SE503402C2 - Immunglobulinkojugat, förfarande för framställning av densamma samt komposition innehållande densamma - Google Patents

Description

503 402 ning har ofta fokuserats på reducering av T-cellaktivitet med användning av antitymocytglobulin. Med utvecklingen av monoklonala antikroppar har det helt nyligen blivit möjligt att bestämma T-cellundergrupper efter deras funktion in yiiin och efter närvaron av specifika ytantigener definierade genom MoAb. Detta har stimulerat sökandet efter en mekanism var- igenom T-celler kontrollerar transplantatavstötning med kon- centration på huvuduppdelningen i hjälpare/inducer och cyto- toxisk/suppressor-undergrupperna definierade genom L3T4 och Ly-2 murin-antigener. Fastän OKT3 MoAb, ett anti-pan-T-cell- reagens, har visat in ning-styrka, fann vi i en färsk Studie att 20 MoAbs till 20 olika murin-lymfocytantigener var utan in ning-effekt på möss och därför är oanvändbara för in Kinn- studier. Det är därför lämpligt att undersöka sätt genom vilka dessa högst specifika MoAbs kan göras starkare och fullstän- digt ersätta Sum målceller. Användningen av cytotoxiska läke- medel kopplade till MoAbs är ett sådant tillvägagångssätt.

Den kliniska potentialen för läkemedels-MoAb-konjugat omfattar immunkemoterapi av cancer och lindring av olika immunregula- toriska sjukdomar och allo-transplantatavstötning. Många stu- dier har visat att den specifika cytotoxiciteten på tumör- celler hos toxiner och läkemedel när de kopplades till MoAb ökade för tumörassocierade antigener. Det har emellertid lagts mindre vikt vid användningen in Kinn av läkemedels-MoAb- konjugat för att bekämpa T-celler och för att undersöka T- cellimmunreglering vid transplantatavstötning, fastän toxin- antikropp-konjugat har använts i stor utsträckning in vitro för att bekämpa T-celler innan benmärgstransplantation.

Antracykliner är en viktig grupp antineoplastiska medel som användes vid kemoterapi vid cancer, av vilka doxorubicin och daunorubicin har visat verkan mot solida tumörer. Koppling av daunorubicin och doxorubicin till antikroppar resulterar emellertid i en väsentlig förlust av läkemedelsaktivitet när kopplingen genomföres via aminogruppen. Nyligen har dauno- rubicin kopplats till MoAbs via kolatom l4 med användning av 503 402 bromodaunorubicin. Dessa konjugat visar aktivitet in ninnn.

Emellertid rapporterades inga in ning-studier (Gallego et al, Int. J. Cancer, l984 33 737-744). Dessutom har det visats att daunorubicin-MoAb-konjugat uppvisar en icke-specificerad toxicitet vid koncentrationer ;>lO pg/ml.

Vi har nu funnit att Idarubicin (4-demetoxi-daunorubicin, Ida) kan kopplas till MoAbs och att konjugaten har en selektiv och kraftig in niing och in ning anti-tumöraktivitet. Icke- specificerad toxicitet hos Ida-MoAb-konjugat har inte visat sig in ninn vid doser på < 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-konjugaten har större verkan in ninnn och in ning än daunorubicin-MoAb- konjugat.

Dessutom bestämde vi förmågan hos Ida-MoAb-konjugat att speci- fikt utrota cellpopulationer genom koppling av Ida till MoAbs kända för att reagera med olika subpopulationer av lymfocyter (L3T4+, Ly-2+ och Thy-l+). Vi har funnit detta vara en för- vånansvärt effektiv metod att göra slut på celler. Exempelvis kan anti-Ly-2.1 MoAb, som inte har någon mätbar effekt in ninn på Ly-2.l+ celler, omvandlas till ett effektivt cytotoxiskt medel genom koppling med det cytotoxiska medlet Ida.

Genom att använda MoAbs till Ly-2 och L3T4 antigener, har vi nu visat att Ida-MoAb kan eliminera målceller in vitro och in vivo. Ida-MoAb-konjugat kan tillhandahållas som har större potential att göra slut pâ speciellt T-cellundergrupper an- svariga för transplantatavstötning än antilymfocytglobuliner eller anti-pan-T-cellreagens såsom OKT3 MoAb.

Följaktligen avser föreliggande uppfinning immunglobulin- konjugat omfattande Ida konjugerad till en monoklonal anti- kropp eller fragment därav som omfattar åtminstone en av anti- genbindningsställena hos antikroppen.

Ida beskrives i US-A-4077988. Företrädesvis från två till åtta Ida-molekyler är kovalent bundna till varje antikropp 503 402 eller antikroppsfragmentmolekyl, helst från två till sex.

