SE528488C2 - Feromoner och metod för förhindrande av angrepp av contarinia nasturtii - Google Patents

Description

30 35 528 438 2 av växelbruk vanligtvis ej en korsblommig gröda) och leta efter ett fält med en brassica- gröda för att lägga sina ägg.

En anledning till höga skadenivåer är avsaknaden av en bra övervakningsmetod för bestämning av tidpunkten för kläckning. Metoden (övervaknlngsmetoden) som används idag innebär såilning och flotation av jordprover, vilka därefter analyseras under mikroskop för att bestämma I vilket utvecklingsstadium pupporna befinner sig.

Anaiyserna genomförs av någon fackman inom området och är mycket tidskrävande.

Jordprover från ett fåtal fält analyseras emellertid endast. Eftersom kiäcknlngen är beroende av det lokala klimatet (fuktighet och temperatur) blir riktigheten för (övervakningen) låg med avseende på andra fält. Vidare framträder de vuxna myggoma mycket plötsligt och under en kort tidsperiod och eftersom bekämpningsåtgärderna måste genomföras innan äggläggandet, är metoden mycket osäker. Den kräver dessutom ett mycket effektivt kommunikationssystem för att nå-alla jordbrukare med resultaten av prognostlserlngen (övervakningen) och rekommendation beträffande tidpunkten för bekämpande åtgärd. För närvarande är den enda tillgängliga övervaknlngsmetoden baserad på utläggningen av gula skåifällor fyllda med vatten och en detergent. Fällorna fångar ej in artspeciflkt, utan snarare attraheras alla fytofaga insekter och följaktligen är analysen av fäillnnehållet mödosam och de små kålgall- myggoma kan endast detekteras och identifieras av van personal. Dessutom är lnfångnlngs-effektiviteten hos gula fällor låg för kålgallmyggan och med ganska små populationer skadas grödan ofta av C. nasturtii även när inga myggor detekteras i fällor.

Tempemturbaserade prognosmetoder har utvecklats, men har ej lyckats att ge riktiga, fäitspecifika prognoser.

I feromonbaserade övervakningsmetoder används ett begränsat antal av fällor betade med ett feromon relaterat till den avsedda insekten, speciellt ett sexualferomon, i syntetisk form. En feromonfälia är det känsiigaste övervakningssystemet som är känt idag. Vid användning av en sådan kan till och med mycket låga populationstätheter detekteras. Eftersom feromoner är mycket speclflka med avseende på de attraherade lnsektsarterna, fångar fällor betade med sådana feromoner huvudsakligen in den art som utgör målet, viiketi hög grad främjar analysen av innehållet l fâlloma och detektionen av den respektive arten.

Skadeinsekter, samt alla andra insekter, kan variera stort l antal från år till år och deras förekomst under säsongen kan också variera. Svårigheten är således att veta om och när de behöver bekämpas. Fällfångsterna kommer emellertid att tillhandahålla ett svar på tre väsentliga frågor, nämligen: 1) om insekten finns i fältet; 2) när insekten finns i fältet; och 3) approximativt hur många det finns där. Svaret på den första frågan är 10 15 20 25 30 35 528 488 väsentlig för att förhindra eller eliminera ej nödvändiga bekämpningsbehandlingar som en förslktighetsåtgärd genom användning av insekticider. Med svar på fråga nummer 2) kan en valfri bekämpningsbehandiing göras vid den rätta tidpunkten, d.v.s. när insekten finns där.. ' Feromonbetade fällor tillhandahåller ej ett exakt mått på populatlonstätheten, men fångstresuitatei: anger om det är ett låg-, ett medel- eller ett högriskangrepp.

Feromonbaserade övervakningssystem används idag för omkring 200 olika skadelnsekter, speciellt malar. Med dylika övewaknlngsfälior kan användningen av insekticider minskas med 50 till 75 %. Onödig bekämpningsbehandiing kan följaktligen undvikas, vilket ej endast reducerar jordbrukarens kostnader, utan begränsar också de negativa effekterna på miljön. Om fälifångstema skulle indlkera att bekämpnings- behandlingar är nödvändiga, kommer man att kunna genomföra' bekämpningen vid det känsllgaste utvecklingsstadlet för insekten.

Kemiska insekticider för skadelnsekter kommer, med avseende på inverkan på miljön och deras ganska ofiza breda bekämpningsspektrum (d.v.s. de har många olika insekter som måitavia), att ersättas med biologiska bekämpningsmetoder. Sådana metoder utnyttjar grundkunskap beträffande ekoiogin och blokemin för de speclflka insekterna.

Precisionen, d.v.s. den önskade artspecificlteten kan följaktligen bil mycket hög.

Metoderna, vilka är de som kommersiellt âr mest framgångsrika, är baserade på sexualferomonema eller andra feromoner från insekter. Användningen av feromoner i skadeinsektshantering är baserad på användningen av naturligt förekommande föreningar vid naturligt förekommande mängder och koncentratloner, vilket innebär maximalt hänsynstagancie till miljön.

