SE540132C2 - Analysmetod för bestämning av antikoagulanter i blod eller blodplasma - Google Patents

Abstract

Analysmetod för bestämning av antikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov, varvid analysmetoden innefattar analyser med minst två våtkemiska protrombintid (PT)-metoder. Analysmetoden innefattar att mäta PT i en första reaktionsblandning med en första PT-metod och att mäta PT i en andra reaktionsblandning med en andra PT-metod, varvid koncentrationerna av blod eller blodplasma i den andra reaktionsblandningen skiljer sig från koncentrationen av blod eller blodplasma i den första reaktionsblandningen. PT-metoderna är kalibrerade att ge samma eller ungefär samma PT-resultat för referensprov som saknar antikoagulanter av intresse för analysmetoden. Vidare beräknas en skillnad i PT från mätningarna, varvid om skillnaden i PT är 1) signifikant, tyder detta på en närvaro av antikoagulanter i provet, eller 2) icke-signifikant, tyder detta på en frånvaro av antikoagulanter i en halt över detekterbar nivå i provet.

Description

ÅåšåšA-*ff-,L\:'¶ALYSi\JlE'i'OÛ FÖR BESTÄMNING AV ANTIKOAGULANTER IBLOD ELLER BLODPLASMA Tekniskt områdeDetta dokument avser en analysmetod för bestämning av antikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov.

BakgrundAntikoagulanter är ämnen som dämpar, minskar eller upphäver blodets, eller blodplasmats, förmåga att koagulera - antikoagulanter minskarhastigheten med vilken fibrinogen omvandlas till fibrin.

En del antikoagulanter är naturligt förekommande, endogena, ochspelar viktiga fysiologiska roller för att begränsa insättandet,utbredningshastigheten och den rumsliga utvidgningen av blodkoagulation invivo. Andra antikoagulanter uppträder under patologiska förhållanden. Detfinns antikoagulanter som hittats i ormgifter och i exkretioner från myggor,iglar, fladdermöss och fästingar. En växande grupp av antikoagulanter ärtillverkade av människor i syfte att behandla och förhindra tromboemboliskasjukdomar.

Blodkoagulation är ett komplext fenomen som involverar en mängdinteragerande molekyler som förekommer i blodplasma eller på ytan avinvolverade celler. Det finns många cellulära och molekylära interaktioner,inkluderande många enzymatiskt katalyserade reaktioner, som kannedregleras eller avbrytas genom inverkan av antikoagulanter.

De direkt verkande antikoagulanterna hämmar, hindrar eller upphäverden enzymatiska aktiviteten hos en eller båda av de kritiska enzymerna ikoagulationsprocessen, trombin (Flla) eller aktiverad koagulationsfaktor X(FXa). lndirekt verkande antikoagulanter arbetar på ett något annat sätt,varav ett sätt är att förstärka kraften hos direkt verkande inhibitorer.Antikoagulanter som används terapeutiskt, heparin och vitamin-Kantagonister ses som indirekt verkande antikoagulanter. Direkt verkande antikoagulanter är hirudin (ett protein från igeln) och de nyligen framtagna inhibitorerna av Flla eller FXa. Det är dessa nya direkt verkandeantikoagulanter, särskilt de som kan administreras oralt, DOACs, som orsakaren djupgående förändring inom klinisk- och laboratoriemedicin.

Det faktum att antikoagulanter har olika verkningssätt utgör enutmaning för laboratoriemedicin att hitta pä metoder genom vilkaantikoagulanterna kan bestämmas. Till en viss grad har denna utmaningförvärrats av nyligen inträffade farmakologiska framgångar i att framställa nyasubstanser för att behandla tromboemboliska sjukdomar, se t.ex. J.Harenburg, S. Marx och R. Krämer, Determination of the anticoagulationeffects of the new oral anticoagulants: an unmet need, Expert Review ofHaematology, February 2012, Vol. 5, No. 1, Sid. 107-113.

Vid centrala sjukhuslaboratorier där det finns en mängd olika testertillgängligt och kvalificerad personal för att tolka resultaten ter sig detektionoch bestämning av DOAC relativt okomplicerat - Flla-inhibitorer och FXa-inhibitorer kan analyseras med respektive trombintid (TT)-tester eller FXa-tester. Om standardvarianter av dessa tester inte uppfyller behoven kommernägon förändring eller ”utspädning” av standardvarianten att göra det. Vidprimärvärdsenheter och pä platser inom sjukhus men pä avständ fräncentrallaboratoriet, ”off-site”, är situationen annorlunda. Kännetecknande förlaboratoriemedicin vid värdenheter är att antalet olika laboratorietester ärbegränsat eftersom det fysiska utrymmet för sädana laboratorier är begränsatoch eftersom tillgängen pä kvalificerad laboratoriepersonal är begränsad.lnom koagulation är det mest tillgängliga testet vid ett primärvärdscenterprotrombintestet (PT-testet) med resultat uttryckta i INR (internationellnormaliserad kvot, en kvot mellan PT hos provet och en normal-PTnormaliserad genom att upphöjas med normaliseringsexponent, ettkänslighetsindex). Andra ”ordinarie” eller ”vanliga” koagulationstester äraktiverad partiell tromboplastintid (APTT), aktiverad koagulationstid (ACT)och nämnda TT. Det är förhoppningen hos visionära experter inomkoagulationsomrädet att dessa ”ordinarie” eller ”vanliga” koagulationstesterkan anpassas, modifieras, ”spädas ut”, för att uppfylla primärvärdenheternasbehov av att analysera de ”nya” antikoagulanterna, särskilt DOACS. Sådana tankar/förhoppningar uttrycks till exempel av E.J. Favaloro och G. Lippi, The new oral anticoagulants and the future of haemostasis laboratory testing,Biochemia Medica 2012; 22(3):329-41.

Eftersom PT-INR är det vanligaste tillgängliga primärvårdsenhetstestetför koagulationsmätningar är ett modifierat PT-test eller “utspädd PT” medvilket DOAC kan bestämmas mycket önskvärt. Det finns arbete i sådanriktning rapporterat. Den låga känsligheten hos de flesta PT-tester för direktaFXa-inhibitorer, såsom rivaroxaban, är känt. C. Kluft visar i EP 2 405 274 A1att PT-tester som påverkas av ett visst ormgift, RVV-V, också uppvisarkänslighet för rivaroxaban, och visar användningen av ett PT-test somanvänder sådana tromboplastiner.

