SE537742C2 - Dextransulfat för cellmobilisering - Google Patents

Abstract

SAMMANDRAG Dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 7000 anvands for att mobilisera celler, sasom stam- och/eller progenitorceller och vita blodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i perifert blod hos en patient. Dextransulfat har en mycket snabb cellmobiliserande effekt som medfor att cellskordande kan starta nastan omedelbart efter dextransulfatsadministrering.

Description

DEXTRANSULFAT FOR CELLMOBILISERING TEKNISKT OMRADE De foreliggande uppfinningama avser allmant mobilisering av celler in i en patients blodbana.

BAKGRUND Stamceller och progenitorceller är omogna celler med formaga att dela sig och utvecklas till att bilda vilken celltyp som heist i det mogna systemet. Hematopoetiska stamceller (HSC) kan producera cellerna i immunsystemet och benmargen. HSC-transplantation (HSCT) anvands for att aterskapa normal hematopoes i en patient for att behandla olika sjukdomar efter kemoterapi eller bestralning. Under de senaste artiondena har HSCT blivit en rutinmassig klinisk behandling for en mangfald av tillstand inklusive multipelt myelom (MM), non-Hodgkins lymfom (NHL) och tillstand som kraver allotransplantation. Trots de uppenbara forbattringarna under de senaste ken är forfarandet fortfarande behaftat med en forhallandevis hog sjuklighet och dodlighet pa grund av komplikationer och aterfall av den underliggande sjukdomen. Det finns ocksa ett standigt behov av forbattrade stamcellskallor, cellskordande forfaranden, konditioneringsregimen och immunosuppressiv behandling. Det finns tva huvudsakliga former av HSCT, antingen allogen — med stamceller som harror fran en kompatibel frisk donator, eller autolog — nar stamceller samlas in tan och sedan ges tillbaka samma patient efter konditioneringsterapi med h6gdosig kemoterapi/radioterapi. I allogen och sarskilt autolog HSCT har perifert blod idag nastan uteslutande ersatt benmarg som kallan for stamceller. Perifert blod som cellkalla är foredraget eftersom det innefattar ett mindre invasivt forfarande f6r donatorn och inympning av transplanterade celler är snabbare jamfOrt med att anvanda benmarg som cellkallan.

Trots de uppenbara forbattringarna under de senaste aren är forfarande fortfarande behaftat med en forhallandevis hog sjuklighet och dodlighet pa grund av transplantationsrelaterade komplikationer (huvudsakligen allogen) och aterfall av den underliggande sjukdomen (huvudsakligen autolog). Det finns saledes ett standigt behov av att forbattra stamcellskallor, cellskordande protokoll, konditioneringsregimer och immunosuppressiv behandling. ldag mobiliseras stamceller till perifert blod via behandling av donatorn med granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF) och cellerna skordas med aferes for efterfoljande transplantation. Efter infusion i mottagarens blodbana vandrar de friska hematopoetiska cellerna till benmargen dar de kan differentiera for att ge nnogna blodceller och aterskapa hematopoes. Nyligen har plerixafor 1 (MOZOBIL TM , AMD3100, 1,1'-[1,4-fenylenbis(metylen)]-bis-1,4,8,11-tetraazacyklotetradekan) godkants i kombination med G-CSF for att Oka mobilisering av progenitorceller i MM- och NHL-patienter.

En vasentlig begransning med kombinationsbehandlingen med G-CSF och plerixafor är den langsamma stamcellsmobiliseringen. Fastan experimentell data i moss indikerar pa en topp i mobiliserade stamceller 1 timma efter plerixaforadministrering (Broxmeye 2005) intraffar den motsvarande toppen i manniska forst runt 9 timmar efter plerixaforadministrering (MozobilTm Product Monograph). Skordandet av mobiliserade stamceller fordrojs saledes till ungefar 11 timmar efter plerixaforadministreringen, vilket medfor langa sjukhusvistelser (MozobilTm Product Monograph). Det är darfor praxis att plerixafor behover 10 administreras dagen fore sjalva cellskordandet.

Sweeney 2000 och Sweeney 2002 undersoker effekterna hos sulfaterade polysackarider, inklusive 10 kDa dextransulfat, i mobiliseringen av stam-/progenitorceller i moss och apa. I moss och apa resulterade dextransulfat i mobilisering av kolonibildande celler (CFC) efter 3 timmar respektive 6 timmar Wan dextransulfatsadministrering. De resultat som presenteras i Sweeney 2000 och Sweeney 2002 verkar saledes antyda att dextransulfat är ungefar tre ganger langsammare jamfort med plerixafor i termer av att mobilisera stam-/progenitorceller.

SAMMANFATTNING Det är ett allmant syfte att tillhandahalla en effektiv mobilisering av malceller in i en patients blodbana.

Det är ett annat allmant syfte att tillhandahalla en hog niva av mobiliserade malceller i en patients blodbana.

Dessa och andra syften uppnas av utforingsformer beskrivna had.

En aspekt av utforingsformerna avser dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 4000 och 7000 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient.

En annan aspekt av ufforingsformerna avser dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 4500 och 7000 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. 2 En ytterligare aspekt av utforingsformerna avser en cellmobiliserande sammansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 4000 och 7000 Da, eller ett farmaceutisk acceptabelt salt darav, och granulocyt-kolonistimulerande faktor (G-CSF). Andra beslaktade aspekter av utforingsformerna avser en cellmobiliserande sammansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 4000 och 7000 Da, eller ett farmaceutisk acceptabelt salt darav, och G-CSF for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient och/eller for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana.

Uppfinnarna har funnit att dextransulfat med ett snavt intervall med avseende pa medelmolekylvikten uppnar en signifikant fordel inom cellmobilisering jamfort med dextransulfatsmolekyler som har mindre eller storre medelmolekylvikter.

Dextransulfatsmolekyler som har en medelmolekylvikt under intervallet for de foreliggande utforingsformerna har inte *on signifikant effekt i termer av mobilisering av progenitor- och/eller stamceller eller vita blodkroppar. Dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt over intervallet for de foreliggande utforingsformerna verkar inte ha nagon additiv effekt och ingen synergistisk effekt da de anvands tillsammans med andra cellmobiliserande foreningar, sasom G-CSF, och verkar ha langsammare mobiliseringseffekt *fort med de foreliggande utforingsformerna.

De foreliggande utforingsformerna tillhandahaller en effektiv cellmobilisering med en ovantad mobiliseringsprofilsomsatterigangcellmobiliseringnastanomedelbartefter dextransulfatsadministrering med en topp i mobiliserade celler redan inom 7,5-30 minuter efter dextransulfatsadministrering i moss och inom 30-120 minuter i manniska. Dextransulfatsmolekyler enligt utforingsformerna kan dessutom synergistiskt kombineras med andra cellmobiliserande foreningar for att ytterligare aka antalet mobiliserade celler.

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Utforingsformerna, tillsammans med ytterligare syften och fordelar med dessa, kan bast forstas genom hanvisning till den efterfoljande beskrivningen last tillsammans med de medfoljande ritningarna, i vilka: Fig. 1 visar leukocytmobilisering inducerad av en s.c. injektion av dextransulfat (LMVV-DS) eller AMD3100 jannfort med kontroll (citronsyramonohydrat (CAM)). Blod togs efter 3 timmar (LMVV-DS) eller 1 timma 3 (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamfOrde LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgruppen (*p<0,05, "p<0,01, ***p<0,001) eller LMW-DS jamfort med AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, tttp<0,001).

Fig. 2 visar effekten av LMW-DS pa blodkoncentrationen av HGF. Djuren behandlades med en s.c. injektion av LMW-DS eller AMD3100. CAM anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 3 timmar (LMW-DS) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS eller AMmed kontrollgruppen (*p<0,05, ***p<0,001) eller LMW-DS jamfort med AM(tttp<0,001).

Fig. 3 visar leukocytmobilisering till perifert blod med en i.v. injektion av LMW-DS och AMD3100. CAM 10 anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (*p<0,05, "p<0,01, ***p<0,001) eller LMW-DS jamfort med AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, tttp<0,001).

Fig. 4A och 4B visar effekten av en i.v. injektion av LMW-DS eller s.c. injektion av AMD3100 pa mobilisering av hematopoetiska kolonibildande celler (CFC) i perifert blod. CAM-buffert (i.v.) anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (*p<0,05, "p<0,01) eller LMW-DS jamfort med AMD3100 (tp<0,05).

Fig. 5 visar en atskillnad i progenitorsubtyp (CFU-GM, CFU-GEMM och BFU-E) hos mobiliserade progenitorceller (CFC) efter en i.v. injektion med LMW-DS eller CAM (kontroll). CAM-buffert anvandes som kontroll och detta varde anvands som ett 0-varde (negativ kontroll). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS med kontrollgrupp (*p<0,05, "p<0,01, ***p<0,001).

Fig. 6 visar leukocytmobilisering inducerad av kombination av G-CSF och LMW-DS eller AMD3100 jamfort med CAM-buffert (medium). Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde G-CSF + LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (G-CSF + CAM) (*p<0,05, "p<0,01, ***p<0,001) eller G-CSF + LMW-DS jamfort med GCSF + AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, tttp<0,001).

Fig. 7A och 7B visar kombinationsbehandling med G-CSF och LMW-DS eller AMD3100 pa mobiliserade progenitorceller i perifert blod. CAM-buffert anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde G-CSF 4 + LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (G-CSF + CAM) (*p<0,05, "p<0,01) eller G-CSF + LMWDS jamfort med G-CSF + AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01).

Fig. 8 är en oversikt over mobilisering av progenitorceller efter enstaka injektioner i moss av 100 mg/kg LMW-DS, G-CSF, G-CSF + LMW-DS, G-CSF + AMD3100 (5 mg/kg) eller CAM (medium). Kombinationsbehandling med G-CSF och LMW-DS okad signifikant antalet CFC jamfort med CAM-buffer( LMW-DS, och G-CSF. Felstaplar visar SEM, n=6-10.

Fig. 9 är en oversikt over mobilisering av lymfocyter efter enstaka injektioner i moss av 100 mg/kg LMW- DS, G-CSF, G-CSF + LMW-DS, G-CSF + AMD3100 (5 mg/kg) eller CAM (medium). LMW-DSadministrering okade lymfocyter i perifert blod jamfort med enkelterapi med G-CSF eller AMD3100 och i kombination med G-CSF var okningen signifikantjamfort med G-CSF + AMD3100. Felstaplar visar SEM, n=6-10.

