SE519116C2 - Syntes och utvärdering av nya cyaninfärgämnen som binder till minor groove - Google Patents

Description

25 30 färgämnena TO och YO och DNA har undersökts spektroskopiskt i olika studier. Dessa färgämnen binder genom interkalation mellan baser på ett icke-specifikt sätt. Vidare, uppvisar de också en stark affinitet för enkelsträngat DNA med stor åtföljande ökning av fluoroscens vid bindning.

Fluoroforerna som ofizast användes idag är Fluorescein, BODIPY, DAPI, Hoechst och asymmetriska cyaninfärgämnen såsom TO, YO och TOTO.

Fluorescein och BODIPY är de mest vanliga fluoroscenta rapporteringsgrupperna för kovalent märkning av proteiner, varvid DAPI, Hoechst och cyaninfärgämnen är de mest vanliga fluoroforerna för detektion av nukleinsyra. _ "H2 *NN n OH / "f H2 ~::. "UÛ-t» Ö rÛ rie/Q N DAPI A HOECHST DERIVATE A CYÅNINE DYE DAPI (abs. max 400 nm) och Hoechst (abs. max 350 nm) binder in i mindre fåran och användes som bas-specifika fluoroscenssonder för DNA med en 20-faldig ökning i fluoroscens vid bindning till DNA. 1 I motsats härtill, har asymmetriska cyaninfärgämnen visat upp till 18 OOO-faldig ökning i fluoroscens vid bindning till DNA. De har också hafl: fördelen att absorptionen och emissionen lätt kan varieras genom att ändra antalet dubbelbindningar mellan aromatiska ringarna. Emellertid, är en väsentlig nackdel med asymmetriska cyaninfärgämnen att de vanligen binder på ett icke-specifikt sätt till DNA- sekvenser, 2 (d.v.s. interkalerar eller bildar jonparskomplex med DNA, vilket kan resultera i komplex eller svag fluoroscenssignal). Därför, kan ett cyaninfärgämne som binder på ett mera organiserat sätt kan ha en stor fluoroscensökning vid hybridisering och sålunda vara en mera känslig fluorofor.

Mindre fåran år ett lämpligt säte för attack eftersom den normalt inte är ockuperad av cellulära föreningar såsom proteiner. Den är också ett perfekt komplement till konkava katjoniska färgämnen på grund av den negativa elektrostatiska potentialen, och det konvexa golv som föreligger i mindre fåran. Vissa ämnen som binder till mindre fåran stabiliserar DNA duplex och kan fungera som regulatorer av DNA protein funktionen.

Som en konsekvens härav kan utveckling av sekvens-specifika ämnen som binder till ' Biochem Biophys Res comm 170, 270 (1990) 2 Nygren J., svmvik, N., Kubism, Mßiopoiymers, 46, 39-51, 1998 10 15 20 25 30 s 19 116 i; 3 mmdre faran generera nya foremngar med anticancer och/eller antivirala egenskaper och sålunda tjäna som ett alternativt och kompletterande sätt för antisense- a o uno-co oligonukleotidstrategi. Vidare, kan de mindre fåran-bindande ämnenas stabiliserande effekt på DNA duplex användas i sonder bestående av ett konjugat av mindre fåran- ligand-nukleinsyra för att öka smälttemperaturen (Tm) hos sond-DNA dupiex. En ökning av Tm hos sonderna medger en mera flexibel testutformning eftersom oligoner i sonden kan vara kortare och ändock ha optimal Tm.

Sekvensselektiva mindre fåran-bindande ämnen har också missmatchande särskiijning.

Nukleinsyrasonder med mindre fåran-bindande ämnen som rapporteringsgrupp bör ha en ökad skillnad mellan Tm hos match och enkel-bas mismatch nukleinsyror än motsvarande sond med en interkalatorgrupp som rapporterande grupp. Därvid ökar den särskiljande kraften hos hybridiseringstest.

Ett användbart kännetecken hos ämnen som binder till mindre fåran är att de föredrar dubbelsträngat DNA jämfört med enkel-strängat DNA, varvid interkalatorer vanligen inte har någon preferens för enkel eller dubbelsträngat DNA. Detta kännetecken resulterar i att sonder med ämnen som binder till mindre fåran uppvisar lägre bakgrundsfluoroscens än sonder med en interkalator och som en konsekvens härav, en större signal-till-brus kvot vid hybridisering. Vidare, kan färger specifika för duplex-DNA användas för kvantifiering av DNA i blandningar kontaminerade med RNA eller enkelsträngat DNA.

En utmaning är att utveckla ett antal mycket känsliga fluoroscensfärgämnen med olika väl-separerade emissionsspektra som binder på ett precist sätt och sålunda medger multidetektion av en serie målgrupper med hög känslighet. Som nämnts kan cyaninfärgämnen ha upp till 18 000-faldig ökning i fluoroscens vid hybridisering vilket är nästan 1000 gånger mer än de ämnen som binder till mindre fåran som användes idag.