Ida-molekylerna är vanligen, men inte nödvändigtvis, konjuge- rade vid l4-positionen till den monoklonala antikroppen eller antikroppsfragmentet. Företrädesvis är de direkt bundna, fastän det är möjligt att skjuta in en inert bärare eller länk. Ida kan emellertid i stället vara bunden till den mono- klonala antikroppen eller antikroppsfragmentet via amino- gruppen. Detta kan uppnås med användning av en nedbrytbar peptidmellangrupp, en dextranbärare, en syra-sensitiv mellan- grupp eller poly-glutaminsyra. Grupper använda för hopkoppling inklusive karboxylsyragrupper av syntetiska polyaminosyror såsom poly-L-glutaminsyra och poly-L-asparginsyra eller inerta proteiner såsom humant serumalbumin eller funktionaliserade dextraner såsom karboximetyldextran kan fungera som bärare.

Dessa bärare kan variera i storlek från 10 till 60 Kilodalton.

Typiskt är varje antikropp eller antikroppsfragment specifikt för en antigen på ytan av celler mot vilka det är önskvärt att använda Ida. Exempelvis kan antikroppen eller antikropps- fragmentet vara specifikt för en önskad målvävnad såsom en human neoplasm. Exempel på humana neoplasmer mot vilka det kan vara önskvärt att sätta in Ida är bröst-, kolon-, lung-, prostata-, ovarial-, tymus- och andra cancrar, sarcom och leukemier. Antikroppen eller antikroppsfragmentet kan alternativt vara specifikt för en animal neoplasm. En anti- kropp eller ett antikroppsfragment specifikt för human transferrin-receptor (TFR), som finnes på delande celler, erytroida prekursorceller och celler hos en mångfald tumörer, kan användas. En lämplig anti-TFR-monoklonal antikropp kan vara en som bildats mot transferrin-receptorn på LiCR-LON- HMy-2 (HMy-2)-celler.

När immunglobulinkonjugaten avses användas för utrotning av en specifik T-lymfocytpopulation, är antikroppen eller anti- kroppsfragmentet specifikt för ett cellyteantigen som i sig själv är specifikt för dessa T-lymfocyter. Antikroppen eller antikroppsfragmentet kan därför vara specifikt för en popula- 503 402 tion av hjälpare, suppressor eller cytotoxiska T-lymfocyter.

Företrädesvis är den monoklonala antikroppen eller antikropps- fragmentet från samma art som den till vilken immunglobulin- konjugatet skall administreras. En human eller musmonoklonal antikropp eller antikroppsfragment användes därför när konju- gatet avses att administreras till människa. Företrädesvis är även antikroppen och antikroppsfragmentet av IgG-klass.

Antikroppsfragmentet kan vara Fab-, Fab'- eller F(ab')2- fragment. IgM-monomer, som kan erhållas från IgM-antikropp genom proteolytisk enzymdigestion, kan även användas.

Immunglobulinkonjugaten framställes enligt uppfinningen genom ett förfarande som omfattar konjugering av Ida till den mono- klonala antikroppen eller fragment därav. Företrädesvis om- sättes en l4-halogen-Ida med den monoklonala antikroppen eller fragmentet därav. 14-substituenten kan vara fluor, klor, brom eller jod men är företrädesvis brom. 14-bromo-Ida beskrives i US-A-4125607. Konjugering kan därför erhållas genom ett för- farande som omfattar: (a) blandning av den monoklonala antikroppen eller fragmentet därav med ett molart överskott av 14-halogen-Ida, (b) omsättning av blandningen vid från l8 till 37°C, (c) avlägsnande av varje fällning, (d) avlägsnande av oreagerat utgångsmaterial genom gel- filtrering, och (e) avlägsnande av adsorberat läkemedel (Ida) genom adsorp- tionskromatografi eller jonbyteskromatografi.

Steg (a) genomföres normalt i ett med vatten blandbart orga- niskt lösningsmedel såsom N,N-dimetylformamid. Företrädesvis är det molara överskottet av 14-halogen-Ida i steg (a) från 503 402 O till 50-faldigt. I steg (b) genomföres reaktionen före- trädesvis under en period av från l till 8 timmar. Normalt är reaktionstemperaturen rumstemperatur.

Andra metoder för konjugering kan emellertid användas. När ett konjugat behöves som har en inert bärare eller länk insatt mellan Ida och den monoklonala antikroppen eller antikropps- fragmentet, är bäraren eller länken normalt först fäst vid C-14-kolatomen hos Ida och sedan kopplade till antikroppen eller antikroppsfragmentet. Som ovan nämnts kan antikroppen eller antikroppsfragmentet även vara bunden till Ida via aminogruppen med användning av ett nedbrytbart peptidmellan- led, en dextranbärare, ett syra-sensitivt mellanled eller poly- glutaminsyra.