Vid bekämpning av skadelnsekter med sexuaiferomoner imiterar och utnyttjar man den naturliga situationen lvilken en hona attraherar en hane genom att avge sexualferomonet, vilket kommer att spridas som en dimma i vindriktnlngen. En hane som kommer in l feromonplymen svarar genom att flyga mot vinden l riktning mot honan. I bekämpnlngssyiten appliceras ett stort antal av syntetiska feromonkälior i ett område som följaktligen kommer att överflödas av feromon. I denna doftmiljö kommer honans egen signal att dränkas och hanen kommer ej att ha någon möjlighet att hitta henne. Tekniken kallas parningsstörning och är en allmänt spridd bekämpnlngsmetod.

Det har visas att honoranvänder. ett sexualferomon för att attrahera hanama l approximativt 10 gaiimyggarter (för en översikt, se Harris och Foster, 1999; Hlllbur, 2001). Emellertid har kemiska identlfieringar av feromoner hittills endast gjorts i ärtgalimyggan, C. písí (Hliibur et al. 1999, 2000, 2001), den röda vetemyggan, 10 15 20 25 30 35 528 488 Sitodiplosis mosel/ana (Gries et al. _2000) och den s.k. "Douglas-flr cone gall midge", C. oregonensis (Grles et al. 2002).

Beskrivning av föreliggande uppfinning Det har nu konstaterats vara möjligt att bekämpa C. nasturtli genom prognostíserlng (övervakning), eller parningsstörnlng, med en blandning av feromonema (2S,9S)- dlacetoxiundekan, (2S,10S)-dlacetoxlundekan och 2S-acetoxlundekan.

Material och metoder Insektsodiing I Larver av C. nasturtii (Kleffer) samlades ln l augusti 2000 från kraftigt angripen brysselkål på ett fält nära Kerzers (Canton Freiburg, Schweiz). Angrlpna växande knoppar placerades på en torvjordsblandning där larver förpuppade sig när de hade avslutat sin utveckling. Kärlen innehållande pupporna lagrades l burar och från de kläckta vuxna myggoma etablerades en kontinuerlig laboratorleodllng. Llkaledes tillfördes larver från ett fält i närheten av Ins (Canton Bern, Schweiz) till odlingen år 2001.

Larver av C. nasturil odlades på blomkål, Brass/ca oleracea convar. botrytis, cv. Candid Charm. Födoplantor odlades l par l kärl (diameter 13 cm) l ett substrat bestående av 85 % torv och lera (Floraton nr. 5, Floragard, Oldenburg, Tyskland) I ett växthus vid 15 - 30 °C med extra ljus tillförd under vlntermånader. Plantorna hölls fria från bladlöss och vita flugor genom att bespruta dem, om nödvändigt, en gång med pymetrozin (0.025 % a.l.) ej senare än tre veckor innan de användes som födoplantor. När plantorna hade 8 till 10 riktiga blad och en knoppdlameter på 5 - 10 mm, överfördes de till kllmatrum med 22 °C, R.H. 75 % och L/D = 16/8. Däri placerades de l burar (50 x 50 x 50 cm) tillverkade av plexlglas med de två sldoväggarna bestående av ett flnmasklgt nät.

Burarna innehöll 100-200 myggor, hanar och honor som medgavs att lägga ägg på plantorna under 24 timmar. Därefter togs plantoma bort, ersattes av nästa omgång, och inkuberades vid de ovan nämnda förhållandena. Varje dag fuktades knopparna på plantorna, där larverna blev synliga 5-6 dagar efter äggläggande, med kranvatten.

Om larvema användes för att fylla ut odlingen, skars plantdelar över mark av dag 17 efter äggläggnlng innan kärlen med substrat innehållande pupporna placerades i äggläggnlngsburama där myggorna medgavs att kläckas. Om myggorna var avsedda att användas för EAG-arbete eller för insamlingen av feromonkörtelextrakt, skars plantdelar över mark av dag 15. Hanar för vindtunnelexperiment hlndrades från att få en chans till parning genom att placera glascyllndrar över kärlen. På morgonen efter 10 15 20 25 30 35 528 488 den natt när de första myggoma hade klåckts, sattes dessa cylindrar, innehållande vanligtvis enbart hanar, åt sidan innan honorna började dyka upp.

Extrakt av honferomonkörtlar Extrakt för EAG och kemisk ldentiflering > Kärlen med angrlpen jord sattes l glasburar (28 x 28 x 33 cm) och bibehöils vid L/D 18/6, 25 °C och RH 70 % för att de vuxna myggorna skulle kläckas. Efter kläckning överfördes hanar och honor till skilda burar. Honor bibehölls under de förhållanden som omnämnts och hanar blbehöiis vid L/D 18/6, 15 °C och RH 75 %. Körteiextrakt bereddes genom att skära ut ovlposltorema hos honor som uppvisade lockande beteende, d.v.s. sträcka ut deras ovlpositor (Se Harris och Foster (1999) för en detaljerad beskrivning). Ovlposltorema samlades I en flaska som bibehölls I flytande kväve och extraherades därefter under 1-2 min i omdestlllerad hexan (LabScan).

Extrakten bibehölis i förslutna glaskapillärer vid -18 °C fram till användning.

Extrakt för preliminära vlndtunnelanalyser Lockande honor samlades in från laboratorleodllngen och sänktes ner i omgångari hexan (p.a. grade) under 15 minuter vid rumstemperatur. Supematanten dekanterades därefter och koncentrerades till den högsta koncentrationen som testades genom att blåsa bort hexanen med NZ.