Fig. 10 visar effekterna av dextransulfat pa vita blodkroppar i perifert blod. Djuren behandlades med en iv. injektion av dextransulfat med olika medelmolekylvikter (DS3 eller DS5) i doser pa 50 mg/kg. Buffrad saltlosning (NaCI) anvandes som mediumkontroll. Vissa djur bedovades med pentanatriumbarbital (PNB) istallet for isofluran for att jamfora effekten av olika anestesimetoder. Felstaplar visar SEM. Student t-test anvandes for att utvardera statistiskt signifikanta skillnader jamfort med kontrollgrupp (*p<0,05, "p<0,01, ***p<0,001).

Fig. 11 visar effektiviteten hos dextransulfat pa mobilisering av hemtopoetiska progenitorceller in i perifert blod. Djuren behandlades med en iv. injektion av DS med olika medelmolekylvikter (DS3 eller DS5) eller med medium (NaCI). Felstaplar visar SEM. Student t-test anvandes for att utvardera statistiskt signifikanta skillnader jamfort med kontrollgrupp (*p<0,05).

Fig. 12 visar effekten hos dextransulfat pa okningen av HGF-nivaer i perifert blod. Djur behandlades med en i.v. injektion av dextransulfat med olika medelmolekylvikter (DS3 eller DS5) eller med medium (NaCI). Felstaplar visar SEM. Student t-test anvandes for att utvardera statistiskt signifikanta skillnader jamfort med kontrollgrupp (***p<0,001).

DETALJERAD BESKRIVNING De foreliggande utforingsformerna avser allmant cellmobilisering i djur, foretradesvis daggdjur och sarskilt manniska. Utforingsformerna avser sarskilt mobilisering av stam- eller progenitorceller och/eller vissa vita blodkroppar som kan anyandas i celltransplantation, inklusive hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT).

Utforingsformerna är baserade pa ovantade karakteristiker hos dextransulfat avseende mobilisering av celler i en patient, foretradesvis en daggdjurspatient och annu hellre manniskopatient.

En aspekt av utforingsformerna avser darfor dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller, typiskt sett fran benmargen (BM), in i perifert blod (PB) hos en patient, 10 foretradesvis en daggdjurspatient och annu hellre en manniskopatient.

I det perifera blodet är stam- och eller/progenitorcellerna tillgangliga for skordande och kan darigenom anvandas i celltransplantation, inklusive HSCT. Alternativt sett kan mobiliseringen av stam- och/eller progenitorcellerna in i det perifera blodet uppna fordelaktiga effekter utan att skordas fran patienten, till exempel cirkulerar in vivo for vavnads- eller organlakning, sasom lakning av hjartmuskel.

En utforingsform av denna aspekt avser darfor en metod f6r att mobilisera progenitor- och/eller stamceller, foretradesvis fran benmargen, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient. Metoden innefattar administrering av en effektiv mangd dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, till patienten. En annan utforingsform av denna aspekt avser anyandningen av dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, for tillverkningen av ett lakemedel for mobilisering av progenitor- och/eller stamceller, foretradesvis fran benmargen, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient.

Uttrycket "progenitorceller" avser hari vissa celler som kan bilda differentierade hematopoetiska eller myeloida celler som svar pa stimuli. Progenitorceller i ett prov kan identifieras via deras formaga att bilda kolonibildande enheter (CFU) av olika typer. Sadana CFU-typer innefattar bland annat CFU-granulocyt, -makrofag (CFU-GM), CFU-granulocyt, -erytrocyt, -monocyt, -megakarocyt (CFU-GEMM), BFU-E ("burst forming unit"-erytrocyt). "Stamcell" är mindre differentierade former av progenitorceller och uttrycker typiskt sett men inte alltid cellyteglykoproteinet CD34 i manniska.

Experimentell data sasom presenteras had visar att det finns en undre grans med avseende pa dextransulfats medelmolekylvikt for att ha nagon cellmobiliserande effekt, se Fig. 10 och 11. 6 Dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt under de fbreliggande utfbringsformernas intervall uppvisar saledes inte flagon positiv effekt med avseende pa mobilisering av progenitor- och/eller stamceller, eller inte heller med avseende pa mobilisering av vita blodkroppar, sarskilt lymfocyter, eller inducering av hepatocyttillvaxtfaktor (HGF), se Fig. 10-12.

Dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt over de foreliggande utforingsformernas intervall har ocksa samre effekt med avseende pa cellmobilisering.

Sweeney 2000 och Sweeney 2002 indikerar att 10 kDa dextransulfat var ungefar tre ganger langsammare an plerixafor i moss i termer av mobilisering av progenitor-/stamceller med en skordetid foreslagen till att vara 3 timmar efter dextransulfatsadministrering jamfort med skordande efter 1 timma efter plerixaforadministrering (Broxmeyer 2005). Experimentell data sasom presenteras hari indikerar att dextransulfat med en medelmolekylvikt enligt utforingsformerna orsakar nastan omedelbart en okning i antalet mobiliserade kolonibildande celler (CFC) och att toppen sker 7,5-30 minuter efter dextransulfatsadministrering i moss jamfort med 1 timma for plerixafor och 3 timmar for 10 kDa dextransulfat. Pa motsvarande sett kommer toppen i CFC-mobilisering i manniskopatienter att ske ungefar 0,5 till 3 timmar, sasom ungefar 1 timma efter dextransulfatsadministrering. CFC-mobilisering med dextransulfat verkar saledes vara ungefar 6-9 ganger langsammare i manniska an i moss. Dena är liknande for plerixafor dar toppen i CFC-mobilisering sker ungefar 9 timmar efter plerixaforadministrering i manniska.

Dextransulfat enligt utforingsformerna verkar saledes ha signifikant snabbare cellmobiliserande effekt an vad som indikeras i den kanda tekniken for storre dextransulfatsmolekyler, se Sweeney 2000 och Sweeney 2002.

Han 1998 undersokte dextransulfat med en molekylvikt pa 10 kDa och G-CSF med avseende pa mobilisering av vita blodkroppar (WBC), mononukleara celler (MNC) och CFU-GM i moss. Forfattarna diskuterade att topparna i perifert WBC, MNC och CFU-GM sker 2-5 timmar efter iv. injektion av 15-30 mg dextransulfat 10 kDa i moss. Den omnamnda tidsperioden är liknande den pa tre timmar som foreslagits av Sweeney 2000 och Sweeney 2002.

Han 1998 jamforde vidare nivaerna av perifert WBC, MNC och CFU-GM efter administrering av 10 pg/kg G-CSF givet varje dag under fern dagar (G-CSF-grupp), 15 mg/kg dextransulfat 10 kDa givet en gang (DS-grupp) och 10 pg/kg G-CSF givet vale dag under fem dagar och 15 mg/kg dextransulfat 10 kDa 7 givet en gang pa dag 5 (DS+GCSF-grupp). Det fanns ingen signifikant skillnad i nagon av de tre grupperna med avseende pa WBC och MNC. DS-gruppen hade en CFU-GM-niva pa 12,9±1,6 kolonier med > 50 celler, G-CSF-gruppen hade en CFU-GM-niva pa 17,1±1,9 kolonier medan den kombinerade behandlingen med DS och G-CSF (DS+GCSF-grupp) hade en CFU-GM-niva pa 19,8±2,3, dvs. nagot over den niva som uppnaddes med enbart G-CSF-behandling.

Han 1998 indikerade saledes att dextransulfat med en medelmolekylvikt pa 10 kDa resulterade i en mobiliseringstopp efter 2-5 timmar fran tiden for administrering i moss och att kombinationen av detta dextransulfat med G-CSF knappast hade flagon ytterligare effekt over enbart G-CSF-behandling i moss.

Dextransulfatet med en medelmolekylvikt enligt utforingsformerna har en signifikant annorlunda administreringsprofil och effekt jamfort med vad som visas for dextransulfat 10 kDa i Han 1998. For det forsta verkar dextransulfatet enligt utforingsformerna ha signifikant snabbare cellmobiliserande effekt an vad som indikeras i den kanda tekniken for storm dextransulfatsmolekyler. For det andra har dextransulfatet enligt utforingsformerna en synergistisk effekt med avseende pa cellmobilisering da det kombineras med G-CSF. Kombinationen av dextransulfat och G-CSF-behandling sasom visas hari resulterade saledes i en okning i mobiliserade progenitorceller och lymfocyter i perifert blod som var storre an den kombinerade effekten med att endast anvanda dextransulfat eller endast anvanda G-CSF, se Fig. 6-9. Dextransulfat med en medelmolekylvikt inom de foreliggande uppfinningarnas intervall har saledes en sann synergistisk effekt da det kombineras med G-CSF.

Det utvalda intervallet med avseende pa medelmolekylvikt hos dextransulfatet tillhandahaller som en foljd en signifikant effektivare cellmobilisering jamfort med dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt som ligger utanfor de foreliggande utforingsformernas intervall.

Experimentell data sasom presenteras hari visar att dextransulfat enligt ufforingsformerna inte bara mobiliserar ungefar samma antal progenitor- och stamceller i termer av totalt antal CFC som plerixafor, utan dextransulfatsadministrering kan synergistiskt kombineras med andra substanser, sasom G-CSF, for att uppna signifikant hogre nivaer av totalt antal CFC jamfort med motsvarande kombinationer av plerixafor och G-CSF. Dextransulfats CFC-mobiliseringsprofil skiljer sig vidare fran CFC-mobiliseringen med plerixafor. Dextransulfat enligt utforingsformerna kan sarskilt uppna hogre nivaer av CFU-GEMM och BFU-E CFC-typer jamfort med plerixafor. 8 Den mycket snabba cellmobilisering som initieras av administrering med dextransulfat enligt utforingsformerna mojliggor en fundamentalt annorlunda administrering-kontra-effekt-profil jamfort med plerixafor pa grund av den mycket snabbare CFC-mobiliseringen. I denna aspekt sá koordineras och synkroneras saledes administreringen av dextransulfatet enligt ufforingsformerna foretradesvis med 5 avseende pa den onskade tidpunkten for att uppna en topp i mobiliserad CFC. Till exempel, om de mobiliserade CFC ska skordas fran perifert blod i en patient sa koordineras och synkroneras foretradesvis administreringen av dextransulfat till all ske fran ungefar 0 timmar till ungefar 8 timmar, annu hellre fran ungefar 0 timmar till ungefar 6 timmar innan starten av CFC-skordandet for en manniskopatient. Dextransulfatsadministreringen sker annu hellre fran ungefar 0 timmar till ungefar 4 10 timmar innan starten av CFC-skordandet.

Skordande av CFC-celler efter en kombinerad behandling med plerixafor och G-CSF sker under ungefar 4 timmar per skordningstillfalle och koordineras darfor fran 9 timmar upp till 13 timmar efter plerixaforadministrering.