Immunglobulinkonjugaten enligt uppfinningen kan användas för att behandla en människa eller annat däggdjur som lider av cancer. En terapeutiskt effektiv mängd av konjugatet kan ad- ministreras. Cancern kan vara en solid tumör, en ascites-tumör eller en leukemi. Human neoplasm som kan behandlas är nämnd ovan. Två eller flera konjugat kan administreras i vilka den monoklonala antikroppen eller antikroppsfragmentet i varje konjugat har en särskild specificitet.

Ett konjugat kan administreras genom injektion. Det kan ges parenteralt, t.ex. intravenöst. Det kan administreras lokalt eller direkt i tumören. Mängden konjugat som administreras till en patient beror på en mångfald faktorer såsom den tumör som skall behandlas och tillståndet hos patienten. Normalt kan emellertid en dos från 10 till 200 mg konjugat administreras per m2 av en patients kroppsyta. Konjugaten kan administreras tillsammans med andra kemoterapeutiska medel eller med medel som ökar konjugatens aktivitet, t.ex. vasoaktiva medel eller tumör-nekros-faktor.

Immunglobulinkonjugaten kan även användas för att specifikt utrota en undergrupp T-lymfocyter från en cellpopulation. 503 402 En terapeutiskt effektiv mängd av ett konjugat, som inkorpore- rar en monoklonal antikropp eller antikroppsfragment riktad mot ett cellyteantigen som finnes på de lymfocyter som skall utrotas, kan administreras till en människa eller ett djur.

Alternativt kan en cellpopulation inkuberas in vitrg med ett sådant konjugat.

En kombination av konjugat riktat mot två eller flera cellyte- antigen kan användas. De lymfocyter som skall utrotas kan vara hjälpare, suppressor eller cytotoxiska T-celler.

Denna aspekt av uppfinningen kan användas för att förhindra avstötning av transplanterad vävnad hos en transplantatmot- tagare. Konjugaten kan användas som immunsuppressiva medel.

En mängd konjugat som effektivt förhindrar transplantatavstöt- ning administreras till transplantatmottagaren. Företrädesvis är det cytotoxiska T-celler som utrotas i detta fall. En människa eller ett djur med en cancer kan behandlas genom att utrota suppressor-T-celler genom administration av ett lämp- ligt konjugat. Autoimmuna sjukdomar kan behandlas genom ad- ministration av ett konjugat i syfte att utrota hjälpar-T- celler. I varje särskilt fall är sättet för administration och dosen av konjugat som angivits ovan.

Immunglobulinkonjugaten formuleras som farmaceutiska komposi- tioner med farmaceutiskt godtagbar bärare eller spädningsmedel.

Varje lämplig bärare eller spädningsmedel kan användas. Lämp- liga bärare och spädningsmedel innefattar fysiologisk salt- lösning och Ringers' dextroslösning.

De följande exemplen belyser uppfinningen. I de bifogade rit- ningarna avser figur l till 12 exempel l och figur l3 till 17 avser exempel 2. Alldeles särskilt: Figur l avser strukturen hos antracyklinderivat; Figur 2 avser kopplingen av Idarubicin (Ida) till anti-Ly-2.l 503 402 (0,5 mg). Antal moler av Ida inkorporerade per mol av anti- Ly-2.1 (I) (vänsterordinata) och proteinåtervinning (0) (högerordinata) visas som en funktion av antalet nmoler av Ida i reaktionsblandningen (abscissa): Figur 3 avser antikroppstiter mätt som % rosettbildande celler (ordinata) mot antikroppsspädning (xlO_2) (abscissa) av anti-Ly-2.1 konjugat på ITT(l) 75 NS E3 målceller. Serie- spädningar utfördes på 0,5 mg/ml lösning av antingen anti-Ly- 2.l (A) eller anti-Ly-2.1 med 2(0) eller 8 (o) mol Ida/mol antikropp; Figur 4 avser inhibitorisk effekt av Ida (I) eller Ida-anti- Ly-2.l, 5 mol Ida/mol antikropp, (0) på E3-celler i ett 24- timmars försök där % inhibition i /3H/ tymidin-inkorporering (ordinata) plottas mot koncentration av Ida(M)(abscissa); Figur 5 avser den inhibitoriska effekten av Ida (I), Ida- Ianti-Ly-2.l, 5 mol Ida/mol antikropp (0) eller Ida-anti-TFR, 5 mol Ida/mol antikropp (o) på (Ly-2+) E3-celler i ett 30- minuters inhibitionsprov där % inhibition i /3H/ tymidin- inkorporering (ordinata) plottas mot koncentration av Ida(M) (abscissa): Figur 6 avser den inhibitoriska effekten av Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol antikropp (o) och konjugat plus anti-Ly-2.1 (0) på E3-mâlceller i ett 30-minuters specificitetsprov där % inhibition i /3H/ tymidin-inkorporering (ordinata) plottas mot koncentration av Ida(M)(abscissa); Figur 7 avser tillväxten av E3 tymom i CBFl möss injicerade subkutant med 2 x 106 celler. Grupper på l0 möss gavs intra- venösa behandlingar utmärkta med en pil; PBS (U), Ida (I), anti-Ly-2.1 (A), Ida-anti-TFR (o) eller Ida-anti-Ly-2.l (0).

