SE521022C2 - Mjölksyraproducerande bakterier för användning som probiotiska organismer i vaginan hos människa - Google Patents

Description

lO 15 20 25 30 35 . , . . . , 521 022 3~~2 2 Släktet Pediococcus är fenotypiskt en grupp av Gram- positiva, katalas-negativa, fakultativt anaeroba, syre- toleranta, rundformiga (diameter ca 0,6-1,0 pm), icke- patogena, mjölksyraproducerande bakterier. (ca 15-60 år) pH av ca 3,8-4,2 i vaginan mellan menstruationer, huvud- Friska, fertila kvinnor uppvisar ett sakligen som en följd av nämnda mjölsyraproduktion. En sur miljö förhindrar vaginal etablering av exempelvis bakterier som förekommer i tjocktarmen, såsom Gardnerella vaginalis, Mobiluncus, Bacteroides, Prevotella och Eschericha coli.

Huden i det urogenitala området och de urogenitala slemhinnorna hos en frisk kvinna härbärgerar en specifik flora av nyttiga mikroorganismer och/eller mikroorganis- mer som lever i kommensalism, såsom olika Lactobacillus- arter. Det urogenitala området kan emellertid också kolo- niseras av sjukdomsalstrande mikroorganismer. Koloniser- ingen av oönskade mikroorganismer kan vara en följd av sexuell överföring, det kan ske spontant eller det kan vara följden av en störd normal mikrobiell flora. Det se- nare är exemplevis känt för att inträffa efter vissa an- tibiotika behandlingar.

Den mikrobiella floran i det urogenital området hos kvinnor, såsom i vaginan, kan störas och förändras av en mikrobiell infektion, såsom jäst (Candida albinancs), Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae och Chlamy- dia trachomatis, och bakteriell vaginos (kännetecknad av ökad förekomst av Gardnerella vaginalis och Mobiluncus), en antibiotikabehandling eller andra ofta komplexa orsa- ker.

Under menstruation och sexuellt umgänge ökas pH i vaginan genom tillsats av blod respektive sperma. Dessa vätskor innehåller en mängd proteiner, som kan spjälkas av bakterier (t ex Gardnerella vagnalis och Mobiluncus), vilka, såsom tidigare beskrivits, kan etablera sig i va- ginan under förhållanden av ökat pH. Nedbrytningsproduk- ter, såsom aminer (t ex putreskin och kadacerin) produce- 10 15 20 25 30 35 521 022 3 ras dä. Vid ökat pH blir dessa aminer flyktiga och ger en “fiskaktig” lukt. Dessutom har dessa kvinnor ofta besvär med ökad vaginal flytning och irritation. Detta tillstànd kallas bakteriell vaginos (BV) och är det mest vanliga tillstànd som förknippas med irritation och ökad mängd luktande vaginal flytning (se Morris, M; Nicoll, A; Simms, I; Wilson, J; Catchpole, M, Bacterial vaginosis: A public health review, British Journal of Obstetrics and Gynaecology, lO8(5):439-450, maj 2001).

Bakteriell vaginos tros vara följden av att undan- trängda vaginala mjölksyraproducerande bakterier ersätts av en rad oönskade arter, såsom Gardnerella vaginalis, Bacterioides, Mobiluncus, Prevotella bivia och Mycoplasma hominis.

En metod för att diagnostisera bakteriell vaginos (BV) beskrivs av Amsels Kriteria. Först mäts pH för vagi- nal flytning. Hos ca 90% av kvinnor med BV är pH förhöjt över ca 4,5. För det andra, om 10% KOH sätts till den va- ginala flytningen kommer en “fiskaktig” lukt att frigöras hos ca 70% av kvinnor med BV. För det tredje observeras för vått prov pá objektglas ofta förekomst av fjälliga epitelceller täckta med kockerbakterier (”clue”-celler).

Andra tillförlitliga test avseende BV är direkt Gram- färgning av vaginal vätska. En standardiserad metod för tolkning av Gram-färgningar avseende BV har presenterats av Nugent et al. (Se Exempel 1.) Det är känt att mjölksyraproducerande bakterier har en förmåga att hämma tillväxt och/eller minska patogene- sen av mànga av de patogener som är förknippade med uro- genitala infektioner (se t ex Redondo-Lopez, V; Cook, R L; Sobel, J D, Emerging role of lactobacillus in the con- trol and maintenance of the vaginal bacterial microflora, Reviews of infectious diseases, vol 12, nr 5, sep-okt 1990, och Boris, S; Barbes, C, Role played by lactobacil- li in controlling the population of vaginal pathogens, Microbes and infektion, vol 2, sid 543-546, 2000). 10 15 20 25 30 35 521 022 4 Det är också känt att de antagonistiska egenskaperna av mjölksyraproducerande bakterier mot nämnda patogener är åtminstone delvis utmärkande för deras förmåga att producera olika antagonistiska substanser, sàsom mjölksy- ra, väteperoxid, bakteriociner, etc.

En frisk vagina uppskattas härbärgera mellan 108-109 cfu (=kolonibildande enheter) mjölksyraproducerande bak- terier. Sammansättningen av denna flora är en följd av vilka specifika stammar som kvinnan har ärvt från sin mamma och/eller vilka stammar som har migrerat från hen- nes matsmältningskanal till det urogenitala området.

Tidigare känd teknik beskriver beredningar, såsom suspensioner, suppositorier och gelatinkapslar, innefat- tande livskraftiga mjölksyraproducerande bakterier. Såda- na beredningar beskrivs exempelvis i US 5 466 463 och WO 9 309 793.

Vidare är det känt att impregnera absorberande ar- tiklar, såsom tamponger och bindor, med mjölksyraproduce- rande bakterier i syftet att bevara en normal mikrobiell flora i det urogenitala omrààdet hos kvinnor och därmed förhindra urogenitala infektioner eller återskapa en nor- mal mikrobiell flora i det urogenitala området hos kvin- nor. En sådan produkt beskrivs i EP O 594 628 och den svenska patentansökan 0003544-4.

För att erhålla ovan beskrivna effekt är det dock avgörande att de uropatogenhämmande, mjölksyraproduceran- de bakterierna verkligen koloniserar och etablerar sig in vivo och faktiskt finns kvar i vaginan under mer än en menstruationscykel vid vaginal administrering.

Huruvida en bakteriestam kommer att kolonisera vagi- nan eller ej beror av den specifika bakteriestammens ad- hesiva egenskaper såväl som vaginans hormon-, närings- och surhetsstatus. Pågående genital infektion eller be- handling med antibiotika kommer också att påverka förmå- gan hos en införd stam att kolonisera vaginan.