Elektrofyslologiska registreringar Hanantennrespons på ovlposltorextrakt analyserades med gaskromatografi med eiektroantennograflsk detektion (GC~EAD). Gaskromatografen som användes var en Hewlett Packard 6890 med flamjonisationsdetektion och en Innowax-kolonn (30 m x 0.25 mm ID, Hewlett Packard, USA). Kolonntemperaturen var programmerad från 80 °C (2 min kvarhåilnlng) till 230 °C vld 10 °C/min. Antennreglstreringama gjordes med användning av en plexigiasshållare med två väggar anslutna tili en förstärkare med guidtrådseiektroder (JoAC, Lund, Sverige; Zhang et al., 1997; Hiiibur, 2001). Insekter av hankön monterades l. hållaren såsom beskrivet av Hlllbur et al. (2000).

Antennpreparaten utsattes kontinuerligt för en kolfiltrerad och fuktgjord lufcström (0.3 m/s) genom ett giasrör (8 mm I diameter). Antennsignaler förstärktes (JoAC) innan de registrerades och analyserades med ElectroAntennoGraphy-mjukvara (Syntech, Hllversum, Nederländerna).

Kemi Analyser Analyser genomfördes med kombinerad gaskromatografl~masspektrometri (GC~MS). En Hewiett-Packard-gaskromatograf 5890 (Palo Alto, Kalifomlen, USA) kopplades ihop med 10 115 20 25 30 35 528 488 en dubbeifokuserande sektorfälts-masspektrometer VG 70/250 E (Vacuum Generators, Manchester, UK) driven vid 70 eV. Altemativt användes ett quadrupoi-instrument (MD 800/GC 8060, Fisons, Ismanlng, Tyskland). Med användning av helium som bärargas uppnåddes separationer med en 60' m x 0,25 mm-ID, 0,25 pm film DB5~MS kvartsglaskolonn (J & W Scientific, Folsom, Kalifomien, USA) under de följande förhållandena: 2 min 50 °C, därefter programmerad till 280 °C vid en hastighet av 5 °C/min. Dessutom drevs en 50 m x 0,25 pm-ID, 0,27 mm film FFAP (Macherey & Nagel, Düren, Tyskland) kvartsglaskolonn under de följande förhållandena: 3 min 50 °C, därefter programmerad till 220 °C vid en hastighet av 3 °C/min. Separation av stereoisomerer genomfördes med en 25 m x 0,25 mm-ID kvartglaskoionn täckt med en lu-blandning av heptakis-(G-O-terta-butyldimetyisilyi-2,3-di-0-metyl)~ß-cyklodextrin och 0V1701 med användning av väte som bärargas. NMR-spectrum registrerades med en Bruker AMX-400 (Karlsruhe, Tyskiand); kemiska shifi: (S) är givna i mlijondelar i förhållande till tetrametylsiian; kopplingskonstanter I är givna i Hertz.

Synteser Flnkemikaller och lösningsmedel köptes från Aldrlch eller Merck och var av högsta tillgängliga renhet. Renlngar av syntetiska produkter genomfördes med flash- kromatografl på klselgel (sllica 32-63, 60 Å, ICN-Blomedicals, Eschwege, Tyskland) vid 1.3 bar med användning av blandningar av etylacetat och hexan.

(S)-Dek-9-en-2-ol Under argonatmosfär bereddes en Grignard-reagent av 10.0 g (56.6 mmol) 7- bromohept-1-en och 2.06 g (84.8 mmol) nymaida magnesiumbitari 50 ml absolut tetrahydrofuran vid 60 °C, Efter nedkyining till rumstemperatur, tillsattes lösningen droppvis till 3.3 g (4 ml, 56.7 mmol) (S)-metyloxiran och 1.1 g (5.7 mmol) koppar-I- jodid upplöst i 40 ml tetrahydrofuran vid ~78 °C. Därefter värmdes lösningen upp till rumstemperatur och rördes om under ytterligare en timme. Efter tillsats av 300 mi mättad vattenhaitig ammoniumkioridiösning, extraherades blandningen med 200 ml etyiacetat. Det vattenhaitiga lagret separerades och extraherades tre gånger med 200 ml av en lzl-blandning av etylacetat och hexan. De förenade organiska extrakten torkades över magnesiumsuifat och koncentrerades ln vacuo. Rening med flash~ kromatografl (10 % etylacetati hexan) levererade 6.2 g (39 mmoi, 70 %) av (S)-dek- 9-en-2-oi.

(S)-2-bensyioxidek-9-en Till en suspension av 3.2 g (133 mmol) natriumhydrid (frigjord från paraffin) i 105 ml iskall absolut tetrahydrofuran tillsattes 6.2 g (39.5 mmol) (S)~del<-9-en-2-ol under argon. Efter omrörning under 2 h tillsattes 470 mg (1.3 mmol) tetra-n- 10 15 20 25 30 35 528 488 butylammoniumjodid, följt av droppvis tillsats av 13.5 g (9,4 ml, 78.9 mmol) bensylbromid, medan omrörning fortsatte under 12 timmar. Därefter tillsattes 50 ml mättad vattenhaltig ammonlumkloridlösning vid 0 °C följt av 50 ml hexan. Det vattenhaltiga lagret separerades och extraherades fyra gånger med 100 ml av en 1:4- biandning av etylacetat/hexan. De förenade organiska lagren torkades över magneslumsulfat och koncentrerades in vacuo. Flash-kromatografi (5 % etylacetati hexan) levererade 9.7 g (39.4 mmol, 100 %) av (S)-2-bensyloxldek-9-en. (2R,9S)-Q-Bensyioxidekan-1,2-diol En kraftigt omrörd lösning av 6.0 g (243 mmol) (S)-2-bensyloxidek-9-en l 300 ml av en lzl-biandning av vatten och tert-butanol kyldes ner till -10 °C. Efter tillsats av 29.2 g AD-Mix ß (d.v.s. 1.2 g per mmol alken) rördes blandningen om vid 4 °C under 40 h.