Medeltumörstorleken (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumörinokulation (abscissa). Avvikelsestaplar betecknar 1 medelstandardavvikelsen; 503 402 Figur 8 avser individuella tumörtillväxtkurvor hos CBFl möss injicerade subkutant med 2,0 x lO6 E3-tumörceller och behand- lade intravenöst på dag 4 och 5 med Ida-anti-Ly-2.l-konjugat.

Tumörstorlek (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumör- inokulation (abscissa); Figur 9 avser tillväxt av E3-tymom hos CBFl möss injicerade subkutant med 3,0 x l06 celler. Grupper om l0 möss gavs intra- venösa behandlingar utmärkta med en pil; PBS (0): anti-Ly-2.l (A), Ida (I) eller Ida-anti-Ly-2.1-konjugat (0). Medeltumör- storlek (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumör- inokulation (abscissa). Avvikelsestaplar betecknar 1 standard- medelavvikelse; och Figur l0 avser tillväxt av E3-tymom i CBFl möss injicerade subkutant med 3,0 x 106 celler. Grupper om 10 möss gavs intratumörbehandlingar utmärkta med en pil; PBS (U); anti-Ly- 2.l (A), Ida (I) eller Ida-anti-Ly-2.l-konjugat (0). Medel- tumörstorlek (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumör- inokulation (abscissa). Avvikelsestaplar betecknar 1 medelstandardavvikelse; Figur ll avser tillväxt av COLO 205 human tumörxenograft hos nakna möss injicerade subkutant med 2 x l06 celler. Grupper om 10 möss gavs följande behandlingar intravenöst utmärkta med en pil; PBS (A), fritt Ida (O), Ida-250-30.6-konjugat (0), blandning av Ida och 250-30.6 00) och 250-30.6 (4). Medel- tumörstorlek (cm2) (ordinata) plottas mot dagar efter tumör- inokulation (abscissa). Avvikelsestaplar betecknar 1 medelstandardavvikelse; Figur 12 avser individuella tumörtillväxtkurvor hos xeno- transplanterade nakna möss som behandlades i.v. (pil) med Ida-250-30.6-konjugat. Den brutna linjen betecknar medel- tumörstorlek hos PBS-behandlade möss. Tumörstorlek (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumörinokulation (abscissa); 503 402 lO Figur 13 visar kopplingen av Idarubicin (Ida) till anti-L3T4 (0,5 mg). Antal mol Ida inkorporerade per mol anti-L3T4 (Q) (vänster ordinata) och proteinåtervinning (0) (höger ordi- nata) visas som en funktion av antalet nmol Ida i reaktions- blandningen (abscissa); Figur 14 visar antikroppstiter mätt som % rosettbildande cel- ler (ordinata) mot antikroppspädning (x l0_l)(abscissa) av anti-Thy-1-konjugat på ITT(l) 75NS E3 målceller. Seriespädnin- gar utfördes på en 1,0 mg/ml lösning av antingen anti-Thy-1 (O) eller konjugat med 1 (o), 4 (0) eller 7 (Cñ mol Ida/mol anti-Thy-1; Figur 15 visar effekten av Ida-MoAb och MoAb-behandling på ett antal L3T4+- och Ly-2+-celler i mjälten hos Ida-anti-L3T4- behandlade (o~o), anti-L3T4-behandlade (k~fl), Ida-anti-Ly-2.l- behandlade (o~o), anti-Ly-2.1-behandlade (twi) eller obehand- lade (U~~-D) möss i vilka % rosettbildande celler (ordinata) plottas mot tiden i dagar (abscissa); Figur 16 visar effekten av kombinerad Ida-MoAb-konjugatbehand- ling på överlevande av eu:P388Dl-tumörtransplantat (över H-2 och icke H-2 skillnader) i CBA-möss. Grupper på 10 till 15 möss injicerades subkutant med 8,0 x 106 P388Dl-tumörceller och erhöll en av de följande intravenöst (pi1): (i) PBS (O), (ii) anti-L3T4 och anti-Ly-2.1 (o), (iii) Ida-anti-L3T4 (I), (iv) Ida-anti-Ly-2.1 (0) och (v) Ida-anti-L3T4 och Ida-anti- Ly-2.1 (4). Meaeitumörstorieken (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumörinokulation (abscissa)- Avvikelsestaplar betecknar I medelstandardavvikelsen; och Figur 17 visar effekten av Ida-anti-Thy-1-konjugat pâ över- levnaden av ett P388Dl-tumörtransplantat i CBA-möss. Grupper om 10 möss injicerades subkutant med 1,0 x l07 P388Dl-tumör- celler och erhöll intravenöst (pil) en av de följande: (i) PBS (0), (ii) anti-Thy-1 (0) och (iii) Ida-anti-Thy-1 (A).