Ett motsvarande skordningsprotokoll enligt ufforingsformerna skulle dá kunna uffora ett 4 timmars CFCskordande fran 0 upp till 4 timmar, fran 0,25 upp till 4,25 timmar, fran 0,5 upp till 4,5, ft* 0,75 upp till 4,75 timmar, fran 1 upp till 5 timmar, fran 1,25 upp till 5,25 timmar, fran 1,5 upp till 5,5 timmar, fran 1,75 upp till 5,75 timmar, fran 2 upp till 6 timmar, ft* 2,25 upp till 6,25 timmar, fran 2,5 upp till 6,5 timmar, fran 2,75 upp till 6,75 timmar eller fran 3 upp till 7 timmar efter dextransulfatsadministrering. I en sarskild ufforingsform är saledes skordandet av stam- och/eller progenitorceller med dextransulfatsinducerad cellmobilisering fordelaktigt redan avslutat innan CFC-skOrdandet ens har startats med anvandning av plerixafor som mobiliseringsinducerade amne.

Preliminara humandata indikerar att CFC-mobilisering med dextransulfat toppar vid ungefar 1 timma efter dextransulfatsadministrering och borjar klinga av ungefar 6 timmar efter dextransulfatsadministrering och är till baka till normala nivaer atminstone ungefar 24 timmar efter dextransulfatsadministrering.

Dextransulfatsadministrering leder saledes till en mycket snabbare och effektivare mobilisering av celler jamfort med plerixafor och darfor kommer antalet aferesdagar som kravs for att fa fram den onskade mangden mobiliserade celler att minska. For patienter med otillrackligt cellantal vid schemalagt aferesbesok siktar behandling med dextransulfat pa att sakra omedelbar mobilisering av celler och aferesen kan startas sasom planerat. Det kommer att underlatta planeringen i aferescentren och minska antalet patienter som maste genomga flera mobiliseringsforfaranden. 9 Studier utforda med dextransulfat s6som presenterade hari har dokumenterat en omedelbar mobilisering av progenitorceller. Antalet CFC toppar saledes redan 7,5 minuter efter administrering med en langlivad topp som bestar i atminstone 1 timma i moss. Mobiliseringen av HSC med anvandning av dextransulfat verkar vara snabbare jamfort med den nuvarande mobiliseringsregimen som innefattar plerixaforbehandling, som har en distinkt topp vid 1 timma i moss.

En snabb, effektiv och forutsagbar mobilisering av HSC skulle minska sjukhusvistelsetiden for patienten. Detta skulle aven gynna aferescentren pa grund av farre aferesmoten och lagre antal installda sessioner 1(:) pa grund av for laga cellantal.

En mojlig mekanism bakom de snabbare mobiliseringseffekterna hos dextransulfat som skiljer sig jamfort med plerixafor presenteras nedan. Kortiattat sa binder dextransulfat till den heparinbindande domanen hos BM-stromala celler, vilka frislapper SD F-1 ("stromal cell-derived factor 1") och HSC in i perifert blod.

Plerixafor paverkar a andra sidan SDF-1-gradienten genom att verka som en SDF-1-antagonist vilket leder till okade mangder HSC i perifert blod. Skillnaden i tid att bryta SDF-1-gradienten antyder olika mekanismer for de mobiliserande substanserna. Den foreslagna mekanismen for dextransulfat kan forklaras genom bindning till en specifik sekvens av positivt laddade aminosyror benamnd den heparinbindande domanen p6 den annars negativt laddade heparansulfaten (HS). Detta medfor en frislappning av SDF-1 till cirkulation och forhOjd serumkoncentration (Sweeney 2002 och Pablos 2003).

De exakta mekanismerna som styr malsokning och mobilisering av HSC till och Iran benmargen är inte kanda men sarskilt cytokinen SDF-1 och dess receptor CXCR4 spelar en avgoranderoll. HSC uttrycker CXCR4 och SDF-1 produceras av benmargen. SDF-1 forankras i proteoglykaner (PG) pa membranet hos stromala celler, endotelceller och den extracellulara matrisen.

Dextransulfat skit- SDF-1-gradienten med okade nivaer i blod och minskade nivaer i BM bade i moss och icke-humana primater. okningen i SDF-1 är troligen pa grund av konkurrensundantrangandet med dextransulfat fran heparansulfatproteoglykaner (HSPG) som isolerar kemokinen pa endotelcellsytor eller extracellular matris i BM och andra vavnader. I apa resulterade en injektion med dextransulfat i maximala nivaer av perifert SDF-1 efter 6 timmar som atergick till basniva efter 24 timmar (Sweeney 2002). Plerixafor binder a andra sidan till receptorerna for SDF-1, CXCR4 och CXCR7 (Kalatskaya 2009) och star saledes bindningen till SDF-1 i benmargens stroma och frisatter cellerna. Plerixafor paverkar denna SDF-1-gradient genom att verka som en SDF-1-antagonist vilket leder till okade mangder HSC i perifert blod (Broxmeyer 2005 och Lapidot 2003).

Forutom att uppna en signifikant snabbare cellmobilisering jamfort med plerixafor uppnar 5 dextransulfatsadministrering ocksa andra stam- eller progenitorcellsmobiliseringsprofiler. Dextransulfat tillhandahaller sarskilt hogre nivaer av CFC-typerna BFU-E och CFU-GEMM jamfort med plerixafor. Denna cellmobiliseringsprofil enligt utforingsformerna kan ha flera kliniska fordelar. Till exempel har det faststallts att antalet tillforda CFU-GEMM till patienten korrelerar med tiden for aterfaende av neutrofiler och blodplattar (Roodman 1987). Transplantation av HSC med okat CFU-GEMM-innehall skulle saledes 10 minska den kritiska tidsperioden med forhojd risk for infektioner hos patienten och skulle kunna vara till star fordel for patienten. Aven okade nivaer av BFU-E i de mobiliserade cellerna kommer att vara fordelaktig i celltransplantationer. Det har visats att antalet tillforda BFU-E-celler under celltransplantationen forbattrade aterfaende av neutrofiler och blodplattar samt hematopoetiskt aterstallande (Cooper 1997 och Hassan 1997).

Stam- och/eller progenitorceller mobiliserade med dextransulfatsadministrering enligt denna aspekt kan skordas enligt tekniker valkanda inom teknikomradet, sasom aferes. Kortfattat kopplas intravenosa slangar till patienten for att kontinuerlig cirkulera patientens blod genom en aferesmaskin och sedan tillbaka till patienten. Aferesmaskinen separerar da olika typer av blod- och immunceller.

De skordade stam- och/eller progenitorcellerna kan anvanda i allogen eller autolog transplantation, sasom HSCT.

De skordade stam- och/eller progenitorcellerna kan dá tillforas en donator som antingen är patienten sjalv (autolog transplantation) eller en annan patient (allogen transplantation). ldag finns det flera sjukdomar och tillstand dar stam- och/eller progenitorcelltransplantation är en terapi. Till exempel har allogen transplantation foreslagits for att behandla olika tumorer och cancersjukdomar inklusive akut myeloid leukemi (AML), akut lymfoblastisk leukemi (ALL), kronisk myeloid leukemi (CML), myelodyplastiska syndrom (MDS), myeloproliferativa sjukdomar (MPD), non-Hodgkins lymfom (NHL), Hodgkins sjukdom (HD), kronisk lymfocytisk leukemi (CLL), multipelt myelom (MM) och juventil kronisk myeloid leukemi. Pa motsvarande sett har autolog transplantation foreslagits for foljande cancersjukdomar MM, NHL, HD, AML, neuroblastom, aggstockscancer och germinalcellstumorer. Andra cancersjukdomar innefattar harcellsleukemi (HCL), akut promyelocytisk leukemi (APL) och andra myelom, leukemier och lymfom. 11 Aven om HSCT är en terapi som framst anvands for hematologisk och lymfoid cancer är det ett alternativ i en mangfald av andra forvarvade och medfodda tillstand inklusive aplastisk anemi, paroxysmal nattlig hemoglobinuri, Fanconis anemi, Blackfan-Diamond anemi, Thalassemi major, sicklecellanemi, war kombinerad immunobrist, Wiskott-Aldrich syndrom, medfodda metabola sjukdomar, autoimmuna sjukdomar och amyloidos (CopeIan 2006).

Dessutom eftersom dextransulfat har en okad mobiliseringseffekt pa blodceller och utfor dess effekter genom en annan mekanism an for narvarande anvant mobiliseringsamne, plerixafor, sá kan behandling 10 med dextransulfat vara anvandbart i alla HSCT-patienter saval som i icke-svarande patienter som inte uppnar tillracklig mobilisering av stamceller med nuvarande terapier.

Dextransulfatsadministrering orsakar inte bara en mycket snabb och signifikant okning i mobilisering av progenitor- och/eller, stamceller, typiskt sett fran benmargen, in i perifert blod hos en patient. Dextransulfat enligt utforingsformerna har dessutom positiva effekter pa flera blodparametrar omedelbart efter administrering och inducerar en snabb mobilisering av vita blodkroppar (WBC). WBC-mobilisering kan vara en sarskilt fordelaktig aspekt hos utforingsformerna eftersom de mobiliserade WBC kan reducera risken for infektion och den kritiska tiden efter en utford HSCT.

En mycket intressant karakteristik hos dextransulfatet enligt utforingsformerna är att dextransulfatet sarskilt orsakar en hog mobilisering av lymfocyter, signifikant hogre jamfort med plerixafor.

En annan aspekt av utforingsformerna avser darfor dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana, foretradesvis en daggdjurspatient och annu hellre en manniskopatient.

En utforingsform av denna aspekt avser en metod for mobilisering av lymfocyter in i perifert blod hos en patient, sarskilt manniskopatient. Metoden innefattar administrering av en effekt mangd av dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, till patienten. En annan utforingsform av denna aspekt avser anvandningen av dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for tillverkningen av ett lakemedel for mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. 12 Dextransulfatet enligt utforingsformerna kan anvandas enligt denna aspekt for att mobilisera lymfocyter forutom progenitor- och/eller stamceller fran en patient. Dextransulfatet skulle emellertid alternativt sett kunna anvandas huvudsakligen for mobilisering av lymfocyter som malceller som ska anvandas i olika tillampningar eller terapier dar lymfocyter behovs.

Eventuell skordande av lymfocyter och administreringen av dextransulfatet koordineras och synkroneras foretradesvis sasom tidigare beskrivit had for stam- och/eller progenitorcellmobilisering. Dextransulfatadministrering koordineras och synkroneras saledes foretradesvis till att ske fran ungefar 0 till ungefar 8 timmar, foretradesvis fran ungefar 0 till ungefar 6 timmar och 5nnu hellre fran ungefar 0 timmar till ungefar 4 timmar innan starten av lymfocytskordande for en manniskopatient. De tidigare visade foredragna skordningsintervallen relativt dextransulfatsadministrering kan med fordel aven anvandas for lymfocytskordning.

