SI23811A

SI23811A - Nova metoda (platforma) za iskanje biološko aktivnih molekul, za ocenjevanje kakovosti celic za celične terapije in za nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov na podlagi analize mobilnosti znotrajceličnih organelov v povezavi z bolezenskimi stanji

Info

Publication number: SI23811A
Application number: SI201100250A
Authority: SI
Inventors: Zorec Robert; Stenovec Matjaž; Trkov Saša; Vardjan Nina; Potokar Maja; Kreft Marko; Gabrijel Mateja; Jorgačevski Jernej
Original assignee: Univerza V Ljubljani; Celica D.O.O.; Center odličnosti za Integrirane Pristope v Kemiji in Biologiji Proteinov (CIPKeBiP)
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2011-07-11
Publication date: 2013-01-31
Also published as: EP2732285B1; WO2013007325A1; US20140178892A1; EP2732285A1

Abstract

Predloženi izum predstavlja platformo, ki vključuje in vitro celične sisteme, metode in standard za manipulacijo in/ali analizo znotrajcelične mobilnosti celičnih organelov, pomembne za razumevanje temeljnih celičnih procesov kot tudi za uporabo celic v medicinske in biotehnološke namene. Novost predloženega izuma je kombinacija pristopov, ki obsegajo: i) metodo spremljanja dinamike znotraj celičnih organelov za iskanje biološko aktivnih substanc (npr. sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter drugebiološko aktivne anorganske ali organske molekule in njihove mešanice), ii) metodo za določanje kakovosti celic za napredne celične terapije in iii) metodo za ocenjevanje in nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov znotraj evkariontskih celic v povezavi z mobilnostjo znotraj celičnih organelov. Ta izum predstavlja tudi podlago za proučevanje učinkov različnih farmacevtskih učinkovin za zdravljenje/modulacijo nekaterih patoloških stanj, ki zadevajo medcelično komunikacijo ter s tem povezanomobilnost in dinamiko znotraj celičnih organelov.

Description

Nova metoda (platforma) za iskanje biološko aktivnih molekul, za ocenjevanje kakovosti celic za celične terapije in za nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov na podlagi analize mobilnosti znotrajceličnih organelov v povezavi z bolezenskimi stanji

Področje tehnike, v katero spada izum

Predloženi izum se nanaša na kombinacijo pristopov (platformo), ki vključujejo celične sisteme, metode in učinkovine za študij mobilnosti znotrajceličnih organelov v povezavi z nekaterimi bolezenskimi stanji. Ti pristopi se lahko uporabijo za iskanje novih bioloških učinkovin, za ocenjevanje kakovosti celic za celične terapije in za nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov.

Tehnični problem

Z uveljavitvijo naprednejših medicinskih in biotehnoloških pristopov se povečuje potreba po celostnejšem razumevanju temeljnih znotrajceličnih procesov ter novih metodoloških orodij za različne oblike nadzora kakovosti in ocene stanja celic. Eden ključnih znotrajceličnih procesov je promet celičnih organelov, ki je temelj usklajenega in intergiranega delovanja celic ter na katerem temelji pridelava in izločanje celici lastnih in/ali rekombinantnih proteinov. Kljub hitro rastočemu tehničnemu napredku, ki omogoča naprednejše tehnološke pristope za vpogled v znotrajcelično mobilnost organelov, ti še vedno niso uporabljeni kot metode za analizo pato/fizioloških stanj celic v terapevtskih in industrijskih procesih.

Stanje tehnike

Evkariontske celice so relativno velike v primerjavi s prokariontskimi celicami in za razliko od slednjih izražajo številne znotraj celične organele. Nekateri od teh, kot so sekretomi organeli mešički, reciklirajoči mešički, različni tipi endosomov in lizosomov ter drugi, so vključeni v različne oblike medcelične komunikacije. Ti organeli so relativno velike strukture (s tipičnim premerom od 50 do 500 nm), zato je njihova difuzijska mobilnost znotraj celic omejena. Prav zaradi tega so se v evkariontskih celicah razvili mehanizmi, ki omogočajo hiter transport teh organelov pretežno vzdolž elementov citoskeleta. Intakten transport celičnih organelov do znotrajceličnih tarčnih mest in do plazmaleme, kjer poteče eksocitozno sproščanje vsebine organelov v zunajcelični prostor, je temeljni pogoj za pravilno delovanje celic ter medcelično komunikacijo s kemičnimi prenašalci. Recentni tehnološki napredek v razvoju fluorescenčne mikroskopije, povezan z razvojem novih fluorescenčnih označevalcev, ki omogočajo označenje specifičnih organelov, je omogočil visoko-ločljivostno zajemanje časovno-prostorske dinamike mobilnosti znotrajceličnih organelov. Ti tehnološki dosežki so odprli vrata novim področjem raziskav usmerjenih v pojasnitev molekulskih mehanizmov, ki poganjajo in/ali vplivajo na promet organelov znotraj celic.