Medeltumörstorlek (cm2) (ordinata) plottas mot dagar efter 503 402 ll tumörinokulation (abscissa). Avvikelsestaplar betecknar I medelstandardavvikelsen.

Figur 18 visar tillväxten av COLO 205 (30.6+, l7.1+) xeno- graft hos nakna möss injicerade med 8 x 10 celler/mus.

Grupper om 10 möss behandlades intraperitonealt, utmärkt med en pil, med PBS (0); 17.1-Ida (o); 30.6-Ida (A) eller en blandning av 30.6-Ida och 17.1-Ida (0). Medeltumörstorlek (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumörinokulation (abscissa). Avvikelsestaplar betecknar 1 medelstandardav- vikelse. Totaldosen av Ida var 200 gg.

Figur 19 visar tillväxten av LIM22l0 human kolontumörxeno- graft hos nakna möss implanterade med tumörfragment (1-5 mg).

Grupper om 10 möss behandlades intravenöst, utmärkta genom en pil, med PBS (m: lll-Ida (0): JGT-13-Ida (An 27.1-Ida (o), 30.6-Ida (o). Medeltumörstorlek (cmz) (ordinata) plottas mot dagar efter tumörinokulation (abscissa). Avvikelse- staplar betecknar i medelstandardavvikelse. Totaldosen av Ida var 80 pg.

Exempel 1 Material och metoder Tumörceller De undersökta cellinjerna i denna studie omfattar (Ly-2+) murine thymoma ITT(l) 75NS E3 variant (E3) (Smyth et al, J.

Natl Cancer Inst. 1986 76 503-510) (Ly-2_, TFR_) lymphoma 21,4 (Herewitz et el, seienee 1968 leo 533-535), (TFH) human cellinje CEM (Foley et al Cancer 1965 18 522-529) och (250-30.6+) human cellinje COLO 205. Cellerna hölls in vitšg i Dulbecco's modifierade Eagle's medium (DME) eller RPMI 1640 medium (Flow Laboratories, Sydney, Australien), kompletterat med 10% värmeinaktiverat nyfött kalvserum (Flow), 2mM glutamin (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Austra1ien); 503 402 l2 l00 gg/ml streptomycin (Glaxo, Melbourne, Australien) och l00 I.U./ml penicillin (Commonwealth Serum Laboratories).

E3-tumören upprätthölls in yiyg genom serieöverföring till (C57BL/6 x BALB/c)Fl-möss (CBFl-möss). Celler från ascites- vätskan tvättades och centrifugerades (400 g x 5 min) två gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,3, resuspende- rades i PBS och injicerades subkutant (s.c.) i abdominal- väggen hos möss; dessa utvecklades till palperbara tumörer före behandling. Möss utsattes för en serie intravenösa (i.v.) eller intratumör (i.t.) behandlingar och den därefter följande storleken på tumörerna mättes dagligen med ett skjut- mått, genom mätning längs tumörens perpendikularaxel. Data registrerades som medeltumörstorlek (produkt av två diametrar I standardavvikelse).

Möss CBA och (C57BL/6xBALB/c)-möss (CBFl-möss) och nakna (nu/nu) möss producerades vid Department of Pathology, University of Melbourne. Försöksgrupper på 8 - 10 möss alla av samma kön och ålder användes i varje experiment.

Monoklonala antikroppar Använda MoAbs var: (i) anti-Ly-2.1 (IgGl) reaktiv med murine Ly-2.1 specificitet (Hogarth et al Immunology l982 46 l35- l44) och (ii) A3C6 (anti-TFR) (IgGl) reaktiv med human trans- ferrin-receptorn (TFR) (Panaccio et al Immunology and Cell Biology 65, 461-472, 1987); och (iii) en antikropp, betecknad 250-30.6, reaktiv mot en antigen som finns på humana kolon- karcinomceller.

MoAbs isolerades från ascites-vätska genom fällning med 40% ammoniumsulfat, upplösning i PBS och dialys med sama buffert.

Dessa råa beredningar absorberades antingen på Protein-A- Sepharose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), tvättades noggrant med PBS (pH 7,3) och eluerades med 0,2 M glycin/HCl 503 402 l3 (pH 2,8), eller fick passera genom en Affigel blå kolonn (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney). Efter neutralisa- tion dialyserades MoAbs sedan mot PBS, delades i lika delar och lagrades vid -70OC. A3C6 erhölls genom immunisering av CBA~möss intraperitonealt med veckointervaller under tre vec- kor med 2xl06 LiCr-LON-HMy-2(HMy-2)-celler (OKT9+v°), avlägsnande av mjälten tre dagar efter den sista injektionen och sammanslagning med P3-NSI-AG4-1-(NS-1)-celler.