Förhoppningarna att finna ett sätt att bestämma DOAC genom någotPT-test, modifierat eller inte, har under de senaste åren minskat. ljanuari2014 rapporterade T. Lindahl, en medlem av en expertgrupp i koagulationhos den externa kvalitetsorganisationen i Sverige, EQUALIS, studier utfördaav expertgruppen på en FXa-inhiberande substans apixaban. Slutsatsen varatt ingen av de många kommersiellt tillgängliga PT eller APTT-testerna kundeanvändas för att bestämma apixaban vid kliniskt relevanta koncentrationer iblodplasma. FXa-tester fungerade å andra sidan bra för detta ändamål.

Ansträngningar för att korrigera PT-resultat för den variablaantikoagulanteffekten hos icke-fungerande koagulationsfaktorer, pivka, somfinns i blodet hos patienter som behandlas med vitamin-K antagonister, ärberättigade att nämnas. US 7,767,459 B2 (J. Horsti) möjliggör detta genomatt mäta PT i blodplasma med standardprotokollen hos vilken som helst givenPT-metod, och mäter också detsamma efter en för-spädning av plasmat meden fysiologisk buffert så som 9 g/l NaCl. PT-resultaten, uttryckt antingen isekunder eller INR, plottas sedan mot graden av slutlig spädning av plasmatoch extrapoleras till noll. PT hos plasmat vid slutlig spädning på noll, minskatmed det samma för ett normalplasma, tas som ett mått på pivka-effekten ochanvänds för att korrigera det ursprungliga PT-resultatet.

Nya koagulationstester har tagits fram med syftet att bestämma fleraolika typer av antikoagulanter, särskilt hepariner och DOACs.

Dessa ansträngningar visar på den kliniska betydelsen av att bestämma dessa antikoagulanter. 4 Se Calatzis A, Peletz D, Haas S, Spannagl M, Rudin K, Wilmer M,Prothrombinase-induced Clotting Time Assay for Determination of theAnticoagulant Effects of UFH and LMWH, Fondaparinux, och Thrombinlnhibitors, Am J Clin Pathol 2008; 130: 446-454, och Samama MM, MartinoliJL, LeFlem L, Guinet C, Plu-Bureau G, Depasse F, Assessment of laboratoryassays to measure rivaroxaban - an oral, direct factor Xa inhibitor, ThrombHaemost 2010; 103/4: 815-825.

Relevant bakgrund till den aktuella uppfinningen är skillnaden mellanvätkemiska metoder och torrkemiska metoder. Vätkemi definieras genomblandandet av en volym av provet, blod eller blodplasma i enkoagulationsanalys, och en volym av reagens. Provet späds således till enviss grad i reaktionsblandningen. lnom torrkemi sker inte sådan spädning.Provet blandas, eller kontakteras, med reagenssubstans i torr form och därsker ingen spädning av provet. De flesta tester vid närsjukvärdsenheter ärtorrkemiska tester eftersom dessa ofta kan presenteras i ett lätthanterligtformat, t.ex. en remsa eller ett chip. Användaren behöver typiskt sätt baratillsätta en liten volym av provet. En nackdel med torrkemiska metoder är atttesterna är svärare att modifiera. En dimension av den frihet som erbjudsmed vätkemiska förfaranden, graden av spädning av provet, är inte tillgängligmed torrkemi. Varje omnämnande av en “spädnings”-förändring av ett “reguljärt“ test har vätkemi som en nödvändig förutsättning.

SammanfattningEtt ändamäl är säledes att åstadkomma en analysmetod för att bestämma antikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov, varvidanalysmetoden involverar analyser med minst tvä vätkemiska protrombintid(PT)-metoder, och vilken analysmetod är utformad att kunna tillämpas förbestämning av bäde direkta och indirekta antikoagulanter i blod- ellerblodplasmaprover.

Uppfinningen definieras av det bifogade självständiga patentkravet.Utföringsformer finns i de osjälvständiga kraven, i de bifogade ritningarna och den följande beskrivningen, Enligt en första aspekt tillhandahälls en analysmetod för bestämning avantikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov, *varvid antil-:oaeaašanterna .sem bestänïa är direktverkaawde iiiiaibšterer av aktiverade keadulaâieiisfekterer lie och Ka vilka välis ur en qrupr; bestående av dabšqatren, apixaban rivaroxaban eller hšrudin eller indirekt “verkande inhibšïerer av aktiverade koadaalatšonsfakierei" tia och Xa, viäka välis ur en Grupp bestående av frekiienereicle eller efraktíonerzade haveri-fier. varvid analysmetoden innefattar analyser med minst tvä vätkemiska protrombintid (PT)-metoder.Analysmetoden innefattar stegen att: a) i en första PT-analys med en första PT-metod mäta PT utârvekt i lNR eafnteâiek tideiikrëande erihet eller kßføter clšàrav i en första reaktionsblandning innefattande en första volym blod ellerblodplasma spädd i en första volym av ett vätskereagensuinggefattaggçfg tromboaieaiizw fšbrirïederw mer: keadulatšerxafaktdr' V, b) i en andra PT-analys med en andra PT-metod mäta PT utârggekt i INR, sviii:e1;isk tídsiiknaiicie eriheâ kveter därav i en andra reaktionsblandning innefattande en andra volym av blodet eller blodplasmat spädd i en andravolym av vätskereagenset, varvid koncentrationen av blod eller blodplasma iden andra reaktionsblandningen skiljer sig frän koncentrationen av blod ellerblodplasma i den första reaktionsblandningen. De minst tvä PT-metoderna ärkalibrerade att ge samma eller ungefär samma PT-resultat när de används föratt analysera referensblod eller blodplasma som saknar antikoagulanter avintresse för analysmetoden. Analysmetoden innefattar vidare steget att c)beräkna en skillnad i PT frän mätningarna i steg a) och b), varvid om skillnaden i PT är 1) signifikant, tyder detta pä en närvaro av antikoagulanter i blod- eller °" T H a: Fwmatted: Indent: First une: 0 cm blodplasmaprovet, eller 2) icke-signifikant, tyder detta pä en fränvaro avantikoagulanter i en halt över detekterbar nivä i blod- eller blodplasmaprovet.