Višje možganske funkcije temeljijo na usklajenem delovanju številnih živčnih celic in celic glije, ki ga omogoča uravnavano sproščanje signalnih molekul - živčnih prenašalcev in prenašalcev glije. Okvare znotrajceličnega prometa mešičkov so povezane s številnimi bolezenskimi stanji v možganih, kot so npr. Parkinsonova bolezen, Huntingtonova bolezen in amiotropna lateralna skleroza (ALS) (Su et al., 2010; Trushina et al., 2004; Munch et al., 2004). Astrociti, najštevilčnejši tip celic glije v centralnem živčnem sistemu, izražajo kompleksno uravnavanje mobilnosti organelov, ki je bila opisana v zadnjem desetletju (pregledano v Potokar et al., 2011). Njihovi izrastki obdajajo sinaptične končiče (Fellin, 2009) ter vzpostavljajo stike s krvnimi kapilarami (Carmignoto & Gomez-Gonzalo, 2010). Astrociti imajo zmožnost vzdraženja, ki temelji na porastu znotrajcelične koncentracije kalcija (Ca²⁺)j (Comell-Bell et al., 1990), ter sposobnost sproščanja različnih kemičnih prenašalcev, kot so glutamat (Parpura et al., 1994), ATP (Cotrina et al., 1998; Pangrsic et al., 2007), D-serin (Martineau et al., 2008) in sekrecijski peptidi (Martin, 1992; McKenzie et al., 2001; Kržan et al., 2003). Astrociti tako direktno modulirajo sinaptični prenos (Newman, 2003) in uravnavajo krvni pretok v možganih (Zonta et al., 2003; Takano et al., 2006) ter igrajo pomembno vlogo pri učenju, spominu, spanju in številnih patoloških stanjih v možganih.

Ena od lastnosti astrocitov je tudi, da lahko prevzamejo vlogo »neprofesionalnih« antigen predstavitvenih celic (APC), ki za razliko od profesionalnih APC (kot so dendriti, makrofagi, Bcelice) na celični membrani ne izražajo molekul poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (»major histocompatibility complex«, MHC) razreda II konstitutivno, ampak le ob izpostavljenosti citokinu interferonu gama (ΙΤΝγ) (Fierz et al., 1985; Fontana et al., 1984; Shrikant & Benveniste, 1996; Wong et al., 1984). V splošnem igrajo APC ključno vlogo pri imunskem odzivu. Njihova naloga je privzem eksogenih antigenov in predstavitev le-teh CD4 pozitivnim T-celicam pomagalkam, kar privede do aktivacije teh celic. APC privzemajo in procesirajo antigene prek procesa endocitoze. Po intemalizaciji antigenov z endocitozo zgodnji endosomi sčasoma dozorijo v pozne endosome/lizosome, v katerih se antigeni predelajo v peptide in se vežejo na molekule MHC razreda II. Pozni endosomi/lizosomi, ki vsebujejo komplekse peptidov in MHC razreda II, imenovani kompartmenti MHC razreda II, se nato prenesejo na površino APC za prepoznavanje T-celičnih receptorjev na CD4 pozitivnih T-celicah pomagalkah (Geuze, 1998; Hiltbold & Roche, 2002; Mellman, 2007; Štern et al., 2006; Turley et al., 2000). V centralnem živčnem sistemu so astrociti aktivirani z IFNy vključeni v predstavitev antigenov in aktivacijo CD4 pozitivnih T-celic pomagalk in tako sodelujejo pri nevroloških motnjah povezanih z imunskim odzivom, kot je multipla skleroza (De Keyser et al., 2004; Fontana et al., 1984; Nair et al., 2008; Soos et al., 1998; Stiive et al., 2002) in živalski model te bolezni, eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis (EAE) (Shrikant & Benveniste, 1996). In vitro, v primarnih kulturah astrocitov lahko izražanje molekul MHC razreda II na površini celic izzovemo z izpostavitvijo celic IFNy (De Keyser et al., 1999; Nikcevich et al., 1997; Wong et al., 1984; Zeinstra et al., 2006). Primarne celične kulture astrocitov aktivirane z IFNy lahko torej služijo kot celični sistem za študijo molekulskih mehanizmov predstavitve antigenov v astrocitih.

