SE520177C2

SE520177C2 - Use of empty, non-infectious, recombinant parvoviral capsid particles, or β-antigen-blocking portions thereof, for the manufacture of drugs for inhibiting hematopoietic stem cells

Info

Publication number: SE520177C2
Application number: SE9804022A
Authority: SE
Inventors: Kristina Broliden; Magnus Westgren
Original assignee: Kristina Broliden; Magnus Westgren
Priority date: 1998-11-24
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2003-06-03
Also published as: WO2000030668A9; SE9804022L; MXPA01004949A; CN1328469A; CA2352043A1; PL348640A1; AU2566600A; EP1131085A2; NO20012534D0; WO2000030668A2; KR20010080518A; WO2000030668A8; SE9804022D0; CZ20011369A3; NO20012534L; WO2000030668A3; JP2003516927A; HUP0104298A2; IS5931A

Abstract

The invention described herein relates to the discovery of methods and compositions for the inhibition of growth and/or migration of cells that have the P antigen, including but not limited to, cells of hematopoietic origin and endothelial cells. More specifically, parvovirus capsid particles or fragments of parvovirus capsid proteins are used to manufacture medicaments that can be administered to a subject to inhibit hematopoietic progenitor cell growth (e.g., prior to stem cell transplantation), endothelial cell growth, (e.g., as an anti-tumorigenesis treatment or to prevent restenosis or fibrotic build up following prosthetic implantation), or to prevent disorders that involve the abnormal proliferation of cells that have the P antigen (e.g., polycytemia vera).

Description

30 1.- n. s s -- t: . .t 1. .a -. s i -» i. f, -. s u. H, . v» I» . . - . _ - in - n 1 . t 2 genetisk stamcellsbrist (15), antyder att donatorcellema behöver en kompetitiv fördel framför recipientcellerna för att uppnå signifikant inympning och långtidschimerism. Eftersom inga lämpliga metoder är tillgängliga för odling av stora mängder nativa parvovirus B19 virus, som sedan skulle kunna inaktiveras, har genetiskt modiﬁerade expressionssystem för produktion av parvovirus B19 antigener utvecklats (5-7). Rekombinanta parvovirus B19 kapsider, producerade i ett baculovirussystem och bestående av två strukturella polypeptider, det mindre VPl proteinet (83 kDa) och det större VP2 proteinet (52 kDa) (6). Parvovirus B19 VPl och VP2 självsammankopplas och bildar viruslika partiklar. Parvovirus B19 kapsider utvärderades nyligen i ett kliniskt försök som ett kandidatvaccin mot parvovirus B19 infektion och visades inducera en god neutraliserande respons utan att förorsaka allvarliga biverkningar (19). Elektronmikroskopiska analyser av parvovirus B19 kapsider visade att de var rätt så lika plasmahärstammande virioner (6). Nativa, replikerande virus och rekombinanta kapsider uppvisar emellertid antagligen struktur- och konforrnationsskillnader samt skillnader i presentation för immunsystemet. Dessa kapsider visades tidigare agglutinera humana celler (17) och sålunda visa sig ha en receptorbindande kapacitet för deras naturliga målceller. 30 1.- n. S s - t:. .t 1. .a -. s i - »i. f, -. s u. H,. we" . . -. _ - in - n 1. t 2 genetic stem cell deficiency (15), suggests that donor cells need a competitive advantage over recipient cells to achieve significant inoculation and long-term chimerism. Since no suitable methods are available for culturing large amounts of native parvovirus B19 virus, which could then be inactivated, genetically modified expression systems for the production of parvovirus B19 antigens have been developed (5-7). Recombinant parvovirus B19 capsids, produced in a baculovirus system and consisting of two structural polypeptides, the smaller VP1 protein (83 kDa) and the larger VP2 protein (52 kDa) (6). Parvovirus B19 VP1 and VP2 self-connect and form virus-like particles. Parvovirus B19 capsids were recently evaluated in a clinical trial as a candidate vaccine against parvovirus B19 infection and were shown to induce a good neutralizing response without causing serious side effects (19). Electron microscopic analyzes of parvovirus B19 capsids showed that they were fairly similar to plasma-derived virions (6). However, native, replicating viruses and recombinant capsids probably exhibit structural and conformational differences as well as differences in presentation to the immune system. These capsids were previously shown to agglutinate human cells (17) and thus prove to have a receptor binding capacity for their natural target cells.

Beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning erbjuder möjligheten att inhibera hematopoietiska stamcellkolonibildningsanalyser med parvovirus B19 kapsider. Vi visar att dessa kapsider har en effekt liknande den hos nativt parvovirus, dvs att hematopoietiska stamceller inhiberas av dessa parvovirus B19 kapsider, och därför kan de finna användning i ett stamcells- transplantationsprogram.Disclosure of the Invention The present invention offers the ability to inhibit hematopoietic stem cell colony formation assays with parvovirus B19 capsids. We show that these capsids have an effect similar to that of native parvovirus, ie that hematopoietic stem cells are inhibited by these parvovirus B19 capsids, and therefore they can find use in a stem cell transplant program.

En aspekt av uppfinningen är inriktad på användning av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav, för framställning av ett läkemedel för inhibering av hematopoietiska stamceller. Denna inhibering kan utföras i cellkultur eller i en patient.One aspect of the invention is directed to the use of empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles, or β-antigen-blocking moieties thereof, for the manufacture of a medicament for inhibiting hematopoietic stem cells. This inhibition can be performed in cell culture or in a patient.

Den cellulära receptorn för parvovirus B19 är P-antigenet (2). P-antigenet uttrycks på erytrocyter, erytroidstamceller, megakaryocyter, endotel, njurbarken, placenta, fetalt myokardium (16) och prononnoblaster från fetal lever (18). Ehuru parvovirus B19 kan infektera och lysera ett brett område av humana vävnads- och celltyper som uttrycker P- antigen, har endast erytroidstamceller visats vara sådana som tillåter parvovirus B19 replikation; det är också kant att viruset kräver mitotiskt aktiva .eller för sin egen replikation.The cellular receptor for parvovirus B19 is the β antigen (2). The β antigen is expressed on erythrocytes, erythroid stem cells, megakaryocytes, endothelium, renal cortex, placenta, fetal myocardium (16) and fetal liver prononoblasts (18). Although parvovirus B19 can infect and lyse a wide range of human tissue and cell types that express P antigen, only erythroid stem cells have been shown to allow parvovirus B19 replication; it is also edge that the virus requires mitotically active .or for its own replication.