Framställning och kvantititerinc av konjuqat Intakt anti-Ly-2.1, anti-TFR MoAb, eller 250-30.6 (1-2 mg/m1 i boratbuffert pH 8,0) blandades med ett molart överskott (l-50) av 14-bromo-4-demetoxidaunorubicin (Br-Ida) löst i (N,N)-dimetylformamid (DMF) till 10 mg/ml. Reaktionen hölls vid rumstemperatur under 4 timmar före centrifugering (400 g x 5 minuter) för att avlägsna varje fällning. Fritt Br-Ida och annat oreagerat utgångsmaterial avlägsnades genom gel- filtreringskromatografi med användning av en Sephadex G-25- kolonn (PD-10; Pharmacia) och konjugaten fick sedan passera genom en kolonn av Porapak Q (Millipore) för att avlägsna eventuellt adsorberat läkemedel (Niederwieser et al, J.

Chromatog. 1971 54 215-223). Mängden Ida som inkorporerats i läkemedel - MoAb-konjugaten bestämdes genom absorptions- spektrofotometri vid 483 mm (E498 = 3,4 x l03M-1 cm_l) och genom proteinberäkning (Bradford, Anal. Biochem. 1976 72 248-253).

Antikroppsaktivitet En rosettanalys med användning av får anti-mus-immunglobulin (SAMG) användes för att bestämma antikroppsaktiviteten hos Ida-MoAb-konjugat jämfört med fri MoAb som hade undergått samma förfaranden som användes i kopplingsmetoden (Parish and McKenzie, J. Immunol. Methods 1978 20 173-183). 503 402 l4 Läkemedelsaktivitet (a) 24 timmars inhibitionsförsök: 100 ul celler (2-5 x lO6/ml) sattes till en flatbottnad mikrotiterplatta och inkuberades unaet l timme vid 37°c. fritt Idarubiein (Ida) (löst 1 Pas) och Ida-MoAb-konjugat filtrerades aseptiskt och spädningar genomfördes i sterilt PBS; 50 ul fritt Ida eller konjugat sat- tes till cellerna med användning av duplikathål för varje prov; kontrollhål erhöll 50 gl PBS och cellerna odlades vid 37OC, 7% C02 under 24 timmar. (bl 30 minuters inhlb1t1eneprev= zoo Pl eeller (2-5 X los/ml) uppsamlades i sterila Eppendorf-rör, resuspenderades i sterilt läkemedel eller konjugat och blandades under 30 minuter vid 37OC. Cellerna centrifugerades sedan (400 g x 5 min), resus- penderades i tillväxtsubstrat och 100 pl alikvoter såddes i en mikrotiterplatta med användning av duplikathål för mæje pnmr före en inkubationsperiod på l6 till 24 timmar. Efter inkuba- tionsperioden i båda dessa försök, sattes 50 pl tillväxt- substrat innehållande l pCi av /BH/-tymidin (specifik akti- vitet=5 Ci/mmol; Amersham) och plattorna inkuberades under 2-4 timmar. Cellerna uppsamlades sedan och torkades, och indi- viduella prov separerades och räknades på en beta-scintilla- tionsräknare. Inkorporering av /3H/-tymidin uttrycktes som procent inhibition i inkorporering av kontroller. Standard- avvikelse för varje punkt åstadkoms genom duplikata bestäm- ningar och översteg inte 5% för varje given försökspunkt.

Toxicitet Grupper om l0-20 CBA-möss gavs en i.v. singelinjektion av olika doseringar av Ida eller Ida-anti-Ly-2.1 och mössens överlevnad registrerades mot dosen givet läkemedel i mg/kg.

Organen från dessa möss avlägsnades och vägdes före formalin- fixering och färgning med hämatoxylin och eosin. 505 402 l5 Resultat Framställning och karaktärisering av konjugat Br-Ida (fig. l) kopplades kovalent till olika MoAbs: mot human TFR, mot ett antigen som finns på humana koloncancerceller (antikropp 250-30.6), och mot murine Ly-2-alloantigen. Reak- tionsbetingelserna etablerades för konjugeringen genom att variera det molara överskottet av Br-Ida som sattes till MoAbs och genom att göra en kompromiss mellan högre Ida- inkorporering och lägre proteinåtervinning. Ida-anti-Ly-2.l (fig. 2), Ida-anti-TFR och Ida-250-30.6 (data inte visade) inkorporerade 3 till 5 molekyler Ida med större protein- återvinning än 50%. Omsättning av Br-Ida med MoAbs kunde ge upphov till två typer bindningar (fig. lC och D). För att fastställa vilken som var närvarande utsattes koniugaten För pH 4,5 eller pH 9,0 under 48 timmar, frigjort läkemedel absorberades i Porapak Q och proven rekvantifierades genom spektrofotometri. 50% av det bundna läkemedlet frigjordes vid exponering för bas (pH 9,0), medan ingen förlust var märkbar vid pH 4,5. Detta skulle tyda på att minst 50% av läkemedlet är esterbundet (fig. lD) då esterbindningen är känslig för basiska betingelser medan aminbindningen är stabil.