Vidare kan också absorptionen och emissionen lätt stämmas genom att variera det konjugerade systemet i cyaninfärgämnet. Sålunda, ett cyaninfårgämne som är substituerat så att bindning i mindre fåran är styrd, men med extraordinära fluoroscensegenskaper hos de kända cyaninfärgämnena kvarstående tycks vara en mycket intressant målförening. 10 15 20 25 5119 116 4 nunnan 2 s NH s srz. KscN s T 1) m, ~ N WP N 2) NaoH / "f \ 3 NH \ s T \ Hear ®'s S / , N i -» f N \ N+ Vacuum N N\ I Inspirerad av den konkava strukturen hos ämnen som binder till den mindre fåran och nya upptäckter att en benzotiazol och relaterade strukturgrupper kan styra igenkännandet av mindre fåran3 har vi designerat och syntetiserat ett asymmetriskt cyaninfärgämne substituerad med en extra benztiazolgrupp i enlighet med ovanstående.

Interaktionen mellan detta nya färgämne och DNA studerades med olika spektroskopiska metoder såsom flödes-LD och CD.

Dessa två tekniker kan ge information om huruvida ett läkemedel binder till DNA genom interkalering eller bindning till fåra. Svag induktion av CD är vanligen förbunden med interkalering, medan asymmetrisk induktion beror på bindning till fåran. Bindning till fåran ger en stark signal i Flödes-LD.

I närvaro av kalvthymus DNA observerades en svag positiv signal i flödes-LD spektra.

Detta kan bero på heterogen bindning med en blandning av interkalerade och fåran- bindnade färgämne. Å andra sidan i närvaro av poly [(dA-dT)]2 visas ett klart positivt LD som ger en stark indikation på bindning till mindre fåran. För poly [(dG-dC)]2 observerades endast en svag signal vilket indikerar en heterogen bindning eller en liten abundans av interkalerat färgämne.

Klart är att de nya färgämnena binder på ett annorlunda sätt till A-T och G-C rika regioner. Resultaten från mätningarna gav vidare stöd för bindning till fåran vad avser detta nya färgämne.

För polyGC ses nästan ingen signal vilket står i överensstämmelse med interkalativ eller extem bindning, medan för polyAT en mycket stark asymmetrisk induktion ses. i Armirage et. al. J. Am. Chem. soc. 121, 2987-2995, (1999) 10 15 519 116 s Den binder till mindre fåran i A-T rika regioner och sålunda stabiliseras A-T bindningar mera än G-C bindningar i ett DNA-duplex. Därför, om en sond utformas så att en A-T-rik region placeras under ämnet som binder till mindre fåran kan den användas i sonder för att förbättra mismatch särskiljning.

Intressant är att våra resultat vidare betonar de preliminära rapporterna i litteraturen om att benzotiazolgruppen kan utnyttjas som ett ämne som igenkänner mindre fåran. Om så, är detta en viktig upptäckt eftersom det öppnar möjligheter för utformning av nya läkemedel som binderi mindre fåran.

Våra första resultat visar att det är möjligt att utforma och bereda asymmetriska cyaninfärgämnen som fungerar som ämne som binder till mindre fåran.

Vidare, möjligheter att bredda denna omfattning är: Eftersom det föreligger en väl arbetande syntetisk väg för substituerade cyaninfärgämnen är det första steget kvävet i orto-position, Z-BEBO, från metinsubstituenten. 519 116 6 Tillsammans med syntesen av de två kinolinderivaten BETO och Z-BETO, kan syntesen av benzoxazol och benzimidazolderivaten ske.

BETO Z-BETO Syntesen av dessa två nya benzoxazol och benzimidazol substituerade färgämnen följer 5 en något annorlunda syntesväg.

X x Br l s ßf S Ürfslllïa Q JL NE N S “H2 f sale f* Stilla-kopplingen av liknande föreningar och syntes av benzoxazol- and benzimidazol- stannaner kan hittas i litteraturenf' Det sista steget, kondensation av förening 1 med pyridin eller kinolinsalt användes rutinmässigt i syntes av asymmetriska 10 cyaninfärgämnen.

“ Kosugi et. al. Bull. Chem. Soc. Jpn. 59, 677-679 (1986), Jutzi et. al. J. Organomet. Chem. 246, 163-168 (1983), Benhida et. al. Tetr. Lott. 40, 5701-5703 (1999) 519 115 7 Exempel Framställning enligt reaktionsschemat s Ni-iz s Brz, KscN s Tf 1) MQ b-O-NH, f N N DMF N 2) NaoH / "f s NH \ s r \ »M Ûs S f / N | / N \ Nr VSGJWH N N\ 5 Färgämnet 1 framställdes i fyra steg utgående från den kommersiellt tillgängliga anilinen 1. Tiocyanatbildning av den 4-substituerade anilinen 1 med kaliumtiocyanat och brom i DMF gav Z-aminobenzothiazolen 2 i ett 40 % utbyte. Metylering och deprotonering av förening 2 fortskred i ett totalt 70 % utbyte för att ge 2-imino-3-metylbenzotiazolin 3.

Färgämnet 5 framställdes i 20 % genom smältning av förening 3 tillsammans med 10 pyridinsaltet 4 vid 160°C under vakuum.

Claims (3)

519 116 8 e som binder i DNA's fåra, och vald ur gruppen PATENTKRAV.

1. Ett cyaninfärgämn il / S \ r 5 vari X är O, S, eller N.

2. Cyaninfärgämne enligt krav 1, med pyridinringen i 2-position.

3. Sond för nukleinsyra hybridisering omfatta 10 15 20 nde ett cyaninfärgämne enligt krav 1-2.