Avseende kolonisering och etablering av mjölksyra- producerande bakterier in vivo kan det vara en avsevärd 10 15 20 25 30 521 022 5 skillnad mellan kliniska resultat och förmodat bakterie- beteende utifrån tolkning av in vitro analysresultat. Det är vanligt att interaktioner mellan olika bakteriearter förekommer i vaginan och detta interaktionsmönster är svårt att återskapa i laboratoriet. Även om en bakterie- art uppvisar lovande in vitro resultat kommer den kanske sålunda inte att etablera sig in vivo och åstadkomma den önskade terapeutiska effekten, d v s att förhindra, lind- ra effekterna av och/eller behandla en mikrobiell infek- tion i det urogenitala området.

Vidare är det av stor betydelse att bakterierna upp- visar stabilitet av sin genetiska profil både vid uppre- pad odling i storskalig produktion och under längre peri- oder in vivo.

Ett annat kriteria som måste uppfyllas för att fram- ställa en acceptabel konsumptionsprodukt som ger den öns- kade terapeutiska effekten är bibehàllandet av bakteriell livskraft vid frystorkning av bakterierna och vid förva- ring av de frystorkade bakterierna (d v s hållbarhet).

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning beskriver nya isolerade bak- teriestammar av släktena Lactobacillus och Pediococcus, vilka stammar har en förmåga att kolonisera och bli eta- blerade i vagina hos människa vid vaginal administrering av minst en av bakteriestammarna. Bakterierna anses eta- blerade om bakterierna fortfarande förekommer i vaginan efter minst två menstruationscykler från tidpunkten för administrering.

Etablerade mjölksyraproducerande bakterier av nämnda stammar förhindar, lindrar effekterna av och/eller be- handlar en mikrobiell infektion i det urogenitala områ- det, i synnerhet bakteriell vaginos. För att erhålla des- sa terapeutiska effekter är det nödvändigt att bakterier- na verkligen etablerar sig vid administrering och sålunda fortfarande förekommer i vaginan även efter flera men- struationsblödningar. 10 15 20 25 30 35 521 022 6 Nämnda bakteriestammar har deponerats i enlighet med Budapest-överenskommelsen vid BCCM/LMG (Belgian Coordina- ted Collections of Mikroorganisms/Laboratorium voor Mic- robioligie-Bacteriënverzammeling, Universiteit Gent) i Belgien den 14 juni 2001, och innefattar den stam av Lac- tobacillus gasseri, av sökande betecknad som LN 40, som deponerats under nummer LMG P-20560, den stam av Lactoba- cillus casei underart rhamnosus, av sökande betecknad som LN 113, av Lactobacillus fermentum, av sökande betecknad som LN som deponerats under nummer LMG P-20562, den stam 99, som deponerats under nummer LMG P-20561, den stam av Lactobacillus crispatus, av sökande betecknad som LN Ol, som deponerats under nummer LMG P-20558, och den stam av Pediococcus acidilactici, av sökande betecknad som LN 23, som deponerats under nummer LMG P-20559, eller varianter därav med väsentligen motsvarande fenotypiska och/eller genotypiska kännetecken.

Vidare beskriver föreliggande uppfinning ett förfa- rande för isolering av en bakteriestam av släktet Lacto- bacillus eller Pedicoccus med förmågan att kolonisera och bli etablerad i vagina hos människa, i vilket a) ett bakterieprov, såsom vaginal vätska, samlas upp fràn det vaginala omrâdet hos en kvinna med en normal, frisk vaginal mikroorganismflora, b) mjölksyraproducerande bakterier väljs ut frän det vaginala provet från steg a), c) de mjölksyraproducerande bakterierna från steg b) renodlas in vitro i ett lämpligt näringsmedium vilket ger minst en isolerad bakteriestam, d) minst en renodlad bakteriestam fràn steg c) och/eller en kombination av minst tvä bakterie- stammar från steg c) utvärderas med avseende pà dess förmåga att kolonisera och bli etablerad i vaginan vid vaginal administrering av bakterie- stammen till en kvinna med en störd vaginal mik- roorganismflora, varvid nämnda bakteriestam eller -stammar anses etablerad(e) om bakteriestammen 10 15 20 25 30 35 521 022 7 eller -stammarna fortfarande förekommer i vaginan efter minst två menstruationscykler från tidpunk- ten för administrering, och e) minst en bakteriestam från steg d) som uppvisar nämnda förmåga att kolonisera och bli etablerade i vaginan väljs ut.

Företrädesvis frystorkas minst en renodlad bakterie- stam från steg c) och/eller en kombination av minst två bakteriestammar från steg c).

Vidare utvärderas och väljs denna stam/dessa stammar företädesvis ut med avseende på stabilitet av bakterie- livskraft vid frystorkning och frystorkade bakteriers livskraft under långa förvaringsperioder, varvid nämnda bakteriella livskraft anses stabil om minst 40% av bakte- rierna har en bevarad livskraft vid frystorkning och för- varing av de frystorkade bakterierna vid ca -l8°C under minst 12 månader.

Dessutom utvärderas och väljs denna stam/dessa stam- mar företädesvis ut med avseende på genetisk stabilitet vid upprepad odling och in vivo vid vaginal administre- ring, varvid nämnda bakterier anses genetiskt stabila om deras genetiska profil bevaras in vivo under minst 12 må- nader.

Föreliggande uppfinning beskriver även en bakterie- stam av släktet Lactobacillus eller Pedicoccus som har förmåga att kolonisera och bli etablerad i vagina hos människa varvid stammen kan isoleras enligt ovan beskriv- na förfarande. Sådana bakteriestammar är företrädesvis den stam av Lactobacillus gasseri, av sökande betecknad som LN 40, som deponerats under nummer LMG P-20560, den stam av Lactobacillus casei underart rhamnosus, av sökan- de betecknad som LN 113, P-20562, den stam av Lactobacillus fermentum, betecknad som LN 99, 20561, den stam av Lactobacillus crispatus, av sökande betecknad som LN 01, 20558, och den stam av Pediococcus acidilactici, av sö- som deponerats under nummer LMG av sökande som deponerats under nummer LMG P- som deponerats under nummer LMG P- 10 15 20 25 30 35 521 022 8 kande betecknad som LN 23, LMG P-20559, svarande fenotypiska och/eller genotypiska kännetecken. som deponerats under nummer eller varianter därav med väsentligen mot- Dessutom beskriver föreliggande uppfinning en kompo- sition för profylaktisk behandling och/eller behandling innefattande LN 113, LN 99, av infektioner i det urogenitala omrâdet, minst en av nämnda bakteriestammar (LN 40, LN Ol Och LN 23).

Företrädesvis innefattar kompositionen alla nämnda stammar, d v s stam LN 40, stam LN 113, stam LN 99, LN 01 och stam LN 23.

