterinar. Vendar pa bo primerna doza v glavnem v intervalu od okoli 0,1 do okoli 750 mg/kg telesne teže na dan, prednostno v intervalu od okoli 0,5 do okoli 60 mg/kg/dan, najbolj prednostno v intervalu od okoli 1 do okoli 20 mg/kg/dan.

Želena doza je lahko primerno formulirana v eno dozo ali v razdeljene doze, ki se dajejo v ustreznih intervalih, npr. kot dve, tri, štiri ali več pod-doze na dan.

Spojino primerno dajemo v enotski dozirni obliki, npr., ki vsebuje 10 do 1500 mg, primerno 20 do 1000 mg, najbolj primerno 50 do 700 mg aktivne sestavine na enotsko dozirno obliko.

Idealno naj bi se aktivni sestavek dajal tako, da dosežemo maksimalno koncentracijo aktivne sestavine v plazmi od okoli 1 do okoli 75 μΜ, prednostno okoli 2 do 50 μΜ, najbolj prednostno okoli 3 do okoli 30 μΜ. To lahko dosežemo, npr. z intravenozno injekcijo 0,1 do 5%-ne raztopine aktivne sestavine, v danem primeru v fiziološki raztopini soli ali z oralnim dajanjem bolusa, ki vsebuje okoli 1 do okoli 100 mg aktivne sestavine. Želene nivoje v krvi lahko vzdržujemo s kontinuirno infuzijo, tako da zagotovimo okoli 0,01 do okoli 5,0 mg/kg/uro ali s prekinjenimi infuzijami, ki vsebujejo okoli 0,4 do okoli 15 mg/kg/ aktivne sestavine.

Čeprav je možno, da za uporabo v terapiji spojino iz izuma dajemo kot surovo kemikalijo, je prednostno, da aktivno sestavino formuliramo kot farmacevtsko formulacijo.

Izum tako nadalje zagotavlja farmacevtsko formulacijo, ki obsega spojino (A) ali njen farmacevtsko sprejemljiv derivat skupaj z enim ali več farmacevtsko sprejemljivimi nosilci zanj in, v danem primeru, druge terapevtske in/ali profilaktične sestavine. Nosilec(i) mora(jo) biti sprejemljiv(i) v smislu, da so kompatibilni z drugimi sestavinami formulacije in da niso škodljivi za pacienta.

Farmacevtske formulacije vključujejo tiste, ki so primerne za oralno, rektalno, nazalno, lokalno (vključno bukalno in sublingualno), vaginalno ali parenteralno (vključno intramuskularno, podkožno in intravenozno) dajanje v obliki, ki je primerna za dajanje z inhalacijo ali insuflacijo. Formulacije lahko, kadar je to potrebno, primerno formuliramo v ločene dozirne enote in izdelamo jih lahko s katerimkoli izmed postopkov, ki so dobro znani v farmacevtski tehniki. Vsi postopki vključujejo fazo privedbe aktivne sestavine v stik s tekočimi nosilci ali fino porazdeljenimi trdnimi nosilci ali z obema snovema, in nato, če je potrebno, oblikovanje produkta v želeno formulacijo.

Farmacevtske formulacije, ki so primerne za oralno dajanje, lahko formuliramo kot ločene enote, kot so kapsule, vrečke ali tablete, pri čemer vsaka vsebuje predhodno določeno količino aktivne sestavine: kot prašek ali granule; kot raztopino, kot suspenzijo ali kot emulzijo. Aktivno sestavino lahko prav tako formuliramo kot bolus, kašo ali pasto. Tablete in kapsule za oralno dajanje lahko vsebujejo takšne običajne sestavine, kot so vezivna sredstva, polnila, maziva, dezintegranti ali omočilna sredstva. Tablete lahko prevlečemo po v tehniki dobro znanih postopkih. Oralni tekoči pripravki so lahko v obliki npr. vodnih ali oljnih suspenzij, raztopin, emulzij, sirupov ali eliksirjev, ali pa so lahko formulirani kot suh proizvod za konstitucijo z vodo ali drugim primernim nosilcem pred uporabo. Takšni tekoči pripravki lahko vsebujejo takšne običajne aditive, kot so sredstva za suspendiranje, sredstva za emulgiranje, ne-vodni nosilci (ki lahko vključujejo jedilna olja) ali konzervansi.

Spojine v smislu izuma lahko prav tako formuliramo za parenteralno dajanje (npr. s pomočjo injekcije, npr. injekcije bolusa ali kontinuime infuzije) in lahko jih formuliramo v posamezno dozirno obliko v ampule, pred-napolnjene injekcije, infuzijo z majhnim volumnom ali v več-dozirne kontejnerje z dodanim konzervansom. Pripravki lahko zavzemajo takšne oblike, kot so suspenzije, raztopine ali emulzije v oljnih ali vodnih nosilcih in lahko vsebujejo sredstva za formuliranje, kot so sredstva za suspendiranje, stabilizacijo in/ali dispergiranje. Alternativno je lahko aktivna oblika v obliki prahu, dobljenega z aseptično izolacijo sterilne trdne snovi ali z liofilizacijo iz raztopine, za konstituiranje z nekim primernim nosilcem, npr. s sterilno vodo brez pirogena, pred uporabo. Za lokalno dajanje na kožo lahko spojine v smislu izuma formuliramo kot masti, kreme ali losione, ali kot transdermalni obliž. Masti in kreme lahko npr. formuliramo z vodno ali oljno osnovo z dodajanjem primernih sredstev za zgoščevanje in/ali geliranje. Losione lahko formuliramo z vodno ali oljno osnovo in prav tako bodo v glavnem vsebovali eno ali več sredstev za emulgiranje, stabilizacijo, dispergiranje, suspendiranje, zgoščevanje ali sredstva za obarvanje.

Formulacije, ki so primerne za lokalno dajanje v usta, vključujejo pastile, ki obsegajo aktivno sestavino v neki dišeči osnovi, običajno saharozi in akaciji ali tragantu; pastile, ki vsebuje aktivno sestavino v neki takšni inertni osnovi kot sta želatina in glicerin ali saharoza in akacija; in tekočine za spiranje ust, ki obsegajo aktivno sestavino v nekem ustreznem tekočem nosilcu. Farmacevtske formulacije, ki so primerne za rektalno dajanje, v katerih je nosilec neka trdna snov, so najbolj želeno formulirane kot svečke v obliki dozirnih enot. Primerni nosilci vključujejo kakavovo maslo in druge materiale, ki se običajno uporabljajo v tehniki, in svečke lahko

primerno oblikujemo z mešanjem spojine z zmehčanim ali staljenim nosilcem(i), čemur sledi močno ohlajanje in oblikovanje v kalupih.

Formulacije, ki so primerne za vaginalno dajanje, lahko formuliramo kot pesarije, tampone, kreme, gele, paste, pene ali spreje, ki vsebujejo poleg aktivne sestavine takšne nosilce, za katere se v tehniki ve, da so primerni.

Za intranazalno dajanje lahko spojine v smislu izuma uporabimo kot tekoče pršilo ali disperzibilen prah ali v obliki kapljic.