Därefter tillsattes 30.0 g (158 mmol)' natriumdisulfit och blandningen rördes om vid 20 °C under ytterligare en timme. Den brunaktlga suspensionen extraherades tre gånger med 250 ml etylacetat. De organiska lagren förenades, torkades över magnesiumsuifat och koncentrerades in vacuo. Flash-kromatografl (etylacetat och hexan 1:1) levererade 4.2 g (15 mmol, 62 %) (2R,9S)-9-bensyioxidekan-LZ-diol som en färglös olja. (2R,9S)-9-Bensyioxi-1-(p-toiylsulfonyloxi)-dekan>2-oi Till en iskall lösning av 4.6 g (16.4 mmol) (2R,9S)-9-bensyioxidekan-1,2-diol i 50 ml absolut pyrldin tillsattes långsamt en lösning av 2.9 g (15 mmol) p-toiuensulfonylkiorid i 20 ml absolut pyrldin. Omrörnlng fortsatte under 5 timmar vid 0 °C och 12 timmar vid 4 °C. Därefter tillsattes 150 mi isvatten (bringat till pH 5 med 0.1 % saltsyra) och 60 mi dietyleter. Därefter extraherades det vattenhaltiga lagret fyra gånger med 120 mi dietyieter. De förenade organiska lagren tvättades tre gånger med 100 ml av en vattenhaitig, mättad lösning av koppar-Ihsuifat och två gånger med 100 ml saltlösning.

Det organiska lagret torkades över magneslumsuifat och koncentrerades in vacuo.

Flash-kromatografi (10 % etylacetat in hexan) levererade 4.6 g (10.5 mmol, 64 %) (2R,9S)-9-bensyloxi-1 (p-tolyisulfonyioxi) dekan-2-oi.

(ZS,9S)~2-Bensyloxiundekan-9-oi Tiil 11.8 ml av en kommersiellt tillgänglig lösning av 20 % metyimagnesiumklorid (31.4 mmol) i tetrahydrofuran tillsattes 20 ml absolut tetrahydrofuran. Lösningen kyldes ner till -78 °C och 595 mg (3.14 mmol) koppar-I-jodid tillsattes. Efter omrörning under 15 min, tillsattes en lösning av 4.55 g (10.5 mmol) (2R,9S)-9-bensyloxi-1(p- tolyisulfonyloxi)-dekan~2-ol i 10 mi absolut tetrahydrofuran under en period på 2 timmar. Lösningen värmdes upp till A-30 °C och rördes om under ytterligare en timme.

Därefter tillsattes 150 ml mättad vattenhaitig ammoniumklorid och 50 mi dietyleter vid 10 15 20 25 30 35 528 488 0 °C. Det vattenhaltiga lagret extraherades tre gånger med 150 ml etylacetat. De förenade organiska lagren torkades over magnesiumsulfat och koncentrerades in vacuo.