Hogre tillford lymfocytmangd har flera fordelar i samband med HSCT. Till exempel kommer okad mangd lymfocyter tillforda en patient tillsammans med tidigare skordade stam- och/eller progenitorceller att minska risken for infektioner och forbattra helhetsresultatet. Hogre tillford lymfocytdos predikterar hogre lymfocytaterstallande, vilket i sin fur predikterar overlagsen overlevnad efter autolog hemtopoetisk stamcellstransplantation for MM- och NHL-patienter. Okad lymfocytdos omsatts till absolut lymfocytantal vid dag 15 (ACL-15). Man har kommit tram till att total medianoverlevnad och overlevnad fri ft* NHLutbredning är signifikant battre for NHL-patienter som mottar 0,68x9 lymfocyter/kg jamfort med de som mottar 0,34x9 lymfocyter/kg, och liknande fbrdelar med hOgre lymfocytutbyte i MM-patienter (Porrata 2004b).

I kliniska forsoka ufforda med plerixafor upplevde mellan 20-25 % av HSCT-patienterna infektioner efter transplantation (CHMP Assessment Report Mozobil (plerixafor) Procesure No. EMEA/H/C/001030). Samhallsforvarvade respiratoriska virus har erkants som en mojlig orsak till allvarliga infektioner, sarskilt i patienter som genomgar HSCT. HSCT-mottagare med symptomatisk ovre respiratorisk infektion har dessutom en hogre tendens att utvecklas till allvarlig lunginflammation med en dodlighet sa hog som 50- 70 % (Chemaly 2006). Dextransulfat enligt ufforingsformerna kan minska dessa risker for infektioner pa grund av de okade nivaerna av lymfocyter.

Mekanismen for forbattrad total overlevnad foreslas vara snabbare inympning och ateruppbyggnad av lymfocyter, vilket resulterar i en starkare transplantat-mot-turnor-effekt (GVT-effekt), vilket minskar 13 kvarvarande cancer (Porrata 2004a, 2004b, 2009 och Hiwase 2008). Sasom presenteras i de experimentella resultaten atminstone dubblerar en administration av dextransulfat frisattningen av lymfocyter i enkelterapi jamfort med en administration av G-CSF eller plerixafor. Dextransulfat i kombination med G-CSF är ungefar tva ganger sa effektivt i att mobilisera lymfocyter jamfort med kombinationen av G-CSF och plerixafor.

De inducerade effekterna pa WBC och sarskilt lymfocyter skulle kunna beror pa den underliggande mekanismen att dextransulfat har visats stora SDF-1-gradienten med okade nivaer av celler i blod och minska nivaer i BM i bade moss och icke-humana primater (Sweeney 2002). Okningen i SDF-1 är troligen pa grund av konkurrensundantrangandet med dextransulfat fran heparansulfatproeoglykaner som isolerar kemokinen pa endotelcellsytor eller extracellular matris i BM och andra vavnader. En annan mojlig mekanisk ar att dextransulfat interfererar med leukocyter via cell-till-cell-interaktioner, t.ex. leukocytrullning och selektinformedlad leukocytadhesion.

Dextransulfat enligt utforingsformerna kan darfor anvandas i samband med donatorlymfocytinfusion (DLI). DLI är en adoptiv immunoterapi som i bland anvands efter HSCT. I DLI tillfors lymfocyter fran den ursprungliga stamcellsdonatorn efter stam- och/eller progenitorstamcellstransplantation for att forstarka ett anti-turnorimmunsvar eller sakerstalla all donatorstamcellerna forblir inympade. Malet med denna terapi är att inducera en minskning av patientens cancer via GVT-effekten. Donatorlymfocyterna kan darigenom attackera och kontrollera tillvaxten av restcancerceller.

Dextransulfatet enligt utforingsformerna anvands med fordel i kombination med G-CSF for att behandla patienter och forbattra utbytet av mobiliserade celler. Sasom visas i experimentavsnittet akar den kombinerade behandlingen med dextransulfat och G-SCF synergistiskt antalet mobiliserade celler, bade stam- och progenitorceller och olika WBC, jamfort med enbart dextransulfat. Dessutom leder kombinationen av dextransulfat och G-CSF till signifikant hogre nivaer av mobiliserade celler jamfort med kombinationen av plerixafor och G-CSF. Denna synergistiska effekt sasom ses mellan plerixafor och GCSF verkar vara annu tydligare for kombinationen av dextransulfat och G-CSF. Detta var ovantat sarskilt i sken av Han 1998 dar kombinationen av dextransulfat 10 kDa och G-CSF gay vasentligen samma resultat som att enbart anvanda G-CSF.

En ytterligare aspekt avser darfor en cellmobiliserande sammansattning som innefattar dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, och G-CSF. Beslaktade utforingsformer av denna aspekt definierar den kombinerade 14 anyandningen av dextransulfat enligt utforingsformerna och G-CSF for mobilisering av celler, sarskilt stam- och/eller progenitorceller och/eller WBC och sarskilt lymfocyter i en patient, foretradesvis en manniskopatient.

Den cellmobiliserande sammansattningen innefattar foretradesvis en barare, sasom ett vattenhaltigt losningsmedel.

En ufforingsform av denna aspekt avser darfor en metod for mobilisering av celler, sasom stam- och/eller progenitorceller och/eller lymfocyter, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis manniskopatient.

Metoden innefattar administrering av en effektiv mangd dextransulfat enligt ufforingsformerna och en effektiv mangd G-CSF eller administrering av den ovan omnamnda cellmobiliserande sammansattningen till patienten. En annan utforingsform av denna aspekt definierar en kombination av dextransulfat enligt ufforingsformerna och G-CSF eller den ovan omnamnda cellmobiliserande sammansattningen for anyandning i mobilisering av celler, foretradesvis stam- och/eller progenitorceller och/eller lymfocyter, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient. En ytterligare ufforingsform av denna aspekt avser anvandningen av en kombination av dextransulfat enligt utforingsformerna och G-CSF eller den ovan omnamnda cellmobiliserande sammansattningen f6r tillverkningen av ett lakemedel f6r mobilisering av celler, foretradesvis stam- och/eller progenitorceller och/eller lymfocyter, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient.

G-CSF som anyands enligt denna aspekt kan vara fran vilken lamplig G-CSF-kalla som heist inklusive rekombinant eller renat G-CSF. Icke-begransade exempel innefattar NEUPOGEN® (filgrastim som är en G-CSF-analog), NEUTROGIN® (lenograstim som är ett rekombinant G-CSF), NEULASTA® (pegfilgrastim som ar en polyetylenglykolform av filgrastim). Biologiskt aktiva fragment, variant, derivat eller fusionsmolekyler kan alternativt sett eller dessutom anvandas som G-CSF-kalla om de har formagan att mobilisera celler liknande naturligt G-CSF.

For narvarande administreras G-CSF (10 pg/kg) till patienten vale morgon i 4 dagar innan aferes och darefter pa varje aferesmorgon. Detta administreringsprotokoll kan anvandas aven i samband med dextransulfat enligt ufforingsformerna. G-CSF administreras saledes foretradesvis till patienten vid en eller nagra tillfallen innan dextransulfatsadministrering och cellskordande, sasom en gang eller tva ganger 1-7 dagar, sasom en gang eller tva ganger 2-4 dagar innan aferes och foretradesvis dessutom pa morgonen pa aferesdagen.

Kombinationen av dextransulfat med G-CSF okar synergistiskt antalet CFC i perifert blod upp till 18000 CFC/ml blod, dvs. mer an 100-faldigt over kontroll och till synes effektivare jamfort med plerixafor i kombination med G-CSF. I vissa patienter mobiliserar behandling med G-CSF i kombination med plerixafor inte tillrackliga mangder HSC for en efterfoljande transplantation. Att kombinera G-CSF med dextransulfat kan forbattra utbytet av HSC i dessa refraktarpatienter och mojliggora den planerade transplantationen. Den synergistiska okningen i antalet CFC i perifert blod med dextransulfat och G-CSF kommer aft vara fordelaktig for patienter som genomgar autolog stamcellstransplantation dar det är problematiskt att erhalla berattigade cellantal fran patienten for att fortsatta med den efterfoljande transplantationen.

I allmanhet maste ett tillrackligt antal HSC erhallas fran donatorn i aferesforfarandet for en efterfoljande lyckad transplantation. I den kliniska situationen mats antalet HSC-celler som mangden CD34+-celler i aferesprodukten. Denna markor har visat vara en konsekvent och stark prediktor pa inympning after kemoterapi. Populationen av CD34+-celler ar emellertid heterogen och CD34+-markoren är endast en surrogatmarkor for HSC-funktion. I allmanhet är <2,5x6CD34+-celler per kilo otillrackligt for HSCT och transplantation av >20x6 CD34+-celler kan orsaka inympningssyndrom som är en toxicitet av stamcellstransplantation som sker ovantad och kan ibland vara dodlig. MeIlan dessa antal finns det dokumentation som stodjer att ju fler cellar som aterfas desto battre transplantationsutfall eftersom inympning är snabbare, sjukhusvistelsetiden reduceras och darigenom minskas kostnader.

For att lyckas med hematopoetisk stamcellstransplantation, dvs. sakra effektiv och snabb inympning for att undvika infektioner och forhindra sjukdomsaterfall, är det darfor viktigt att mobilisera tillrackliga mangder stamceller i perifert blod.

Oavsett om det är autolog och allogen transplantation är det huvudsakliga malet att uppna lyckad inympning. Att misslyckas med detta kommer att resultera i en kritisk situation som kan leda till en patient utan hematologiska och immunologiska system. For att undvika en sadan livshotande situation maste det sakerstallas att transplantatet innehaller tillrackligt med cellar for att sakerstalla lyckad inympning. Om cellantalet är for lagt maste den myeloablativa terapin skjutas fram och vardefull tid forloras. Aven efter den myeloablativa terapin kan transplantationen med hogre antal progenitorceller leda till snabbare inympning, vilket kan resultera i ett minskat behov av sjukhusvistelse och stodjande yard. Sasom omnamnts är standardmetoden for att Oka antalet cirkulerande hematopoetiska progenitorceller i blodet att behandla donatorn med G-CSF under flera dagar. Aven med nuvarande behandling (plerixafor och G-CSF) uppnar inte alla patienter tillrackligt cellantal for aft berattiga transplantation. Efter 16 transplantationen finns det dessutom en risk for infektion och sjukdomsaterfall. For dessa patienter har dextransulfat potential att fungera som undsattande terapi eller som ett alternativ till plerixafor och GCSF.