Kapljice lahko formuliramo z vodno ali ne-vodno osnovo, ki vsebuje tudi eno ali več sredstev za dispergiranje, sredstev za raztapljanje ali sredstev za suspendiranje. Tekoča pršila primemo dajemo iz embalaže pod tlakom.

Za dajanje z inhlacijo dajemo spojine v smislu izuma primerno iz insuflatorjev, razpršilcev ali iz pakiranj pod tlakom ali iz nekega drugega primernega sredstva za dajanje aerosolnih pršil. Pakiranja pod tlakom lahko obsegajo tak primeren propelant, kot so diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, ogljikov dioksid ali nek drug primeren plin. V primeru aerosola pod tlakom, lahko dozirno enoto določimo z zagotovitvijo ventila za dajanje odmerjene količine.

Alternativno lahko izvedemo dajanje spojin v smislu izuma z inhalacijo ali insuflacijo v obliki suhega praškastega pripravka, npr. zmesi prahu spojine in neke primerne osnove za prah, kot sta laktoza ali škrob. Pripravek v prahu lahko formuliramo v enotski dozirni obliki v npr. kapsule ali kartuše ali npr. v želatinska ali blister pakiranja, iz kateri lahko prah dajemo s pomočjo inhalatorja ali insuflatorja.

Kadar je želeno, zgoraj opisane formulacije prilagodimo tako, da jih lahko uporabljamo za dajanje aktivne sestavine v obliki z zadrževanim sproščanjem.

Farmacevtski pripravki v smislu izuma lahko vsebujejo tudi druge aktivne sestavine, kot so antimikrobna sredstva ali konzervansi.

Spojine v smislu izuma lahko prav tako uporabljamo v kombinaciji z drugimi terapevtskimi sredstvi, npr. z drugimi antiinfekcijskimi sredstvi. Zlasti lahko spojine v smislu izuma uporabljamo skupaj z znanimi antivirusnimi sredstvi.

Izum tako v nadaljnjem vidiku zagotavlja kombinacijo, ki obsega spojino (A) ali njen fiziološko sprejemljiv derivat skupaj z nekim drugim terapevtsko aktivnim sredstvom, zlasti antivirusnim sredstvom.

Kombinacije, o katerih govorimo zgoraj, lahko primerno formuliramo za uporabo v obliki farmacevtske formulacije in takšne farmacevtske formulacije, ki obsegajo kombinacijo, kot je definirana zgoraj, skupaj s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem, tvorijo nadaljnji vidik izuma.

Primerna terapevtska sredstva za uporabo v takšnih kombinacijah vključujejo aciklične nukleozide, kot je aciklovir ali ganciklovir, interferone, kot so α, β ali 7-interferon, inhibitorje renalne ekskrecije, kot je probenecid, inhibitorje transporta nukleozidov, kot je dipiridamol, 2’,3’-dideoksinukleozide, kot so AZT, 2’,3’-dideoksicitidin-2’,3’-dideoksiadenozin, 2’,3’-dideoksitimidin, 2’,3’-dideoksi-2’,3’-didehidrotimidin in 2’,3’-dideoksi-2’,3’-didehidrocitidin, imunomodulatorje, kot je interlevkin II (IL2) in faktor za stimulacijo granulocitne makrofagne kolonije (GM-CSF), eritropoetin, ampligen, timomodulin, timopentin, foskarnet, ribavirin in inhibitorje vezave HIV na CD4 receptorje, npr. topne CD4, CD4 fragmente, CD4 hibridne molekule, inhibitorje glikoziliranja, kot so 2-deoksi-D-glukoza, kastanospermin in

1-deoksinojirimicin.

Posamezne komponente takšnih kombinacij lahko dajemo ali sekvenčno ali istočasno v posebnih ali kombiniranih farmacevtskih formulacijah.

Kadar spojino (A) ali njen farmacevtsko sprejemljiv derivat dajemo v kombinaciji z drugim terapevtskim sredstvom, kije aktivno proti istemu virusu, je lahko doza vsake spojine ali enaka ali pa se razlikuje od tiste, ki jo uporabimo, kadar spojino uporabljamo samostojno. Strokovnjaki bodo zlahka dojeli ustrezne doze.

Spojino (A) in njene farmacevtsko sprejemljive derivate lahko pripravimo s postopki, ki so znani iz tehnike za pripravo spojin z analogno strukturo, npr. kot je opisano v objavi Evropske patentne prijave št. 0382562.

Strokovnjakom v tehniki bo jasno, da lahko za določene postopke, ki so opisani tu nižje, želeno stereokemijo spojine (A) dobimo ali z izhajajnjem iz optično čistega izhodnega materiala ali z razklopom racemne zmesi v katerikoli primerni fazi sinteze. V primeru vseh postopkov lahko optično čist želeni produkt dobimo s ponov0- 1 R .M - 88 ,. j y % nim razklopom končnega produkta vsake reakcije.

V takšnem postopku (A) 1,3-oksatiolan s formulo (VIII):

v kateri je anomerna skupina L skupina, ki se jo da zamenjati, reagiramo z neko ustrezno bazo. Primerne skupine L vključujejo -OR, kjer je R alilna skupina, npr.

C j ₆ alkilna skupina, kot je metil ali je R acilna skupina, npr. C_I6 alkilna skupina, kot je acetil ali halogen, npr. jod, brom ali klor.

Spojino s formulo (VIII) primerno reagiramo s citozinom ali z ustreznim prekurzorjem pirimidinske baze (ki je predhodno sililiran s takšnim sredstvom za sililiranje, kot je heksametildisilazan) v nekem takšnem kompatibilnem topilu, kot je metilenklorid, z uporabo neke takšne Lewisove kisline, kot je titanov tetraklorid, kositrova(IV) spojina, kot je SnCl₄ ali trimetilsililtriflat.

1,3-oksatiolane s formulo (VIII) lahko pripravimo npr. z reakcijo aldehida s formulo (VII) z merkaptoacetalom s formulo (VI) v nekem takšnem kompatibilnem organskem topilu, kot je toluen, v prisotnosti kislega katalizatorja, npr. neke takšne Lewisove kisline, kot je cinkov klorid.

HSCH₂CH(OC₂H₅)₅ (VI)

C₆H₅CO₂CH₂CHO (VII)

Merkaptoacetale s formulo (VI) lahko pripravimo s postopki, ki so znani v stroki, npr. G. Hesse in I. Jorder, Chem. Ber. 85, 924-932 (1952).

Aldehide s formulo (VII) lahko pripravimo po znanih postopkih iz tehnike, npr. E.

G. Halloquist in H. Hibbert, Can. J. Research, 8, 129-136 (1933). Primerno lahko surovi aldehid (VII) prečistimo s konverzijo v kristalni bisulfitni adicijski adukt in s kasnejšo ponovno konverzijo v prosti aldehid.