Flash-kromatografi (16 % etylacetati hexan) levererade 2.6 g (9.4 mmol, 90 %) (2S,9S)-2-bensyloxiundekan-Q-ol. (2S,9S)-Undekan~2,9-diol 'i'ili en lösning av 1.95 g (7 mmol) (25,95)~2-bensyloxlundekan-9-oi i 30 ml etanol tillsattes 20 mg Pd/C-katalysator. Hydrering genomfördes under en period på 12 timmar vid ett tryck på 40 atm. Efter slutförande av reaktionen, flltrerades kataiysatom bort över klseldioxid och lösningen koncentrerades in vacuo. Flash-kromatografi (etylacetat: hexan 1:1) gav 1.2 g (6.4 mmol, 92 %) (2S,9S)-undekan-2,9-diol. (2S,9S)-Diacetoxlundekan [2S,9S] En lösning av 1.40 g (7.4 mmol) (2S,9S)-undekan-2,9-diol l 20 ml absolut pyridin kyldes ner till 0 °C. Eftertiilsats av en liten mängd av ll-dlmetylamlnopyridln, tillsattes 2.3 g (2.1 ml, 22.3 mmol) ättlksyraanhydrld droppvis och blandningen rördes om under ytterligare två timmar vid rumstemperatur. Vanlig upparbetning följt av 'flash- kromatografi (7 % etylacetat i hexan) levererade 1.9 g (6.9. mmol 93 %) (2S,9S)- diacetoxiundekan. (25,10S)-Undekan-2,10-diol Under en argonatmosfär bereddes en Grignard-reagent av 2.5 g (10.9 mmol) 1,5- dibromopentan och 795 mg (32.6 mmol) nymaida magneslumbitari 25 mi absolut tetrahydrofuran vid 60 °C. Efter nedkylning tlii rumstemperatur, tillsattes lösningen droppvis till 1.24 g (1.5 ml, 21.7 mmol)"(S)-metyloxiran och 420 mg (2.17 mmol) Cu-I- jodld, upplöst i 10 ml absolut tetrahydrofuran vid -78 °C. Därefter värmdes lösningen upp till rumstemperatur och rördes om under ytterligare en timme. Efter tillsats av 250 ml mättad vattenhaltlg ammoniumkloridlösnlng, extraherades blandningen med 100 ml etylacetat. Det vattenhaitiga lagret separerades och extraherades tre gånger med 150 mi av en lzl-biandning av etylacetat och hexan. De förenade organiska extrakten torkades over magnesiumsulfat och koncentrerades In vacuo. Renlng med flash~ kromatografi (20 % hexan i etylacetat) levererade 1.1 g (5.84 mmol, 54 %) (2S,10S)- undekan-ZJO-dlol. (zsaosy-oiáceroxiunaekan [2s,1os1 - En lösning av 1.1 g (5.8 mmol) (2S,10S)-undekan-2,10-dlol i 15 ml absolut pyridin kyldes ner till 0 °C. Efter tillsats av en llten mängd av 4-dlmetylaminopyridin, tillsattes 1.79 g (1,66 ml, 17.5 mmol) ättiksyraanhydrid droppvis och blandningen rördes om under ytterligare två timmar vid rumstemperatur. Vanlig upparbetning följt av flash- 10 15 20 25 30 35 528 488 kromatografl (10 % etylacetati hexan) levererade 1.38 g (5.1 mmol, 87 %) (2S,10S)- dlacetoxiundekan. (2S)-Undeka'n-2~oi En Grlgnard-reagent bereddes av 2.8 g (14,7 mmol) 1-bromooktan och 900 mg (37.0 mmol) nymalda magnesiumbitar och reagerades med 853 mg (1.03 ml, 14.7 mmol) (S)-metyloxiran. Beredningsproceduren och upparbetnlngen följde protokollet som beskrivits för syntesen av (S)-dek-9-en-2-ol. Efter flash-kromatografl av råprodukten, (20 % etylacetat I hexan), erhölls 2.0 g (11.6 mmol, 79 %) (2S)-undekan~2-oi. (2S)-Acetoxiundekan Acetylering av 2.0 g (11.6 mmol) (2S)-undekan-2-oi följde protokollet som beskrivits ovan för acetyleringen av undekandlolerna. Upparbetning följd av flash-kromatografi (5 % etylacetat i hexan) levererade 2.3 g (10.7 mmol, 93 %) (2S)-acetoxlundekan.

Vlndtunnel Vindtunneiexperiment genomfördes i den andra till fjärde timmen av fotofasen vid 22 °C och 73 % r.h. i en vindtunnel beskriven iådetaij av Rauscher et al. (1984).

Föreningar späddes ut i hexan (p.a. grade). För de biologiska försöksmodellerna appiicerades 10 pl av stimulus som skulle testas på en bit fllterpapper (Chromatographiepapler "Schleicher & Schuell AG" Auer-Bittmann Souiié AG, Zürich, Schweiz, 69.2 gr/m2, 1 cmz), vilket däreflzer placerades i lufiströmmen åtminstone 20 sekunder innan den första hanen testades. För varje stlmulus, testades en serie på fem hanar individuellt, vilket erfordrade totalt 5-10 min för varje serie. För vaije serie, laddades en ny bit fllterpapper med respektive stlmulus.

Hanar hölls individuellt i glasrör (10 cm, 15 mm l diameter) förslutna vid en ände med en bit nät (maskstoriek 1 x 1 mm) tills de testades. Med dessa rör överfördes de in i vindtunnein, där röret placerades på en stolpe l horisontell position med öppningen mot vindens riktning, vid ett avstånd på 130 cm i vindens riktning från doftkäilan.

Tidsregistrering startades därefter och de följande stegen registrerades: aktivering genom vingslagnlng, flygstart, riktad flygnlng l riktning mot doñkällan, flygnlngar närmare än 30»cm från källan ("närmade slg"), landning på källan eller någon annanstans. Testet avbröts när någon aktivitet eller 'flygstart ej registrerades under 2 min eller när insekten landade någon annanstans.

Av de registrerade parametrarna analyserades endast antalet av lyckosamma landnlngar på källan. 10 15 20 25 30 35 528 488 10 Fältanalyser Blandnlngen med den största lockeisen l vlndtunneln testades l fältet. Behandlingar som testades var antingen dispensrar bestående av rödgummisepta (använda som lock för serumflaskor, VWR Intemational, S-220 09 Lund, Sverige, vikt = 1.7 g), eller bomullsrullar för dentalbruk (Hllibur et al., 2000) eller kontrollfällor utan feromondlspensrar.

Bomullsrullar klipptes av och en tredjedel användes per dispenser. Båda dlspensertyperna laddades med en 'blandning av 500 ng (25, 9S)-diacetoxiundekan, 1000 ng (2S,10S)-diacetoxlundekan och 10 ng (2S)-acetoxiundekan, utspätt I 20 ul hexan. Deltafälior tillverkade av vaxad kartong tlllhandahölis av PheroNet AB. De hade en höjd på 10 cm och en klibblg lnsatsdel på 15.5 x 9 cm. Dlspensrar placerades 1-2 cm över insatsdeien.