Det är känt inom omrâdet att en kombination av olika stam bakterier förkortar en bakteries generationstid, vilket resulterar i en snabbare bakterietillväxt. Vidare, efter- som olika arter av mjölksyraproducerande bakterier har olika fermentationsmönster och egenskaper är det föredra- get att använda en kombination av olika bakteriearter.

Kompositionen formuleras företädesvis för vaginal kapsel, såsom ett suppositorium, piller, spray, annan form av vagitorium. administrering, tablett, suspension, gel, kräm, pulver eller någon Dessutom beskriver föreliggande uppfinning en sani- tetsartikel, såsom en absorptionsprodukt för kvinnor binda, trosskydd), kontinensskydd, för profylaktisk behandling och/eller be- (t ex tampong, en blöja, och ett in- handling av infektioner i det urogenitala omrâdet inne- fattande minst en av nämnda bakteriestammar (LN 40, LN 113, LN 99, LN oi, och LN 23).

Företrädesvis innefattar sanitetsartikeln alla nämn- da stammar, d v s stam LN 40, stam LN 113, stam LN 99, stam LN 01 och stam LN 23.

Sanitetsartikeln är företrädesvis en tampong.

Vidare beskriver föreliggande uppfinning användning- en av minst en av nämnda bakteriestammar (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01, och LN 23) tion eller en sanitetsartikel för profylaktisk behandling för framställning av en komposi- och/eller behandling av infektioner i det urogenitala om- l0 15 20 25 30 35 _ * - = - v v 1 1 « . - * ' v * f v r ø a _ , , . 1 i » v 4 . | f 1 Q '~ '- I 1 \ _ _ V , f . , , i 5 1 ' ^ ~ i v » _ , . 9 rådet, företrädesvis bakteriell vaginos eller någon annan bakteriell rubbning i vaginan, varvid minst en av nämnda (LN 40, LN ll3, LN 99, LN Ol OCh LN 23) administreras vagipalt i en terapeutiskt effektiv mängd bakteriestammar för att förhindra, lindra effekterna av och/eller behand- la en mikrobiell infektion.

Andra särdrag och fördelar av föreliggande uppfin- ning kommer att tydliggöras från följande detaljerade be- skrivning av uppfinningen.

Kort beskrivning av ritningar Fig 1 visar tillväxtprocessen av bakteriestammar LN 40, LN 99, LN ll3 respektive LN 23.

Fig 2 visar en bild av en gel med stamspecifika pro- dukter alstrade genom att använda RAPD och gelelektrofo- Stammar LN 40, LN 99, LN 113, LN 01 respektive LN 23 jämförs med typstammar av respektive bakterieart.

IES .

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Såsom den används här avser termen “mjölksyraprodu- cerande bakterier” bakterier som genom fermentation pro- ducerar mjölksyra.

Såsom den används här avser termen “terapeutiskt ef- fektiv mängd” en mängd som kommer att ge den önskade te- rapeutiska effekten.

Den önskade terapeutiska effekten är profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det uro- genitala området, såsom bakteriell vaginos eller någon annan bakteriell rubbning i vaginan.

Såsom den används här avser termen “isolerad bakte- riestam” att stammen kan odlas in vitro i en odlingskul- tur innefattande nämnda stam.

Såsom den används här avser termen “bakterieprov” ett prov innefattande bakterier. Provet kan exempelvis vara vaginal vätska/flytning.

Såsom den används här avser termen “normal, frisk vaginal mikroorganismflora” att kvinnan inte har några vaginala besvär och att Gram-färgningen av det vaginala 10 15 20 25 30 b) U'| 521 10 provet ger en total poäng av 0-3 enligt den metod som presenteras av Nugent et al (se Exempel 1).

Såsom den används här avser termen “störd vaginal mikroorganismflora” att kvinnan har vissa vaginala be- svär, såsom ökad vaginal flytning och/eller “fiskaktig” vaginal lukt. Vidare ger Gram-färgningen av det vaginala enligt provet en total poäng av minst 4, i synnerhet 2 7, den metod som presenteras av Nugent et al (se Exempel 1).

Såsom den används här avser termen “lämpligt när- ingsmedium” ett medium, såsom LAB-buljong eller MRS- buljong, i vilket bakterierna kan odlas.

Såsom den används här avser termen “sanitetsartikel" tamponger (både digitala tamponger och tamponger med en applikator), bindor, trosskydd, blöjor, inkontinensskydd och liknande.

Föreliggande uppfinning beskriver nya isolerade stammar av mjölksyraproducerande bakterier av släktena Lactobacillus och Pediococcus, vilka stammar har en för- måga att kolonisera och bli etablerade i vagina hos män- niska vid vaginal administrering av minst en av bakte- riestammarna. Bakterierna anses etablerade om bakterierna fortfarande förekommer i vaginan efter minst två menstru- ationscykler från tidpunkten för administrering.

Nämnda bakteriestammar har deponerats i enlighet med Budapest-överenskommelsen vid BCCM (Belgian Coordinated Collections of Mikroorganisms) i Belgien den 14 juni 2001, av sökande betecknad som LN 40, mer LMG P-20560, och innefattar den stam av Lactobacillus gasseri, som deponerats under num- den stam av Lactobacillus casei underart rhamnosus, av sökande betecknad som LN 113, som depone- rats under nummer LMG P-20562, den stam av Lactobacillus fermentum, av sökande betecknad som LN 99, som deponerats under nummer LMG P-20561, den stam av Lactobacillus cris- patus, av sökande betecknad som LN 01, som deponerats un- der nummer LMG P-20558, av sökande betecknad som LN 23, och den stam av Pediococcus aci- dilactici, som deponerats under nummer LMG P-20559, eller varianter därav med vä- 10 15 20 25 30 35 521 022 ll sentligen motsvarande fenotypiska och/eller genotypiska kännetecken.

Vidare beskriver föreliggande uppfinning ett förfa- rande för isolering av en bakteriestam av släktet Lacto- bacillus eller Pedicoccus med förmàgan att kolonisera och bli etablerad i vagina hos människa, i vilket a) ett bakterieprov, såsom vaginal vätska, samlas upp fràn det vaginala området hos en kvinna med en normal, frisk vaginal mikroorganismflora, b) mjölksyraproducerande bakterier väljs ut fràn det vaginala provet från steg a), c) de mjölksyraproducerande bakterierna fràn steg b) renodlas in vitro i ett lämpligt näringsmedium vilket ger minst en isolerad bakteriestam, d) minst en renodlad bakteriestam från steg c) och/eller en kombination av minst två bakterie- stammar fràn steg c) utvärderas med avseende pà dess förmåga att kolonisera och bli etablerad i vaginan vid vaginal administrering av bakterie- stammen till en kvinna med en störd vaginal mik- roorganismflora, varvid nämnda bakteriestam eller -stammar anses etablerad(e) om bakteriestammen eller -stammarna fortfarande förekommer i vaginan efter minst tvà menstruationscykler fràn tidpunk- ten för administrering, och e) minst en bakteriestam från steg d) som uppvisar nämnda förmåga att kolonisera och bli etablerad i vaginan väljs ut.