Effekten av parvovirus B19 infektion på hematopoietiska celler in vivo har studerats i hematologiskt normala personer. De uppvisar transient anemi och vanligen frånvaro av retikulocyter, samt varierande grader av neutropeni och trombocytopeni. I experimentell \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk Kextdoc 10 15 20 25 30 i. tu» 520 177 3 infektion av normala humana frivilliga personer, avslöjade benmärgsprover en allvarlig förlust av erytroidprekursorceller och en förlust av både erytroid- och myeloidstamceller i det perifera blodet.The effect of parvovirus B19 infection on hematopoietic cells in vivo has been studied in hematologically normal individuals. They show transient anemia and usually the absence of reticulocytes, as well as varying degrees of neutropenia and thrombocytopenia. In experimental \\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svensk Kextdoc 10 15 20 25 30 i. Tu »520 177 3 infection of normal human volunteers, bone marrow samples revealed a severe loss of erythroid precursor cells and a loss of both erythroid and myeloid stem cells in the peripheral blood.

I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är läkemedlet ett läkemedel för inhibering av endotelcelltillväxt.In one embodiment of this aspect of the invention, the medicament is a medicament for inhibiting endothelial cell growth.

I en annan utföringsform är läkemedlet ett läkemedel för behandling av hematologiska proliferativa stömingar hos P-antigenpositiva celler, t ex polycytemi vera.In another embodiment, the medicament is a medicament for treating hematological proliferative disorders of β-antigen-positive cells, eg polycythemia vera.

I ytterligare en utföringsforrn är läkemedlet ett läkemedel för förbehandling av en patient före stamcellstransplantation. I en föredragen utföringsform är patienten ett foster.In a further embodiment, the medicament is a medicament for pretreatment of a patient before stem cell transplantation. In a preferred embodiment, the patient is a fetus.

Icke-myeloablativ konditionering före postnatal stamcellstransplantation är en ny utveckling (20,21). Sådana högdoskemoradioterapi. Emellertid kommer kanske inte fullständig donatorhematopoietisk protokoll är mindre toxiska för patientema än chimerism att uppnås till samma utsträckning med icke-myeloablativ terapi. Genom att använda sådana protokoller är det nu möjligt, enligt föreliggande uppfinning, att administrera parvovirus B19 kapsid till patienten före stamcellstransplantation och därigenom inhibera recipient hematopoies och främja donatorcellinympning.Non-myeloablative conditioning before postnatal stem cell transplantation is a new development (20,21). Such high-dose memory radiotherapy. However, complete donor hematopoietic protocols may be less toxic to patients than chimerism may not be achieved to the same extent with non-myeloablative therapy. By using such protocols, it is now possible, according to the present invention, to administer parvovirus B19 capsid to the patient prior to stem cell transplantation, thereby inhibiting recipient hematopoiesis and promoting donor cell inoculation.

Ett sätt att utnyttja uppfinningen är att behandla en patient för inhibering av hematopoietisk stamcelltillväxt hos nämnda patient. Därvid administreras åt patienten en P- antigenblockerande mängd av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsid- partiklar, eller P-antigenblockerande delar därav.One way of utilizing the invention is to treat a patient for inhibiting hematopoietic stem cell growth in said patient. Thereby, a P-antigen-blocking amount of empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles, or P-antigen-blocking parts thereof, is administered to the patient.

Ytterligare ett sätt att utnyttja uppﬁnningen är att behandla en patient för inhibering av endotelcelltillväxt hos nämnda patient, varvid en P-antigenblockerande mängd av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav administreras åt nämnda patient. Ännu ett sätt att utnyttja uppfinningen är att behandla en patient som lider av hematologiska proliferativa stömingar hos P-antigenpositiva celler, t ex polycytemi vera.Another way of utilizing the invention is to treat a patient for inhibiting endothelial cell growth in said patient, wherein a β-antigen-blocking amount of empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles, or β-antigen-blocking portions thereof is administered to said patient. Yet another way of utilizing the invention is to treat a patient suffering from hematological proliferative disorders of β-antigen-positive cells, eg polycythemia vera.

Därvid administreras åt nämnda patient en P-antigenblockerande mängd av tomma, icke- infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav.Thereby, a P-antigen-blocking amount of empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles, or P-antigen-blocking parts thereof, is administered to said patient.

En ytterligare sätt att utnyttja uppfinningen är att behandla en patient för inhibering av hematopoietisk stamcelltillväxt hos nämnda patient före stamcellstransplantation. Därvid N° administreras t nämnda patient en P-antigenblockerande mängd av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav. I en föredragen tillämpning är patienten ett foster.A further method of utilizing the invention is to treat a patient for inhibiting hematopoietic stem cell growth in said patient prior to stem cell transplantation. In that case, said patient is administered a P-antigen-blocking amount of empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles, or P-antigen-blocking portions thereof. In a preferred application, the patient is a fetus.

\\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk tcxtdoc L. 520 177 *l Administreringssättet är t ex intravaskulärt, intramuskulärt, intradermalt eller intravenöst. Konstituenter och/eller spädmedel som vanligen används för formulering av sådana preparat kan användas. För vägledning hänvisas till den amerikanska och europeiska Farmakopén.\\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svensk tcxtdoc L. 520 177 * l The method of administration is, for example, intravascular, intramuscular, intradermal or intravenous. Excipients and / or diluents commonly used for the formulation of such preparations may be employed. For guidance, refer to the American and European Pharmacopoeia.

Den erfordrade P-antigenblockerande mängden av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar eller P-antigenblockerande delar därav kommer att bestämmas på basen av patientens ålder, vikt och kliniska tillstånd. Rekommendationer kommer att ges i den kommersiella förpackningen som inkluderar parvoviruskapsidpartiklar eller P-antigenblockerande delar därav. Rekommendationerna ges baserat på experimentella data.The required β-antigen-blocking amount of empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles or β-antigen-blocking moieties thereof will be determined on the basis of the patient's age, weight and clinical condition. Recommendations will be provided in the commercial package which includes parvovirus capsid particles or β-antigen blocking moieties thereof. The recommendations are given based on experimental data.

En kommersiell Förpackning som innehåller tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav, kommer att inkludera skrivna instruktioner för dosering och administrering åt en patient för hematopoietisk stamcellstillväxtinhibering, instruktioner för dosering och administrering för hematopoietisk stamcellstillväxtinhibering i en patient före stamcellstransplantation åt nämnda patient, såsom ett foster, instruktioner för dosering och administrering åt en patient för endotelcelltillväxtinhibering och/eller instruktioner för dosering och administrering åt en patient som lider av hematologiska proliferativa stömingar hos P-antigenpositiva celler, t ex polycytemi vera.A commercial package containing empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles, or β-antigen-blocking moieties thereof, will include written instructions for dosing and administration to a patient for hematopoietic stem cell growth inhibition, dosing instructions and administration for hematopoietic stem cell transplantation. for said patient, such as a fetus, instructions for dosing and administering to a patient for endothelial cell growth inhibition and / or instructions for dosing and administering to a patient suffering from hematologic proliferative disorders of P-antigen-positive cells, e.g. polycythemia vera.