V drugem postopku (B) dobimo spojino (A) z notranjo konverzijo s pomočjo baze spojine s formulo (IX):

B

HOCH

C1X9 kjer je B baza, ki sejo da prevesti v citozin. Takšna notranja konverzija lahko poteče ali z enostavno kemijsko transformacijo (npr. s konverzijo uracilne baze v citozin) ali z encimatsko konverzijo z uporabo deoksiribozil transferaze. Takšni postopki in pogoji za notranjo konverzijo z bazo so dobro znani v tehniki nukleozidne kemije.

V tretjem postopku (C) lahko spojino s formulo (XI):

nh₂

CXI9 prevedemo v spojino (A) s konverzijo NH₂ skupine v citozinsko bazo z dobro znanimi postopki v tehniki nukleozidne kemije.

Mnoge reakcije, ki so tu opisane kasneje, so obširno objavljene v kontekstu sinteze nukleozidov, npr. v Nucleoside Analogs - Chemistry, Biology and Medical Applications, R. T. Walker et. al., izd. Plenum Press, New York (1979) na str. 165-192; T. Ueds v Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, vol. I, L. B. Townsend izd., Plenum Press, New York (1988) na str. 165-192, katerih opisi so tu vneseni kot referenca.

Jasno bo, da lahko gornje reakcije zahtevajo uporabo, ali pa jih lahko običajno uporabimo na njih, izhodnih materialov, ki imajo zaščitene funkcionalne skupine in je tako potrebna odstranitev zaščite kot vmesna ali končna faza za pridobitev želene spojine. Zaščito in odstranitev zaščite s funkcionalnih skupin lahko izvedemo z uporabo običajnih sredstev. Tako lahko npr. amino skupine zaščitimo s skupino, kije izbrana iz aralkila (npr. benzila), acila, arila (npr. 2,4-dinitrofenila) ali silila; kasnejšo odstranitev zaščitne skupine izvedemo, kadar je to želeno, s hidrolizo ali hidrogenolizo, kakor je pač ustrezno, z uporabo standardnih pogojev. Hidroksilne skupine lahko zaščitimo z uporabo običajne hidroksilne zaščitne skupine, npr. kot je opisano v Protective Groups in Organic Chemistry, izd. J.F.W. McOmie (Plenum Press, 1973) ali Protective Groups in Organic Synthesis Theodor W.Greene (John Wiley and Sons, 1981). Primeri primernih hidroksilnih zaščitnih skupin vključujejo skupine, ki so izbrane iz alkila (npr. metila, t-butila, ali metoksimetila), aralkila (npr.

/A

benzila, difenilmetila ali trifenilmetila), heterocikličnih skupin, kot so tetrahidropiranila, acila (npr. acetila ali benzoila) in sililne skupine, kot je trialkilsilil (npr. t-butildimetilsilil). Hidroksilne zaščitne skupine lahko odstranimo z običajnimi tehnikami. Tako lahko npr. alkilne, sililne, acilne in heterociklične skupine odstranimo s solvolizo, npr. hidrolizo pod kislimi ali bazičnimi pogoji. Aralkilne skupine, kot je trifenilmetil, lahko odstranimo na podoben način s solvolizo, npr. hidrolizo pod kislimi pogoji. Aralkilne skupine, kot je benzil, lahko odcepimo, npr. z obdelavo z BF^/eteratom in acetnim anhidridom in nato z ločitvijo tako nastalih acetatnih skupin v ustrezni fazi sinteze. Sililne skupine lahko prav tako primerno odstranimo z uporabo vira fluoridnih ionov, kot je tetra-n-butil-amonijev fluorid.

V gornjih postopkih dobimo v glavnem spojino (A) kot zmes cis in trans izomerov, od katerih je cis izomer zanimiva spojina.

Te izomere lahko ločimo s fizikalnimi sredstvi, npr. s kromatografijo na silikagelu ali frakcionirno kristalizacijo ali direktno ali na njihove ustrezne derivate, npr. acetate (pripravljene npr. z ocetnim anhidridom) in nato, po ločitvi, s ponovno konverzijo v prvotni produkt (npr. z deacetiliranjem z metanolnim amoniakom).

Farmacevtsko sprejemljive soli spojin v smislu izuma lahko pripravimo kot je opisano v US patentu št. 4,383,114, katerega opis je tu vnešen kot referenca. Tako npr., kadar želimo pripraviti kislinske adicijske soli spojine (A), lahko produkt kateregakoli izmed gornjih postopkov z uporabo običajnih postopkov prevedemo v sol z obdelavo dobljene proste baze z neko primerno kislino. Farmacevtsko sprejemljive kislinske adicijske soli lahko pripravimo z reakcijo proste baze z ustrezno kislino, v danem primeru v prisotnosti nekega takšnega primernega topila, kot je nek ester (npr. etilacetat) ali nek alkohol (npr. metanol, etanol ali izopropanol). Soli z anorgansko bazo lahko pripravimo z reakcijo osnovne spojine z neko takšno primerno bazo, kot je nek alkoksid (npr. natrijev metoksid), v danem primeru v prisotnosti nekega takšnega topila, kot je nek alkohol (npr. metanol). Farmacevtsko sprejemljive soli lahko prav tako pripravimo iz drugih soli, vključno s farmacevtsko sprejemljivimi solmi spojine (A) z uporabo običajnih postopkov.

Spojino (A) lahko prevedemo v farmacevtsko sprejemljiv ester ali drug ester z reakcijo s sredstvom za fosforiliranje, kot je POC1₅ ali nekim primernim sredstvom za esterifikacijo, kot je nek kislinski halogenid ali anhidrid, pač po potrebi. Ester ali sol spojine (A) lahko prevedemo v osnovno spojino, npr. s hidrolizo.

Odločitev končnega produkta ali intermediata ali izhodnega materiala zanj lahko izvedemo s katerimkoli primernim postopkom, ki je znan v tehniki: glej npr. Stereochemistry of Carbon Compounds, E. L. Eliel (McGraw Hill, 1962) in Tables of Resolving Agents, S. H. Wilen.

Tako lahko npr. spojino (A) dobimo s pomočjo kiralne HPLC z uporabo primerne stacionarne faze, npr. acetiliranega /3-ciklodekstrina ali triacetata celuloze in nekega primernega topila, npr. takšnega alkohola, kot je etanol ali vodne raztopine, npr. trietilamonijevega acetata. Alternativno lahko spojine odločimo z enantioselektivnim katabolizmom, ki ga posredujejo encimi z nekim takšnim primernim encimom, kot je citidin deaminaza ali selektivno encimatsko degradacijo nekega primernega derivata, z uporabo 5’-nukleotidaze. Kadar odločevanje izvedemo encimatsko, lahko uporabimo encim ali v raztopini ali, primerneje, v imobilizirani obliki. Encime lahko imobiliziramo s katerimkoli znanim postopkom iz tehnike, npr. z adsorpcijo na takšno smolo kot je Eupergit C.

Izum nadalje opisujemo s pomočjo naslednjih primerov, ki niso namenjeni, da bi omejili izum na kakršenkoli način. Vse temperature so v stopinjah Celzija.