Företrädesvis frystorkas minst en renodlad bakterie- stam fràn steg c) och/eller en kombination av minst tvà bakteriestammar fràn steg c).

En väsentlig mängd av bakterierna bör vara livskraf- tiga efter frystorkning och sedan bevara sin livskraft vid förvaring. Vidare bör en väsentlig mängd frystorkade bakterier som formuleras i exempelvis kompositioner 0 och/eller sanitetsartiklar för kommersiell försäljning bevara sin livskraft vid förvaring vid rumstemperatur. 10 15 20 25 30 35 521 022 §;§¿,¿§¿ l2 Sålunda utvärderas och väljs företrädesvis nämnda stam/stammar ut med avseende på stabilitet av bakteriell livskraft vid frystorkning och livskraft av frystorkade bakterier under långa förvaringsperioder, varvid nämnda bakteriella livskraft anses stabil om minst 40% av bakte- rierna har en bevarad livskraft vid frystorkning och för- varing av de frystorkade bakterierna vid ca -18°C under minst 12 månader.

Vidare bör minst 1% av de frystorkade bakterierna, som formuleras i någon sorts bevarande matris, såsom en olja, och innesluts i en komposition och/eller en sani- tetsartikel, bevara sin livskraft under minst 12 månader vid rumstemperatur.

Vidare är en viktig egenskap stabiliteten av den bakteriella genetiska profilen vid upprepad odling i storskalig produktion och under tillverkningsprocesser av exempelvis kompositioner och sanitetsartiklar. Bakterier- na bör företrädesvis bevara sin genetiska profil under minst 10 upprepade odlingar. Vidare bör bakterierna upp- visa genetisk stabilitet in vivo under längre perioder efter administrering, såsom minst 12 månader. Sålunda ut- värderas och väljs nämnda stam/stammar företrädesvis ut med avseende på genetisk stabilitet in vivo vid vaginal administrering, varvid nämnda bakterier anses vara gene- tiskt stabila om deras genetiska profil bevaras in vivo under minst 12 månader. Dessutom är även bakterietillväx- ten och generationstiden väsentlig. Vaginalt administre- rade frystorkade bakterier bör börja att växa inom minst 4 timmar från tidpunkten för administrering. Generations- tiden bör vara mindre än 2 h.

Föreliggande uppfinning beskriver också en bakterie- stam av släktet Lactobacillus eller Pedicoccus med förmå- gan att kolonisera och bli etablerad i vagina hos männi- ska, varvid stammen kan isoleras enligt ovan beskrivna förfarande. Sådana bakteriestammar är företrädesvis den stam av Lactobacillus gasseri, av sökande betecknad som LN 40, som deponerats under nummer LMG P-20560, den stam 10 15 20 25 30 35 .í M1. 521 022 13 av Lactobacillus casei underart rhamnosus, av sökande be- tecknad som LN 113, som deponerats under nummer LMG P- 20562, betecknad som LN 99, som deponerats under nummer LMG P- 20561, betecknad som LN 01, som deponerats under nummer LMG P- 20558, kande betecknad som LN 23, LMG P-20559, svarande fenotypiska och/eller genotypiska kännetecken. den stam av Lactobacillus fermentum, av sökande den stam av Lactobacillus crispatus, av sökande och den stam av Pediococcus acidilactici, av sö- som deponerats under nummer eller varianter därav med väsentligen mot- Isolering och utvärdering av Lactobacillus- och Pediococ- cus-stammar Bakteriestammar av släktena Lactobacillus och Pedi- coccus med förmågan att kolonisera och bli etablerade i vagina hos människa isolerades enligt följande steg: - vaginal vätska samlades upp fràn det vaginala om- rådet hos en kvinna med en normal, frisk vaginal mikroorganismflora, - mjölksyraproducerande bakterier (ca 25 olika stam- mar) valdes ut från den vaginala vätskan genom att placera ett utstryksprov av nämnda vätska pà MRS- agar selektiv för mjölksyraproducerande bakterier (enstaka kolonier plockades och ströks ut pà en platta med ny MRS-agar för kontroll av renhet), - de mjölksyraproducerande bakterierna renodlades därefter in vitro i ett lämpligt näringsmedium, och under lämpliga betingelser (pH, temperatur, etc) vilket gav isolerade bakteriestammar, och - de renodlad bakteriestammarna utvärderades däref- ter med avseende pà dess förmåga att kolonisera och bli etablerade i vaginan vid vaginal admini- strering av bakteriestammarna till en kvinna med en störd vaginal mikroorganismflora.

LN 40 renodlades mikroaerofiliskt i LAB-buljong (ca pH 6,5) vid ca 37°C.

LN 113 renodlades mikroaerofiliskt i MRS-buljong (ca pH 6,5) vid ca 37°C. 10 15 20 25 30 35 521 022 14 LN 99 renodlades mikroaerofiliskt i LAB-buljong (ca pH 6,5) micro-aerofilic vid ca 37°C.

LN 01 renodlades anaerobt i MRS-buljong (ca pH 6,5) vid ca 37°C.

LN 23 renodlades mikroaerofiliskt i MRS-buljong (ca pH 6,5) vid ca 37°C.

De renodlade bakteriestammarna utvärderades först med avseende pà generationstid. De bakteriestammar (ca 15 olika stammar) som uppvisade en generationstid < 30 minu- ter valdes ut. Dessa utvalda stammar selekterades på grundval av deras förmåga att hämma tillväxten av vissa mikroorganismer in vitro (data visas inte). Först utvär- derades förmågan att hämma tillväxt av Staphilococcus Enterococcus cloace, epidemidis (två olika stammar), Eschericha coli, Serratia marcesus, Micrococcus lysodeic- ticus, och Candida albicans. 8 olika bakteriestammar (7 stammar av släktet Lactobacillus och 1 stam av släktet Pediococcus) uppvisade denna förmåga och valdes sålunda ut. Dessa 8 stammar utvärderades vidare med avseende på förmågan att hämma tillväxt av uropatogenen Gardernella vaginalis. De bästa stammarna (d v s de stammar med bäst möjlighet att kolonisera en störd vaginal mikroorganism- Var LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 och LN 23.

Dessa stammar utvärderades vidare med kliniska stu- flora) dier, varvid bakterierna ansågs etablerades i vaginan om bakterierna fortfarande fanns i vaginan efter minst två menstruationscykler från tidpunkten för administrering (bakterieadministreringen påbörjades under den första menstruationen). De bakteriestammar (LN 40, LN 113, LN 99, LN Ol och LN 23) som uppvisade nämnda förmåga att ko- lonisera och bli etablerade i vaginan valdes ut.