Experiment Kolonibildningsanalyser utfördes med användning av färska humana fosterleverceller, navelsträngsblodceller och fullvuxna benmärgsceller. När rekombinanta parvovirus B19 tomma kapsider sattes till dessa celler såg man en minskning av kolonibildningen av BFU-E (burst fonning unit-erythroid), CFU-GM (colony forrning unit- granulocyte, macrophage) och CFU-GEMM (colony forrning unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte, megakaryocyte) celler i ett ll-dagars analyssystem. Kolonibildningen av prekursorceller räddades genom förinkubering av parvovirus B19 kapsider med anti-B19 monoklonala antikroppar eller med parvovirus B19 IgG positiva humana sera, innan blandningen sattes till cellerna.Experiments Colony formation assays were performed using fresh human fetal liver cells, umbilical cord blood cells and adult bone marrow cells. When recombinant parvovirus B19 blank capsids were added to these cells, a decrease in the colony formation of BFU-E (burst fonning unit-erythroid), CFU-GM (colony formation unit-granulocyte, macrophage) and CFU-GEMM (colony formation unit-granulocyte was seen , erythrocyte, monocyte, megakaryocyte) cells in a 11 day assay system. The colony formation of precursor cells was saved by preincubating parvovirus B19 capsids with anti-B19 monoclonal antibodies or with parvovirus B19 IgG positive human sera, before adding the mixture to the cells.

Ytterligare bevis på att inhiberingen av kolonibildningen faktiskt förrnedlades av parvovirus B19 kapsider erhölls med användning av monoklonala antikroppar mot den cellulära receptom för parvovirus B19, P-antigenet. När färska fosterleverceller förinkuberades med monoklonala antikroppar mot P-antigenet, innan parvovirus B19 kapsider tillsattes, minskade inhiberingen av kolonibildningen. Därtill, när en monoklonal antikropp 10 15 20 25 30 520 177ï“?ﬂfH*ﬂ** 5 användes mot PI-antigenet, som inte är involverat i bindningen av parvovirus B19 till cellytan, blev det inget skydd. Dessa effekter är lika de som rapporterats när nativt virus sattes till erytroidstamceller (2) och innebär att samma P-antigenstruktur används i båda fallen. /lßlygllﬂ Preparering av donatorceller Humana foster i en ålder av 6-12 havandeskapsveckor erhölls från legala aborter; patientema hade frivilligt donerat fostervävnad. Studien godkändes av Huddinge Sjukhus etiska kommitté. Havandeskapsålder uppskattades i enlighet med specifika anatomiska markörer och ges som menstruationsålder. Aborteringar utfördes med vakuumaspiration.Further evidence that the inhibition of colony formation was actually mediated by parvovirus B19 capsids was obtained using monoclonal antibodies to the cellular receptor for parvovirus B19, the P antigen. When fresh fetal liver cells were preincubated with monoclonal antibodies to the β antigen, before parvovirus B19 capsids were added, the inhibition of colony formation decreased. In addition, when a monoclonal antibody was used against the PI antigen, which is not involved in the binding of parvovirus B19 to the cell surface, there was no protection. These effects are similar to those reported when native virus was added to erythroid stem cells (2) and mean that the same β-antigen structure is used in both cases. / lßlygll ﬂ Preparation of donor cells Human fetuses at the age of 6-12 weeks of gestation were obtained from legal abortions; the patients had voluntarily donated fetal tissue. The study was approved by Huddinge Hospital's ethics committee. Gestational age was estimated according to specific anatomical markers and is given as menstrual age. Abortions were performed with vacuum aspiration.

Fosterlever dissekerades under sterila betingelser, placerades i ett sterilt rör som innehöll RPMI164O och sönderdelades genom passage genom ett vinylnät för att bilda en singelcellsuspension. Kämförsedda celler tvättades sedan tre gånger, räknades och späddes i odlingsmedium.Fetal liver was dissected under sterile conditions, placed in a sterile tube containing RPMI164O and disintegrated by passage through a vinyl mesh to form a single cell suspension. Nucleated cells were then washed three times, counted and diluted in culture medium.

Navelsträngsblodprover erhölls omedelbart efter vaginal förlossning från normala födslar. Prover av fullvuxen benmärg erhölls från friska allogena donatorer. Suspensioner av farska celler hepariniserades och späddes i 0,9% NaCl och separerades på Lymphoprep (Nycomed, Parma, Oslo, Norge) för gradientcentrifugering vid 2000 varv per minut under 20 min. Celler avlägsnades försiktigt med en Pasteurpipett, tvättades tre gånger i 0,9% NaCl, räknades och späddes i odlingsmedium. lmmunologiska reagens Rekombinanta parvovirus B19 tomma kapsidpartiklar (6) var en gåva från Medlmmune (Gaithersburg, MD, USA). Dessa kapsider producerades i en rekombinant baculovirus-insektscell (Spodoferafrugiperda) expressionssystem, som tidigare beskrivits (6).Umbilical cord blood samples were obtained immediately after vaginal delivery from normal births. Samples of adult bone marrow were obtained from healthy allogeneic donors. Fresh cell suspensions were heparinized and diluted in 0.9% NaCl and separated on Lymphoprep (Nycomed, Parma, Oslo, Norway) for gradient centrifugation at 2000 rpm for 20 minutes. Cells were carefully removed with a Pasteur pipette, washed three times in 0.9% NaCl, counted and diluted in culture medium. Immunological reagents Recombinant parvovirus B19 empty capsid particles (6) were a gift from Medlmmune (Gaithersburg, MD, USA). These capsids were produced in a recombinant baculovirus insect cell (Spodoferafrugiperda) expression system, as previously described (6).

Rekombinanta humana papillomaviruskapsider (HPV6) och Cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) kapsider var en gåva från Dr. J. Dillner, Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige.Recombinant human papillomavirus capsids (HPV6) and Cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) capsids were a gift from Dr. J. Dillner, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden.