Analvsriieieden innefattar vidare d) varvid om ekšiinadeii i Vi' beräknad i sætec: cfi är :sš-:mifikzariâ beräkna: en e-ppssi-ßaiiaci PT tsi-:xå- eiiei' bledplasmaprevet i fränvaro av antilaeaduianter.

Med analyser med minst tvä PT-metoder menas här att analysmetoden kan innefatta analyser med 2, 3, 4, 5 eller upp till 6 PT-metoder. Üfl rninßi- f f” DT rncsf *i raw rn f" firfi ' i n i: rvx ff .finn l-n :firfi1_M1111-_1. 11 _ 11 .. .1M _11 _. _11 . 1 1 u .1 _ _ 1 ...1 M1Mxci-w/ífi n~ wføi* Tixo ÛT -1 mi* fins* i* mv' CL' ill nn ÜT 1 *Ari 111 fi w fn “T_ . 1 . _ , __, 1 . . 11. .n h-»rš fn ('11 in!! 9* -Ai- “i i' “i -' ff? ' 1 -š- (han :in f-:š- ' ^" fi* av 1' :in ~'1 1 1.11. Nk.. 1 1.. 1 1 1.111,1 . 1 1 .. 1 . 1 . 1 1 ..- . 1m1' R när DT :-1 1'r rlcarrwf- in vil lw :nn-am ~n~1|~f~1 m1' Ömarnn ff 'mM .1 1 1 1 1 _1 _ 1.1 1 _. ._1\1,1 _ 11 M 1 .11_1 M -1 V1 .fr/_.(11 n 1 fn r-ifli' inêfl inr in mr FH l'~'f 5 n: »l-'f-.fi *l in din n 1' .UT fnnêwf-lnvn1 _1 M1 1M _.1 v15 f., 1 1.1 1 _._l «..1 .111 1 . _1 1 _ _.. 1HU 1- i -1 mri lzi- n" w fn ^ i* lans i L' -1 mi* ni 1 fn 4 *ff fßnšn :vi Sv; n s f*_ _ _, 1 _»_. _ , _ 1 ._ _1._»_. _.

De två PT-metoderna som används i analysmetoden kan varafundamentalt samma PT-metod, men med någon skillnad som kan uppfattassom icke-signifikant. Sådana skillnader, förutom skillnaden som tillhandahållsav uppfinningen, dvs. skillnad i kvot mellan provvolym och reagensvolym, kanvara skillnader i temperaturen vid vilken mätningarna utförs och skillnader ijonstyrka eller pH hos reaktionsblandningen.

Med våtkemisk PT-metod avses här PT-metoder av Qufclfayp-ellerOwren-typ.

Kvoten mellan volymen blod eller blodplasma och volymen vätskereagens i reaktionsblandningen kan variera beroende på viikesë-typ-av m' .:~ :í: ä: f r: :is i 'avi q.. ~ f. ~ ~' ::~, :i PT *nptf :i :_ "fw :k n; J* koncentrationen i provet av antikoagulanten som ska detekteras. Ett vätskereagens för PT-metodern av Quick-typ innehåller ingetfibrinogen och har därför en inbyggd begränsning i hur mycket provet kanspädas ut. Detta eftersom koagulationen som ska registreras äromvandlingen av provfibrinogen, dispergerad i reaktionsblandningen, tillfibrin. För att denna omvandling ska vara märkbar måste fibrinogenet ireaktionsblandningen vara över någon praktisk gräns, säg över cirka 0,1 g/L.Följaktligen kan inte blod- eller blodplasmaprovet spädas mer än cirka tiogånger i vätskereagens, då blod och blodplasma ofta innehåller fibrinogenkoncentrationer på 1 g/L eller mindre.

\ 'E14 1>'l“'F1-"\rf>f>r~' ffl: i irxvÜxinrfiv-:rw 'n 'vicari ÛT frnui-'xflar f ' (wii iifliz 5 v» f Rear»1 1.. . f .1.1Y;...11 1_J.1.1,1.. 1.. 1 .<1 .;..,1\ 1..,.Fiiåfinf- i' rrflfr n rvxcaiif- 1 iwrvxnn I i ri :inr in: *ån-win rv: P1 1' i rfin1.111.111.. _ _ 1.1 ..._ ._).1 1.1 1.. MJ 1, .År/M _1 _1 3,1.1 1,- 11 ha '1- --l,1:,-11--1«11.- 1,4- ~ 1- -1.- a- - 1-5; 1-0 11 »if-w1 1 ...v 1 1. 1.41 1 1..- 1\,1.....:, 1111 1 1. 111 _ V1 1,1 _ o ~ u Jwazr» _ w ~:;H-ß1 Vri- i-ß- f-'n--ÜVHW1 31 . 1 13 1 '"\1' *Fil- fin war: wrixæíï *z ~ f: i I'í"-':Éx'l' H' fi - wv” J* “Frunai/r fnrr -31 i1.1. 13,1. .. .1 m1... 1.. 1 -.11,1 ...1\ 11M. *etui/ti .. Nblfx.. ...ingen iv *lf ämm: ni làfir. Efter om F” inte ingfri .DTyf-Li-CL» .- aäa. SM. r" 9. n? ma; a n.. ra- ' § tj' . ßya jry a, _-« n-af “n _35: abiedfl-eller-åaleáplaswia-pëeveà- När en PT-metod av Owren-typ används för att utföra analysmetodensätts inga begränsningar av fibrinogen eller FV eftersom vätskereagenset,förutom tromboplastin, också innehåller verksamma nivåer av dessa.Emellertid finns det praktiska begränsningar i slutlig spädning av provet medvätskereagenset som används i PT-metoder av Owren-typ på grund avreaktionshastigheter. Vid mycket små volymer av blod- eller blodplasmaprov ireaktionsblandningen kommer halterna av FVll, FX och Fll vara så låga attkoagulationstiden (PT) blir så lång att detektion blir svårt eller omöjligt. MedDT f» -nf-lnn Fhuwnn é~ f- är f-i n l-'f-»wf INN-t av hlmrí milf-w_ ,_.. _, M, v. flä..- .V1 _. _. _.. ß-s »s :NW »vv-m ~ 1 -f ;. . :an -ßaifm- » f . -1-*2 -az--ai 5.- tw-v .- m.- ...p ...p s., s...v. . cd .c .. m, .. .rn - ' "JT .- ..ut ifl »w Fï- ' i P v- 'xt-ax han :~-" 1~rn'x;-1'l= w e I-'flli-'xr a- Lf i -v-.m-. _.. . HM.. p... ..v .,..g p.. mg-. 'att "W bei; iiigt nigre. :LW *FPWX Följaktligen kan, när uppfinningen praktiseras med PT-metoden av Owren-typ, kvoten mellan volymen blod ellerblodplasma och volymen vätskereagens i reaktionsblandningen varierasmellan 1:2 och 1:200. Ett föredraget kvotområde kan vara mellan 1:5 och1:100 eller mellan 1:10 och 1:50.