Fältanalysen genomfördes på en täppa med broccoli (B. o/eracea convar botrytis var. italica cv. Fiesta) två veckor före skördnlng. Vid detta stadium var plantorna 50-70 cm l höjd, bladhyddan var försluten och mellan broccoliplantorna växte mycket ogräs. Kärl innehållande substrat med 150 - 250 puppor i varje av laboratorieodlade myggor placerades l fältet. Två grupper om vardera 5 kärl arrangerades l mitten på fältet, på ett avstånd på 8 m från varandra. Kärlen ersattes av en ny omgång' 7 dagar senare.

Grupper med fällor placerades på 6 platser, alla mellan«3.5 och 5 m från den närmsta frigivnlngspunkten. Varje fällgrupp bestod av 6 fällor, tillhörande de tre olika behandlingama, var och en exponerad vid två olika höjder över marken. Fäilor med samma behandling fästes på samma stolpe vid 20 eller 55 cm över marken, och vid 30 - 40 cm från nästa stolpe tillhörande samma grupp. De kllbbiga insatsdelarna ersattes 5 gånger inom experlmentperioden på 10 dagar och myggor räknades med ett blnokulärt mikroskop.

Resultat Elektrofysiologl GC-EAD-anaiys av ovlposltorextrakt visade två toppar som framkallade en respons I hanantennen (fig. 2).

Kemi Masspektrumen för de två EAD-aktiva topparna (fig. 3) konstaterades visa ett liknande mönster som de för 2,11-diacetoxitridekan och 2,12-diacetoxitridekan, de huvudsakliga feromonkomponenterna hos ärtgailmyggan, C. p/'sl (Hlilbur et al., 1999). Slgnalerna l det högre massområdet pekade på en molekylmassa på M = 272, vilket föreslår att '10 15 20 25 30 35 528 488 11 målföreningarna är Zß-diacetoxiundekan och ZJO-dlacetoxiundekan. Detta stämde överens med en diagnostisk signal vid m/z 152 som representerar ett undekadien- fragment och med ett retentlonsindex som är lägre än det för C. písi~föreningarna.

Syntesen av de optlskt aktiva stereolsomererna av 2,10-diacetoxiundekan var okomplicerad (flg. 1).'Bís-Grignardreagenten av 1,4-dibromopentan (Aidrich) reagerades med optlskt aktivt Z-rnetyioxiran för att leverera (2R,10R)- respektive (25,10S)-undekan-2,10-diol. De motsvarande diacetatema aistrades vid reaktion med ättiksyraanhyddd. Med användning. av en kiral stationär fas, visade saminjektion av de syntetiska stereolsomerema och ett C. nasturtll-extrakt att endast (2S,10S)- diacetoxlundekan sameluerar med den naturliga produkten. I analogl därmed föreslår detta resultat starkt att den andra EAD-aktlva föreningen uppvisar (2595)- konflguration. Syntesen av målförenlngen startade från kommersiellt tillgängligt 1- bromohept-ö-en, som kedjeförlångdes med (S)-metyloxlran via Grignard-reaktion. Den resulterande (S)-2-dek~9-en~2-ol bensylerandes och reagerades med AD-Mix-ß för att leverera (2S,9S)-9-bensyloxidekan~1,2-dlol. Efter tosylering av den primära hydroxigruppen, genomfördes kedjeförlängnlng med metylmagnesiumklorld l närvaron av koppar-I-jodid. Debensylering vid hydrering och acetylering avslutade syntesen av (2S,9S)-2,9-diacetoxiundekan. Vid kiral gaskromatografl, sameluerade den syntetiska föreningen med den naturliga produkten.

Med användning av ett syntetiskt prov för att kontrollera retentionstlder och användning av "single ion monitoring* rnasspektrometrl (m/z 43, 87) hittade vid en målförening i det naturliga extraktet l ytterst små mängder. På grund av dess låga koncentration kunde vi emellertid ej bestämma den stereoisomera sammansättningen av den naturliga produkten.

Vindtunneianalyser Respons på honextrakt: Antalet hanar som flög mot vindens riktning och landade på dofikällan ökande med ökande doser av honextrakt på filterpappret (flg. WT 1). Vid dosen på 15 honekvivaienter, närmade sig 92 % av hanama doftkäilan och 80 % landade på den. Detta resultat bevisade att uppstäliningen var lämplig för att också testa syntetiska potentiella feromonföreningar.

Respons på syntetiska föreningar och blandningar: De identiflerade feromonkomponenterna framkallade ej responser riktade mot doftkälian (flg. WT 2).

Mindre än 15 % av de testade hanarna startade från frlglvningspunkten och inga hanar flög i riktning mot doftkällan. En blandning av de två huvudkomponenterna (2S,9S)- diacetoxiundekan och (2S,10S)-diacetoxiundekan blandade i ett förhållande liknande det för de två föreningarna i feromonkörtelextrakt stlmuierade som bäst 26 % av 10 15 20 25 30 35 528 488 12 hanama att uppvisa hela beteendesekvensen från flygstart till iancining på doftkällan (fig. WT 2). Tllisats av 2 % av (2S)-acetoxlundekan till blandningen gav en mycket attraktivare trekomponentsblandning med en landnlngsgrad på 86 % för den attraktivaste koncentrationen, för vilken totalt 250 hanar testades.