INTERMEDIAT1

5-metoksi-l,3-oksatiolan-2-metanol, benzoat

Raztopino cinkovega klorida (1,6 g) v vročem metanolu (15 ml) dodamo v mešano raztopino merkaptoacetaldehida, dimetilacetala (34,2 g) in benzoiloksiacetaldehida (48,3 g) v toluenu (1300 ml), ki ga nato segrevamo pri refluksu pod dušikom tekom 50 minut. Ohlajeno zmes koncentriramo, razredčimo s toluenom, nato filtriramo skozi kremenico. Združene filtrate in toluen speremo z nasičeno vodno raztopino natrijevega karbonata (x2), in z raztopino soli, posušimo (MgSOJ, nato izparimo do olja, ki ga podvržemo kromatografiji na koloni silicijevega dioksida (2 kg, Merck 9385), eluiramo s kloroformom, tako da dobimo naslovni produkt kot olje (45,1 g), zmes anomerov (približno 1:1) IH NMR (DMSO-d_fi) 3,1-3,3 (4H), 3,42 (6H), 4,4-4,6 (4H), 5,41 (IH), 5,46 (1 H), 5,54 (IH), 5,63 (IH), 7,46 (4H), 7,58 (2H), 8,07 (4H); θ maks. (CHBrp 1717 cm'⁷.

INTERMEDIAT 2 (±)-cis-l-(2-benzoiloksimetil-L3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2,4-dion

Zmes fino zmletega uracila (9,62 g), heksametildisilazana (50 ml) in amonijevega sulfata (30 mg) segrevamo pri refluksu pod dušikom, dokler ne dobimo bistre raztopine. Le-to ohladimo in nato izparimo do brezbarvnega olja, ki ga raztopimo pod atmosfero dušika v acetonitrilu (100 ml). Raztopino dodamo na mešano, z ledom ohlajeno raztopino 5-metoksi-l,3-oksatiolan-2-metanola, benzoata (intermediat i) (19,43 g) v acetonitrilu (600 ml) in dodamo trimetilsililtrifluorometansulfonat (14,7 ml). Ledeno kopel odstranimo in raztopino segrevamo pri refluksu pod dušikom tekom 45 minut. Po ohladitvi in uparitvi ostanek prečistimo s kromatografijo na koloni preko 1 kg silikagela (Merck 9385), z elucijo s kloroformom/metanolom 9:1. Ustrezne frakcije združimo in uparimo, tako da dobimo surovi ostanek. Tega frakcionirno kristaliziramo iz minimalno vročega metanola (približno 1200 ml), tako da dobimo naslovno spojino (6,32 g) v obliki belih kristalov. IH NMR (d⁶DMSO) δ 11,36 (IH, šir.s), 7,50-8,00 (6H, m), 6,20 (IH, t), 5,46 (2H, m), 4,62 (2H, m), 3,48 (lm, m), 3,25 (IH, m).

INTERMEDIAT 3 (±)-(cis-4-amino-l-(2-benzoiloksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on

Postopek (a)

Suspenzijo citozina (20,705 g) in amonijevega sulfata (nekaj mg) v heksametildisilazanu (110 ml) mešamo in segrevamo pri refluksu 2,5 ure pod dušikom. Topilo odstranimo z izparevanjem in nastalo trdno snov raztopimo v suhem acetonitrilu (350 ml). To raztopino prenesemo z uporabo tehnik s prožno iglo v mešano, z ledom ohlajeno raztopino 5-metoksi-l,3-oksatiolan-2-metanol benzoata (intermediat I) (43,57 g) v acetonitrilu (650 ml) pod dušikom. Dodamo trimetilsililtrifluorometansulfonat (33 ml), raztopino pustimo, da se segreje do sobne temperature (1,5 ure), nato jo segrevamo pri refluksu preko noči. Ostanek zmesi koncentriramo, razredčimo z nasičeno vodno raztopino natrijevega bikarbonata (500 ml), nato ekstrahiramo z etilacetatom (3x500 ml). Združene ekstrakte speremo z vodo (2x250 ml) in s slanico (250 ml), osušimo (MgSO₄), nato uparimo do pene, ki jo podvržemo kromatografiji na koloni silicijevega dioksida (600 g, Merck 7734), eluiramo z zmesmi etilacetata-metanola, da dobimo zmes anomerov (približno 1:1,

31,59 g). Zmes kristaliziramo iz vode (45 ml) in etanola (9,0 ml), da dobimo trdno snov (10,23 g), ki jo prekristaliziramo iz etanola (120 ml) in vode (30 ml), tako da dobimo naslovni produkt kot belo trdno snov (9,26 g); kmaks (MeOH) 229,4 mm (E^7% 610); 272,4 mm (E'^% 293); 'H NMR (DMSO d6) δ 3,14 (IH), 3,50 (IH), 4,07 (2H), 5,52 (IH), 5,66 (IH), 6,28 (IH), 7,22 (2H), 7,56 (2H), 7,72 (2H), 8,10 (2H).

Postopek (b)

Fosforjev oksiklorid (7,0 ml) po kapljicah dodamo v mešano ledeno hladno suspenzijo 1,2,4-triazola (11,65 g) v acetonitrilu (120 ml) in nato, ob vzdrževanju notranje temperature pod 15°C, dodamo z dokapavanjem trietilamin (22,7 ml). Po 10 minutah počasi dodamo raztopino (±)-cis-l-(2-benzoiloksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)(lH)-pirimidin-2,4-diona (intermediat 2) (6,27 g) v acetonitrilu (330 ml). Nato nadaljujemo z mešanjem pri sobni temperaturi preko noči. Zmes preko noči ohladimo s pomočjo ledene kopeli in počasi dodamo trietilamin (30 ml) in nato vodo (21 ml). Dobljeno raztopino uparimo in ostanek porazdelimo med nasičeno raztopino natrijevega bikarbonata (400 ml) in kloroforma (3x200 ml). Združene kloroformske ekstrakte posušimo z magnezijevim sulfatom, filtriramo in uparimo, tako da dobimo surovi ostanek (9,7 g). Ostanek raztopimo v 1,4-dioksanu (240 ml) in dodamo h koncentrirani vodni raztopini amoniaka (s.g. 0,880 g, 50 ml). Po 1,5 ure raztopino uparimo in ostanek raztopimo v metanolu. To povzroči oboritev trdne snovi, ki jo odfiltriramo. Matično lužnico prečistimo s kromatografijo preko kolone silikagela (Merck 9385, 600 g). Ustrezne frakcije združimo, tako da dobimo naslovno spojino kot rumenkasto rjavo trdno snov (2,18 g), ki je identična tisti, dobljeni s postopkom (a).

Primer 1 f±)-(cis)-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(l-H)-pirimidin-2-on

Suspenzijo (cis)-4-amino-l-(2-benzoiloksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin2-ona (intermediat 3) (8,19 g) in Amberlite-a IRA-400 (OH) smole (8,24 g) v metanolu (250 ml) mešamo in segrevamo pri refluksu 1,5 ure. Trdne snovi ločimo s filtracijo in jih nato speremo z metanolom. Združene filtrate uparimo. Ostanek trituriramo z etil acetatom (80 ml). Tako dobljeno trdno snov združimo s filtracijo, tako da dobimo naslovno spojino (5,09 g), IH NMR (DMSO-d₆) 3,04 (IH), 3,40 (IH), 3,73 (2H), 5,18 (IH), 5,29 (IH), 5,73 (IH), 6,21 (IH), 7,19 (2H), 7,81 (IH).