I den aktuella analysmetoden analyseras PT i minst tvåreaktionsblandningar som har olika koncentrationer av blod eller blodplasma ireaktionsblandningarna. Skillnaden i koncentration i blod eller blodplasma ireaktionsblandningarna när PT-metoden av Owren-typ används ianalysmetoden kan vara cirka 1,5 till 100 gånger, 1,5 till 50 gånger, 1,5 till 25gånger, 1,5 till 10 gånger eller 1,5 till 5 gånger. En skillnad i koncentration på1,5 till 5 gånger är praktiskt att uppnå och är med den aktuella analysmetodenvisat att möjliggöra bestämning av antikoagulanter i kliniskt relevantakoncentrationsområden. °lfiiiri°d=af: i kfwarer tfatif f: 'a ~ hif i eller hä' dplfisrta irf: 'ti ffrvš näringar* .när .DT me* .fi p. f Q' 'kf ty 1,5 fi!! 5 f *' 1,5 t" f. f .- - :nav .sn-ap. . g. ...,. ., . v Å m3 v-.ßt.. . 31.4. E; , ------------ --Trots skillnaden i blod- eller blodplasmakoncentration i reaktionsblandningen är alla två eller flera olika PT-metoder i analysmetoden kalibrerade för att ge, med relevanta referensblod- ellerreferensblodplasmaprover som saknar antikoagulanten av intresse, sammaeller ungefär samma PT-resultat. PT uttrycks på ett sådant sätt att detta ärmöjligt. Uttryck i vanliga tidsenheter kommer inte att fungera då dessakommer att variera. En reaktionsblandning med en låg koncentration av blodeller blodplasma visar långa PT och vice versa. Ett naturligt sätt att uttryckaPT är i INR (internationaliserad normaliserad kvot), men andra uttryckssätt,olika syntetiska tidsliknande enheter, eller kvoter av sådana, är möjliga.Viktigt är att ett givet relevant prov som saknar antikoagulant/antikoagulanter,analyserat med två eller flera PT-metoder, kommer att ge så nära som möjligtsamma resultat. Ett naturligt sätt attjämföra resultaten från en PT-metod meden annan är med medel-PT-resultat och med CV (Variationskoefficient) förjämförelsen. Kalibreringen är sådan att det genomsnittliga PT-resultatet förflera relevanta prov som saknar antikoagulant så nära som möjligt ska varasamma för alla de två eller flera PT-metoderna, och CV förjämförelsen skavara så lågt som möjligt.

De minst två PT-metoderna kan kalibreras så att PT-metoderna gersamma eller ungefär samma PT-resultat när de används för att analyserareferensblod eller referensblodplasma från en normal individ och spädningarav sådant referensblod eller referensblodplasma. Med blod eller blodplasmafrån en normal individ avses här blod eller blodplasma från en eller fleranormala personer eller en pool av normala individer som inte står undernågon antikoagulationsbehandling.

De minst två PT-metoderna kan kalibreras för att visa samma ellerungefär samma PT-resultat när de används för att analysera blod ellerblodplasma (från en eller flera individer eller pool av prover från olikaindivider) som saknar antikoagulanter av intresse för den aktuellaanalysmetoden och vilket blod eller blodplasma har ett PT-värde högre ännormalt vilket fastställts med en eller flera etablerade PT-metoder.

I steg c) av analysmetoden beräknas en skillnad i PT mellan PT-mätningarna. Termerna ”signifikant” och ”icke-signifikant” ges här deras vedertagna statistiska definition. En signifikant skillnad är då en relativ skillnad pä 2 gånger CV eller mer, och en icke-signifikant skillnad är mindreän 2 gånger CV.

Om skillnaden i PT beräknad i steg c) är signifikant och identiteten avantikoagulanten är känd, kan koncentrationen av antikoagulanten i blod- ellerblodplasmaprovet beräknas.

Om skillnaden i PT beräknad i steg c) är icke-signifikant och identiteten av antikoagulanten är känd, sä kan nivän över vilken antikoagulanten inte Û'if'5Ä)vv, wQ.«(wC.)ft f:2v w.ä Beräkning av antikoagulantkoncentrationen i ett blod- ellerblodplasmaprov kan bara utföras om identiteten pä antikoagulanten är kändeller kan antas.

Om analyser med tvä PT-metoder har utförts kan det vara lämpligt attanvända skillnaden i PT-resultat och PT-resultatet frän analysen med denhögsta provspädningen för denna beräkning. PT-resultatet vid den högstaspädningen kommer att vara närmast PT-resultatet om det inte skulleförekomma nägra antikoagulanter. Genom att använda INR-formalismbetecknas detta tänkta PT-resultat lNRo. lNRo kan erhällas genom attsubtrahera en fraktion av skillnaden, eller subtrahera en funktion avskillnaden, beroende pä om dos-responsen för antikoagulantnivän är linjäreller ej. Eftersom dos-responsen kan bero pä denna lNRo och pätemperaturen vid vilken bestämningarna har gjorts, kan omvandlingen avstorleken pä skillnaden till antikoagulantkoncentration kräva en mängd av säkallade standardkurvor. Alternativt kan en multidimensionell funktionanvändas för att beräkna lNRo och antikoagulantnivän.