Opis izuma

Predloženi izum predstavlja platformo, ki vključuje in vitro celične sisteme, metode in standard za manipulacijo in/ali analizo znotrajcelične mobilnosti celičnih organelov. Ta platforma predstavlja pomembno orodje za razvoj novih terapevtskih tarč za zdravljenje nevroloških motenj, kot so travme, mentalna zaostalost, kognitivni primanjkljaj, nevrodegeneracijske bolezni, vnetja, nevrološki sindrom pri visokih tlakih (HPNS) in drugo.

• *

Novost predloženega izuma je kombinacija pristopov, ki obsegajo: i) metodo spremljanja dinamike znotraj celičnih organelov za iskanje biološko aktivnih substanc (npr. sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter druge biološko aktivne anorganske ali organske molekule in njihove mešanice), ii) metodo za določanje kakovosti celic za napredne celične terapije in iii) metodo za ocenjevanje in nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov znotraj evkariontskih celic v povezavi z mobilnostjo znotrajceličnih organelov. Ta izum predstavlja podlago za proučevanje učinkov različnih farmacevtskih učinkovin za zdravljenje/modulacijo nekaterih patoloških stanj, ki zadevajo medcelično komunikacijo ter s tem povezano mobilnost in dinamiko znotrajceličnih organelov. V ta namen smo v predloženem izumu vpeljali referenčno snov (standardno mešanico), ki povzroči standardno spremembo dinamike mobilnosti znotrajceličnih mešičkov. Glede na to, da pridelava rekombinantnih proteinov za biofarmacevtski ali katerikoli drug namen temelji na sekrecijski poti, ki obvezno vključuje transport sekretomih mešičkov, je kakovost izbranih celic za pridobivanje rekombinantnih proteinov pogojena z značilnostmi dinamike znotrajceličnih organelov. Predloženi izum predstavlja tudi podlago za oceno kakovosti celic za uporabo pri naprednih celičnih terapijah v medicini.

V predloženem izumu so in vitro celične kulture astrocitov (ali drugih celičnih tipov) predstavljene kot primeren celični sistem za ocenjevanje kakovosti celic za razvoj naprednih celičnih terapij (bodisi kot celice uporabljene za zdravljenje ali kot celični sistem, na katerem ocenjujemo učinke terapevtskih substanc). Astrociti prav tako predstavljajo »neprofesionalne« antigen predstavitvene celice, ki se na tretiranje z IFNy odzovejo s povečanjem izražanja molekul MHC razreda II na celični površini, kar posledično privede do sprememb v mobilnosti mešičkov, v katerih so shranjeni antigeni. Zaradi že znane odzivnosti astrocitov na nekatere pato/fiziološke dražljaje, so astrociti dober celični model za študije molekulskih mehanizmov znotraj celičnega transporta organelov.

Metode predloženega izuma vključujejo naslednje korake:

a) Celične kulture astrocitov (izoliranih iz novorojenih podgan, kot je opisano v Schwartz & Wilson, 1992) ali katerikoli drug tip celic izoliran iz živalskih tkiv, ali klonalne celične linije iz človeških ali živalskih virov, so nasajene na krovna stekelca in hranjene v primernem celičnem gojišču.

b) Eksocitozne in endocitozne organele v celičnih kulturah obarvamo s specifičnimi barvili ali s pomočjo transfekcije celic. Na primer, peptidergične sekrecijske mešičke obarvamo z atrijskim natriuretičnim peptidom označenim z mutiranim zelenim fluorescenčnim proteinom (ANP.emd) (Han et al., 1999; Kržan et al., 2003), glutamatergične mešičke s fluorescenčno označenim vezikulamim glutamatnim transporteijem (VGLUT1-EGFP), mešičke, ki vsebujejo ATP, z inkubacijo celic v kvinakrin dihidrokloridu (1 μΜ, 15 minut na sobni temperaturi) (Pangršič et al., 2007) in za barvanje endosomov/lizosomov z inkubacijo celic v barvilu LysoTracker Red DND-99 (200 nM, 5 minut na sobni temperature; Invitrogen) (Potokar et al., 2010). Za opazovanje mešičkov, ki izražajo molekule MHC razreda II, celice inkubiramo z Alexa Fluor⁵⁴⁶ dekstranom (0.1 mg/ml, 16 ur na 37°C; Molecular Probes, Invitrogen).