Forutom dess effekter pa mobilisering utovar dextransulfatet enligt utforingsformerna ytterligare effekter som skulle kunna ha gynnsamma konsekvenser for HSCT-utfallet. Dextransulfat inducerar omedelbara och forhojda plasmanivaer av hepatocyttillvaxtfaktor (HGF), som är ett hormon med mitogen effekt pa olika celltyper och som gynnar inympning av transplanterade celler (Roos 1995 och Zioncheck 1995). HGF fungerar aven som en synergistisk poliferativ faktor pa HSC-tillvaxt da den kombineras med granulocyt/makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) (Kmiecik 1992 och Weimar 1998) saval som kolonibildande av mansklig ryggmarg-blodharrorande HSC inducerad av GM-CSF, G-CSF eller M-CSF (Goff 1996). HGF har aven visats delvis aterskapa hematopoes i moss som saknar c-kit/SCF, ett signalsystem som är viktigt for tillvaxten och celldelningen av ursprungliga hematopoetiska celler (Yu 1998). HGF i narvaron av erytropoietin inducerar bildandet av BFU-E-kolonier ("erythroid burst-forming unit") fran CD34+-celler (Galimi 1994). Vara resultat visar att dextransulfat inducerar signifikant mer BFUE jamfort med plerixafor, vilket kan bero pa den tydligare forhojningen i HGF jamfort med plerixafor.

Dextransulfat har, jamfort med nuvarande behandling, potentialen att forbattra mobiliseringen av progenitorceller och andra blodceller och utfallet for den efterfoljande transplantationen pa flera satt, vilket skulle vara av signifikant fbrdel for patienten. Dextransulfat har i allmanhet visats Oka utbytet av cirkulerande WBC, lymfocyter, HGF och progenitorceller.

En okad mobilisering av dessa specifika celler och tillvaxtfaktorer skulle starkt forbattra utfallet for patienten eftersom det skulle forbattra resultatet av transplantationen pa grund av en battre och snabbare inympning av de transplanterade cellerna. Dextransulfatsbehandling kan reducera risken for infektioner eftersom lymfocytinnehallet och CFU-GEMM verkar Oka, vilket kan forkorta neutropenitiden. Detta kommer ocksa att medfora en kortare sjukhusvistelsetid for patienten. Mobilisering med dextransulfa kan dessutom mojliggora att fler patienter far HSCT.

En effektivare mobilisering kommer att minska behovet av upprepat cellskordande fran patienten och minskar darfor risken for bieffekter (huvudsakligen fran administrering av G-CSF under lang tid) eftersom behandlingsperioden är forkortad. Dextransulfat okar det totala utbytet av HSC, vilket gynnar patienten genom att uppna den minimala mangden mobiliserade HSC for att berattiga transplantation saval som Oka prediktionen for cellskordande 17 lnympning och malsokning av dextransulfatbehandlade stamceller har visats vara effektivare an obehandlade stamceller i moss (Hayakawa 2009). Detta antyder att forutom mojliggora fler transplantationer har dextransulfat potentialen att Oka framgansfrekvensen for HSCT genom att Oka prediktionsmajligheten for HSC-transplantation, reducera komplikationer efter HSCT, minska behovet av upprepat cellskordande, hjalpa fler patienter na den minimala mangden cellar for att berattiga en HSCT och Oka antalet patienter som far lyckad inympning efter HSCT.

Mekanismen for forbattrad total overlevnad foreslas vara snabbare inympning och ateruppbyggnad av lymfocyter, vilket resulterar i en starkare GVT-effekt, vilket minskar kvarvarande cancer (Porrata 2009). Administrering av dextransulfat atminstone dubblerar frislappningen av lymfocyter i enkelterapi jamfort med en administrering av G-CSF eller plerixafor. Dextransulfat i kombination med G-CSF dubblerar frisattningen av mobiliserade lymfocyter jamfort med kombinationen av G-CSF och plerixafor.

Dessutom kommer ett okat utbyte av lymfocyter aven att vara anvandbart i DLI, vilket är anvandbart for allogen transplantation dar upprepade infusioner med lymfocyter anvands for att forbattra resultatet av transplantationen.

Dessutom orsakar dextransulfat mer an 100-faldig okning av HGF jamfort med baslinjenivaer och ganger mer an plerixafor, vilket ger uttryck i en omedelbar forhojning i HGF (Iran < 160 till 16000 pg/ml) redan efter 15 minuter. Dessa nivaer är tillrackligt hoga for att inducera celldelning.

Tabell 1 nedan sammanfattar nagra av de fordelaktiga effekter som uppnas med dextransulfat.

Tabell 1 — fordelar med dextransulfatsbehandling Antagen signifikant fordel for patienten Prekliniska effekter med dextransulfat Okadcellinympning,transplantationsutfalloch total overlevnad. Okatantalprogenitorceller.

Dextransulfatsbehandlade cellar uppvisar okad inympning.TillsynesmerCFU-GEMM- progenitorcel ler.

Minskad risk for infektioner. Okat antal lymfocyter. Okat antal progenitorceller.

Prediktionsformagaformobiliseringoch cellskordande. Snabb mobilisering. Okat antal progenitorceller. 18 Kortare sjukhusvistelsetid.Okat antal lymfocyter. Okat antal progenitorceller.

Till synes mer CFU-GEMM-progenitorceller.

Mindre G-CSF-bieffekter.Okat antal progenitorceller.

Okad GVT-effekt.Okat antal lymfocyter.

Dextransulfatet enligt ufforingsforrnerna är ett lagmolekylart dextransulfat (LMW-DS) med en medelmolekylvikt inom intervallet 3500 och 9500 Da.

I en sarskild ufforingsform har dextransulfatet en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 7000 Da. Foretradesvis har dextransulfatet en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 5500 Da, sasom en medelmolekylvikt pa 4,6 kDa, 4,7 kDa, 4,8 kDa, 4,9 kDa, 5,0 kDa, 5,1 kDa, 5,2 kDa, 5,3 kDa eller 5,4 kDa.

Ett exempel pa dextransulfat som kan anvandas enligt ufforingsformerna har en medelmolekylvikt pa 5139 Da och ett polydispersitetsindex (PDI) pa 1,2009.

I en sarskild utforingsform har dextransulfatet en vasentligt smal molekylviktsfordelning. I en sadan ufforingsform har de fiesta dextransulfatsmolekyler en respektive molekylvikt inom det foredragna intervallet pa 3500 och 9500 Da. I en exempelutforingsform har mindre an 20 % av dextransulfatsmolekylerna en molekylvikt over 8000 Da, foretradesvis mindre an 15 (:)/0, sasom mindre an 10% eller mindre an 5% av dextransulfatsmolekylerna har en molekylvikt over 8000 Da. Dessutom, eller alternativt sett, har mindre an 40 % av dextransulfatsmolekylerna en molekylvikt under 3000 Da, foretradesvis mindre an 35 %, sasom mindre an 30 % eller mindre 25 % av dextransulfats molekylerna en molekylvikt under 3000 Da.

Dextransulfat är ett polyanjoniskt derivat av dextran och innehaller svavel. Medelsvavelinnehallet for dextransulfat är foretradesvis 15 till 20 % och annu hellre ungefar 17 (:)/0, vilket i allmanhet motsvarar ungefar tv5 svavelgrupper per glukosylrest. I en sarskild ufforingsform är svavelinnehallet i dextransulfatet foretradesvis lika med eller atminstone nara den maximala mojliga graden av svavelinnehall for dextransulfatsmolekylerna.

Dextransulfatet enligt utforingsformerna kan tillhandahallas som ett farmaceutiskt acceptabelt derivat av dextransulfat. Sadana farmaceutiskt acceptabla derivat innefattar salter och solvat av dextransulfat, t.ex. ett natrium- eller kaliumsalt. 19 Dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav administreras foretradesvis genom injektion till patienten och sarskilt via intravenos (i.v.) injektion, subkutan (s.c.) injektion eller intraperitoneal (i.p.) injektion, foretradesvis i.v. eller s.c. injektion. Andra parenterala administreringsrutter som kan anvandas innefattar intramuskular och intraartikular injektion. For dessa administreringsrutter är dextransulfatet foretradesvis tillhandahallet i en formulering i vatskeform med ett utvalt losningsmedel eller excipient. Losningsmedlet är foretradesvis ett vattenhaltigt losningsmedel och sarskilt en buffertlosning. Ett icke-begransande exempel pa en sadan buffertlosning är en citronsyrabuffert, sasom citronsyramonohydratbuffert (CAM-buffert), eller en fosfatbuffert. Till exempel kan dextransulfat enligt utforingsformerna losas upp i saltlosning, sasom 0,9 % NaCI-saltlosning, och darefter valfritt buff ras med 75 mM CAM och justering av pH till ungefar 5,9 med anvandning av natriumhydroxid. Aven icke-buffrade losningar är mojliga, inklusive vattenhaltiga injektionslosningar sasom saltlosning. Vidare skulle andra buffertsystem an CAM kunna anvandas om en buffrad losning onskas.

Utforingsformerna är inte begransade till injektioner och andra administreringsrutter kan alternativt sett anvandas inklusive oralt, nasalt, buckalt, rektalt, dermalt, trakealt, bronkialt eller topikalt. Den aktiva foreningen, dextransulfat, formuleras dá med en lamplig excipient eller barare som valjs baserat pa den sarskilda administreringsrutten.

Lampliga dosintervall for dextransulfatet kan variera enligt storleken och vikten pa patienten, tillstandet for vilket patienten ska behandlas och andra overvaganden. Sarskilt for manniskopatienter skulle ett mojligt dosintervall vara fran 1 pg/kg till 150 mg/kg kroppsvikt, foretradesvis fran 1 mg/kg till 50 mg/kg kroppsvikt, och annu hellre fran 5 mg/kg till 25 mg/kg kroppsvikt, sasom fran 5 mg/kg till 20 mg/kg kroppsvikt eller fran 5 mg/kg till 15 mg/kg kroppsvikt. Aven lagre koncentration skulle kunna anvandas sasom 0,5-5 mg/kg kroppsvikt.

Dextransulfatet enligt utforingsformerna kan administreras vid ett enda administreringstillfalle sasom i form av en enda bolusinjektion. Denna bolusdos kan da injiceras ganska snabbt till patienten men kan med fordel ges Over tid sa att dextransulfatlosningen ges over nagra minuter till patienten sasom under till 10 minuter. Det forvantas allmant att en enda dos och injektion eller infusion (eller faktiskt annan administrering) är tillracklig for all uppna terapeutisk effekt i patienten enligt utforingsformerna. Det ar emellertid majligt att administrera dextransulfatet i flera doser vid olika administreringstillfallen. Till exempel kan en bolusinjektion kompletteras med en forlangd infusion av en dextransulfatslosning.

EXPERIMENT En serie med experiment i moss utfordes for att karakterisera dextransulfats effekter pa mobilisering och fa ytterligare kunskap om lampliga doser, skordetid, administreringssatt och effekten jamfort med nuvarande behandling plerixafor (AMD3100) i kombination med G-CSF (NEUPOGENC).