Dessa kapsider hade producerats i liknande baculovirus-insektscellsystem i laboratoriema hos Dr. J. Schiller, National Cancer Institute, USA resp Dr. R. Kimbauer, University of Vienna, Österrike. Anti-parvovirus B19 monoklonal antikropp (MAB8292) köptes (Chemicon AB, Malmö, Sverige), i likhet med anti-Pl (Seraclone) monoklonal antikropp (Labdesign, Stockholm, Sverige). Anti-P-monoklonal antikropp (CLB-ery-2) (16) var en gåva från Dr. de Jong och Dr. von dem Berne (Central L^bor-^to“y of the lletherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Nederländema). Alla monoklonala antikroppar var mus IgM med undantag för anti-parvovirus B19 som var IgG. Parvovirus B19 IgG-positiva \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT'\29-\29624\svensk texLdoc 10 15 20 25 30 520 177 6 (parvovirus B19 IgM-negativa) sera erhölls från två asymptomatiska individer på vårt laboratorium.These capsids had been produced in similar baculovirus insect cell systems in the laboratories of Dr. J. Schiller, National Cancer Institute, USA resp Dr. R. Kimbauer, University of Vienna, Austria. Anti-parvovirus B19 monoclonal antibody (MAB8292) was purchased (Chemicon AB, Malmö, Sweden), as was anti-Pl (Seraclone) monoclonal antibody (Labdesign, Stockholm, Sweden). Anti-β monoclonal antibody (CLB-ery-2) (16) was a gift from Dr. de Jong and Dr. von dem Berne (Central L ^ bor- ^ to “y of the lletherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Nederländema). All monoclonal antibodies were mouse IgM except for anti-parvovirus B19 which was IgG. Parvovirus B19 IgG-positive (parvovirus B19 IgM-negative) sera were obtained from two asymptomatic individuals in our laboratory.

Kolonibildning Ett kommersiellt kit "Stem cell CFU kit" (GIBCO BRL, Life Technology Inc., NY, USA) användes för att studera kolonibildning. Det halvfasta systemet imiterar den extracellulära matrix som produceras av stromaceller. De inkluderade komponentema är: Iscoves modifierade Dulbeccos medium, modifierat fetalt bovinserum, metylcellulosa, 2- merkaptoetanol, konditionerat medium och erytropoietin. Kolonier identiﬁerades som BFU-E (burst forrning unit-erythroid cells) med tätt packade hemoglobiniserade celler, CFU-GM (colony forming units-granulocytes, macrophages) med arrangemang av icke- hemoglobiniserade celler, och CFU-GEMM (colony fonning units-granulocytes, erythroid cells, macrophages, megakaryocytes) med hemoglobiniserade celler och små samt stora perifera celler.Colony Formation A commercial kit "Stem cell CFU kit" (GIBCO BRL, Life Technology Inc., NY, USA) was used to study colony formation. The semi-solid system mimics the extracellular matrix produced by stromal cells. The components included are: Iscove's modified Dulbecco's medium, modified fetal bovine serum, methylcellulose, 2-mercaptoethanol, conditioned medium and erythropoietin. Colonies were identified as BFU-E (burst formation unit-erythroid cells) with densely packed hemoglobinized cells, CFU-GM (colony forming units-granulocytes, macrophages) with arrangement of non-hemoglobinized cells, and CFU-GEMM (colony forming units-granulocytes , erythroid cells, macrophages, megakaryocytes) with hemoglobinized cells and small and large peripheral cells.

Viruskapsider späddes i buffert (20 mM Tris, O,5M NaCl, pH 8,5) och 30 uL av varje spädning sattes till 25x103 fetala celler (50xl03 för postnatala celler) i 100 uL odlingsmedium och inkuberades under 1 timme vid +4°. Blandningama överfördes sedan till inkubationsbrickor och odlingsmedium tillsattes till en slutvolym av 0,5 mL per brunn.Virus capsids were diluted in buffer (20 mM Tris, 0.5M NaCl, pH 8.5) and 30 μL of each dilution was added to 25x10 3 fetal cells (50x10 3 for postnatal cells) in 100 μL of culture medium and incubated for 1 hour at + 4 °. The mixtures were then transferred to incubation trays and culture medium was added to a final volume of 0.5 mL per well.

Cellema inkuberades under ll dagar i en fuktad atmosfär vid 5% C02, och poängsattes sedan beträffande BFU-E, CFU-E och CFU-GEMM härstammade kolonibildning.The cells were incubated for 11 days in a humidified atmosphere at 5% CO 2, and then scored for BFU-E, CFU-E and CFU-GEMM derived colony formation.

I ytterligare experiment förinkuberades parvovirus B19 kapsider eller fosterceller med antikroppar före inkuberingen av cellerna under 11 dagar: a) 25 ul av antingen parvovirus B19 IgG positivt serum eller anti-parvovirus B19 monoklonal antikropp (MAB8292) förinkuberades med 25 ul av parvovirus B19 kapsider under 2 h vid +4°. Blandningama sattes sedan till celler såsom ovan beskrivits. b) 25 ul av antingen anti-P (CLB-ery-2) eller anti-Pl (Seraclone) monoklonal antikropp sattes till 25xlO3 celler suspenderade i 100 ul medium. Celler och monoklonal antikropp förinkuberades under 1 h vid 4°C. Blandningama tvättades två gånger i kallt odlingsmedium innan parvovirus B 19 kapsider sattes till cellema såsom ovan beskrivits.In further experiments, parvovirus B19 capsids or fetal cells were preincubated with antibodies before incubating the cells for 11 days: a) 25 μl of either parvovirus B19 IgG positive serum or anti-parvovirus B19 monoclonal antibody (MAB8292) was preincubated with 25 μl of parvovirus B19 capsids h at + 4 °. The mixtures were then added to cells as described above. b) 25 μl of either anti-P (CLB-ery-2) or anti-P1 (Seraclone) monoclonal antibody was added to 25x10 3 cells suspended in 100 μl of medium. Cells and monoclonal antibody were preincubated for 1 hour at 4 ° C. The mixtures were washed twice in cold culture medium before parvovirus B 19 capsids were added to the cells as described above.

Alla analyssatser inkluderade tripletter av varje serum, monoklonal antikropp eller kapsidspädning. Tripletter av mediumkontroll (ingen tillsatt kapsid eller antikropp) och tripletter av kapsidkontroll (ingen tillsatt antikropp) inkluderades i varje experiment. När färska humana celler användes, vid varje tillfalle från olika donatorer, varierade det totala antalet räknade kolonier mellan experimenten. Lämpliga kontroller (”endast kapsid”) visas \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk tcxtdoc 10 15 20 25 30 i < I r .- 520 177 7 därför i ﬁgurema. Medeltal av räknade kolonier från triplettema i representativa experiment ges. Räknade kolonier i mediumkontroll ansågs vara 100% i respektive experiment.All assay kits included triplets of each serum, monoclonal antibody or capsid dilution. Medium control triplets (no added capsid or antibody) and capsule control triplets (no added antibody) were included in each experiment. When fresh human cells were used, in each case from different donors, the total number of colonies counted varied between the experiments. Appropriate controls ("capsid only") are displayed \\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svensk tcxtdoc 10 15 20 25 30 i <I r .- 520 177 7 therefore in ﬁ gurema. Averages of counted colonies from the triplets in representative experiments are given. Counted colonies in medium control were considered to be 100% in each experiment.