Om analyser med mer än tvä PT-metoder har utförts för att praktiseraanalysmetoden enligt uppfinningen kan mer än en skillnad beräknas ochdessa flertalet skillnader, och PT-värdet erhället vid den högstaprovspädningen, kan användas för att beräkna lNRo och de möjliga antikoagulantniväerna beroende pä identiteten av antikoagulanten. Det är också möjligt att favorisera en av skillnaderna som varande mest användbar då den är i ett fördelaktigt område för bestämningarna. \i'~'-' šß 'šßi-.ßw fw -- mat i win' i xchfi f »n ' - nå" iii-i flfxi-'x - ' -i »h. . i i . i i fi.. i. ii..- ii __, lill *i c-i fn i-inlcd DT r w-ini-wß l/wn f-n r"--i-' .- FV- fl-.H ii-iiFåår iini-wíii-inínmnn.ii..i.i .i ..i¿..i-.i..ii ..i i .i o.. Miri/ii iii i, .:! rv *f våfcliømi' »fl i r~ w Ö nfrni *w få? i' »fl n-*lm f w-'i hi* lflßi-:n i. _, D-vi. i at, ä; ._54 f., Fil-iv* i /1 a r 'r> r-nh' fur - 'H 'Fr-'r få '- 'Fí W n" få i' W- r-'iiï 113 ' n izrfrFF wffl'..iii_¿.i . ,\ Mi. AMA iiii i.i.i... i J ¿¿ i .i i._l i. f c-É nnrlrfi' i: v* rcafi "f- nvr' AP ÖT n-ÅÉ-J rnfirwnrw r (Wi n fi 11-1 vi 131-114i . .. ii; .in i . »Mi voi i -_i -igu . vii «.,i . i innui.,\i.,ii igiav. uii1\iu Fïfififi ~'~'i- i n n- ni fll/iflw r~-ri~ är i-f-š AfiF -ii Enl - “lifxfni f~ii~ i-íwl i Kiwi-l nl» l~ h-ii i v... -.ii y i.- i. ii i »i -iii i _._ i. i, i.i_»i _.. i i ii v . i. ..i vi. iaifš- --r\i- - -x ifs-i' H1 f.. i r- f l -v iz--x an "in-inc i* ß '- l-:i ^t -fll iz --\ - x lär?i i i. . i ii vi i., i i »i , i; i . . i. i i iir wii av Fri :war i, r- .i hr«~a-iiir,»«i-.»= Wrrfïr* J. I. ti!! F-”ä frflikfflitpr.PT-mätningarna kan utföras vid en omgivningstemperatur från 17 °C till45 °C, företrädesvis från 18 °C till 30 °C, mer företrädesvis från 21 °C till 30°C och mest företrädesvis från 25 °C till 30 °C.'ar iii/Pär*- =E:ar i; .rr 'a s* 'rn kar Wacíär *rñr = fier* ' *tnella : fia' trrietf denim. fi: .i ii~_»i_» ~_~_ Hi »i -vipp 'iiiviiß-ii-ifiivif __"_~i_i_i ___ :ffxi rj ii híl-iiff i »up sin* H '-~ i' izr» H ' f: -s J-l/ü-i - fi" »h \^ f; fill! ka; *fi-il ac 'v- - \ ns n' I u i... ...i i iviui . i i i .i i .- , i mail ..- t; in F- F» »l fi» l-xi - f' » s ß w: »l-x-»Hi "I *av- ' »al-war ll r Vi i šïr v' »-ii iiMi. .ii i; . .ii 3:; i .ii i, Wii i. , .i i ii . iiiu i. f f .ii rn Älnrw-'rn r w r nn r-i unc-w' ni. nf-ln inf-lira' i' flh' ïnl-wW-“nvrißi . .i i.. i vi .ii ïycipi., i . i i i .i .i\ ... ii . ...._i ii i nlzfwfi .sin 11 :m iaf: Jcffilifff n HP “h \ ø_ wriilzfl lfai wwlíøc _;i' nn Gr ipii' \-5-'l>4~' \ I' “F »LIF s avs-win Uni 'Fv- i/ši- i; "rå- l-ar ar' \ -ii .u . i ..- ii i i »i i i i ii.. i i.. ii i, lin-iii nêii^ ii: nl- v-nllnr- wi-wiil/w f- i-ß w- li-iirw 'rf- ll-M-H *in i: 'E-“íliliciFvi-.ii ii i.. . .. ii _.ii vii .iii _.:_ ,._i i. iii .i _.. i; u» . i vi i .i / ~ Formatted: Indent: First line: 0 cm Den första volymen av vätskereagenset i den första reaktionsblandningen kan*vara lika stor som den andra volymen av vätskereagenset i den andrareaktionsblandningen.

Volymen blod eller blodplasma som späds i vätskereagenset kan varamellan 1 och 20 pl.

Volymen blod eller blodplasma kan tillsättas vätskereagenset med en ände till ände-kapillär.

Kort beskrivning av ritningarnaFig. 1 är en graf som visar apixabaninnehåll mätt med den aktuella analysmetoden i normalblod plasma. 11 Fig. 2 är en förstoring av en del av grafen i Fig. 1.

Fig. 3 är en graf som visar apixabaninnehäll mätt med den aktuellaanalysmetoden in normalblodplasma (primärdata: PT i sekunder)Fig. 4 är en förstoring av en del av grafen i Fig. 3.

Fig. 5 är en graf som visar apixabaninnehäll mätt med den aktuellaanalysmetoden i normalblod.

Fig. 6 är en förstoring aven del av grafen i Fig.5.

Fig. 7 är en graf som visar dabigatraninnehäll mätt med den aktuellaanalysmetoden i normalblod.

Fig. 8 är en förstoring aven del av grafen i Fig. 7.

Fig. 9 är en graf som visar heparininnehäll mätt med den aktuellaanalysmetoden i normalblodplasma.

Fig. 10 är en förstoring av en del av grafen i Fig. 9.