Moss DBA/2 mosshonor erholls fran Harlan Laboratories (Nederlanderna) och Charles River laboratories (Tyskland). Alla djur holls vid djurenheten pa Uppsala universitet, forvarades under standardforhallanden och tillhandaholls mat och vatten ad libitum enligt institutionens riktlinjer. Djur som var 7-40 veckor gamla och som vagde 17-31 g anvandes. Alla experiment godkandes av den lokala djuretikkommitten, Uppsala, Sverige.

Mobiliseringsprotokoll G-CSF (NEUPOGEN®, Amgen, Holland) anskaffades som steril isoton vattenlosning vid 0,3 mg/ml och spaddes ut i normal saltlosning till en koncentration pa 50 pg/ml. G-CSF administrerades vid en dos pa 2,5 mg som en subkutan injektion, morgon och kvall Dag -2 och Dag -1. Dextransulfat med olika medelmolekylvikter anvandes: Meito — en medelmolekylvikt pa 6 939 Da tillhandahallen av Meito Sangyo co Ltd (Tokyo, Japan) och upplost i citronsyramonohydratbuffert (CAM-buffert); pKC — en medelmolekylvikt pa 5 139 Da tillhandahallen av pK Chemicals NS (KOpenhamn, Danmark) och upplost i CAM-buffert eller 0,9 (:)/0 NaCI (Fresenius Kabi); samt TdB — en medelmolekylvikt pa 3,3 kDa tillhandahallen av TdB Consultancy (Uppsala, Sverige) och upplost i 0,9 (:)/0 NaCI (Fresenius Kabi).

AMD3100 koptes [ran Sigma Aldrich (Tyskland) och lostes upp i normal saltlosning till en koncentration pa 2 mg/ml. Dag 0 administrerades moss 100 mg/kg dextransulfat iv. eller s.c. eller 5 mg/kg AMD3100 s.c. savida inte annat specificeras. I kontrollgruppen administrerades djuren CAM-buffert eller NaCI iv. eller s.c. Alla djur fick ungefar 50-100 pl av vardera losning (2,5-5 ml/kg).

Meito Sangyo co Ltd sats N-3188 hade foljande molekylviktsfordelning: Mw 0-300010,61 % Mw 3000-800061,05 % Mw 8000-1200019,38 % Mw 12000-200008,15 % Mw 20000-300000,79 % 21 Mw 30000-400000,01 % Mp5664 Da Mn5240 Da AMw6939 Da PD I1,3242 pK Chemicals NS sats 31497 hade foljande molekylviktsfordelning: Mw 0-20003,75 % Mw 2000-400030,62 % Mw 4000-600036,64 % Mw 6000-800019,94 % Mw 8000-120008,94 % Mw 12000-20000 Mw 20000-30000 15 Mw 30000-40000 Mp4690 Da Mn4279 Da AMw5139 Da PDI1,2009 TdB Consultancy sats 20341 hade foljande molekylviktsfordelning: Mw 0-200019,26 % Mw 2000-400052,01 % Mw 4000-600026,71 To Mw 6000-80002,01 % Mw 8000-12000 Mw 12000-20000 Mw 20000-30000 Mw 30000-40000 Mp3341 Da Mn2557 Da AMw3305 Da PD I1,2924 Mp = toppmedel-molekylvikt Mn = antalmedel-molekylvikt AMw = viktmedel-molekylvikt Kolonibildande cellforsok Perifert blod togs med hjartpunktion under isofluranbedovning med anvandning av EDTA-spolade (0,2 M EDTA framstalld fran en stamlosning pa 0,5 M EDTA (framtagen av Rudbeck laboratoriet) utspadd 1:2,5 i 0,9 % NaCI) sprutor och overfordes till polypropylenror innehallande 1,6 mg EDTA (Sarstedt, Landskrona, Sverige).

Blod (100-200 pl) overfordes till polypropylenror innehallande heparin (slutlig koncentration 17,5 IE/m1). Erytrocyter forbrukades med anvandning av ammoniumkloridlosning (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Kanada). Aterstaende celler aterupplostes i lscoves modifierade Dulbeccos Medium med 2 % fetalt bovinserum (StemCell Technologies) och blandades med 2 ml metylcellulosamedium innehallande tillagg med en cocktail av rekombinanta cytokiner (MethoCult 3434; StemCell Technologies) och penicillin-streptomycin enligt tillverkarens instruktioner. Kulturer pa 1,1 ml innehallande HPC spreds ut pa 35 mm diskar (Sarstedt, Landskrona, Sverige) och placerades i en luftfuktad kammare med 5 % CO2 vid 37°C. Totalt antal kolonier raknades pa dag 12 av odling.

Hematologisk analys Perifert blod togs med hjartpunktion under isofluranbedovning med anvandning av EDTA-spolade sprutor och overfordes till EDTA-innehallande polypropylenror (Sarstedt).

Fullstandiga blodrakningar erholls med anvandning av en automatiserad cellraknare (Advia 21hematology systems; Simens healthcare diagnostics Inc, Illinois, USA) vid Sveriges lantbruksuniversitetet (SLU), Uppsala, Sverige.

HGF-ELISA Perifert blod togs med hjartpunktion under isofluranbedovning (savida inget annat anges) med anvandning av EDTA-spolade (0,2 M EDTA framstalld enligt ovan Plasma preparerades genom centrifugering av EDTA blod i 5 minuter vid 3000 g och fits ned vid 20°C tills analys. HGF-ELISA-analys (RnD systems, Minneapolis, USA) utfordes enligt instruktioner fran tillverkaren. 23 Statistisk Data uttrycks som medelvarden plus och minus SEM. Jamforelse mellan grupper uffordes med anvandning av Students t-test (tvasvandad, samma varians). Statistiska analyser uffordes med anvandning av Microsoft Excel. Skillnader vid ett p-varde mindre an 0,05 ansags vara statistiskt signifikant.

Dextransulfat, s.c. dosfinnande studie pa cellmobilisering i perifert blod Moss (DBA/2N, 8-14 veckor, Charles River) behandlades med s.c. injektioner av dextransulfat (10, 50, 150 och 500 mg/kg, pKC), AMD3100 (5 mg/kg, positiv kontroll) eller CAM-buffert (negativ kontroll). Den anvanda dosen for AMD3100 och 1 timma for cellskordande hade rapporterats som optimal dosregimen for detta lakemedel i moss (Broxmeyer 2005). Blod analyserades med anvandning av hematologisk analys enligt ovan. I mer detalj offrades moss 3 timmar efter sista injektionen (1 timma for AMD3100) och hematologisk differentiell analys utfordes i perifert blod. Serum- och/eller plasmaprov samplades in och lagrades i -20°C tills analys. Blod samlades in via hjartpunktion med EDTA-spolade sprutor och blandades med EDTA och lepirudin for cellrakningsanalysen och endast EDTA for HGF-analysens.

Det var en dosberoende okning i cirkulerande vita blodkroppar (WBC), huvudsakligen lymfocyter (Fig. 1) och HGF (Fig. 2) 3 timmar efter dextransulfatsadministrering. Doser pa 10-50 mg/kg dextransulfat och AMD3100 5 mg/kg visade liknande effekter medan effekterna hos 150 och 500 mg/kg dextransulfat var signifikant okade (p<0,001 respektive p<0,01) jamfort med AMD3100-effekt. Administrering av dextransulfat vid bade 150 och 500 mg/kg gay upphov till signifikant (p<0,001) okade nivaer (Fig. 2) av cirkulerande HGF, vilka var tydligare an AMD3100.

Tabell 2 sammanfattar blodparametrarna efter administrering av dextransulfat (LMW-DS) respektive AMD3100. Tabellen indikerar de hematologiska variablerna i perifert blod efter administrering av LMWDS eller AMD3100 jamfort med kontroll (CAM, *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001) eller jamfort med AMD3100 (tp< 0.05, ttp< 0.01, tttp< 0.001).

Tabell 2 — Hematologiska variabler i perifert blod efter administrering av LMW-DS Kontroll LMW-DS LMW-DS LMW-DS LMW-DS AMD3100 mg/kg mg/kg 150 mg/kg 500 mg/kg Erytrocyter 9,1 ±0,1 9,0 ± 0,0ttt 9,2 ± 0,4t 8,3 ± 0,6 9,4 ± 0,2m 8,0 ± 0,0*** 24 Hemoglobin 127,5± 1,9 122,0± 1,7tt 127,8 ± 5,0t 113,3 ± 8,2 130,3± 3,1tt 112,5± 0,9*** Hematokrit 0,4 ± 0,0 0,4 ± 0,0t 0,4 ± 0,0t 0,3 ± 0,0 0,4 ± 0,0tt 0,3 ± 0,0*** MCV 42,6 ± 0,3 41,9 ± 0,1 42,6 ± 0,3 41,7 ± 0,4 42,4 ± 0,3 42,7 ± 0,6 MCHC 329,3 ± 323,7 ± 3,8 324,3 ± 1,4t 329,3 ± 4,9 327,3 ± 2,332,0 ± 2,0 1,8 Retikulocyter 202,9 ± 222,7 ± 6,3 230,1 ± 64,6 243,7 ± 224,5 ± 186,3 ± 73,23,7 35,2 23,7 Blodplattar 946,8 ± 1083,3 ± 902,0 ± 96,4 893,5 ± 893,5 ± 706,8 ± 37,1 116,3t 60,8t 61,0tt 30,7** MPV 8,0 ± 0,1 7,7 ± 0,2 7,9 ± 0,1 7,2 ± 0,7,9 ± 0,1 8,0 ± 0,1 Leukocyter 5,2 ± 0,7 9,0 ± 1,2* 9,4 ± 0,7** 15,7± 21,8± 7,8 ± 0,6* (WBC) 0,4***/ttt 2,5***/tt Neutrofiler 1,0 ± 0,1 1,9 ± 0,4 1,5 ± 0,2 2,4 ± 0,3** 2,7± 1,8 ± 0,2* 0,3**/t Eosinofiler 0,1 ±0,0 0,2 ± 0,0t 0,2 ± 0,0 0,3 ± 0,1* 0,4 ± 0,1* 0,3 ± 0,0* Lymfocyter 3,8 ± 0,6,1 ± 0,5** 7,3 ± 0,6**/t 12,4± 17,9± 5,3 ± 0,4 0,2***/ttt 2,2***/tt Monocyter 0,3 ± 0,0* 0,6 ± 0,0tt 0,3 ± 0,1 0,4± 0,5 ± 0,1*/t 0,3 ± 0,0 0,0*/tt LUG 0,03 ± 0,1 ± 0,0* 0,1 ± 0,0* 0,1 ± 0,3 ± 0,2 0,05 ± 0,0* 0,0* 0,0***/tt Basofiler 0,01 ± 0,0 0,02 ± 0,0 0,03 ± 0,0 0,1 ± 0,0** 0,1 ± 0,0* 0,03 ± 0,0 n= 4 3 4 4 4 4 MCV: medelkorposkularvolymMCHC: medelkorpuskular hemoglobinkoncentration MPV: medelblodplattsvolumWBC: vita blodkropparLUG: lukocyter Enheter: Erytrocyter 12 cellerIl, andra celler 9cellerIl, MCV (fl), MCHC (g/l), HOT (g/l) Dextransulfat, i.v. dosfinnande studie pa cellmobilisering i perifert blod Mobilisering utfordes pa DBA/201aHsd-moss (7-12 veckor, Harlan) med anvandning av 25-200 mg/kg dextransulfat (Meito) i.v. Som positive och negative kontroller anvandes AMD3100 (5 mg/kg, s.c.) eller CAM-buffert (i.v.). Blod analyserades med anvandning av CFC-analys och hematologisk analys enligt oven.