Dessutom utvärderades stabilitet av bakteriell livs- kraft vid frystorkning och livskraft av frystorkade bak- terier under långa förvaringsperioder (hållbarhet), beva- rande av genetisk profil vid upprepad odling och in vivo, och bakteriell tillväxtprocess. lO 15 20 25 521 022 15 Exempel 1: Kolonisering och etablering av mjölksyraprodu- cerande bakterier vid vaginal administrering 15 BV-patienter (kvinnor som hade diagnosticerats att ha bakteriell vaginos) studerades. Alla 15 patienter behandlades med klindamycin-vagitorier (Dalacin® 2 % va- gitorier, fràn Pharmacia) under 3 dagar. Därefter fort- satte behandlingen med en dubbelblind, placebokontrolle- rad del där 6 patienter använde tamponger innefattande ca 103 cfu frystorkade bakterier av stammarna LN 01, LN 23, LN 99, rioden efter antibiotikabehandlingen. De övriga 9 patien- LN 113 och LN 40 under den första mentruationspe- terna använde konventionella tamponger utan mjölksyrapro- ducerande bakterier. Under den andra menstruationsperio- den använde alla 15 patienterna konventionella tamponger utan mjölksyraproducerande bakterier och ett vaginalt prov togs några dagar efter denna menstruation.

De vaginala proverna Gram-färgades. Med den standar- diserade Gram-färgningsmetoden, som presenterats av Nu- gent et al utvärderas förekomsten eller frånvaron av vis- sa bakteriemorfotyper. Morfotyperna är stora, Gram- positiva baciller av Lactobacillus-morfotypen; mindre Gram-växlande baciller kallade Gardnerella-morfotypen; och bàgformiga stavar. De organismer som förekommer i va- ginal vätska kvantifieras och överförs till en poäng (se Tabell 1).

Tabell 1 Kod Lactobacillus- Gardnerella- och Bàgformig Poäng morfotyp Bacteroides- Gram-växlande morfotyper stav 4+ O O O 3+ 1+ 1+ or 2+ 1 2+ 2+ 3+ or 4+ 2 1+ 3+ 3 O 4+ 4 10 15 521 022 16 v. u.

Kod O to 4+ baseras pà medelantalet organismer med den morfotypen per oljeimmersionsfält; l+, 2+, 1-4 förekommer; 3+, 5-30 förekommer; 4+, <1 förekommer; 2 30 före- kommer. En total poäng erhàlls genom att addera poängen för alla tre morfotyperna. Den totala poängen tolkas sä- som följer: 0-3, normal; 4-6, intermediär; och 27, BV.

Tabell 2 Patient nr Gram-färgning Tamponger Gram-färgning före studie- (M = mjölksy- efter den start raproduceran- andra men- de bakterie) struationspe- rioden 1 7 M O 2 8 M O 3 9 7 4 5 4 5 10 O 6 8 4 7 8 M O 8 9 4 9 4 M O 10 8 4 ll 8 4 12 8 O 13 8 M l 14 O 5 15 9 M O Bakteriell vaginos detekterades inte hos någon av de 6 patienter som använde tampongen med de mjölksyraprodu- cerande bakterierna.

Vidare visar resultaten att de mjölksyraproducerande bakterierna fortfarande förekommer i vaginan efter den andra menstruationscykeln.

Vidare visar dessa result att ett relativt litet antal administererade bakterier (ca 103 cfu) är tillräck- 10 15 20 25 » , , , . , 521 022 1.. .r 17 ligt för en fullständig vaginal kolonisering och etable- ring av bakteriestammarna enligt föreliggande uppfinning.

Dessutom uppvisar bakteriestammarna enligt förelig- gande uppfinning utmärkta adhesiva egenskaper till de vaginala slemhinnorna.

Exempel 2: Stabilitet av livskraft vid frystorkning och under långa förvaringsperioder (hållbarhet) för bakterie- Stammar LN 40, LN ll3, LN 99 OCh LN 23 Frystorkade bakteriestammar LN 40, LN 113, LN 99, och LN 23 utvärderades med avseende på stabilitet av livskraft under längre förvaringsperioder (d v s hållbar- het) vid ca -l8°C.

Tabell 3 Tid efter Livskraftiga bakterier [cfu/g] frystorkning [månader] LN 40 LN 113 LN 99 LN 23 0 83 x 109 224 x 1019 33 x 109 290 x 109 12 47 x 109 192 x 1019 14 x 109 272 x 109 (~57%) (~86%) (~42%) (~94%) 78 22 x 109 46 x 109 6 x 109 155 x 109 (~27%) (~21%) (48%) (~53%) De resultat som presenteras i Tabell 3 visar att minst 40% av bakterierna fortfarande är livskraftiga ef- ter 12 månader vid -l8°C. Vidare är minst ca 20% av bak- terierna fortfarande livskraftiga efter 78 månader vid - 18°C.

Vidare analyserades dessa bakterier även enligt API 50CH och de result som erhölls från denna analys indike- LN 113, LN 99 och LN 23 behåller sin genetiska profil under minst 78 månader vid förvaring rar att stammarna LN 40, i frystorkad form vid -18°C.

Frystorkade bakterier (LN 40, LN 113, LN 99 och LN 23) dispergerades i Akosoft® 36 (från Karlshamns AB) och utvärderades med avseende på stabilitet av livskraft un- lO l5 20 521 022 18 der längre förvaringsperioder (d v s hållbarhet) vid ca 8°C respektive 22°C.

Tabell 4 Tid efter beredning Livskraftiga bakterier [vecka/månader] [cfu/g] +8°C +22°C 0 3,5 X 101° 3,5 X 1o1° 1 vecka 2,7 X 10” 1,9 X 10” (~75%) (~53%) 1 2,5 X 101° 1,3 X 1o1° <~71%) (~37%) 3,5 2,0 X 10” 6 X 109 (+17%) (~55%) 6 2,4 X 101° 3,9 X 109 <~6e%> (~11%) 9 1,8 X 10” 1,0 X 109 (~50%) (~2.8%) 12 1,7 X 101° 1,3 X 109 (~49%) (~3.7%) De resultat som presenteras i Tabell 4 visar att ca 45-50% av bakterierna fortfarande är livskraftiga efter 12 månader vid 8°C. Vidare är ca 4% av bakterierna fort- farande livskraftiga efter 12 månader vid rumstemperatur, d V s 22°C.