c) Celične kulture tretiramo z biološko aktivnimi substancami (npr. sestavinami serumov, cerebrospinalne tekočine ter drugimi biološko aktivnimi anorganskimi ali organskimi molekulami ter njihovimi mešanicami), ali z referenčno standardno mešanico, ki jo sestavljata FTY720 and FTY720-fosfat (FTY720-P) v razmerju od 1:0.1 do 1:100, raztopljeni v celičnem gojišču za 10 minut na 18-37°C. Za opazovanje povečanja izražanja molekule MHC razreda II celice tretiramo z IFNy (600 U/mF) 48 ur na 37°C ali katerimkoli drugim stimulantom predstavitve antigenov.

d) Krovna stekelca s celicami speremo v zunajcelični raztopini (sestavljeni iz 10 mM HEPES/NaOH (pH 7.2), 10 mM D-glukoze, 130 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ in 5 mM KC1) in opazujemo s fluorescenčno mikroskopijo pri 63x ali 100* povečavi z uporabo argonskega laserja valovne dolžine 488 nm (za ANP.emd, VGFUT1-EGFP in kvinakrin dihidroklorid) ali s He-Ne laserjem z valovno dolžino 543 nm (za Fysotracker Red DND-99 in Alexa Fluor⁵⁴⁶ dextran), in filtriranjem emisijske svetlobe z ozkopasovnim filtrom 505-530 nm oziroma z dolgopasovnim filtrom 560 nm. Za spremljanje mobilnosti mešičkov zaporedno zajemamo konfokalne mikroskopske posnetke s frekvenco 0.5-2 Hz 1-10 minut.

e) Dodatno celice lahko stimuliramo z adenozin trifosfatom (ATP) in posnamemo mobilnost celičnih mešičkov pred in po stimulaciji.

f) Mobilnost mešičkov analiziramo s pomočjo programa za sledenje delcev. Z uporabo programa Track2 (ParticleTR, Celica, Slovenija), kot je bilo opisano (Potokar et al., 2005), dobimo orise poti in kvantitativne parametne mobilnosti posameznih mešičkov.

g) Izračunamo parametre mobilnosti mešičkov za določene časovne intervale, tipično dolge 1060 s (Potokar et al., 2005; Stenovec et al., 2007): dolžina koraka (premik mešička med dvema zaporednima časovnima korakoma), hitrost, dolžina poti (TL; celotna prepotovana pot znotraj določenega časovnega okvirja), maksimalen odmik (MD; maksimalna celokupna premestitev mešička znotraj določenega časovnega okvirja; Wacker et al., 1997), kot maksimalnega odmika in indeks usmerjenosti (Dl; razmeije med MD in TL).

h) Dodatno celice lahko fiksiramo z 1-5% formaldehidom in imuocitokemično obarvamo s komercialno dostopnimi protitelesi za MHC razreda II za potrditev njihovega izražanja po tretiranju astrocitov z IFNy ali katerimkoli drugim stimulantom predstavitve antigenov.

Opis slik izuma

Slika 1 podaja shematski prikaz metode razvite za proučevanje sestavin serumov in cerebrospinalne tekočine za njihove biološke učinke z uporabo posamične evkariontske celice s specifično obarvanimi znotrajceličnimi organeli. Evkariontska celica je lahko izpostavljena nepermeabilnim ligandom, ki delujejo prek receptorjev na plazemski membrani in aktivirajo znotrajcelične signalne poti, ali celično prepustnim molekulam, ki lahko prestopajo plazemsko membrano in posredno ali neposredno vplivajo na mobilnost znotrajceličnih organelov prek citoskeleta in/ali na veijetnost za spontano ali stimulirano zlitje vsidranih mešičkov ter sprostitev njihove vsebine v zunajcelični prostor.