Optimering av den relativa koncentrationen av (2S)-acetoxiundekan: I blandningar med 1.5 ng/dispenser av (2S,9S)-diacetoxiundekan och 3.0 ng/dispenser av (2S,10S)- diacetoxiundekan, varierades koncentrationen av (2S)-acetoxiundekan för att hitta den optimala relativa koncentrationen för denna förening (fig. WT 3). En koncentration på 0.03 ng/dispenser visades vara den attraktivaste. Denna koncentration motsvarar den för dos-responskurvan i fig. WT 2. Medan koncentrationer av (ZQ-acetoxiundekan lika med eller lägre än 0.03 ng/dlspenser lnducerade landnlngar i åtminstone så många hanar som den binära blandningen gjorde (jfr. flg. WT 3, konc. (2S)-acetoxlundekan = 0), var högre koncentrationer hämmande och minskade signifikant andelen av hanar som landade. Följaktligen användes ett förhållande av komponenter motsvarande blandningen med 0.03 ng/dispenseri detta experiment, d.v.s. viktförhåliande (2535)- diacetoxiundekan : (2S,10S)~diacetoxiundekan : (25)-aoetoxiundekan = 1 : 2 : 0.02, i de följande fältexperimenten.

Fältanaiys med frigivna myggor Totalt 1500-2500 hanar frigavs för detta experiment och totalt 1543 hanar fångades in i de utsatta fällorna under~10 dagar. Ingen av kontrollfällorna utan feromondispensrar innehöll någon gång en C. nasturtíi av hankön (fig. Fält 1). Under hela analysen fångade fällorna i den lägre positionen l medeltal in 81.9 % =l= 2.12 av hanarna (medel =l= s.e., N = 5 tidpunkter för räkning av myggor). Detta indikerar att myggor, åtminstone för spridning över små områden inom grönsaksfält, flyger nära jorden.

Fällor med bomullsruliar som dlspensrar fångade in 88.4 % :t 2.35 av alla myggor som fångades in (medel å: s.e., N = 5 tidpunkter för räkning av myggor), vilket indikerar att feromonblandnlngen som avgavs från bomullsruilama- var attraktivare än den från gummlsepta, vilket kan bero på frlgivnlngshastigheten från och absorbansen till septa.

Analysen genomfördes i ett fält som hade haft lite skador av C. nasturt/I under de senaste åren. Följaktligen var det sannolikt att den naturliga populationen var låg under experimentet. Därför föreslår en jämförelse mellan det uppskattade antalet av frigivna myggor och de infångade hanarna en hög återlnfångningsgrad, förmodligen över 50 %, trots den samtidiga närvaron av honor som förmodligen lockade under viss tid av analysen. Detta indikerar en mycket hög effektivitet för fäilan inom det testade området 0 pa 3 ~ 5 m. 10 528 488 13 Fältanalys I denna preliminära fältanalys som sattes upp I brysselkål i området av Ins (Kanton Bern, Schweiz) fångade två fällor ln hanmyggor under sex veckor. Från de klibbiga pappren hos dessa fällor ldentiflerades totalt 100 hanmyggor baserat på en molekylär dlagnosmetod (Frey et al., lnsklckat) och alla visade sig vara C. nasturfii. Följaktligen finns det bevis för att den testade blandningen ej endast är attraktiv för C. nastuftií av hankön utan att denna lockelse också är artspeclfik l en väsentlig grad. För att befästa detta rön behövs mer bevis från alla C. nasturtIi-flygnlngar över hela säsongen. Vidare måste den utvecklade fällan testas l flera oilka områden med populationer av C. nasturtii över hela världen så att artspeclflcitet för fångstema kan fastställas för de respektive områdena. 10 20 25 30 35 528 488 14 REFERENSER FREY, J.E., FREY, B. OCH BAUR, R. 2004 (INSKICKAD). Molecular identification of the Swede Mldge Contarínia nasturtii (Diptera: Cecidomylidae) for surveys and testing the attractlveness and field-speclficlty of synthetlc pheromone blends. Canadian Entomologist.

Grass R, GRnss G, KHAsloN G, KING S, OLFERT 0, KAMINSKI L-A, LAMB R, BENNErr R. 2000.

Sex pheromone of the orange wheat blossom mldge, Sitodiplosls mose/lana.

Naturwlss. 87, 450-454 GRIES R, KHAsKIN G, GRIEs G, BENNm RG, KING GGS, MoREwooo P, SLEssoR KN, Moruswooo WD. 2002. (Z,Z)-4,7-Tridecadien-(S)-2-yl acetate: Sex pheromone of Douglas-fir cone gall mldge, Contarinía oregonensis. J. Chem. Ecol. 28, 2283-2297 HARius, M. O. och FosTsR, S. P. 1999. Gall mldges, pp. 27-49, I Har-die, J. och Mlnks, A.

K. (ed.). Pheromones of Non-Lepldopteran Insects Associated with Agricultural Plans. cAß International, oxfora, UK.

HILLBUR Y., ANoeRsoN P., ARN H., BENGTssoN M., LOFQUIST J., BmoLa AJ., SMrrr 0., HOGBERG H.-E., Puss E., FRANKE S., och FRANcKs W., 1999, Identlficatlon of sex pheromone components of the pea mldge, Contafinf písi (Dlptera: Cecidomyiidae).