Exempel 3: Bibehàllande av genetisk profil vid upprepad odling av bakteriestammar LN 40, LN 113, LN 99, LN Ol och LN 23 Bakteriestammarna LN 23) rades därefter med API SOCH. Fermentationsmönstret för bibehölls efter den Sålunda indikerar resultaten att (LN 40, LN 01 och odlades upprepade gånger, LN ll3, LN 99, 10 gånger, och utvärde- vardera bakteriestam (se Exempel 7) upprepade odlingen. nämnda bakteriestammar bibehåller sin genetiska profil vid upprepad odling. 10 15 20 25 30 35 521 022 19 Exempel 4: Bakteriell tillväxtprocess för bakteriestammar LN 40, LN 99, LN ll3 Och LN 23 För att àstadkomma nämnda önskade terapeutiska ef- fekt bör vaginalt administrerade frystorkade bakterier börja att växa i vaginan inom minst 4 h frän tidpunkten för administrering. (optisk densitet, OD) mättes vid 620 nm (LN 40, LN 113, LN 99 och LN 23) satta till steriliserad MRS-buljong. Tvà typer av ex- (se fig la och lb) a) 0,01 g frystorkade bakterier sattes till 3 ml Absorbansen för frystorkade bakterier periment utfördes: MRS-buljong och 100 pl av denna dispersion spades med 3 ml ytterligare MRS-buljong, och b) frystorkade bakterier sattes till MRS-buljong i en mängd som resulterade i en absorbans av ca 0,100 Kyvetterna innehållande ovan nämnda bakteriedisper- sioner placerades vid 37°C och absorbansen mättes var 15:e minut under 10,5 h.

Såsom kan ses i fig la och lb är den bakteriella tillväxten för vardera bakteriestam (LN 40, LN ll3, LN 99 respektive LN 23) snabb och alla bakteriestammar börjar växa inom minst 2 h.

Vidare är generationstiden för vardera bakteriestam ca 20-25 min. Sålunda växer bakterierna snabbare än uro- patogener, vilket är mycket gynnsamt med avseende pä den här beskrivna användningen av bakterierna.

Dessutom är det inom omrâdet känt att en kombination av olika bakterier förkortar generationstiden av en bak- terie, vilket resulterar i en ännu snabbare bakterietill- växt. Vidare är det föredraget, eftersom olika arter av mjölksyraproducerande bakterier har olika fermentations- mönster och egenskaper, att använda en kombination av olika bakteriearter. 10 15 20 25 30 bJ UI 521 022 20 Karaktårisering av bakteriestammar LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 och LN 23 Bakterierna karaktäriserades bàde med fenotypiska och genotypiska metoder.

Exempel 5: Mïcrobiologisk karaktärisering av bakterie- stammar LN 40, LN ll3, LN 99, LN Ol Och LN 23 Stammarna (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 och LN 01) ka- raktäriserades med avseende pà cellmorfologi, Gram- färgning, oxidas- och katalasreaktion.

Stammen LN 40 innefattade Gram-positiva, katalas- negativa, oxidas-negativa, icke-sporbildande, stavformade (ca 0,9 pm x 3-10 pm) bakterier, som förekom som enstaka celler eller i par.

Stammen LN 99 innefattade Gram-positiva, katalas- negativa, oxidas-negativa, icke-sporbildande, stavformade (ca 0,9 pm X 1,5-2.0 pm) bakterier, som förekom som en- staka celler.

Stammen LN 113 innefattade Gram-positiva, katalas- negativa, oxidas-negativa, icke-sporbildande, stavformade (ca 0,9 pm x 2 pm) bakterier, som förekom som enstaka celler eller i par.

Stammen LN 01 innefattade Gram-positiva, katalas- negativa, oxidas-negativa, icke-sporbildande, raka eller något böjda stavformade (ca 0,8-1,6 pm x 2,3-11 pm) bak- terier, som förekom som enstaka celler eller i kedjor.

Stammen LN 23 innefattade Gram-positiva, katalas- negativa, oxidas-negativa, icke-sporbildande, runda (ø ca 1 pm) bakterier, som förekom som enstaka celler eller i par.

Exempel 6: SDS-PAGE och klusteranalys av bakteriestammar LN 40, LN 113, LN 99, LN Ol Och LN 23 (Oxoid CM361) 24 h vid 37°C under anaeroba betingelser. Beredningen av Kulturer odlades på MRS-agar under cellextrakt och proteingelelektrofores (SDS-PAGE) utför- des vid BCCMW/LMG i enlighet med det protokoll som upp- rättats av forskningsgruppen vid Mikrobiologilaboratoriet (Pot, B, Vandamme, vid universitetet i Gent P, Kersters, 10 15 20 25 30 35 *f ->-f ,; , í:"-'~*«-«- 2,3 *,=;'_' <1 f» . , , _ v .g -- , , I ,,; , ., _* §.,_ -. 21 K, Analysis of elctrophoretic whole-organism protein fingerprints, Chemical Methods in Prokaryotic Systema- M, Goodfellow, och A G, O'Donell (eds), J Wiley & Chichester (1994)).

De normaliserade och digitaliserade proteinmönstren tics, Sons, analyserades numeriskt och grupperades med referensprofi- ler i BCCM-databasen (december 1999) för LN 40, LN 113, LN 99 och LN 23. LN 01 analyserades och grupperades med referensprofiler i CCUG-databasen (januari 2001).

Stammen LN 40 befanns tillhöra arten Lactobacillus johnsonii eller Lactobacillus gasseri.

Stammen LN 99 befanns tillhöra arten Lactobacillus fermentum.

Stammen LN 113 befanns tillhöra arten Lactobacillus casei underart rhamnosus.

Stammen LN 23 befanns tillhöra arten Pediococcus acidilactici.

Stammen LN 01 befanns tillhöra arten Lactobacillus crispatus.

Exempel 7: Karaktårisering av bakteriestammar LN 40, LN 113, LN 99 och LN 23 med användning av API 5OCH och ”ra- pid ID32 strep” Förmågan hos stammarna LN 99 och LN (LN 40, LN 113, 23) att fermentera olika kolhydrater visas i Tabell 5.

Testerna utfördes med hjälp av API SOCH och API rapid ID32strep vid 37°C i enlighet med tillverkarens instruk- tioner. För de resultat som skiljer mellan API SOCH och API rapid ID32strep anses API 5OCH-resultaten vara mer tillförlitliga.

De erhållna fermentationsmönstren söktes efter i CCUG-databasen. Den högsta databaspoängen som erhölls för vardera stam bekräftade resultaten fràn den ovan beskriv- na analysen (SDS-PAGE/klusteranalys) med avseende på till vilken respektive bakterieart som nämnda stammar tillhör.