Detal'erad beskrivningExemplen nedan ges, inte för att begränsa omfattningen av uppfinningen, utan för att ytterligare förklara och beskriva uppfinningen, ochför att stimulera utvecklingen inom detta viktiga medicinsk-diagnostiskaområde. Experimentellt arbete utfördes med det kommersiellt tillgängligakoagulationsinstrumentet Simple Simon PT Zafena AB, Borensberg, Sverige,för användning i omgivningsrumstemperatur med funktioner beskrivna i EP 1636 595 B2. Ett instrument eller läsare användes för varje PT-metod.Alternativt kunde samma instrument användas för alla PT-metoder.Omgivningsrumstemperaturen varierade mellan 21°C och 26°C i detlaboratorium där arbetet utfördes. Ett sädant temperaturintervall, lägre meninte avlägset frän 30°C, är att föredra dä temperaturen knappast päverkar PT,därmed förbättras precisionen hos den tillhandahällna PT-analysen. Där tillökar en lägre temperatur analysmetodens känslighet för antikoagulanter iexemplen nedan. Analysmetoden är, emellertid, möjlig att utföra vid enomgivningstemperatur frän 17 till 45°C.PT-reagenset var det som levererades tillsammans med parti N233M av Simple Simon PT-produkten, ett reagens av Owren-typ som säledes innehåller verksamma mängder av tromboplastin, fibrinogen och FV 12 (tromboplastinet med ursprung från kaninhjårna och fibrinogenet och FV frånblodplasma från nötkreatur). Andra reagenser av Owren-typ kunde ocksåanvändas.

Reagenset var i portioner på 200 ul till vilket provet, citrerat blod ellercitrerad plodplasma, tillsattes och blandades. Tillsatsen gjordes med en ändetill ånde-plastkapillår monterad på ena ånden av en tubulår kropp med enförskjutningsmekanism iden andra ånden för att möjliggöra behändigblandning av prov och reagens, sådana Mixxocaps med 10 ul-kapillårertillhandahålls med Simple Simon PT-produkten. För att utföra de beskrivnaexperimenten var en del Mixxocaps utrustade med 20 ul-kapillårer, eller 5 ul-kapillårer istållet för 10 ul-kapillårer med vilka de tillhandahålls av tillverkaren.Alternativt kan standardpipetter eller liknande anvåndas för att blanda blod-eller blodplasmaprovet med våtskereagenset.

Kvoterna mellan volymen blod eller blodplasma och våtskereagensetsom anvåndes i experimenten var 1:11, 1:21 och 1:41. Andra kvoter somligger mellan 1:5 och 1:100 kan anvåndas.

Skillnaden i koncentration av blod eller blodplasma mellan de olikareaktionsblandningarna som anvåndes i analyserna i experimenten varmellan 1,5 till 5 gånger. Skillnaden i koncentration kan emellertid vara cirka1,5 till 100 gånger.

Antikoagulerad normalplasma var NKP-produkten GHl-163 parti10188, MediRox AB, Nyköping, Sverige. Stamlösningar av dabigatran(Pradaxa, Boehringer-lngelheim) och apixaban (Eliquis, Bristol-Myers Squibb)innehållande 100 mg/L var vånliga gåvor från Professor Tomas Lindahl vidavdelningen för experimentell medicin vid Linköpings universitet.Ofraktionerat heparin var Heparin Leo parti A6888B, Leo Pharma A/S, Balleru p, Dan mark.

Exempel 1 Apixaban år en direktverkande inhibitor av aktiverad koagulationsfaktorX (FXa). Det år den aktiva föreningen i den antitrombotiska medicinen Eliquis,Bristol-Myers Squibb. Det år av kliniskt intresse att måta apixaban i blodplasma i området 50 till 1000 ug/L. För att förbereda låmpliga prover 13 tillsattes smä volymer av stamlösningen av apixaban till normalplasma,kontrollplasmat NKP, för att ge normalplasma med apixabaninnehäll iområdet 0 till 1000 ug/L. Dessa normalplasmor med apixaban, inkluderandedet oblandade normalplasmat (NKP) och det samma spätt 1:2 i 9 g/L NaCL(NKP 1:2) analyserades alla med Simple Simon PT med provtillsatser pä 20pL, 10 pL och 5 pL i 200 pL reagens, och därmed med tre PT-metoder medolika provinnehäll i reaktionsblandningarna, ienlighet med uppfinningen. Detvar vidare relevant att alla tre PT-metoder kalibrerades, i enlighet meduppfinningen, för att visa INR 1,000 för oblandat NKP, och INR 1,357 för NKP1:2. Alla primära INR-värden, de resultat som visades päinstrumentskärmarna (ett instrument eller läsare användes för varje PT-metod), var därför omvandlade till korrigerat/kalibrerat INRc med formelna*lNRexp(b) där a och b valdes för att ge NKP och NKP 1:2 deras respektiveönskade värden 1,000 och 1,357. INR-värdet för NKP 1:2 beräknades medLindahl et als formel för INR korresponderande med PT-aktivitet pä 50%(hälften av 100% som likställs med INR 1,000). Databehandlingen visas itabell 1. Ovanför de INR-kalibrerade kolumnerna (INRc) finns det ett övre tal och ett nedre tal, vilka är de ovan nämnda a respektive b.

Tabell 1 Tvä mätningar av apixabaninnehället i normalplasmat visas, en merkänslig mätning, där skillnaden i INRc ges av PT-metoder med 20ul prov och5ul prov, och en mindre känslig mätning, INRc-skillnaden mellan 10ul och med 5ul. Dessa INRc-skillnader plottas mot apixabaninnehället hos 14 normalplasmat såsom visas i grafen i Fig. 1. De kvadratiska symbolerna ärskillnaden i lNRc mellan resultaten med 20ul-metoden och 5ul-metoden, ochde runda symbolerna skillnaden i lNRc mellan 10ul-metoden och Sul-metoden.

Det ska påpekas att det är möjligt att uppskatta INR hosnormalplasmat i frånvaro av antikoagulant, IN Ro. Ovan är detta gjort på ettmindre sofistikerat sätt. En del (56%) av den mindre lNRc-skillnadensubtraheras från IN Rc-resultatet från 5ul-provmetoden, det resultat somuppenbarligen ligger närmast lNRo. Dessa enkla IN Ro-uppskattningar ärförvånansvärt bra, då endast den med högst apixaban-innehåll (1000 ug/L)avviker med mer än en tiondel av en INR-enhet.

Fig. 1 och 2 visar grafer i vilken ökningstakten vid mätningarna avapixabaninnehåll ökar med innehållet. För de som emellertiduppskattar/favoriserar linjära dos-respons-förhållanden, visas sådanaförhållanden här av apixabanmätningar som är under en INR-enhet såsomvisas i grafen i Fig. 2, där Fig. 2 visar en förstoring av en del av grafen i Fig.1.