Primer 2

Kiralno HPLC ločevanje enantiomerov (±)-(cis)-4-amino-l-(2-hidroksimetil-L3oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-ona (a) Racemni produkt iz primera 1 (25 mg) podvržemo preparativni HPLC pod naslednjimi pogoji:

Kolona : Merck Hibar triacetat celuloze, 250 x 10 mm, 10 μ

Eluent: etanol;

Pretok: 3 ml/min

Detekcija : uv, 270 nm;

Temperatura: normalna

Uparevanje ustreznih združenih frakcij je dalo (2R,cis)-4-amino-l-(2-hidroksimetill,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on (6,8 mg, t.j. okoli 100%) in (2S,cis)-4-aminol-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on (3,6 mg, t.j. okoli 90%).

(B) Racemni produkt iz primera 1 (26 mg) podvržemo preparativni HPLC pod naslednjimi pogoji:

Kolona: ASTEC cyclobond I acetyl, 250 x 4,6 mm;

Eluent: 0,2% trietilamonijev acetat (pripravljen z dodajanjem ledocetne kisline na 0,2% trietilamina v vodi, do končnega pH 7,2);

Pretok: 2 ml/min

Detekcija : uv, 300 nm;

Temperatura: normalna

Uparevanje ustreznih frakcij je dalo surovi (2R,cis)-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on (25 mg) in surovi (2S,cis)-4-amino-l-(2hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on (17 mg). Te frakcije ločeno podvržemo nadaljnji preparativni HPLC pod naslednjimi pogoji:

Kolona : ASTEC cyclobond I acetyl, 250 x 4,6 mm;

Eluent: 15 mM amonijev acetat, pH 6,8);

Pretok: 0,5 ml/min

Detekcija: uv, 300 nm;

Temperatura: 5°C.

V

Uparevanje ustreznih združenih frakcij je dalo (2R,cis)-4-amino-l-(2-hidroksimetill,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on (5,0 mg, t.j. okoli 91%) in (2S,cis)-4-aminol-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-iI)-(lH)-pirimidin-2-on (7,6 mg, t.j. okoli 96%).

Primer 3 (-)-cis-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on (i) (±)-cis-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidinon, dihidrogenfosfat, amonijeva sol

Hladno (0°), mešano suspenzijo (±)-cis-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan5-il)-(lH)-pirimidin-2-ona (1,00 g) (primer 1) v suhem trimetilfosfatu (20 ml) obdelamo s fosforjevim oksikloridom (2,44 ml) in zmes mešamo pri 0°C 35 minut in nato pogasimo v ledeni vodi (60 g). Hladno zmes naravnamo na pH 2,5 z dodatkom vodnega N-natrijevega hidroksida, jo nato nanesemo na kolono oglja (10 g, DARCO), ki jo eluiramo z vodo, nato z etanolom-vodnim amoniakom. Frakcije, ki vsebujejo surovi monofosfat, združimo in koncentriramo. Nastalo raztopino nanesemo na kolono, ki vsebuje 25 g DEAE Sephadex A-25 (HCO₅ - oblika). Elucijo izvedemo z gradientom vode (120 ml) do 0,1 M-NH^HCOj (240 ml), nato z 0,2, 0,3 in 4M NHjHCO^ (240 ml) (120, 240, oz. 400 ml). Ustrezne frakcije združimo in koncentriramo. Preostalo raztopino razredčimo z vodo (40 ml) in liofiliziramo, tako da dobimo naslovni produkt kot belo trdno snov (1,37 g); 7maks. (pH 6 pufer), 271,0 nm (E^7%; cm 190); ^;H NMR (D20) δ 3,23 (IH), 3,55 (IH), 4,0-4,2 (2H), 5,43 (IH), 6,07 (IH), 6,33 (IH), 8,08 (IH).

(ii) (2R, cis)-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on in (2S,cis)-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidm-2-on

5’-nukleotidazo (iz kačjega strupa crotalus atrox) [EC 3.1.3.5] (60 mg pri 17 enot/mg) dodamo v raztopino (±)-cis-4-amino-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)(lH)-pirimidin-2-on, 6’-dihidrogenfosfata, amonijeve soli (1,35 g) v pufru [30 ml, pripravljen iz glicina (526 mg) in magnezijevega klorida (190 mg) v vodi (100 ml) in zmes inkubiramo 2,5 uri pri 37°C. Dodamo še več encima (20 mg) in inkubacijo nadaljujemo nadaljnje 3,5 ure. Dobljeno zmes nanesemo na kolono DEAE Sephadex

A-25 (HCO₃-oblika). Elucijo izvedemo z vodo (160 ml), nato s 0,1, 0,2, 0,3 in 0,4 M NH₄HCO₃ (s po 200 ml vsakega). Ustrezne frakcije, ki vsebujejo prvo eluirano komponento, združimo in uparimo, ostanek podvržemo kromatografiji na koloni silicijevega dioksida (60 g, Merck 7734), eluiramo z zmesmi kloroforma-metanola. Uparitev ustreznih frakcij iz metanola-etilacetata je dala (+)-cis-4-amino-l-(2hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on kot belo trdno snov (0,30 g) [a]D²¹ +137° (c. 1,04 MeOH); Ή NMR (DMSO) δ 3,04 (IH), 3,40 (IH), 3,73 (2H), 5,18 (IH), 5,29 (IH),5,73 (IH), 6,21 (IH), 7,19 (2H), 7,81 (IH).

Ustrezne frakcije iz Sephadex kolone, ki vsebujejo drugo eluirano komponento, združimo in uparimo. Ostanek raztopimo v vodi (30 ml), obdelamo z alkalno fosfatazo (iz Escherichia coli) [EC 3.1.3.1] (1,5 ml na 416 enot/ml) nato inkubiramo 1 uro na 37°C. Topilo odstranimo z uparevanjem in ostanek podvržemo kolonski kromatografiji na silicijevem dioksidu (60 g, Merck 7734), eluiramo z zmesmi kloroforma-metanola. Uparitev ustreznih frakcij iz metanola-etilacetata je dala (-)-cis-4-amino-l-(2-hidroksimetil)-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on kot belo trdno snov (0,32 g); [a]D²¹ -132° (c. 1,08, MeOH); Ή NMR (DMSO) δ 3,04 (IH), 3,40 (IH), 3,73 (2H), 5,18 (IH), 5,29 (IH), 5,73 (IH), 6,21 (IH), 7,19 (2H), 7,81 (IH).