Vidare bekräftade reaktionen med rhamnos att stammen LN 113 tillhör arten Lactobacillus casei underart rhamno- SUS . 10 521 022 22 Jämförelser mellan LN 40, LN 99, LN 113 respektive LN 23 och typstammar av vardera bakterieart (CCUG 31451T, CCUG 301329, ccUG 21452T respektive ccUG 322353) visade dock betydande skillnader för alla stammar (LN 40, LN 113, LN 99 och LN 23) med avseende pà fermentationsmönst- ren.

I Tabell 5 betecknar 1 att ingen reaktion skedde, 2 betecknar förekomsten av en vag reaktion, 3 betecknar fö- rekomsten av en reaktion, 4 betecknar förekomsten av en stark reaktion och 5 betecknar förekomsten av en mycket stark reaktion.

Tabell 5 LN 40 LN 99 LN 113 LN 23 API SOCH Kontroll Glycerol I-'I-*l-J Erytritol D-arabinos L-arabinos Ribos P-*KDP-*HHi-'l-J U'1U1U'l}-' D-xylos l-*I-lb-'F-'l-'i-*D-*P L-xylos I-' Adonitol l-' PI-'l-'Uïlfib-*l-'P-'P-*H F* P ß-metyl-D-xylosid UI Galaktos U1 Glukos Fruktos Mannos Sorbos F-'I-'bå-Ultfirß Rhamnos Dulcitol Inositol Mannitol If-'Pi-'l-J f-'I-*F-'l-'l-'ß-*Lßlolë LHU1UJI-'UJU1U1LHLTIU1 P1 Sorbitol F* F' l-' i-i a-metyl-D-mannosid d-metyl-D-glukosid 1 1 5 1 521 022 m. 24, 23 N-acetyl-glukosamin 5 1 4 4 Amygdalin 3 1 4 2 Arbutin 1 l 4 4 Aesculin 5 l 5 5 Salicin 2 1 4 4 Cellobios 5 1 5 5 Maltos 5 4 3 1 Laktos 3 4 5 1 Melibios 5 1 1 Sackaros 5 4 3 1 Trehalos 1 4 5 1 Inulin l 1 1 1 Melezitos 1 1 5 1 D-raffinos 5 4 1 l Stärkelse 1 1 1 1 Glykogen 1 1 1 1 xylitol 1 1 1 1 ß-gentiobios 4 1 3 3 D-turanos 1 1 5 l D-lyxos 1 1 3 1 D-tagaros 2 1 5 4 D-fucos 1 1 l 1 L-fucos 1 1 1 1 D-arabitol 1 1 1 1 L-arabitol 1 1 1 1 Glukonat 1 3 2 1 Z-keto-glukonat 1 1 l l S-keto-glukonat 1 1 1 1 API rapid ID32s Arginin dihydrolas 1 5 1 5 ß-glukosidas 5 1 5 3 ß-galaktosidas (1) 1 5 l 1 ß-glukuronidas 1 l 1 1 oL-galaktosidas 5 3 l 1 Alkaliskt fosfatas 1 1 1 1 521 022 24 Ribos l 5 5 1 Mannitol 1 1 5 1 Sorbitol 1 1 1 1 Laktos 1 5 1 1 Trehalos l 5 5 1 Raffinos 5 1 1 1 Acetoin 5 5 5 5 Alanin-fenylalanin-prolin 5 1 4 3 arylamidas ß-galaktosidas (2) 1 5 5 1 Pyroglutamat 4 1 5 1 N-acetyl-ß-glucosamin 1 1 2 1 Glycyl -tryptofan 1 1 1 1 Hippurat 1 1 5 4 Glykogen 1 1 1 1 Pul lulan 1 1 1 1 Maltos 2 5 1 1 Melibios 5 1 1 1 Melezitos 1 1 2 1 Sackaros 5 5 1 1 L-arabinos 1 1 1 1 D-arabitol 1 1 1 1 Metyl-ß-D-glukopyranosid 2 1 1 1 Tagatos 3 1 3 1 ß-mannosidas 1 1 1 1 Cyklodextrin 1 1 1 1 UreaS 1 1 1 l Hemolys 3 1 3 3 Exemgel 8: Karaktärisering av bakteriestammar LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 och LN 01 med användning av ”Random Amplified Polymorphic DN ”.

Vidare analyserades bakteriestammarna med RAPD (Ran- dom Amplified Polymorphic DNA). Denna teknik beskrivs t ex av Willians, J G, et al, Nucl Acids Res, 18: 6531 (1990), och har nyligen använts inte bara för att detek- lO 15 20 25 30 35 521 022 5§3%'@~aï~= 25 tera stamolikheter utan också för genkartläggning, popu- lationsanalyser, epidemiologi och för att analysera tax- onomiska och fylogenetiska samband (Welsh, J, et al, PCR 2: A Practical Approach, McPherson, M J, Hames, B D, och G R, eds Chapter 11, IRL Press (1995).

Reproducerbara grupper av stamspecifika produkter Taylor, alstrades genom att använda en kort oligonukleotidprimer (5'ACGCGCAAC 3') under làgstyrkebetingelse med PCR (Poly- merase Chain Reaction). De erhållna grupperna analysera- des därefter med gelelektrofores och jämfördes med typ- stammar av vardera bakterieart, vilka hade utsatts för likadan behandling.

Resultaten fràn denna analys sammanfattas i fig 2.

Fält 1 är L fermentum, ATcc i4931T, fält 2 är LN 99, fält 3 är L crispatus, CCUG 44117? fält 4 är LN Ol, fält 5 är a 100 bp molekylviktmarkör, fält 6 är LN 23, fält 7 är LN 40, fält 8 är L gässeri, ATCC i9992T, fält 9 år LN 113, OCh fält lo är L cäsei ATcc 4646T.

I fig 2 kan stora skillnader mellan bakteriestammar- na enligt föreliggande uppfinning (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 och LN 01) Dessutom beskriver föreliggande uppfinning en kompo- och respektive typstammar ses. sition för profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det urogenitala området innefattande- minst en av nämnda bakteriestammar (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 och LN 23).

Företrädesvis innefattar kompositionen alla nämnda stammar, d v s stam LN 40, stam LN 113, stam LN 99, LN 01 och stam LN 23.

Kompositionen är företrädesvis formulerad för vagi- stam nal administrering, sàsom ett suppositorium, en kapsel, piller, en tablett, suspension, spray, gel, kräm, pulver, 10 15 20 25 30 35 521 022 26 eller någon annan form av vagitorium, som kan innefatta konventionella farmaceutiska tillsatsämnen som används inom omràdet. Dessutom beskriver föreliggande uppfinning en sanitetsartikel, sàsom absorptionsprodukter för kvin- nor (t ex tamponger, bindor, trosskydd, e t c), blöjor och inkontinensskydd, för profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det urogenitala om- rådet innefattande minst en av nämnda bakteriestammar (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 och LN 23).