Antikroppsaktivitet Antikroppstitrarna före och efter konjugation mättes med rosettmetoden och bestämdes som den spädning vid vilken 50% av målcellerna visade rosetter. Ida-anti-Ly-2.1-konjugat inne- hållande 2 och 8 molekyler Ida hade antikroppstitrar mot E3- celler på l:56.000 och l:33.000 respektive, medan den icke konjugerade antikroppstitern var l:80.000 (fig. 3). Ida- 250-30.6-konjugat innehållande 2 och 6 molekyler Ida hade antikroppstitrar mot COLO 205-celler på l:l6.000 och l:ll.00O respektive, medan den icke konjugerade antikroppstitern var l:33.000. Det är således någon förlust av antikroppaktivitet beroende på konjugationsförfarandet; konjugat med mindre än 503 402 l6 6 molekyler Ida-molekyl av MoAb användes för in vitro- och in yivg-studier. Det noterades att lösligheten och antikropp- aktiviteten av Ida-anti-Ly-2.1-konjugat minskade signifikant under dessa nivåer av Ida-inkorporering (data inte visade).

Maximumantalet Ida-molekyler som lämpligen kan inkorporeras varierar beroende på den individuella antikroppen.

In vitro-aktivitet och Idarubicin och Idarubicin-MoAb-konjugat In vitro-cytotoxiciteten av Ida och två Ida-MoAb-konjugat på murine ITT(l)75NS E3-cellinje (Ly-2+TFR_) och den humana CEM- cellinjen (Ly-2_TFR+) mättes i ett 24 timmars inhibitionsprov och värden för I.D50 (50% inhibition i /3H/-tymidin-inkorpore- ringen av kontroller) bestämdes. Resultaten visas i fig. 4 och tabell l. I.D50 för Ida var i omrâdet från 1,0 till 2,5 x l0_7M för båda undersökta cellinjerna (fig. 4, tabell l).

I.D50 för Ida-anti-Ly-2.1 på E3 var 4 gånger större (fig. 4) och för Ida-anti-TFR på CEM var I.D50-värdena l-2 gånger större än de för fritt Ida (tabell l). Därför var fritt Ida mera cytotoxiskt till både E3 och CEM än Ida-anti-Ly-2.1 och Ida- anti-TFR respektive. Dessa Ida-MoAb-konjugat visade emellertid en 10-faldigt lägre cytotoxicitet till icke-reaktiva cell- linjer (tabell l), och visar således att deras cytotoxiska verkan var specifik och härrörde från deras retention av antikroppsaktivitet (fig. 3).

TABELL l Effekten av Idarubicin-monoklonal antikroppskonjugat på tumörceller.l Medel I.D50-värden bestämda för Tumör- Ida Ida-anti-Ly-2.l Ida-anti-TFR cellinje -7 -7 -4 E3 1,2 x 10 4,3 x 10 2,3 x l0 (s)2 (3) (2) cam 2,2 X 1o'7 2,0 x 1o'6 3,0 X 1o'7 503 402 l7 lI.D5O = 50% inhibition i /3H/-tymidin-inkorporering av kontroller. 2= antal testade beredningar.

Ida-250-30.6-konjugaten var något mindre aktiva än fritt Ida.

Fritt Ida hade en I.D50 på 6xl0_8M medan konjugatet hade en LDBÛ på 3,5x1o'7M på måiceiiinjen coLo 205.

För att undersöka huruvida konjugaten visade selektivitet i sin cytotoxiska verkan på målceller, inkuberades Ida-anti- Ly-2.l och Ida-anti-TFR under 30 minuter med E3 (Ly-2+)- celler, före borttvättning av icke-bundna konjugat och mätning av cytotoxiciteten. Ida-anti-Ly-2.l-konjugaten hade en I.D5o på 6,2 x 10-7M jämfört med en I.D50 på 5,2 x l0_7M för fritt Ida (fig. 5). Som kontrast hade icke-reaktiv Ida-anti-TFR- konjugat en I.D50 på 5,0 x l0_6M, d.v.s. l0 gånger större än den för fritt Ida, som visar att antikropps-bindningsaktivi- teten hos Ida-anti-Ly-2.l-konjugatet resulterade i dess se- lektiva cytotoxicitet. På liknande sätt inkuberades Ida-250- 30.6-konjugat och fritt läkemedel under 30 minuter med COLO 205 (250-30.6+ve) och E3 (250-30.6 -ve) cellinjer före tvätt- ning och dess utsättande för cytotoxicitetsprovet. Båda cell- linjerna visade en liknande dosrespons till fritt läkemedel, d.v.s. 9,2xl0_7M för COLO 205 och 9,8xl0_7M för E3. Emeller- tid var Ida-250-30.6-konjugatet 4 gånger mer toxiskt till COLO 205 än mot den antikropps icke-reaktive E3-cellinjen.