Primer 4 (-)-cis-4-ammo-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-(lH)-pirimidin-2-on (i) Tri 50 ml-bučke s hranljivo brozgo (Oxoid Ltd) inokuliramo s po eno polno žličko Escherichia coli (ATCC 23848), ki smo jo postrgali iz agarne plošče. Bučke inkubiramo preko noči na 37°C ob stresanju s 250 obr/min in nato vsako bučko uporabimo za inokulacijo 41 CDD podlage (glutaminska kislina, 3 g/1; MgSO₄, 0,2 g/1 : K,SO₄, 2,5 g/1; NaCl, 2,3 g/1, Na^PO^Hp, 1,1 g/1, NaH₂PO₄.2H₂O, 0,5 g/1 citidin,

1,2 g/1) v 71 fermentotju. Kulture fermentiramo na 750 obr/min, na 37°C z aeracijo s 4 1/min. Po rasti tekom 24 ur celice zberemo s centrifugiranjem (5000 g, 30 minut), tako da dobimo 72 g mokre mase. Celično pilulo ponovno suspendiramo v 300 ml 20mM Tris HC1 pufra (pH 7,5) in razbijemo s sonifikacijo (4 x 45 sek.). Celične odpadke odločimo s centrifugiranjem (30.000 g, 30 minut) in protein v supernatantu oborimo z dodatkom amonijevega sulfata do 75%-ne nasičenosti. Oborino zberemo s centrifugiranjem (30.000 g, 30 minut) in pilulo ponovno suspendiramo v 25 ml HEPES pufra (100 mM, pH 7,0), ki vsebuje amonijev sulfat (75% nasičenje). Encimsko raztopino pripravimo s centrifugiranjem na 12.000 obr/min tekom 30 minut.

--

Supernatant zavržemo in pilulo raztopimo v Tris HC1 pufru (pH 7,0; 100 mM) do prvotnega volumna.

(ii) Produkt iz primera 1 (115 mg) raztopimo v vodi (100 ml) in mešamo. Dodamo encimsko raztopino (0,5 ml) in zmes vzdržujemo na konstantnem pH s kontinuimim dodajanjem HC1 (25 mM). Konverzijo spremljamo s kiralno HPLC, ki je pokazala, daje bil preferencialno deaminiran (+) enantiomer substrata. Po 25 urah je bil (+) enantiomer substrata (RT 12,5 min) popolnoma odstranjen in raztopino smo naravnali na pH 10,5 z dodatkom koncentriranega natrijevega hidroksida.

Zgoraj proizvedeno raztopino eluiramo skozi kolono QAE Sephadex (A25; Pharmacia; 30Χ 1,6 cm), predekvilibriran na pH 11). Kolono speremo z vodo (200 ml) in nato s HC1 (0,1 M). Frakcije (40 ml) zberemo in analiziramo s pomočjo HPLC z reverzno fazo. Frakcije 5-13, ki vsebujejo nezreagirani (-) enantiomera substrata, združimo in naravnamo na pH 7,5 s HC1. Frakcijo 47, ki vsebuje deaminirani produkt, naravnamo na pH 7,5 z razredčenim NaOH. Analiza s pomočjo kiralne HPLC je pokazala, da je bil ta material zmes, ki sestoji iz enega enantiomera (RT

10,2 min) kot glavne komponente, z drugim enantiomerom (RT 8,5 min) kot komponente v manjšini (okoli 90%).

(iii) Gornjo fazo (ii) ponovimo v večjem merilu. Spojino iz primera 1 (363 mg) v 250 ml vode inkubiramo z encimsko raztopino (0,5 ml), pripravljeno kot v fazi (i). Po 18 in 47 urah dodamo nadaljnje alikvote (0,5 ml) encima. Reakcijsko zmes mešamo 70 ur, nato pustimo, da stoji nadaljnjih 64 ur. Analiza s pomočjo kiralne HPLC je pokazala, da je bil (+) enantiomer substrata popolnoma deaminiran, in dobljeno raztopino naravnamo na pH 10,5 z NaOH.

Gornjo raztopino napolnimo na isto QAE kolono in eluiramo kot v fazi (i), pri čemer zberemo frakcije 2-6, ki vsebujejo zmes rezidualnega substrata in deaminiranega produkta. Frakcije 7-13, ki vsebujejo rezidualni substrat ((-) enantiomer), zberemo in naravnamo na pH 7,5. Frakcije 25-26, ki vsebujejo deaminirani produkt, zberemo in nevtraliziramo.

Gornje frakcije 2-6 ponovno eluiramo skozi isto QAE kolono. Frakcije 3-11 iz te druge kolone so vsebovale nezreagirani substrat ((-) enantiomer). Frakcija 70 je vsebovala deaminirani produkt.

(iv) Razstavljene frakcije substrata iz faze (ii) in (iii) združimo in naravnamo na pH 7,5. To raztopino eluiramo skozi kolono XAD-16 (40x2,4 cm), pakirano v vodi. Kolono speremo z vodo in nato eluiramo z zmesjo aceton : voda (1:4 v/v). Frakcije, ki vsebujejo (-) enantiomer BCH 189, zberemo in liofiliziramo, tako da dobimo bel prah (190 mg).

Zgoraj opisani HPLC postopki so bili kot sledi:

1. Analizna HPLC z reverzno fazo

Kolona : Capital Cartridge

Eluent Pretok Detekcija Retencijski časi

Spherisorb ODS-2 (5 μτη)

150 x 4,6 mm amonijev dihidrogen fosfat (50 mM) + 5% MeCN

1,5 ml/min UV, 270 nm

BCH 189 5,5 min; deaminiran

BCH -189 8,1 min.

2. Kiralna analizna HPLC

Kolona

Eluent

Pretok:

Detekcija

Cyclobond I acetyl 250 x 4,6 mm 0,2 % trietilamonijev acetat (pH 7,2) 1,0 ml/min

UV, 270 nm

Retencijski časi : BCH 18911,0 in 12,5 min deaminiran 189 8,5 in 10,2 min.

(Biokonverzijo spremljamo z registriranjem izgube pika na 12,5 min in akumuliranega produkta na 10,2 min).

Primer 5 (±)-cis-4-ammo-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)-flH)-pirimidin-2-on

Polno žličko E. coli B celic (ATCC 32848) postrganih s ploščice za gojenje s hranljivim agarjem, uporabimo za inokulacijo dveh firenških bučk, pri čemer vsaka vsebuje 250 ml hranljive brozge. Kulturo inkubiramo na 37°C s stresanjem (250

obr/min, 5 cm nihaj) tekom 18 ur. Le-to nato uporabimo za inokulacijo 40 1 CDDpodlage s citidinom v 701 fermentorju.

Pogoji za fermentacijo so bili, kot sledi: 40 1/min aeracija, hitrost mešanja 750 obr/min, na temperaturi 37°C. Tri Rushton-ove propelerje namestimo v fermentor. Fermentacijo vodimo 18 ur pred žetvijo z uporabo Sharples kontinuirne centrifuge. Celično pasto (150 g neto mase) zamrznemo na -20°C pred razbitjem celic.