Företrädesvis innefattar sanitetsartikeln alla nämn- da stammar, d v s stam LN 40, stam LN 113, stam LN 99, stam LN Ol och stam LN 23.

Sanitetsartikeln är företrädesvis en tampong.

Vidare beskriver föreliggande uppfinning användning- (LN 40, LN 113, för framställning av en komposi- en av minst en av nämnda bakteriestammar LN 99, LN 01 och LN 23) tion eller en sanitetsartikel för profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det urogenitala om- rådet, företrädesvis bakteriell vaginos eller någon annan bakteriell rubbning i vaginan.

Vidare beskriver föreliggande uppfinning ett förfa- rande för profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det urogenitala området, företrädesvis bak- teriell vaginos eller någon annan bakteriell rubbning i vaginan, varvid minst en av nämnda bakteriestammar (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 och LN 23) nalt i en terapeutiskt effektiv mängd för att förhindra, administreras vagi- lindra effekterna av och/eller behandla en mikrobiell in- fektion. Bakteriestammarna administreras företrädesvis med användning av en vaginal beerdning och/eller en sani- tetsartikel, Sammanfattningsvis uppvisar bakteriestammarna LN 40, mest föredraget en tampong.

LN 113, LN 99, LN 01 och LN 23 utmärkta egenskaper med avseende pà: - förmåga att hämma tillväxt av uropatogener (inklu- sive en snabb bakterietillväxt) lO 15 20 521 022 27 - förmåga att kolonisera och etablera sig in vivo vid vaginal administrering - stabilitet av bakteriell livskraft vid frystork- ning och under längre förvaringsperioder (hållbar- het), - bibehållande av genetisk profil vid upprepad od- och ling och in vivo.

Vidare är dessa bakteriestammar även gynnsamma ur ekonomiska aspekter.

Sammantaget innebär dessa egenskaper att bakterie- stammarna enligt föreliggande uppfinning är mycket väl lämpade för industriell storskalig produktion av en kon- sumptionsprodukt (såsom en komposition eller en sanitets- artikel) innefattande nämnda bakteriestammar för att för- hindra, lindra effekterna av och/eller behandla en mikro- biell infektion i det urogenitala omrâdet. Ãven om uppfinningen har beskrivits detaljerat och med hänvisning till specifika utföringsformer därav är det uppenbart för en fackman inom omrâdet att diverse förändringar och modifieringar kan göras utan att avvika fràn tanken och omfattningen därav.

Claims (11)

lO 15 20 25 30 35 521 022 28 PATENTKRAV

1. l. Isolerad bakteriestam av släktet Lactobacillus eller Pediococcus k ä n n e t e c k n a d a v att den är utvald från den grupp som består av den stam av Lacto- bacillus gasseri, LN 40, som deponerats under nummer LMG P-20560, sus, LN 113, som deponerats under nummer LMG P-20562, den den stam av Lactobacillus casei underart rhamno- stam av Lactobacillus fermentum, LN 99, som deponerats under nummer LMG P-20561, den stam av Lactobacillus cris- patus, LN 01, som deponerats under nummer LMG P-20558, och den stam av Pediococcus acidilactici, LN 23, som de- ponerats under nummer LMG P-20559, eller varianter därav med väsentligen motsvarande fenotypiska och/eller genoty- piska kännetecken och med förmågan att kolonisera och bli etablerad i vagina hos människa, även under menstruation, nämnda stammar deponerades vid Belgian Coordinated Col- lections of Mikroorganisms den 14 juni 2001.

2. Förfarande för isolering av en bakteriestam av släktet Lactobacillus eller Pedicoccus med förmågan att att kolonisera och bli etablerad i vagina hos människa, även under menstruation, innefattande följande steg: a) ett bakterieprov samlas upp från det vaginala området hos en kvinna med en normal, frisk vaginal mikro- organismflora, b) mjölksyraproducerande bakterier väljs ut från det vaginala provet från steg a), c) de mjölksyraproducerande bakterierna från steg b) renodlas in vitro i ett lämpligt näringsmedium vilket ger minst en isolerad bakteriestam, d) minst en renodlad bakteriestam från steg c) och/eller en kombination av minst två bakteriestammar från steg c) utvärderas med avseende på dess förmåga att kolonisera och bli etablerad i vaginan vid vaginal admi- nistrering av bakteriestammen till en kvinna under hennes menstruation, nämnda kvinna uppvisar en störd vaginal mikroorganismflora, varvid nämnda bakteriestam eller 10 15 20 25 30 35 521 022 29 -stammar anses etablerad(e) om bakteriestammen eller -stammarna fortfarande förekommer i vaginan efter minst två menstruationscykler fràn tidpunkten för administre- ring, och e) minst en bakteriestam från steg d) som uppvisar nämnda förmàga att kolonisera och bli etablerad i vaginan väljs ut.

3. Förfarande enligt krav 2 innefattande ett ytter- ligare steg, där minst en renodlad bakteriestam fràn steg c) och/eller en kombination av minst tvà bakteriestammar fràn steg c) frystorkas.

4. Förfarande enligt krav 3 innefattande ett ytter- ligare steg, där minst en frystorkad, renodlad bakterie- stam fràn steg c) och/eller en kombination av minst tvä frystorkade bakteriestammar från steg c), utvärderas och väljs ut med avseende på stabilitet av bakteriell livs- kraft vid frystorkning och livskraft hos frystorkade bak- terier under lànga förvaringsperioder, varvid nämnda bak- teriella livskraft anses stabil om minst 40% av bakteri- erna har en bevarad livskraft vid frystorkning och förva- ring av de frystorkade bakterierna vid -l8°C under minst 12 månader.

5. Förfarande enligt krav 3 eller 4 innefattande ett ytterligare steg, varvid minst en frystorkad, renodlad bakteriestam fràn steg c) och/eller en kombination av minst tvà frystorkade bakteriestammar från steg c), ut- värderas och väljs med avseende pä genetisk stabilitet vid upprepad odling.

6. Komposition för profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det urogenitala området inne- fattande minst en bakteriestam enligt krav 1.

7. Komposition enligt krav 6 som är formulerad för vaginal administrering.

8. Sanitetsartikel för profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det urogenitala om- rådet innefattande minst en bakteriestam enligt krav 1. lO 15 521 022 30

9. Sanitetsartikel enligt krav 8 i form av en tam- pong.

10. Användning av minst en bakteriestam enligt krav 1 för framställning av en komposition eller en sanitets- artikel för profylaktisk behandling och/eller behandling av infektioner i det urogenitala området.

11. ll. Användning enligt krav 10 för profylaktisk be- handling och/eller behandling av bakteriell vaginos eller någon annan bakteriell rubbning i vaginan.