Bgëyﬂt Viruskapsiders effekt på fosterlevercellkolonibildning Kolonibildning av BFU-E, CFU-GM och CFU-GEMM analyserades genom odling av färska fosterleverceller i odlingsmedium i en ll-dagars standardanalys. De resulterande räknade koloniema uttrycks som procent av mediumkontrollen. Kapsiderna visades inhibera kolonibildning hos alla cellerna (BFU-E, CF U-GM, CFU-GEMM) (Tabell 1).Bgëy ﬂ t Effect of virus capsids on fetal liver cell colony formation Colony formation of BFU-E, CFU-GM and CFU-GEMM was analyzed by culturing fresh fetal liver cells in culture medium in a 11 day standard assay. The resulting counted colonies are expressed as a percentage of the medium control. The capsids were shown to inhibit colony formation in all cells (BFU-E, CF U-GM, CFU-GEMM) (Table 1).

Rekombinanta papillomaviruskapsider (Cottontail rabbit papillomavirus och human papillomavirus typ 6) inkluderades som kontroll vid odlingen av fosterleverceller. Dessa kapsider är strukturellt liknande parvovirus B19 kapsider, men de använder inte samma receptor som parvovirus B19. Papillomaviruskapsidema hade ingen effekt på kolonibildning av någon celltyp (som testats i området 0,01-100 tig/ml) (icke-visade data).Recombinant papillomavirus capsids (Cottontail rabbit papillomavirus and human papillomavirus type 6) were included as controls in the culture of fetal liver cells. These capsids are structurally similar to parvovirus B19 capsids, but they do not use the same receptor as parvovirus B19. The papillomavirus capsids had no effect on colony formation of any cell type (tested in the range 0.01-100 tig / ml) (data not shown).

Neutralisering av B19 kapsiderna Parvovirus B19 kapsider förinkuberades med anti-B19 monoklonal antikropp (MAB8292) innan blandningen sattes till fosterleverceller för 11 dagars inkubationsperioden.Neutralization of the B19 capsids Parvovirus B19 capsids were preincubated with anti-B19 monoclonal antibody (MAB8292) before the mixture was added to fetal liver cells for the 11 day incubation period.

Ehuru en relativt hög koncentration av parvovirus B19 kapsider (7 tig/ml, jämför Tabell 1) användes, hade anti-B19 monoklonal antikroppen (20 tig/ml) förmåga att fullständigt blockera den inhiberande effekten på BFU-E och minska effekten på CFU-GM och CFU- GEMM kolonibildning (Tabell 2A).Although a relatively high concentration of parvovirus B19 capsids (7 tig / ml, see Table 1) was used, the anti-B19 monoclonal antibody (20 tig / ml) was able to completely block the inhibitory effect on BFU-E and reduce the effect on CFU-E. GM and CFU- GEMM colony formation (Table 2A).

Två parvovirus B19 IgG positiva sera från asymptomatiska individer testades också beträffande deras neutraliserande effekt på kapsider före inkubering av blandningen med fosterleverceller. Parvovirus B19 kapsider (0,14 tig/ml) inhiberade ensamma BFU-E till 18% av mediumkontrollen. När parvovirus B19 kapsider förinkuberades med serum 1 (1110 spädning), minskade inhiberingen (Tabell 2B). Den neutraliserande kapaciteten hos serum 2 var lägre.Two parvovirus B19 IgG positive sera from asymptomatic individuals were also tested for their neutralizing effect on capsids before incubating the mixture with fetal liver cells. Parvovirus B19 capsids (0.14 tig / ml) alone inhibited BFU-E to 18% of medium control. When parvovirus B19 capsids were preincubated with serum 1 (1110 dilution), inhibition decreased (Table 2B). The neutralizing capacity of serum 2 was lower.

Blockering av P-antigen på fosterleverceller Fosterleverceller förinkuberades med anti-P-monoklonal antikropp (CLB-ery-2).Blockage of β-antigen on fetal liver cells Fetal liver cells were preincubated with anti-β-monoclonal antibody (CLB-ery-2).

Genom att blockera parvovirus B19 cellulära receptom med denna monoklonala antikropp minskade parvovirus B19 kapsidens inhiberande effekt med åtminstone 25% för de olika cellerna (BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM) (Tabell 3). kontrollmonoklonal antikropp mot P1 antigenet (Seraclone; som inte är involverad i Genom att använda en \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk textdoc 10 15 20 520 177 8 parvovirus B19 bindning) sågs ingen effekt på kolonibildning jämfört med parvovirus B19 kapsidkontrollen.By blocking the parvovirus B19 cellular receptor with this monoclonal antibody, parvovirus B19 reduced the inhibitory effect of the capsid by at least 25% for the different cells (BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM) (Table 3). control monoclonal antibody to the P1 antigen (Seraclone; which is not involved in By using a \\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ swedish B19 capsid control.

Kolonibildning av navelsträngsblod och fullvuxna benmärgsstamceller Parvovirus B19 kapsiders inhiberande effekt på kolonibildning testades också med användning av färska stamceller som härstammade från navelsträngsblod och fullvuxna benmärgsprover. Den inhiberande effekten var jämförbar med odlingar av fosterleverceller (Tabell 4). Neutralisering av parvovirus B19 kapsider med anti-parvovirus B19 monoklonal antikropp (MAB8292) i samma koncentrationer som i Tabell 2A var också jämförbar med odlingar av fosterleverceller (icke-visade data).Colonial formation of umbilical cord blood and adult bone marrow stem cells The inhibitory effect of parvovirus B19 capsules on colony formation was also tested using fresh stem cells derived from umbilical cord blood and adult bone marrow samples. The inhibitory effect was comparable to fetal liver cell cultures (Table 4). Neutralization of parvovirus B19 capsids with anti-parvovirus B19 monoclonal antibody (MAB8292) at the same concentrations as in Table 2A was also comparable to fetal liver cell cultures (data not shown).