Slika 2 predstavlja temeljni princip in primer kvantitativne analize mobilnosti mešičkov za iskanje biološko aktivnih snovi, ki vplivajo na mobilnost mešičkov.

A. Shematični prikaz 2D Gaussove krivulje (slika zgoraj), ki se prilega intenziteti signala fluorescence izbranega mešička na posnetku zajetim s konfokalnim mikroskopom (slika spodaj), na čemer temelji določanje x, y koordinat lege mešičkov z uporabniškim programom za sledenje delcev Track2 (ParticleTR, Celica, Slovenija), ki je bil uporabljen v predloženem izumu.

B. Slika predstavlja x, y koordinate (pike) vrhov 2D Gaussovih krivulj pridobljenih s sledenjem posameznega mešička na zaporednih mikroskopskih posnetkih (slika zgoraj). Povezani vrhovi krivulj predstavljajo celotno prepotovano pot posameznega mešička, pri čemer lahko določimo dolžino poti (»track length«, TL; črna krivulja) in maksimalen odmik (»maximal displacement«, MD; siva črta) mešičkov v določenem časovnem intervalu.

C. Prikaz tirnic gibanja mešičkov s programom Track2, ki prikazuje prepotovane poti posameznih mešičkov (40) v ne-tretiranih kontrolnih astrocitih (Kont.) transfeciranih za izražanje fluorescenčno označenega peptida ANP.emd, ki je shranjen v sekretomih mešičkih. Velik delež mešičkov izraža usmerjeno mobilnost, ki jo označujejo podolgovate tirnice potovanja mešičkov.

D. Prikaz prepotovanih poti mešičkov v astrocitih tretiranih s sfingozinom (Sph), ki močno zmanjša mobilnost mešičkov, kar prikazujejo izrazito točkaste tirnice mešičkov.

E. Povprečna (± standardna napaka) dolžina poti (TL) in

F. povprečen (± standardna napaka) maksimalen odmik mešičkov v celicah tretiranih s standardno referenčno mešanico (Stand) in celicah tretiranih z biološko aktivnima substancama: 10 μΜ sfingozinom (Sph) ali 100 pg/ml človeškim imunoglobulinom G (IgG). Opazne so jasne razlike v učinku različnih dražljajev na prikazana parametra mobilnosti mešičkov. Sfingozin močno zmanjša oba parametra mobilnosti, medtem ko človeški IgG ne vpliva znatno na TL mešičkov, povzroči pa povečanje MD mešičkov glede na standard (Stand). Številke na dnu stolpcev prikazujejo skupno število analiziranih mešičkov v pozameznih časovnih intervalih (15 s). *p<0.001 proti standardu.

Slika 3 prikazuje celične kompartmente, ki vsebujejo molekule MHC razreda II označene z Alexa Fluor⁵⁴⁶ dekstranom, v astrocitih tretiranih z IFNy. Prikazane so slike fluorescence z dekstranom označenih kontrolnih (Ctrl.) astrocitov in astrocitov tretiranih z IFNy (+IFNy), ki so bili nadalje fiksirani in imunocitokemično barvani s protitelesi za MHC razreda II. Barvanje prikazuje, da tretiranje astrocitov z IFNy povzroči točkasto porazdelitev molekul MHC razreda II, ki se prekriva s strukturami obarvanimi z dekstranom. Dekstran je kolokaliziran z markerjem za lizosome LAMP1 (ni prikazano).

Slika 4 prikazuje spremembo mobilnosti mešičkov v povezavi s predstavitvijo antigenov na površini astrocitov. V celicah tretiranih z IFNy (+IFNy) se statistično značilno povečata povprečna dolžina poti (TL) in maksimalen odmik (MD) mešičkov v primerjavi s kontrolnimi (Kont.) celicami (stolpci Spon.). Stimulacija celic z adenozin trifosfatom (ATP) povzroči upad prikazanih parametrov mobilnosti tako v ne-tretiranih kot v tretiranih celicah. *p<0.05.