Naturwissenschaiten 86:292-294. i HILLBUR Y, EL-SAYED A, BENGrssoN M. Lörqvzsr J, Broouæ A, PLAss E,- r-'RANcKE W. 2000.

Laboratory and field study of the attractlon of male pea midges, Contarínia písl, to synthetlc sex pheromone components. J. Chem. Ecol. 26, 1941-1952 HILLBUR Y, BENGTssoN M, LoFQwsT J, Bloc-Le A, PILLON 0, PLAss E, FRANCKE, W, HAußERG E. 2001. A chlral sex pheromone system in the pea midge, C. plsi. J. Chem. Ecol. 27, 1391-1407 Hxußun Y., 2001, Tracking the tíny - identificatlon of the sex pheromone of the pea mldge as a prerequlslte for pheromone-based monitoring. Doktorsavhandling, SLU, Agraria 275 Rauscher, S., Arn, H., Guerin, P. 1984. Effects of dodecyl acetate and Z-IO-Tridecenyl acetate on attraction of Eupoeci/la amblguella maies to the main sex pheromone component, Z-9-Dodecenyl acetate. J. Chem. Ecol. 10:253-264.

ZHANG, A., Roßsms, P. S., LEAL, W. S., LINN, C. E., VILIANI, G., och RoELoFs, W. L. 1997.

Essential amlno aclcl methyl esters: major sex pheromone components of the cranberry white grub, Phyllophaga anxia (Coleoptera: Scarabldae). J. Chem. Ecol. 23:231~245.

Claims (2)

1. 0 15 20 25 30 528 488 IS PATENTKRAV 1. Feromonblandning innefattande 2,9-diacetoxiundekan, 2,10-diacetoxiundekan och 2-acetoxiundekan, som ett racemat eller biologiskt aktiva stereoisomerer därav. Feromonen 2,9-diacetoxiundekan som ett racemat eller en biologiskt aktiv stereoisomer därav. Feromonen 2,10-diacetoxiundekan som ett racemat eller en biologiskt aktiv stereoisomer därav. Feromonblandning för C. nasturtii innefattande (2S,9S)-diacetoxiundekan, (25,1OS)-diacetoxiundekan och (2S)-acetoxiundekan. Sexualferomonet (2S,9S)-diacetoxlundekan för C. nasturtíi. Sexualferomonet (ZS,1OS)-diacetoxiundekan för C. nasturtií. Blandning enligt patentkrav 1 eller 4, där (2S,9S)-diacetoxiundekan, (2S,10S)- diacetoxiundekan och (2S)-acetoxiundekan ingåri ett viktsförhållande på 1:0.5- 3:0.001-0.05, fÖreträdeSViS 1122002. Metod för förhindrande av angrepp av C. nasturtii på kål, där en sexualferomonsblandning för C. nasturtii innefattande (2S,9S)- diacetoxiundekan, (25,105)-diacetoxiundekan och (2S)-acetoxiundekan används för att övervaka, fånga in, attrahera och döda och/eller störa parning används i sådana mängder för att fånga in, attrahera & döda eller störa parning av nämnda C. nasturtii. Metod för övervakning av C. nasturtii, där man applicerar 2,9-diacetoxiundekan, 2,10-diacetoxiundekan och 2-acetoxiundekan antingen som ett racemat och/eller som en biologiskt aktiv stereoisomer, i en kombination, i en fälla i samband med ett fält eller ett geografiskt område som skall övervakas med avseende på närvaron av C. nasturtii. 10 15 20 25 30 10. 11. 12. 13. 14. 15. 528 488 lb Metod för prognostisering (övervakning) av C. nasturtii enligt patentkrav 11, där man applicerar (2S,95)-diacetoxiundekan, (25,105)-diacetoxiundekan och (25)- acetoxiundekan antingen som ett racemat och/eller som en biologiskt aktiv stereoisomer, i en kombination. Metod för bekämpning av C. nasturtii, där man applicerar 2,9-diacetoxiundekan, 2,10-diacetoxiundekan och 2-acetoxiundekan, antingen som ett racemat och/eller som en biologiskt aktiv stereoisomer, i en kombination, i samband med ett fält, som skall kontrolleras, för spridning av dessa föreningar för parningsstörning. Metod för bekämpning av C. nasturtii enligt patentkrav 11, där man applicerar (2S,9S)-diacetoxiundekan, (25,105)-diacetoxiundekan och (25)- acetoxiundekan, antingen som ett racemat och/eller som en biologiskt aktiv stereoisomer, i en kombination. Dispenser innefattande sexualferomonföreningarna 2,9-diacetoxiundekan, 2,10- diacetoxiundekan och 2-acetoxiundekan, som racemat eller biologiskt aktiva stereoisomerer i en kombination för prognostisering (övervakning) och/eller bekämpning av C. nasturtil. Dispenser enligt patentkrav 13, innefattande sexualferomonföreningarna (2S,9S)-diacetoxiundekan, (25,10S)-diacetoxiundekan och (2S)-acetoxiundekan i en kombination, vid beredningen av en dispenser för prognostisering (övervakning) och/eller bekämpning av C. nasturtii. Dispenser enligt patentkrav 13-14, där 2,9-diacetoxiundekan, 2,10- diacetoxiundekan och 2-acetoxiundekan ingår i ett viktsförhållande på omkring 1:0,5-3:0.001~0.05, företrädesvis 1:2:0.

2.