De erhållna resultaten beträffande parvovirus B19 kapsiders inhiberande effekt på kolonibildning föreslår att de kan användas för att inhibera hematopoes i recipienter fore in utero stamcellstransplantation. Ett angreppssätt vid fosterstamcellstransplantationer skulle vara att behandla recipienten med parvovirus B19 kapsider för att undertrycka stamcellsaktivet och därigenom öka donator-till-recipient cellförhållande. I en tidigare studie om vävnadsdistribution av stamceller i humant foster uppskattade vi att en foster- transplantation med 5 x 107 celler i den andra trimestern leder till ett donator-till-recipient förhållande av ungefär l:l000 - 1110000. Det är i hög grad diskutabelt om ett sådant lågt förhållande i hematopoietiska organ skulle vara tillräckligt för att ge de transplanterade cellerna en kompetitiv fördel framför de nativa stamcellema (14). Därtill skulle det vara möjligt att förbehandlat donatorceller med anti-P-monoklonala antikroppar för att skydda dem mot suppression av kapsidema, varigenom dessa celler skulle ges en till och med fördelaktigare status.The results obtained regarding the inhibitory effect of parvovirus B19 capsules on colony formation suggest that they can be used to inhibit hematopoiesis in recipients before in utero stem cell transplantation. An approach in fetal stem cell transplants would be to treat the recipient with parvovirus B19 capsids to suppress the stem cell activity and thereby increase the donor-to-recipient cell ratio. In a previous study on tissue distribution of stem cells in human fetuses, we estimated that a fetal transplant with 5 x 107 cells in the second trimester leads to a donor-to-recipient ratio of approximately 1: 1000 - 1110000. This is highly debatable. if such a low ratio in hematopoietic organs would be sufficient to give the transplanted cells a competitive advantage over the native stem cells (14). In addition, it would be possible to pretreat donor cells with anti-β monoclonal antibodies to protect them from suppression of the capsids, giving these cells an even more beneficial status.

\\FSERVER\OSCARUSER\PATEN"l'\29-\29624\svensk textdoc 10 15 20 25 30 520 177 9 n» ~- Tabell 1. Kolonibildande enhetsanalys av fosterleverceller. Cellema förinkuberades med spädningar av parvovirus B19 kapsider fore ll-dagars odlingen.\\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATEN "l '\ 29- \ 29624 \ svensk textdoc 10 15 20 25 30 520 177 9 n» ~ - Table 1. Colony-forming unit analysis of fetal liver cells. The cells were preincubated with dilutions of parvovirus B19 capsids for ll-days. cultivation.

Räknade ko1onier(% av mediumkontroll) Parvovirus B19 kansid (ua/mL) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM 70 22% 14% 3 1% 0,7 39% 54% 63% 0,007 79% 95% 94% Medium (=100%). räknade kolonier 95 3 7 16 Tabell 2. Kolonibildande enhetsanalys av fosterleverceller. Cellerna ﬁñrinkuberades med följ ande reagens fore ll-dagars odlingen.Counted colonies (% of medium control) Parvovirus B19 Canside (ua / mL) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM 70 22% 14% 3 1% 0.7 39% 54% 63% 0.007 79% 95% 94% Medium ( = 100%). counted colonies 95 3 7 16 Table 2. Colony-forming unit analysis of fetal liver cells. The cells were incubated with the following reagents for the 11-day culture.

A Parvovirus B19 kapsid (7 ug/mL) + spädningar av Anti-parvovirus B19 Räknade kolonier (% av mediumkontroll) mab (ua/mL) BFU-E CF U-GM CFU-GEMM 20 >1 00% 74% 67% 2 69% 35% 45% 0,2 52% 21% 19% 0,02 52% 30% 21% endast kapsid 43% 30% 21% Medium (=100%). räknade kolonier 1 14 66 42 B Parvovirus B19 kapsid (0.l4 ug/mL) + spädningar av två humana parvovirus Räknade kolonier (% av mediumkontroll) B19 IQG Dositiva sera BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Serum 1, 1:10 70% 78% 90% Serum 1, 1:l00 25% 23% 40% Serum 2, 1:10 48% 57% 57% Serum 2, 1:l00 17% 27% 67% endast kapsid 18% 17% 63% Medium ( =100%1. räkande kolonier 157 81 30 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svcnsk texLdoc . . . . . u m. _.. . . .. S. . »- . «. .. .s -. » »o - 4 -. ». i, -. « | n - ~ f'- I ... » .. ., f.. - .. . . . . . a . i ,, . f -. . l = . - . n i H .l 1. .. U- A- 10 Tabell 3. Kolonibildande enhetsanalys av fosterleverceller. Cellema fórinkuberades med följande reagens fore ll-dagars odlingen Parvovirus B19 kapsid (0. 14 ug/mL) Räknade kolonier (% av mediumkontroll) + av Anti-P mab (titer) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM 1 :5 5 1% 39% 93% 1:500 23% 10% 43% endast kapsid 18% 17% 63% Medium (=1 00%1, räknade kolonier 157 81 30 Parvovirus B19 kapsid (O. l4ug/mL) + av Anti-Pl mab (LLQ/mL) 400 25% 20% 50% 4 1 7% 22% 47% endast kapsid 18% 17% 63 % Medium (=100%). räknade kolonier 157 81 30 Tabell 4. Kolonibildande enhetsanalys av navelsträngsblod resp fullvuxna bemnärgsceller.A Parvovirus B19 capsid (7 ug / mL) + dilutions of Anti-parvovirus B19 Counted colonies (% of medium control) mab (ua / mL) BFU-E CF U-GM CFU-GEMM 20> 1 00% 74% 67% 2 69% 35% 45% 0.2 52% 21% 19% 0.02 52% 30% 21% only capsid 43% 30% 21% Medium (= 100%). counted colonies 1 14 66 42 B Parvovirus B19 capsid (0.14 ug / mL) + dilutions of two human parvoviruses Counted colonies (% of medium control) B19 IQG Positive sera BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Serum 1, 1:10 70% 78% 90% Serum 1, 1: l00 25% 23% 40% Serum 2, 1:10 48% 57% 57% Serum 2, 1: l00 17% 27% 67% only capsid 18% 17% 63% Medium (= 100% 1. Counting colonies 157 81 30 \\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svcnsk texLdoc..... U m. _ .... .. S.. »-.«. .. .s -. »» o - 4 -. ». i, -.« | n - ~ f'- I ... »..., f .. - ...... a. i ,,. f -.. l =. -. ni H .l 1. .. U- A- 10 Table 3. Colony-forming unit analysis of fetal liver cells. ug / mL) Counted colonies (% of medium control) + of Anti-P mab (titer) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM 1: 5 5 1% 39% 93% 1: 500 23% 10% 43% capsid only 18% 17% 63% Medium (= 100% 1, counted colonies 157 81 30 Parvovirus B19 capsid (O. 14ug / mL) + of Anti-Pl mab (LLQ / mL) 40 0 25% 20% 50% 4 1 7% 22% 47% only capsid 18% 17% 63% Medium (= 100%). counted colonies 157 81 30 Table 4. Colony-forming unit analysis of umbilical cord blood and adult border cells.