Databehandlingen som visas i Fig. 1 och 2 skulle kunna varaförbryllande för de som inte är förtrogna med bestämning av INR vidomgivningsrumstemperatur. lstället för ett primärt IN R-resultat som harkorrigerats för temperatureffekt genom beräkningarna medinstrumentet/läsaren, skulle vi istället kunna titta på PT i sekunder. Detta görsför att öka tydligheten vid beskrivningen av uppfinningen trots att ett felintroduceras på grund av att temperaturen inte är strikt konstant undertidsperioden under vilken analysmetoden utfördes (temperaturer varieradefrån 22,3°C till 24,2°C). Trots denna påverkan är resultaten fortfarandetillräckligt bra för att vara övertygande, och förklarar mer tydligt, då detmöjliggör en databehandling som är känd för alla med kunskap inomområdet, det vill säga beräkning av INR genom att dividera PT (i sekunder)med ett normal-PT och upphöja kvoten med en normaliseringskonstantekvivalent med ISI.

I tabell 2 visas resultaten från analysmetoden för normalplasma (NKP) med tillsatt apixaban, men primärdata är här i PT, i sekunder, och data omvandlas till lNRc genom division med PT hos normalplasma och genom attupphöja kvoten med en lSl, övre respektive och undre tal, visas ovanförlNRc-kolumnerna. Som bedömts relevant väljs det övre talet sä att NKP 1:2ska visa lNRc 1,357. vr is) PT (s) Tabell 2 I tabell 2 har data påverkats av en temperaturgradient frän 22,3 °C itoppen till 24,2 °C i botten, vilket emellertid bara stör den generella bilden lite.PT-metoderna som användes, Owren-metoder i rumstemperatur, är merkänsliga för inhibitorer än andra, men det är fortfarande uppenbart att enbarten av de valda PT-metoderna inte skulle ge mycket användbar informationvid lägre niväer av apixaban. Anta att man använder den mestapixabankänsliga av de tre, den med 20 ul prov, och man erhäller ett PT pä35,2 sekunder. Detta är mer än det för en normal, 32,8 sekunder, men berordenna skillnad pä antikoagulanter eller är det bara pä grund av att provet haren liten förhöjd PT (PT hos NKP 1:2 är 36,9 sekunder)? Hur kan man veta?Utövande av uppfinningen genom att utföra tvä eller flera PT-metoder medolika provinnehäll i reaktionsblandningarna ger en tydligare bild, eftersommetoderna är kalibrerade för att visa samma INR om PT varierar av andraorsaker än koagulantinnehäll, skulle det vara liten eller ingen skillnad, ingensignifikant skillnad, mellan lNRc-resultaten. ldet aktuella exemplet är det käntatt proven innehåller antikoagulanten apixaban eftersom detta har tillsatts,och en skillnad i lNRc-resultat uppstär. I exemplet användes tre PT-metoder enligt uppfinningen, och det är tre skillnader i lNRc-resultat som kan 16 undersökas (tvä av dessa tre visas i tabell 2), och för analysen avnormalplasma med 50 ug/L apixaban, indikerar alla tre skillnaderna närvaronav antikoagulant. Om identiteten hos antikoagulanten är känd kan dessinnehåll uppskattas. Ocksä det förväntade lNRc för provet utan inhibitor,lNRo, kan uppskattas. Tabell 2 som visar PT i sekunder klargöruppfinningens användbarhet. Temperaturens inverkan, päverkar bara till enmindre grad de med högst INR-värden, de högst upp överdrivs med ca 10%,annars är data nästan identiskt med de som visas i den tidigare tabellen,inkluderande lNRo-uppskattningarna.

I graferna i Fig. 3 och 4 har data frän tabell 2 förts in. lNRc-skillnadernaär plottade mot apixabaninnehället hos normalplasma (skillnad i lNRc somges av PT-metoder med 20ul prov och 5uL prov (kvadrater), och lNRc-skillnader mellan 10ul och med 5ul (prickar). Grafen i Fig. 4 är en förstoring av en del av grafen i Fig. 3.

Exempel 2 Apixaban frän 0 till 1000 ug/L tillsattes citrerat normalblod. Dessablodprov och ett blodprov med ett INR pä 2,3 analyserades med SimpleSimon PT användande provvolymer pä 20uL, 10uL och 5uL i 200uL reagens.De primära resultaten i INR, och efter relevant kalibrering, lNRc, visas i tabellen nedan, tabell 3: m1: un. í :Humla .-SL*c.å2 _ -. _ 1'c-nb. si am 2.2: É 2.05- .130 i Tabell 3 Här beslutades det, för alla tre PT-metoder, att normalblod utan tillsatsav apixaban skulle visa lNRc 1,00, och ett citrerat blod, som av det centrala sjukhuslaboratoriet rapporterades visa INR 2,3 skulle här visa lNRc 2,30. 17 Precis som i tidigare exempel ses skillnaden i lNRc-resultat som uppskattningav antikoagulantinnehåll, här apixabaninnehåll, och två av tre möjliga sådanaskillnader plottas mot det kända apixabaninnehållet och visas i Fig. 5 och 6.Skillnaden i lNRc som ges av PT-metoderna med 20uL prov och 5uL provvisas som kvadrater och lNRc-skillnad mellan 10uL och med 5 uL somprickar. Grafen i Fig. 6 är en förstoring av en del av grafen i Fig. 5.Dos-respons hos antikoagulationsmetoden enligt uppfinningen visarbra, positiva dos-responsegenskaper över ett kliniskt intressant intervall förapixaban i blod. Dos-responsen är återigen linjär för skillnader i lNRc på mindre än en enhet, se Fig. 6.