Primer uporabe izuma

Možnost uporabe izuma opisujemo v naslednjih dveh primerih:

1. Primer študije vpliva biološko aktivnih snovi, kot sta sfmgozin in imunoglobulilni G (IgG) iz človeškega seruma, na mobilnost sekretomih mešičkov v primerjavi z vplivom standarda, ki je pravtako predmet predloženega izuma. Primer prikazujeta sliki 2 E in F. Mobilnost fluorescenčno označenih mešičkov v transfeciranih astrocitih, ki izražajo ANP.emd, smo analizirali s programom za sledenje delcev Track2 in določili kvantitativne parametre mobilnosti mešičkov. Kot je prikazano na slikah 2 E in F, rezultati analize kažejo, da tretiranje celic z 10 μΜ sfingozinom (Sph) povzroči zmanjšanje mobilnosti mešičkov glede na oba prikazana parametra, povprečno dolžino poti mešičkov (TL) (slika 2 E) in povprečen maksimalen odmik (MD) (slika 2 F), medtem ko človeški IgG v koncentraciji 100 pg/ml ne vpliva znatno na TL mešičkov, poveča pa njihov MD glede na standard (Stand).

2. Primer analize spremenjene mobilnosti mešičkov v povezavi s predstavitvijo antigenov na površini astrocitov aktiviranih z IFNy. Primer je prikazan s slikama 3 in 4. Kot je prikazano na sliki 3, celični kompartmenti, ki vsebujejo molekule MHC razreda II, sovpadajo s celičnimi organeli označenimi z Alexa Fluor⁵⁴⁶ dekstranom, zato z analizo mobilnosti mešičkov označenih z dekstranom lahko opišemo spremembe mobilnosti mešičkov pod vplivom izzvane predstavitve antigenov (z IFNy) na površini celice. Kot je prikazano na sliki 4, se v astrocitih aktiviranih z IFNy statistično značilno povečata povprečna dolžina poti in maksimalen odmik mešičkov v primerjavi s kontrolnimi celicami. Stimulacija celic z adenozin trifosfatom (ATP) pa nasprotno povzroči upad prikazanih parametrov mobilnosti tako v kontrolnih kot v aktiviranih celicah.

Reference

Geuze HJ. 1998. The role of endosomes and lysosomes in MHC class II functioning. Immunol

Today 19(6):282-7.

Han W, Ng YK, Axelrod D, Levitan ES. Neuropeptide release by efficient recruitment of diffusing cytoplasmic secretory vesicles. ProcNatl Acad Sci USA. 1999; 96:14577-14582.

Hiltbold EM, Roche PA. 2002. Trafficking of MHC class II molecules in the late secretory pathway. Curr Opin Immunol 14(1):30-5.

Kržan M, Stenovec M, Kreft M, Pangrsic T, Grilc S, Haydon PG, Zorec R. Calcium-dependent exocytosis of atrial natriuretic peptide from astrocytes. J Neurosci. 2003; 23(5):1580-3.

Lee SC, Collins M, Vanguri P, Shin ML. 1992. Glutamate differentially inhibits the expression of class II MHC antigens on astrocytes and microglia. J Immunol 148(11):3391-7.

Martin DL. Synthesis and release of neuroactive substances by glial celiš. Glia. 1992; 5:81-94. Martineau M, Galli T, Baux G, Mothet JP. Confocal imaging and tracking of the exocytotic routes for D-serine-mediated gliotransmission. Glia. 2008; 12:1271-1284.

McKenzie JC, Juan YW, Thomas CR, Berman NE, Klein RM. Atrial natriuretic peptide-like immunoreactivity in neurons and astrocytes of human cerebellum and inferior olivary complex. J Histochem Cytochem. 2001; 11:1453-1467.

Mellman I. 2007. Private lives: reflections and challenges in understanding the celi biology of the immune system. Science 317(5838):625-7.

Miinch C, Sedlmeier R, Meyer T, Homberg V, Sperfeld AD, Kurt A, Prudlo J, Peraus G,

Hanemann CO, Stumm G, Ludolph AC. Point mutations of the pl50 subunit of dynactin (DCTN1) gene in ALS. Neurology. 2004 63(4):724-6.

Nair A, Frederick TJ, Miller SD. 2008. Astrocytes in multiple sclerosis: a product of their environment. Celi Mol Life Sci 65(17):2702-20.

Neumann H, Boucraut J, Hahnel C, Misgeld T, Wekerle H. 1996. Neuronal control of MHC class

II inducibility in rat astrocytes and microglia. Eur J Neurosci 8(12):2582-90.

Neumann H. 2001. Control of glial immune function by neurons. Glia 36(2):191-9.

Newman EA. New roles for astrocytes: regulation of synaptic transmission. Trends Neurosci. 2003; 26(10):536-42.