JamfOrt med AMD3100 (5 mg/kg) och kontroll-CAM-buffert inducerade enstaka i.v.-injektioner av dextransulfat (25, 50, 100 och 200 mg/kg, Meito) en signifikant okning i WBC (p<0,01), huvudsakligen lymfocyter (p<0,001) i perifert blod redan 30 minuter efter dextransulfatsinjektion (Fig. 3). Mobiliseringsnivaerna erhallna med de fyra dextransulfatsdoserna var signifikant okade jamfort med AMD3100.

Dextransulfats mobiliseringseffekt pa CFC var ocksa signifikant pataglig redan vid den lagsta givna dosen (25 mg/kg, p<0,001). Effekten verkade Oka pa ett dosberoende satt. Effekten efter 200 mg/kg dextransulfat var liknande den hos AMD3100, 5 mg/kg, med avseende pa total CFC (Fig. 4A och 4B).

Okningen i CFC efter endosadministrering av AMD3100 (s.c.) och dextransulfat (i.v.) var hogre (6-12 ganger over kontroll) jamfort med den allmanna okningen av WBC (3-5 ganger over kontroll). Detta kan antyda en specifik mekanism pa mobilisering av progenitorceller (Fig. 4A och 4B).

Mobiliseringseffekten pa olika subtyper av progenitorceller, CFU-GM, CFU-GEMM och BFU-E studerades ocksa (Fig. 4A och 4B) och dextransulfat verkade Oka BFU-E mer an AMD3100.

Dextransulfat, effekt av administreringsrutt pa cellmobilisering till perifert blod Mobilisering uffordes pa DBA/2N-moss (9-10 manader, Charles River) med anvandning av 100 mg/kg dextransulfat (Meito i.v. och s.c.). Blod analyserades med anvandning av CFC-analys och hematologisk analys enligt ovan.

Effekterna pa perifera blodceller efter administrering av 100 mg/kg dextransulfat i.v. och s.c. jamfordes (n=5). Celler skordades 30 minuter efter administrering for !pada administreringsrutter. Det fanns inga signifikanta skillnader pa cirkulerande WBC, lymfocyter, CFC eller CFC-subtyper 30 minuter efter de olika administreringsrutterna, se Tabell 3.

Tabell 3 — jamforelse pa blodparametrar for s.c. och i.v. administrering s.c. LMW-DS i.v. LMW-DS WBC, *9/1 12,5 ± 1,1 16,2 ± 1,8 Lymfocyter, *9/l 9,9 ± 1,2 12,6 ± 1,7 CFC, *9/1 692 ± 111 712 ± 17 CFC-GM, *9/1 604 ±83 592± 172 26 CFC-GEMM, *9/1 28 ± 28 ± BFU-E, *9/1 60 ± 22 92 ± 12 Dextransulfat, tid-effektforhallande pa cellmobilisering i perifert blod Mobilisering uffordes pa DBA/2N-moss (8-14 veckor, Charles River) med anvandning av 50 mg/kg dextransulfat (pKC, i.v.) eller 100 mg/kg dextransulfat (Meito, i.v.). Som negativ kontroll anvandes CAM-buffert (i.v.). Blod analyserades med anvandning av CFC-analys, hematologisk analys och HGF-ELISA.

Mobiliseringseffekten av i.v. administrerad dextransulfat (100 mg/kg) uppvisade de hogsta antal WBC och lymfocyter runt 30 minuter och sjonk men var forffarande forhojda vid 3 timmar efter administreringen. En mycket snabb okning av CFC med en topp som borjar redan vid 7,5 minuter efter administrering (Fig. 5) kunde ses. De olika subtyperna av progenitorceller toppade vid nagot olika tidpunkter BFU-E vid 7,5 minuter och CFU-GM/CFU-GEMM mellan 15-30 minuter efter administrering. HGF okade till den hogsta nivan efter 15 minuter (15960 pg/ml) och avtog darefter. HGF uppmattes emellertid i ett annat exempel och mattes inte vid 7,5 minuter (se Tabell 4). AMD3100 okade HGF-nivaer till 650±230 pg/ml en timma efter administrering Tabell 4 — cellmobilisering efter i.v. administrering av dextransulfat (LMW-DS) CAM LMW-DS 7,5 min LMW-DS min LMW-DS min LMW-DS 1 timma LMW-DS 3 timmar WBC,*1 09/1 3,9 ± 0,5,6 ± 0,5* 10,2 ± 0,7*** 14,6 ± 1,3*** 11,2 ± 0,6*** 6,8 ± 1,0* Lymf,*9/I 2,2 ± 0,2 4,6 ± 0,5*** 8,9 ± 0,7*** 12,3 ± 1,1*** 8,8 ± 0,5*** 5,2 ± 0,8** PLT, *9/1 998 ±34 1034 ±31 1122 ± 58 978 ±64 965 ±23 936 ±26 HGF, pg/ml <160 n.a. 15960± 1450*** 13800± 1100*** 77±510*** 710± 230** Saledes okade i.v. administrering av dextransulfat (100 mg/kg) i moss snabbt antalet WBC och sarskilt lymfocyter (Lymf) i perifert blod jamfort med kontroll (CAM). Dextransulfat paverkade inte antalet blodplattar (PLT). Dextransulfat okade ocksa snabbt mangden HGF i plasma. Resultat rapporteras i Tabell 4 som medel ± SEM, n.a. = inte analyserad. Statistik presenteras jamfort med CAM-buffert, *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.

Dextransulfat i kombination med G-CSF pa cellmobilisering i perifert blod 27 Standardbehandling av patienter innan aferes är baserad pa dagliga injektioner av G-CSF fran upp till en vecka. Kliniskt skulle dextransulfat kunna anvandas i kombination med G-CSF. I en studie i moss administrerades 2,5 pg/djur G-CSF tva ganger dagligen (8 timmar emellan) i 2 dagar (Broxmeyer 1999). For att undersoka effekten av kombinationen av G-CSF och dextransulfat behandlades DBA/20IaHsd- moss (10-15 veckor, Harlan) med G-CSF i 2 dagar (Neupogen, 2x2,5 pg/dag, s.c.) och injicerades pa dag 3 antingen med dextransulfat (100 mg/kg, Meito, i.v.), CAM (negativ kontroll, i.v.) eller AMD3100 (positiv kontroll, 5 mg/kg, s.c.). Blod analyserade med anvandning av CFC-analys och hematologisk analys.

G-CSF okade antalet WBC jamfort med normalt (se Fig. 1 och 3 for endast CAM-administrering) och tillsats av dextransulfat (25 och 100 mg/kg) okade WBC- och lymfocytantalet synergistiskt. Okningen i WBC och lymfocyter var signifikant mer markant an efter AMD3100-administrering (5 mg/kg) (Fig. 6).

Tillsats av dextransulfat i en dos pa 100 mg/kg till G-CSF medfor en omfattande och synergistisk okning i progenitorceller i perifert blod och dextransulfat verkade vara effektivare som mobiliseringsamne an AMD3100 (Fig. 7A och 7B). Kombinationen av dextransulfat och G-CSF mobiliserade mer CFU-GEMMoch BFU-E-progenitorceller (Fig. 7B) jamfort med kombinationen av G-CSF och AMD3100.

De ufforda experimenten visade ett dos-effekt-forhallande for dextransulfat pa mobilisering av WBC, lymfocyter och CFC bade efter s.c. och i.v. administrering. Okningen av CFC verkade vara hogre (6-12 ganger over kontroll) jamfort med den allmanna okningen i WBC (4-5 ganger over kontroll). Tidseffekten av i.v. administrerat av dextransulfat (100 mg/kg) var en snabb okning i CFC, WBC och lymfocyter. Toppen borjade redan efter 7,5 minuter, vilket var signifikant tidigare an for AMD3100. Kombinationen av dextransulfat med G-CSF visade en ovantad och markant okning i CFC i perifert blod till upp till 18000 CFC (mer an 100-faldigt over kontroll) och till synes effektivare jamfort med AMi kombination med G-CSF, se Fig. 8. Dextransulfatsadministrering resulterade i en signifikant hogre mobilisering av WBC och lymfocyter och verkade aven mobilisera mer BFU-E i monoterapi jamfort med en optimal dos av AMD3100. Dextransulfatsadministrering i kombination med G-CSF resulterade i en signifikant hogre mobilisering av WBC och lymfocyter och verkade aven mobilisera mer CFU, BFU-E och CFU-GEMM jamfort med AMD3100, se Fig. 7A, 7B, 8 och 9. Dextransulfat okade HGF i plasma till hoga nivaer (fran <160 till 16000 pg/ml) 15 minuter efter administrering, 25-faldigt mer an AMD3100 efter 1 timma.

Jamforelse pa mobilisering av hematopoetiska celler med lagmolekylart dextransulfat med olika medelmolekylvikter 28 Djur DBA/20Ia-mosshonor (Harlan, Holland) holls vid djurenheten pa Uppsala universitet, forvarades under standardforhallanden och tillhandaholls mat och vatten ad libitum. Djur som vagde 17-22 g anvandes.

Experimentuppsattning DBA/2-honor grupperades i fyra grupper: 1) medium (NaCI-vattenlosning) (n=8), 2) 50 mg/kg dextransulfat DS3 (n=5), 3) 50 mg/kg dextransulfat DS5 (n=5) och 4) 50 mg/kg dextransulfat DS5 PNB (n=5). Grupp 4) bedovades med natriumpentobarbital (PNB) istallet for isofluran for att utvardera om en andring i anestesiprotokoll paverkar mobilisering.