Cellema inkuberades med soädningar av B19 kapsid (LLQ/ml) fore ll-dagars odlingen.The cells were incubated with B19 capsid seedlings (LLQ / ml) for the 11-day culture.

Räknade kolonier (% av mediumkontroll) Parvovirus B19 kapsid (ua/mL) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Navelsträngsblodceller 7 10% 54% 43% 0,7 33% 62% 43% 0,07 49% 72% 50% 0,007 57% 67% 70% 0,0007 84% 79% 93% Medium (=100%), räknade kolonier 134 39 30 Benmärgsceller 7 18% 36% 6% 0,7 43% 45% 28% 0,07 63% 41% 44% 0,007 76% 80% 78% 0,0007 86% 77% 78% Medium (=l00%l. räknade celler 134 39 30 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk textdoc 10 15 20 25 30 520 177 11 Referenser 1. Anderson LJ, Young NS. Human parvovirus B19. Ed.: Parks WP. Monographs in Virology. Vol. 20. Karger. 1997. 2. Brown KE, Anderson SM, Young NS: Erythrocyte P antigen: Cellular receptor for B19 parvovirus. Science 262: 114, 1993. 3. Mortimer PP, Humphries RK, Moore JG, Purcell RH, Young NS: A human parvovirus-like virus inhibits haemotopoietic colony formation in vitro. Nature 302: 426, 1983 4. Saunders PW, Ried MM, Cohen BJ: Human parvovirus induced cytopenias: A report of five cases. Br J Haematol 63: 407, 1986 5. Kajigaya S, Shimada T, F ujita S, Young NS: A genetically engineered cell line that produces empty capsids of B19 (human) parvovirus. Proc Natl Acad Sci USA 86: 7601, 1989 6. Kajigaya S, F uj ii H, Field A, Anderson S, Rosenfeld S, Anderson LJ, Shimada T, Young NS: Self-assembled B19 parvovirus capsids, produced in baculovirus system, are antigenically and immunogenically similar to native virions. Proc Natl Acad Sci USA 88: 4646, 1991 7. Brown CS, van Lent J WM, Vlak JM, Spaan WJM: Assembly of empty capsids by using baculovirus recombinants expressing human parvovirus B19 structural proteins. J Virol 65: 2702, 1991 8. Zanjani ED, Macintosh FR, Harrison MR: Hematopoietic chimerism in sheep and in nonhuman primates by in utero transplantation of fetal hematopoietic stem cells. Blood cells 17: 349, 1991 9. Zanjani ED, Pallavieini MG, Ascensao JL, Flake AW, Langlois RG, Reitsma M, Mackintosh FR, Stutes D, Harrisson MR, Tavassoli M: Engraftment and long tenn expression of human fetal hemopoietic stem cells in sheep following transplantation in utero. J Clin Invest 89: 1178, 1992 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk texLdoc 10 15 20 25 30 » . - . i I 520 177 12 10. Shields LE, Bryant EM, Easterling TR, Andrews RG: F etal liver cell transplantation for the creation of lymphohematopoietic chimerism in fetal baboons. Am J Obstet Gynecol 173: 1157, 1995 11. Touraine JL, Raudrant D, Rebaud A, Roncarolo MG, Laplace S, Gebuhrer L, Betuel H, Frappas D, F reycon F, Zabot MT, Touraine F, Souillet G, Philippe N, Vullo C: In utero transplantation of stem cells in human: immunological aspects and clinical follow up of patients. Bone marrow transplant 9: 121, 1992 12. Flake AW: Succesful treatment of XSCID by in utero transplantation of CD34 enriched patemal bone marrow cells. Blood 86: 125a, 1995 13. Wengler GS, Lanfranchi A, Frusca T, Verardi R, Neva A, Brugnoni D, Giliani S, F iorini M, Mella P, Guandalini F, Mazzolari E, Pecorelli S, Notarangelo LD, Porta F, Ugazio AG: In- utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X- linked severe combined immunodeﬁciency (SCIDX1). Lancet 348: 1484, 1996 14. Westgren M, Ek S, Bui TH, Jansson B, Kjaeldgaard A, Markling L, Nennesmo I, Seiger Å, Sarby B, Thomström S, Ríngdén O: Tissue distribution of transplanted fetal liver cells in the human fetal recipient. Am J Obstet Gynecol 176: 49, 1996 15. Flake AW, Zanjani ED: In utero hematopoietic stem cell transplantation, JAMA 278: 932, 1997 16. von dem Bome A.E.G.Kr., M.J.E. Bos, N. Joustra-Maas, J .F. Tromp, R. Van Wijngaarden-du Bois, P.A.T. Tetteroo: A murine monoclonal IgM antibody specific for blood group P antigen (globoside). Br J Hematol 63: 35, 1986 17. Brown KE, Cohen BJ: Haemagglutination by parvovirus B 19. J Gen Virol 73(Pt 8): 2147, 1992. 18. Morey AL, Flemming KA: Immunophenotyping of fetal haemopoietic cells pennissive for human parvovirus B19 replication in vitro. Br J Haematol 82: 302, 1992 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk texLdoc 10 15 X . . . » ß 520 177 13 19. Bostic J, Koenig S: Quantitative analysis of Parvovirus B19 neutralizing responses in immune sera by an RT-PCR based assay. Abstract 4.5. VIIth Intemational Parvovirus Workshop, Heidelberg, Germany, 1997. 20. Giralt S, Estey E, Albitar M, van Besien K, Rondon G, Anderlini P, O'Brien S, Khouri I, Gajewski J, Mehra R, Claxton D, Andersson B, Beran M, Przepiorka D, Koller C, Kornblau S, Korbling M, Keating M, Kantarjian H, Champlin R: Engraﬁment of allogeneic hematopoietic progenitor cells with purine analog-containing chemotherapy: harnessing graﬁ- versus-leukemia without myeloblative therapy. Blood 89: 4531, 1997 21. Slavin S, Nagler A, Naparstek E, Kapelushnik Y, Aker M, Cividalli G, Varadi G, Kirchbaum M, Ackerstein A, Samuel S, Amar A, Brautbar C, Ben-Tal O, Eldor A, Or R: Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood 91: 756, 1998.Counted colonies (% of medium control) Parvovirus B19 capsid (ua / mL) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Umbilical cord blood cells 7 10% 54% 43% 0.7 33% 62% 43% 0.07 49% 72% 50% 0.007 57% 67% 70% 0.0007 84% 79% 93% Medium (= 100%), counted colonies 134 39 30 Bone marrow cells 7 18% 36% 6% 0.7 43% 45% 28% 0.07 63% 41% 44% 0.007 76% 80% 78% 0.0007 86% 77% 78% Medium (= l00% l. Counted cells 134 39 30 \\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svensk textdoc 10 15 20 25 30 520 177 11 References 1. Anderson LJ, Young NS. Human parvovirus B19. Ed .: Parks WP. Monographs in Virology. Vol. 20. Karger. 