Nikcevich KM, Gordon KB, Tan L, Hurst SD, Kroepfl JF, Gardinier M, Barrett TA, Miller SD. 1997. IFN-gamma-activated primary murine astrocytes express B7 costimulatory molecules and prime naive antigen-specific T celiš. J Immunol 158(2):614-21.

Pangrsic T, Potokar M, Stenovec M, Kreft M, Fabbretti E, Nistri A, Pryazhnikov E, Khiroug L, Giniatullin R, Zorec R. Exocytotic release of ATP from cultured astrocytes. J Biol Chem. 2007; 28;282(39):28749-58.

Parpura V, Basarsky TA, Liu F, Jeftinija K, Jeftinija S, Haydon PG. Glutamate-mediated astrocyte-neuron signalling. Nature. 1994; 369:744-747.

Potokar M, Kreft M, Li L, Daniel Andersson J, Pangrsic T, Chowdhury HH, Pekny M, Zorec R. 2007. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic 8(1):12-20.

Potokar M, Kreft M, Pangrsic T, Zorec R. Vesicle mobility studied in cultured astrocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 329(2):678-83.

Potokar M, Stenovec M, Gabrijel M, Li L, Kreft M, Grilc S, Pekny M, Zorec R. Intermediate filaments attenuate stimulation-dependent mobility of endosomes/lysosomes in astrocytes. Glia. 2010; 58(10):1208-19.

Potokar M, Stenovec M, Kreft M, Gabrijel M, Zorec R. 2011. Physiopathologic dynamics of vesicle traffic in astrocytes. Histol Histopathol 26(2):277-84.

Schwartz JP, Wilson DJ. Preparation and characterization of type 1 astrocytes cultured from adult rat cortex, cerebellum, and striatum. Glia. 1992; 5(1):75-80.

Shrikant P, Benveniste EN. 1996. The central nervous system as an immunocompetent organ: role of glial celiš in antigen presentation. J Immunol 157(5):1819-22.

Soos JM, Morrow J, Ashley TA, Szente BE, Bikoff EK, Zamvil SS. 1998. Astrocytes express elements of the class II endocytic pathway and process central nervous system autoantigen for presentation to encephalitogenic T celiš. J Immunol 161(11):5959-66.

Stenovec M, Kreft M, Grilc S, Potokar M, Kreft ME, Pangrsic T, Zorec R. Ca2+-dependent mobility of vesicles capturing anti-VGLUTl antibodies. Exp Celi Res. 2007; 313(18):380918.

Stem LJ, Potolicchio I, Santambrogio L. 2006. MHC class II compartment subtypes: structure and function. Curr Opin Immunol 18(1):64-9.

Stuve O, Youssef S, Slavin AJ, King CL, Patarroyo JC, Hirschberg DL, Brickey WJ, Soos JM, Piskurich JF, Chapman HA and others. 2002. The role of the MHC class II transactivator in class II expression and antigen presentation by astrocytes and in susceptibility to central nervous system autoimmune disease. J Immunol 169(12):6720-32.

Su LJ, Auluck PK, Outeiro TF, Yeger-Lotem E, Kritzer JA, Tardiff DF, Stratheam KE, Liu F, Cao S, Hamamichi S, Hill KJ, Caldwell KA, Bell GW, Fraenkel E, Cooper AA, Caldwell GA, McCaffery JM, Rochet JC, Lindquist S. Compounds from an unbiased Chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinsoni disease models. Dis Model Mech. 2010 3(3-4):194-208.

Takano T, Tian GF, Peng W, Lou N, Libionka W, Han X, Nedergaard M. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 2006; 9(2):260-7.

Trushina E, Dyer RB, Badger JD 2nd, Ure D, Eide L, Tran DD, Vrieze BT, Legendre-Guillemin V, McPherson PS, Mandavilli BS, Van Houten B, Zeitlin S, McNiven M, Aebersold R, Hayden M, Parisi JE, Seeberg E, Dragatsis 1, Doyle K, Bender A, Chacko C, McMurray CT. Mutant huntingtin impairs axonal trafficking in mammalian neurons in vivo and in vitro. Mol Celi Biol. 2004 24(18):8195-209.

Turley SJ, Inaba K, Garrett WS, Ebersold M, Untemaehrer J, Steinman RM, Mellman I. 2000. Transport of peptide-MHC class II complexes in developing dendritic celiš. Science 288(5465):522-7.