Administrering av substans DS5 (medel-Mw 5,1 kDa, pKC Danmark, sats 31497) och DS3 (medel-Mw 3,3 kDa, TdB Consultancy. Uppsala Sverige, sats 20341) lostes upp i 0,9 % NaCI (Fresenius Kabi) till 20 mg/ml och filtrerades genom 20 pm filter for att erhalla en steril losning. Djuren fick 2,5 ml/kg (ungefar 50 pl) intravenost genom svansvenen.

Hematologisk analys Resultaten visas i Fig. 10 och Tabell 6. DS3 uppvisade inte flagon signifikant forandring i total WBC eller lymfocyter medan en svag minskning i neutrofiler rapporterades.

Tabell 6 — hematologiska variabler i perifert blod efter administrering av dextransulfatsubstanser Enhet Medium DS3 DSDS5 PNB Blodplattar 9/I 943±925±950±31 980±11 Hemoglobin g/I 128±2 128±4 129±3 135±2* Erytrocyter 12/I 10±0,1 9,6±0,2 9,7±0,2 10,1±0,2* Hematokrit (EFV) 0,42±0,000,42±0,008 0,43±0,008 0,44±0,01* MCV fl 44±0,3 44±0 44±0,4 44±0,3 MCHC g/I 308±1 302±6 305±1 304±4 Retikulocyter 9/I 3±0,4 3±0,4 4±0,6 4±0,4 Leukocyter (WBC) 9/I 3±0,2 3,0±0,4 10,1±1,0*** 8,5±0,7*** Neutrofiler 9/I 1,0±0,1 0,7±0,1* 1,4±0,2* 0,8±0,2 Eosinofiler 9/I 0,1±0,02 0,1±0 0,1±0 0,1±0 Basofiler 9/I 0,1±0 0,1±0 0,1±0 0,1±0 29 Lymfocyter 9/1 2±0,1 2,2±0,4 8,5±0,9*** 7,4±0,7*** Monocyter 9/1 0,05±0,02 0,02±0,02 0,1±0 0,06±0,02 Tid for blodprov efter DS min 31±0,3 32±0,4 31±0,2 33±1,4 MVC=Medelkorpuskularvolym; MCHC=Medelkorposkular hemoglobinkoncentration Hematologiska variabler jamfort med medium (NaCI):*p < 0.05, **p < 0.01. ***p < 0.001 Kolonibildande cellanalys Resultaten visas i Fig. 11. DS3 inducerade inte en signifikant okning i antalet CFC.

Hepatocyttillvaxtfaktor DS5 inducerade en signifikant okning i HGF oberoende anvandningen av bedovningsmedel. Substansen med lagre molekylvikt (DS3) uppvisade ingen signifikant okning i HGF, se Fig. 12.

Sammanfattning Data som presenteras han visar att DS3 är ett daligt mobiliseringsamne *fort med DS5. DS3 okar inte HGF i flagon utstrackning bortom medium De utforingsformer som beskrivs ovan ska forstas som flaw fà belysande exempel pa den foreliggande uppfinningen. Det kommer att forstas av fackmannen att olika modifieringar, kombinationer och forandringar kan goras for utforingsformerna utan att avvika fran den foreliggande uppfinningens omfattning. Sarskilt sa kan olika dellosningar i olika utforingsformer kombineras i andra konfigurationer dar tekniskt mojligt.

REFERENSER Broxmeyer et al. (1999) "Dominant myelopoietic effector functions mediated by chemokine receptor CCR1" J Exp Med 189(12): 1987-92 Broxmeyer et al. (2005) "Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100, a CXCR4 antagonist" J Exp Med 201(8): 1307-18 Chemaly et al. (2006) "Respiratory viral Infections in adults with hematologic malignancies and human stem cell transplantation recipients" Medicine 85(5): 278-287 CHMP Assessment Report Mozobil (plerixafor) Procedure No. EMEA/H/C/001030, 2009 Cooper et al. (1997) "Erythroid burst-forming units (BU-E) predict hematopietic recovery after peripheral blood progenitor cell transplantation in patients with advanced breast cancer" Bone Marrow Transplantation 19: 1089-94 CopeIan (2006) "Hematopoietic Stem-cell Transplantation" N Engl J Med 354: 1813-26 Galimi et al. (1994) "Hepatocyte growth factor induces proliferation and differentiation of multipotent and erythroid hematopoietic progenitors" J Cell Biol 127(6 Pt 1): 1743-54 Goff et al. (1996) "Synergistic effects of hepatocyte growth factor on human cord blood CD34+ progenitor cells are the result of c-met receptor expression" Stem Cells 14(5): 592-602 Han et al. (1998) "Effect of combination of DS and G-CSF on mobilization of peripheral hematopoietic progenitors in mice" Journal of Experimental Hematology 6: 29-31 Hassan et al. (1997) "Factors influencing hematological recovery after allogeneic bone marrow transplantation in leukaemia patients treated with methotrexate-containing GVHD prophylaxis" Support Care Cancer 5: 299-306 Hayakawa et al. (2009) "Dextran sulfate and stromal cell derived factor-1 promote CXCR4 expression and improve bone marrow homing efficiency of infused hematopoietic stem cells" J Nippon Med Sch 76(4): 198 Hiwase et al. (2008) "Higher infused lymphocyte dose predicts higher lymphocyte recovery, which in turn, predicts superior overall survival following autologous hematopoietic stem cell transplantation for multiple myeloma" Biol Blood & Marrow Transpl 14: 116-24 Kalatskaya et al. (2009) "AMD3100 is a CXCR7 ligand with allosteric agonist properties" Mol Pharmacol 75(5): 1240-7 Kmiecik et al. (1992) "Hepatocyte growth factor is a synergistic factor for the growth of hematopoietic progenitor cells" Blood 80(10): 2454-7 31 Lapidot et al. (2003) "Current understanding of factors influencing stem cell mobilization" Hematology (Am Soc Hematol Educ Program), 419-37 MozobilTm Product Monograph, moZoBilTM (plerixafor injection), genzyme Pablos et al. (2003) "Synoviocyte-derived CXCL12 is displayed on endothelium and induces angiogenesis in rheumatoid arthritis" J Immunol 170: 2147-52 Porrata et al. (2004a) "Infused peripheral blood autograft absolute lymphocyte count correlates with day 10 15 absolute lymphocyte count and clinical outcome after autologous peripheral hematopoietic stem cell transplantation in non-Hodgkin's lymphoma" Bone Marrow Transpl 33: 291-8 Porrata et al. (2004b) "The dose of infused lymphocytes in the autograft directly correlates with clinical outcome after autologous peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation in multiple myeloma" Leukemia 18: 1085-92 Porrata (2009) "Clinical Evidence of Autologous Graft versus Tumor Effect" Am J Immunol 5(1): 1-7 Roodman et al. (1987) "CFU-GEMM correlate with neutrophil and platelet recovery in patients receiving 20 autologous marrow transplantation after high-dose melphalan chemotherapy" Bone Marrow Transpl 2: 195-73 Roos et al. (1995) "Induction of liver growth in normal mice by infusion of hepatocyte growth factor/scatter factor" Am J Physiol 268(2 Pt 1): 380-6 Sweeney et al. (2000) "Mobilization of stem/progenitor cells by sulfated polysaccharides does not require selectin presence" PNAS 97(12): 6544-49 Sweeney et al. (2002) "Sulfated polysaccharides increase plasma levels of SDF-1 in monkeys and mice: involvement in mobilization of stem/progenitor cells" Blood 99(1): 44-51 Weimar et al. (1998) "Hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) is produced by human bone marrow stromal cells and promotes proliferation, adhesion and survival of human hematopoietic progenitor cells (CD34+)" Exp Hematol 26(9): 885-94 32 Yu et al. (1998) "Stimulatory effects of hepatocyte growth factor on hemopoiesis of SCF/c-kit system-deficient mice" Stem cells 16(1): 66-77 Zioncheck et al. (1995) "Sulfated oligosaccharides promote hepatocyte growth factor association and govern its mitogenic activity" J Biol Chem 270(28): 16871-8 33

Claims (17)

PATENTKRAV

1. Dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 7000 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient.

2. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt patentkrav 1, van i progenitor- och/eller stamcellerna är kolonibildande celler valda fran en grupp som bestar av kolonibildande enhet — granulocyt, erytrocyt, monocyt, megakarocyt (CFU-GEMM) och BFU-E ("burst forming unit-erythtrocyte").

3. Dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 7000 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, for anvandning i mobilisering av vita blodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana.

4. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt nagot av patentkrav 1 till 3 med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 5500 Da.

5. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt nagot av patentkrav 1 till 4, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, har ett medelsvavelinnehall i ett intervall fran 15 till 20%, och foretradesvis ungefar 17%.

6. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt nagot av patentkrav 1 till 5, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, är formulerat som en vattenhaltig injektionslosning.

7. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt nagot av patentkrav 1 till 6, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, är formulerat for att administreras vid en dos i ett intervall fran 1 till 50 mg/kg kroppsvikt hos patienten, foretradesvis fran 5 till 25 mg/kg kroppsvikt hos patienten och annu hellre fran 5 till 15 mg/kg kroppsvikt hos patienten.

8. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt nagot av patentkrav 1 till 7, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, ska administreras till en manniskopatient inom ett intervall fran ungefar 0 timmar till ungefar 6 timmar innan en tidpunkt for mobilisering av cellerna in i manniskopatientens blodbana. 34

9. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt patentkrav 8, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, ska administreras till manniskopatienten inom ett intervall fran ungefar 0 timmar till ungefar 4 timmar innan tidpunkten for mobilisering av cellerna in i manniskopatientens blodbana.

10. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt nagot av patentkrav 1 till 9, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, är formulerat for kombinerad anvandning med granulocyt-kolonistimulerande faktor (G-CSF) i mobilisering av cellerna in i perifert blod hos patienten.

11. Dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla saltet darav, for anvandning enligt patentkrav 10, van i G-CSF ska administreras till patienten en eller tva ganger 2-4 dagar innan en tidpunkt for mobilisering av cellerna in i patientens blodbana och foretradesvis dessutom pa en dag for tidpunkten for mobilisering av cellerna in i patientens blodbana.

12. En cellmobiliserande sammansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 7000 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, och granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF).

13. Sammansattningen enligt patentkrav 12, vidare innefattande ett vattenhaltigt losningsmedel.

14. En cellmobiliserande sammansattning enligt patentkrav 12 eller 13 for anvandning som ett lakemedel.

15. En cellmobiliserande sammansattning enligt patentkrav 12 eller 13 for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient.

16. En cellmobiliserande sammansattning enligt patentkrav 12 eller 13 for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. Celler * 9/1 30O 1111W8Ca Lymfocyterm Neutrofiler 25,0 20,0 15,0 10,0 0,0 MediumLMW-D {CAM)10 mg/kg LM W-DLMW-DLMW-DS mg/kg150 mg/kg 500 mg/kg