1997. 2. Brown KE, Anderson SM, Young NS: Erythrocyte P antigen : Cellular receptor for B19 parvovirus. Science 262: 114, 1993. 3. Mortimer PP, Humphries RK, Moore JG, Purcell RH, Young NS: A human parvovirus-like virus inhibits haemotopoietic colony formation in vitro. Nature 302: 426, 1983 4. Saunders PW, Ried MM, Cohen BJ: Human parvovirus induced cytopenias: A report of five cases. Br J Haematol 63: 407, 1986 5. Kajigaya S, Shimada T, F ujita S, Young NS: A genetically engineered cell line that produces empty capsids of B19 (human) parvovirus. Proc Natl Acad Sci USA 86: 7601, 1989 6. Kajigaya S, F uj ii H, Field A, Anderson S, Rosenfeld S, Anderson LJ, Shimada T, Young NS: Self-assembled B19 parvovirus capsids, produced in baculovirus system, are antigenically and immunogenically similar to native virions. Proc Natl Acad Sci USA 88: 4646, 1991 7. Brown CS, by Lent J WM, Vlak JM, Spaan WJM: Assembly of empty capsids by using baculovirus recombinants expressing human parvovirus B19 structural proteins. J Virol 65: 2702, 1991 8. Zanjani ED, Macintosh FR, Harrison MR: Hematopoietic chimerism in sheep and in nonhuman primates by in utero transplantation of fetal hematopoietic stem cells. Blood cells 17: 349, 1991 9. Zanjani ED, Pallavieini MG, Ascensao JL, Flake AW, Langlois RG, Reitsma M, Mackintosh FR, Stutes D, Harrisson MR, Tavassoli M: Engraftment and long tenn expression of human fetal hemopoietic stem cells in sheep following transplantation in utero. J Clin Invest 89: 1178, 1992 \\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svensk texLdoc 10 15 20 25 30 ». -. i I 520 177 12 10. Shields LE, Bryant EM, Easterling TR, Andrews RG: F etal liver cell transplantation for the creation of lymphohematopoietic chimerism in fetal baboons. Am J Obstet Gynecol 173: 1157, 1995 11. Touraine JL, Raudrant D, Rebaud A, Roncarolo MG, Laplace S, Gebuhrer L, Betuel H, Frappas D, F reycon F, Zabot MT, Touraine F, Souillet G, Philippe N , Vullo C: In utero transplantation of stem cells in human: immunological aspects and clinical follow up of patients. Bone marrow transplant 9: 121, 1992 12. Flake AW: Successful treatment of XSCID by in utero transplantation of CD34 enriched patemal bone marrow cells. Blood 86: 125a, 1995 13. Wengler GS, Lanfranchi A, Frusca T, Verardi R, Neva A, Brugnoni D, Giliani S, F iorini M, Mella P, Guandalini F, Mazzolari E, Pecorelli S, Notarangelo LD, Porta F , Ugazio AG: In- utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDX1). Lancet 348: 1484, 1996 14. Westgren M, Ek S, Bui TH, Jansson B, Kjaeldgaard A, Markling L, Nennesmo I, Seiger Å, Sarby B, Thomström S, Ríngdén O: Tissue distribution of transplanted fetal liver cells in the human fetal recipient. Am J Obstet Gynecol 176: 49, 1996 15. Flake AW, Zanjani ED: In utero hematopoietic stem cell transplantation, JAMA 278: 932, 1997 16. von dem Bome A.E.G.Kr., M.J.E. Bos, N. Joustra-Maas, J .F. Trump, R. Van Wijngaarden-du Bois, P.A.T. Tetteroo: A murine monoclonal IgM antibody specific for blood group P antigen (globoside). Br J Hematol 63:35, 1986 17. Brown KE, Cohen BJ: Haemagglutination by parvovirus B 19. J Gen Virol 73 (Pt 8): 2147, 1992. 18. Morey AL, Flemming KA: Immunophenotyping of fetal haemopoietic cells pennissive for human parvovirus B19 replication in vitro. Br J Haematol 82: 302, 1992 \\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svensk texLdoc 10 15 X. . . »Ss 520 177 13 19. Bostic J, Koenig S: Quantitative analysis of Parvovirus B19 neutralizing responses in immune sera by an RT-PCR based assay. Abstract 4.5. VIIth Intemational Parvovirus Workshop, Heidelberg, Germany, 1997. 20. Giralt S, Estey E, Albitar M, van Besien K, Rondon G, Anderlini P, O'Brien S, Khouri I, Gajewski J, Mehra R, Claxton D, Andersson B, Beran M, Przepiorka D, Koller C, Kornblau S, Korbling M, Keating M, Kantarjian H, Champlin R: Engra ﬁ ment of allogeneic hematopoietic progenitor cells with purine analog-containing chemotherapy: harnessing gra ﬁ- versus-leukemia without myeloblative therapy. Blood 89: 4531, 1997 21. Slavin S, Nagler A, Naparstek E, Kapelushnik Y, Aker M, Cividalli G, Varadi G, Kirchbaum M, Ackerstein A, Samuel S, Amar A, Brautbar C, Ben-Tal O, Eldor A, Or R: Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood 91: 756, 1998.

\\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk texLdoc\\ FSERVER \ OSCARUSER \ PATENT \ 29- \ 29624 \ svensk texLdoc

Claims

10 15 520 177 / L / Patent claim

Use of empty, non-infectious, recombinant parvovirus capsid particles, or β-antigen-blocking moieties thereof, for the manufacture of a medicament for inhibiting hematopoietic stem cells.

Use according to claim 1, wherein the medicament is a medicament for inhibiting endothelial cell growth.

Use according to claim 1, wherein the medicament is a medicament for the treatment of haematological proliferative disorders of β-antigen-positive cells, such as polycythemia vera.

Use according to claim 1, wherein the medicament is a medicament for treating a patient before stem cell transplantation.

Use according to claim 4, wherein the patient is a fetus. K: \ Patent \ l 9- \ l 929- \ l 92962400 \ O30 l 3 l Kravdoc