CDD podlaga g/1

L-glutaminska kislina 3

MgSO, 0,2

K₂SO₄ 2,5

NaCl 2,3

Na₂HPO₄ 1,1

NaH₂PO₄ 0,6

Pripravimo jo z destilirano vodo. Steriliziramo na 121°C tekom 30 minut. Citidin (1,2 g/1) steriliziramo na filtru in dodamo pred inokulacijo.

Zmrznjeno celično pasto (150 g) odtalimo in suspendiramo v 750 ml 100 mM Hepes (N-l[2-hidroksietil]piperazin-N’-[2-etansulfonska kislina) pufra (pH 7,5), ki vsebuje 1 mM etilendiamintetraocetne kisline (natrijeve soli) in 1 mM ditiotreitola (pufer za razbitje). Celice razbijemo s prehodom suspenzije skozi Manton-Gaulin homogenizator, ki deluje na 51712,5 kPa. To izvedemo trikrat z ohlajanjem suspenzije na približno 5°C po vsakem prehodu skozi homogenizator. Homogenat zbistrimo s centrifugiranjem (1400 g; 60 min). Aktivnost citidin deaminaze je adsorbirana na koloni Q-sefaroze (490 mg volumen sloja), ki je predekvilibrirana z 50 mM Tris (hidroksimetil)metilaminom (pH 7,5), ki vsebuje 1 mM natrijevega klorida. Zbrane aktivne frakcije (210 ml) zberemo na fenil-sefarozni koloni (490 ml volumen sloja), ki je predekvilibrirana z vzorcem pufra, ki vsebuje 3,2 M amonijevega sulfata. Vezani encim eluiramo s pomočjo gradienta z zmanjševanjem koncentracije amonijevega sulfata. Frakcije, ki vsebujejo aktivnost citidin deaminaze, zberemo (695 ml) in delno prečiščeni encim nato oborimo z 80%-nim amonijev sulfatom. Po centrifugiranju (1400 g; 60 min) pilulo ponovno suspendiramo v 54 ml supernatanta in skladiščimo pri 4°C.

6,2 ml te raztopine centrifugiramo (18.000 g, 90 min) in pilulo raztopimo v 24 ml 0,5M kalijevega fosfatnega pufra (pH 7,5). Suspenzijo dializiramo preko noči proti IM kalijevem fosfatnem pufru (pH 7,5). Retentat (20 ml) nato razredčimo z enakim volumnom destilirane vode. Na 35 ml te raztopine dodamo Eupergit C bisere (1 g) in pustimo, da zmes stoji pri sobni temperaturi 150-300 ur (določimo z merjenjem rezidualne aktivnosti citidin deaminaze v raztopini). Imobilizirani encim izperemo s 100 mM Tris/HCl pufra (pH 7,0), ki vsebuje 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5M NaCl in 500 ppm etilestra p-hidroksibenzojske kisline (pufer za skladiščenje). Imobilizirani encim (2,7 g, mokre mase) skladiščimo v tem pufru na 4°C dokler ni potreben za biotransformacijo.

Produkt iz primera 1 (3 g) raztopimo v 500 ml destilirane vode v bučki z magnetnim mešalom. Biokonverzijo izvedemo pri 32°C v pH-statu. pH vzdržujemo konstantno na 7,0 z dodajanjem IM ocetne kisline. 1 g mokre mase biserov z imobiliziranim encimom speremo pred začetkom reakcije z destilirano vodo. Konverzijo spremljamo s pomočjo kiralne HPLC, kije pokazala, daje (+) enantiomer substrata preferenčno deaminiran. Na koncu reakcije (72 ur) bisere z encimom filtriramo in filtrat uporabimo za izolacijo želenega (-) enantiomera.

pH reakcijske zmesi naravnamo na pH 10,5 z uporabo amoniakalne raztopine (IM) in raztopino nanesemo na Duolite A113 super-smolo v CH ciklusu (50 ml); 0,4 volumna sloja na uro). Uridinski analog, ki se adsorbira na smolo in (-) enantiomer prehajata naravnost skozi kolono. Kakršenkoli (-) enantiomer, ki še vedno ostane na smoli, odstranimo s spiranjem z 0,04%-no amonijakalno raztopino (2 volumna sloja; hitrost pretoka 0,8 sloja/uro).

pH porabljenih raztopin in tekočine pri spiranju (600 ml) naravnamo na pH 7,0 s koncentrirano žveplovo kislino in raztopino uporabimo na XAD16 smoli (50 ml); hitrost pretoka 1,4 volumna sloja na uro. Kolono speremo z destilirano vodo (2,5 volumna sloja, hitrost pretoka 2 volumna sloja na uro) in (-) enantiomer eluiramo z zmesjo acetomvoda 1:3 (hitrost pretoka 1,5 volumna sloja na uro).

Frakcijo, ki vsebuje maso (-) enantiomera (4 volumne sloja), koncentriramo na Buchi uparilniku na majhen volumen pred filtracijo skozi stekleni sinter št. 3. Sinterirano raztopino liofiliziramo, da dobimo 1,2 g naslovnega produkta, ki je identičen tistemu, ki ga dobimo v primeru 4.

Primer 6

Formulacija tablete

A. Naslednja formulacija je pripravljena z mokro granulacijo sestavin z raztopino providona v vodi, sušenjem in sejanjem in nato dodajanjem magnezijevega stearata in stiskanjem.

mg/tableto (a) aktivna sestavina 250 (b) laktoza B.P. 210 (c) providon B.P. 15 (d) natrijev škrobni glikolat 20 (e) magnezijev stearat 5

500

B. Naslednja formulacija je pripravljena z direktnim stiskanjem, pri čemer je laktoza za stiskanje direktnega tipa.

mg/tableto aktivna sestavina 250 laktoza 145 avicel 100 magnezijev stearat 5

500

C. (Formulacija z nadzorovanim sproščanjem). Formulacijo pripravimo z mokro granulacijo sestavin (spodaj) z raztopino providona v vodi, sušenjem in sejanjem in nato dodajanjem magnezijevega stearata in stiskanjem.

mg/tableto (a) aktivna sestavina 500 (b) hidroksipropilmetilceluloza 112 (Methocel K4M Premium) (c) laktoza B.P. 53

(d) providon B.P. 28 (e) magnezijev stearat 7

700

Primer 7

Formulacija kapsule

Formulacijo kapsule izvedemo z mešanjem spodnjih sestavin in polnjenjem v dvodelno trdo želatinsko kapsulo.

Aktivna sestavina	mg/kapsulo 125
laktoza	72,5
avicel	50
magnezijev stearat	2,5
	250

Primer 8

Formulacija za injekcije

Aktivna sestavina 0,200 g

Raztopina natrijevega hidroksida, 0,lM q.s. do pH okoli 11.

Sterilna voda q.s. do 10 ml

Aktivno sestavino suspendiramo v nekaj vode (ki je lahko ogreta) in pH naravnamo na okoli 11 z raztopino natrijevega hidroksida. Šaržo nato dopolnimo do potrebnega volumna in filtriramo skozi filter z membrano sterilizirne kvalitete v sterilno stekleno fiolo z 10 ml in zapremo s sterilnim zamaškom in zavarimo.