Exempel 3Dabigatran är den aktiva föreningen som bildas in vivo när den farmaceutiska beredningen innehållande Dabigatran-etexilat, Pradaxa,Boehringer-lngelheim, administreras per os, dvs. oralt. Kliniskt intressantanivåer är från 50 till 1000 ug/L i blodplasma. Sådana prov togs fram genomatt tillsätta små volymer av stamlösning av dabigatran till normalblodplasma NKP. Resultat och databehandling, liknande den i Exempel 1, visas i tabell 4. 9lziâ (L- ZM. prov ~“ÜÜÜ " '_13 . f.á2lll Tabell 4 När tabell 4jämförs med tabell 1 i Exempel 1, verkar det som att denvisade utföringsformen av uppfinningen är mindre känslig för dabigatran änför apixaban i normalplasma. lntrycket förstärks när man jämför graferna i Fig. 7 och 8 med korresponderande figurer för Exempel 1. 18 De känsligare lNRc-skillnaderna (20uL minus 5uL, visade somkvadrater i Fig. 7 och 8) når i den linjära delen av grafen (se Fig. 8, enförstoring av en del av grafen i Fig. 7) 0,5 vid cirka 200 ug/L av dabigatran,medan det samma nås vid cirka 80 ug/L av apixaban, se Fig. 2, dvs. en merän tvåfaldig skillnad i känslighet. Ändå verkar dabigatrannivåer på 50 ug/Lvara detekterbara.

Uppenbarligen visar analysmetoden för att bestämma antikoagulanterolika känslighet för olika antikoagulanter, och dessutom förväntas olikakänslighet med olika reagens, olika relevanta kalibreringar, och olika temperaturer vid vilka PT-analyserna utförs.

Exempel 4 Heparin är en antikoagulant som är tröttsam att bestämma vidnärvårdscentraler, såsom kirurgiska vårdavdelningar. Mer lämpliga metoderefterfrågas. Användbarheten av den föreliggande uppfinningen exemplifierasnedan. Exemplet är med ofraktionerat heparin, som ofta används somantitrombotiskt agens vid omfattande kirurgi.

Prover förbereddes genom att tillsätta små volymer av en stamlösningav heparin till normalplasma, NKP. Vid den valda kalibreringen sattes NKPoch NKP 1:2 till INR 1,000 respektive INR 1,357, vilket var samma relevantakalibrering som valdes i Exempel 1 och 3 ovan. Experimentella detaljer är desamma som i Exempel 1 och 3 och resultaten och databehandlingen visas itabell 5.

Tabell 5 Genom att plotta mätningen av antikoagulantinnehåll i normalplasmat ges skillnaden i lNRc för två av tre möjliga skillnader mot heparininnehållet i 19 graferna i Fig. 9 och 10. Som ses från tabell 5 och Fig. 9 och 10 kan heparindetekteras vid ca 0,2 U/ml och bestämmas i koncentrationsintervallet 0,2 till 5 U/ml, vilket är av klinisk relevans.

Claims (10)

1. Analysmetod för bestämning av antikoagulanter i ett blod- ellerblodplasmaprov, varvid antikoagulanterna som bestäms är direktverkandeinhibitorer av aktiverade koaguiationsfaktorer lla och Xa, vilka väljs ur engrupp -inifiefa-ttande--bestàende av dabigatran, apixaban, rivaroxaban ellerhirudin, eller indirekt verkande inhibitorer av aktiverade koaguiationsfaktorerlla och Xa, vilka väljs ur en grupp bestàeswde av fraktioneradeeller ofraktionerade hepariner, varvid nämnda analysmetod innefattaranalyser med minst tvä vätkemiska protrombintid (PT)-metoder, varvidanalysmetoden innefattar stegen att: a) i en första PT-analys med en första PT-metod mäta PT uttryckt iINR, syntetisk tidsliknande enhet eller kvoter därav i en förstareaktionsblandning innefattande en första volym blod eller blodplasma spädd ien första volym av ett vätskereagens innefattande trombopiastin. fibrinodenoch koadtælatšonsifaktor \i, b) i en andra PT-analys med en andra PT-metod mäta PT uttryckt i INR, syntetisk tidsliknande enhet eller kvoter därav i en andrareaktionsblandning innefattande en andra volym av nämnda blod ellerblodplasma spädd i en andra volym av nämnda vätskereagens, varvidkoncentrationen av blod eller blodplasma i den andra reaktionsblandningenskiljer sig frän koncentrationen av blod eller blodplasma i den förstareaktionsblandningen; kännetecknad avatt nämnda minst tvä PT-metoder är kalibrerade att: - ge samma eller ungefär samma PT-resultat när de används för attanalysera referensblod eller blodplasma som saknar antikoagulanter avintresse för nämnda analysmetod, och varvid analysmetoden vidare innefattar steget att: c) beräkna en skillnad i PT från mätningarna i steg a) och b), varvid omnämnda skillnad i PT är1) signifikant, tyder detta på en närvaro av antikoagulanter iblod- eller blodplasmaprovet, eller2) icke-signifikant, tyder detta på en frånvaro av antikoagulanteri en halt över detekterbar nivå i blod- eller blodplasmaprovet,:d) varvid om skillnaden i PT beräknad i steg e) är signifikantberäkna en iibbskattad PT för bioci~ eiier båedbiasrriaerovet i frånvaro av eritikoaguiariier,

2. Analysmetod enligt krav 1, varvid om skillnaden i PT beräknad i steg c)är signifikant och identiteten av antikoagulanten är känd, beräknakoncentrationen av antikoagulanten i blod- eller blodplasmaprovet.

3. Analysmetod enligt krav 1, varvid om skillnaden i PT beräknad i steg c)är icke-signifikant och identiteten av antikoagulanten är känd, bestämma nivån över vilken antikoagulanten inte förekommer i nämnda blod- eller blodplasmaprov. beräkna-ae--i--eteg--e)-år-eigeiii-keriff;»beräkna--en--eepsi-aetted--Pï--f-ör--biee~eliereieeeiaeeiaerevet-i-fifånverena-v--an1ti-l~z-ea-ge-lai=iter-; ëåí.utförs vid en omgivningstemperatur från 17 °C till 45 °C, företrädesvis från18 °C till 30 °C, mer företrädesvis från 21 °C till 30 °C och mest företrädesvisfrån 25 °C till 30 °C. Analysmetod enligt något av föregående krav, varvid PT-analyserna Im 21 ål. Analysmetod enligt något av föregående krav, varvid den förstavolymen av vätskereagenset i den första reaktionsblandningen är lika storsom den andra volymen av vätskereagenset i den andrareaktionsblandningen. ëâš. Analysmetod enligt något av föregående krav, varvid volymen blodeller blodplasma som späds i vätskereagenset är mellan 1 och 20 pl. QX.eller blodplasma tillsätts vätskereagenset med en ände till ände-kapillär. Analysmetod enligt något av föregående krav, varvid volymen blod