Wacker I, Kaether C, Kromer A, Migala A, Almers W, Gerdes H. 1997. Microtubule-dependent transport of secretory vesicles visualized in real time with a GFP-tagged secretory protein. J Celi Sci 110 ( Pt 13):1453-63.

Wong GH, Bartlett PF, Clark-Lewis I, Battye F, Schrader JW. 1984. Inducible expression of H-2 and la antigens on brain celiš. Nature 310(5979):688-91.

Zeinstra E, Wilczak N, Chesik D, Glazenburg L, Kroese FG, De Keyser J. 2006. Simvastatin inhibits interferon-gamma-induced MHC class II up-regulation in cultured astrocytes. J Neuroinflammation 3:16.

Zonta M, Angulo MC, Gobbo S, Rosengarten B, Hossmann KA, Pozzan T, Carmignoto G. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 2003; 6(1):43-50.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Metoda za spremljanje dinamike organelov v evkariontskih celicah za iskanje biološko aktivnih substanc (npr. sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter druge biološko aktivne anorganske ali organske molekule in njihove mešanice), kije označena s stopnjami:

a) Barvanje znotrajceličnih (eksocitoznih ali endocitoznih) organelov.

b) Tretiranje celic z biološko aktivnimi substancami.

c) Spremljanje sprememb mobilnosti organelov z mikroskopijo in zaporednim zajemanjem slik.

d) Analiza mobilnosti organelov s programom za sledenje delcev.

e) Izračun parametrov mobilnosti organelov.
2. Metoda za določanje kakovosti celic na osnovi premikanja organelov z namenom uporabe celic za napredne celične terapije, kije označena s sledečimi zaporednimi stopnjami:

a) Barvanje znotrajceličnih (eksocitoznih ali endocitoznih) organelov.

b) Tretiranje celic z referenčno standardno mešanico ali drugimi biološko aktivnimi substancami.

c) Spremljanje sprememb mobilnosti organelov z mikroskopijo in zaporednim zajemanjem slik.

d) Analiza mobilnosti organelov s programom za sledenje delcev.

e) Izračun parametrov mobilnosti organelov.
3. Metodo za ocenjevanje in nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov znotraj evkariontskih celic v povezavi z mobilnostjo znotrajceličnih organelov, ki je označena s stopnjami:

a) Transfekcija celic za izražanje optično označenih rekombinantnih proteinov, ki označujejo celične organele (eksocitozne ali endocitozne).

b) Spremljanje mobilnosti organelov z mikroskopijo in zaporednim zajemanjem slik.

c) Analiza mobilnosti organelov s programom za sledenje delcev.

d) Izračun parametrov mobilnosti organelov.
4. Metoda po zahtevkih 1 in 2 označena s tem, da barvamo katerekoli znotraj celične eksocitozne ali endocitozne organele specifično ali ne-specifično (s transfekcijo celic, z barvili, ki se specifično nalagajo v določenih tipih organelov, ipd.).
5. Metoda po zahtevkih 1 in 2 označena s tem, da so biološko aktivne substance lahko sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter druge biološko aktivne anorganske ali organske molekule ter njihove mešanice.
6. Metoda po zahtevkih 1, 2 in 3 označena s tem, da celice opazujemo s fluorescenčno mikroskopijo.
7. Metoda po zahtevkih 1, 2 in 3 označena s tem, da so zaporedni posnetki slik fluorescence zajeti s frekvenco 0.01-300 Hz.
8. Standardna raztopina, ki predstavlja standardno referenčno mešanico v zahtevku 2 v koraku b) označena s tem, dajo sestavlja mešanica učinkovin FTY720 in FTY720-fosfata (FTY720P) v razmerju od 1:0,1 do 1:100.
9. Metoda po zahtevku 2 označena s tem, da celice tretiramo s standardno referenčno mešanico na način, da standardno raztopino dodamo v celično gojišče ali zunajcelično raztopino v razmerju 0,01-100 pL na 1 mL.
10. Metoda po zahtevku 2 označena s tem, da celice inkubiramo s standardno referenčno mešanico ali drugimi biološko aktivnimi substancami od nekaj sekund do več ur.
11. Metoda po zahtevku 2 označena s tem, da celice inkubiramo s standardno referenčno mešanico ali drugimi biološko aktivnimi substancami pri temperaturi 10-37°C.