Primer 9

Aktivna sestavina trda maščoba, B.P mg/svečko

250

1770

2020 . - - Ί

Eno petino trde maščobe stalimo v ponvi s parnim plaščem na maksimalno 45°C. Aktivno sestavino sifoniramo skozi sito z 200 /im in dodamo na stopljeno osnovo z mešanjem ob uporabi mešalnika z veliko strižno silo, dokler ne dobimo gladke disperzije. Ob vzdrževanju zmesi na 45°C dodamo v suspenzijo preostalo trdo maščobo in mešamo, da dobimo homogeno zmes. Vso suspenzijo spustimo preko sita iz nerjavnega jekla z 250 /im in ob kontinuirnem mešanju pustimo, da se ohladi na 40°C. Pri temperaturi 38°C do 40°C 2,02 g zmesi napolnimo v primerne plastične kalupe z 2 ml. Pustimo, da se svečke ohladijo na sobno temperaturo.

Primer 10

Biološka aktivnost

Antivirusna aktivnost

Antivirusno aktivnost spojine iz primera 2 določimo proti trem sojem HIV-1 in enemu soju HIV-2 v naslednjih celičnih linijah.

JM celice, pol-zrela T-celična linija izvedena iz pacienta z limfoblastno levkemijo, inficiranim s HIV-1 sojem GB/3.

C8166 celice, humana T-limfoblastoidna celična linija, inficirane s HIV-1 sojem RF.

MT-4 celice, celična linija humane levkemije T-celice, inficirane s HIV-1 sojem RF.

CEM celice, humana T limfoblastoidna celična linija, inficirana s HIV-1 soji RF in U455 ali HIV-2 sojem ROD.

Antivirusne aktivnosti v C8166, JM in CEM celicah določimo z inhibiranjem tvorbe sincitija (Tochikura et al Virology, 164, 542-546), v MT-4 celicah pa z inhibicijo konverzije formazana (Baba et al; (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 128134; Mossman (1983) J. Immun. Meth.; 65, 55-57). Antivirusne aktivnosti prav tako določimo z analiziranjem količine HIV p24 antigena, ki se sintetizira v prisotnosti in odsotnosti enantiomera.

Rezultati so prikazani v spodnjih tabelah 1 in 2:

j». r\ r· ;

j, · « * •'ΐ • Λ

V *Λ· 'ίί

Tabela 1

	50% antivirusna aktivnost (^jg/ml)
. Test	Forma zan	Inhiblranje tvorbe sincitija
Celice	MT-4	CEM	CEM	CEM	JM	C8166
Virus (H (V” 1)	HIV-1 RF	• HIV-2-ROD	HIV-1 RF	HIV-1 U455	HIV-1GB8	HIV-1 RF
{+)-enantiomer	0.28	0.045	0.07	0.006	0.03	0.05
(-)-enantiomer	0.20	o rčrss	0.04	0.008	0.05	0.01

Tabela 2

Inhiblranje sinteze HIV p24

50% inhibiranje sinteze HIV p24 (^jg/ml)
Celice	C8166	JM	MT-4
Virus	RF	GB8	RF
(+)-enantiomer	0.021	0.033	0.0008
(-)-enantiomer	0.016	0.016	0.0004

B. Citotoksičnost

Citotoksičnosti spojin iz primera 2, racemne spojine (BCH-189; primer 1) in 50/50 zmesi dveh enantiomerov določimo v pet CD4 celičnih linijah : H9, JM, CEM, C8166 in U937.

Spojine za testiranje serijsko razredčimo od 100 +g/ml na 0,3 gg/ml (končne koncentracije) v mikrotiterskih ploščicah s 96 vdolbinami. 3,6 χ 10⁴ celic inkubiramo v vsako vdolbino plošče vključno s kontrolami brez zdravila. Po inkubaciji 5 dni na 37°C izvedemo štetje življenja sposobnih celic z odstranitvijo vzorca celične suspenzije in štetjem v hemocitometru ob izključitvi Trypan Blue celic.

Tabela 3

Citotoksičnost

50Χ Citotoksičnost CpgSj&}
Spojina	CEN čel.	JM čel.	K9 čel	. U937 čel.	C8186 čel.
C♦)-enantiomer	1 <	1.5	2	4	35
C->-enantiomer	>150	30	>100	>100	>100
BCH-1A8S	3	3.5	8	15	SO
1:1 zmes	2.5	ND*	ND	ND	ND

ND » ni določena

Za

BioChem Pharma Inc.:

v η fi- ''

Claims (16)

1. Patentni zahtevki

   1. Postopek za pridobivanje (-)-4-amino-l-(2-hidroksimetil-l,3-oksatiolan-5-il)(lH)-pirimidin-2-ona ali njegovega farmacevtsko sprejemljivega derivata (spojina A), označen s tem, da obsega ločevanje (-)-enantiomera iz zmesi, ki vsebuje tudi (+)-enantiomer.
2. 2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da spojino (A) dobimo v bistvu brez ustreznega (-f-)-enantiomera.
3. 3. Postopek po zahtevku 1 ali zahtevku 2, označen s tem, da v tako dobljeni spojini (A) (+)-enantiomer ni prisoten v količini večji od 5% m/m.
4. 4. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, označen s tem, da je v tako dobljeni spojini (A) (+)-enantiomer prisoten v količini, ki ni večja od okoli 2% m/m.
5. 5. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 4, označen s tem, da je v tako dobljeni spojini (A) (+)-enantiomer prisoten v količini manjši od okoli 1% m/m.
6. 6. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da je spojina (A) dobljena v v bistvu čisti obliki.
7. 7. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 6, označen s tem, da obsega ločevanje (-)-enantiomera iz zmesi, ki vsebuje tudi (+)-enantiomer.
8. 8. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 7, označen s tem, da je zmes spojin v racemni zmesi.
9. 9. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 8, označen s tem, da ločevanje izvedemo s kiralno HPLC.
10. 10. Postopek po zahtevku 9, označen s tem, da HPLC uporablja kot stacionarno fazo acetilirani /3-ciklodekstrin ali triacetat celuloze.
11. 11. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 8, označen s tem, da ločevanje izvedemo z encimatsko posredovanim enantioselektivnim katabolizmom.
12. 12. Postopek po zahtevku 11, označen s tem, da uporabimo encim v imobilizirani obliki.
13. 13. Postopek po zahtevku 11 ali zahtevku 12, označen s tem, da je encim citidin deaminaza.
14. 14. Postopek po zahtevku 11 ali zahtevku 12, označen s tem, da je encim 5’-nukleotidaza.
15. 15. Uporaba spojine pripravljene s postopkom po kateremokoli izmed zahtevkov 1 do 14 za izdelavo zdravila za zdravljenje virusne infekcije.
16. 16. Postopek za pripravo farmacevtske formulacije, ki obsega kot aktivno sestavino spojino, kot je pripravljena s postopkom, kot je definiran v kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 14, skupaj s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem zanjo, označen s tem, da obsega mešanje aktivne sestavine in nosilca.