Liknande resultat erhölls med användning av CEM-cellinjen och Ida-anti-Ly-2.1 som en icke-reaktiv kontroll (data inte visade). För att ytterligare säkerställa att cytotoxiciteten hos Ida-MoAb-konjugat för mâlceller var specifik och förekom vid antikropps-bindningsplatsen, genomförde vi studier för att inhibera konjugatcytotoxicitet med användning av fritt 6M (2 yg anti-Ly- 2.l), reducerades cytotoxiciteten hos anti-Ly-2.1-konjugatet på E3-celler med 70% efter tillsats av 50 pg (250 pg/ml) anti- MoAb. Vid en Ida-koncentration av 4,0 x 10- 503 402 l8 Ly-2.1 (fig. 6), utvisande att cytotoxiciteten hos Ida-anti- Ly-2.l-konjugatet är direkt relaterat till dess antikropps- bindande förmåga. Liknande kontrollresultat erhölls med 250-30.6. Det skall påpekas att i alla försök var fritt anti- Ly-2.1, anti-TFR och 250-30.6 icke-cytotoxiska (data inte visade).

In vitro-behandling av murine thymoma ITT(l)75NS E3 För att bestämma tillväxtinhibition av solida tumörer behand- lades grupper av CBFl-möss (10 per grupp) som inokulerats s.c. med 2,0 x 106 E3-celler i abdominalregionen med i.v. injektioner av en av följande: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2.l; (iii) Ida; (iv) Ida-anti-TFR; eller (v) Ida-anti-Ly-2.l.

Möss erhöll 20 ug Ida och/eller 1200 gg anti-Ly-2.1 respek- tive på 4:e och 5:e dagen (tumörstorlek = 0,1 cm2) efter tumörinokulation.

Inom 24 timmar efter den första behandlingen hade de Ida-anti- Ly-2.l-behandlade mössen en medeltumörstorlek 20% av den hos PBS-behandlade möss (d.v.s. en 80%-ig minskning i tumör- massa (fig. 7)); det var tydligt att anti-Ly-2.1 enbart och Ida kovalent bundet till den icke-specifika anti-TFR Moab inte påverkade E3-tumörtillväxt. Tumörerna hos möss som er- hållit Ida enbart reducerades upp till 50%; fastän 3 av dessa möss dog och de andra hade en 25%-ig reduktion i kroppsvikt.

Individuella tumörtillväxtkurvor för möss som erhållit Ida- anti-Ly-2.l visade regression hos 9 tumörer av l0 under be- handlingens gång (fig. 8); faktiskt gick 5 tumörer av l0 fullständigt tillbaka och återkom inte (>-200 dagar), och de tumörer som fortsatte att växa under behandlingens utförande (5 av l0), växte i långsamare takt än tumörerna hos PBS och Ida-anti-TFR-behandlade möss. Ett ytterligare försök genomför- des för att bedöma i.v. behandling av större tumörer med an- vändning av Ida-anti-Ly-2.l. Grupper av CBFl-möss (l0 per grupp) inokulerades med 3,0 x l06 E3-celler, och mössen fick sedan 15 pg och 900 Mg av Ida och anti-Ly-2.l respek- 503 402 19 tive på dag 6 (tumörstorlek = 0,2 cm2) och 7 efter tumör- inokulation (fig. 9). De Ida-anti-Ly-2.1-behandlade mössen hade en medeltumörstorlek på 50% av den hos PBS-behandlade möss, och 66% av den hos Ida-behandlade möss på dag 7, och denna trend fortsatte till slutförandet av studien (dag 18).

Individuella tumörtillväxtkurvor för de 10 CBFl-mössen som erhållit Ida-anti-Ly-2.1 visade att där var 4 regressioner och ett fullständigt avlägsnande av tumörmassa (>-200 dagar; data inte visade). Därför var Ida-anti-Ly-2.1 effektivt mot större tumörer och i båda försöken förbättrades anti- tumöraktiviteten hos Ida avsevärt när den kopplades till anti-Ly-2.1 MoAb.

In vivo-behandling av human kolontumör COLO 205 Effekten av Ida-anti-250-30.6-konjugat bestämdes pâ nakna (nu/nu) möss som hade COLO 205 xenograft.

Injektion av 2xl06 celler subkutant i abdominalväggen gav en palpabel knöl inom 4 dagar (aprox. 0,1 cmz). Grupper om 10 möss behandlades sedan med i.v. injektioner av en av följande: (i) PBS; (ii) 250-30.6 (iii) Ida plus 250-30.6 (icke konju- gerad); (iv) Ida; (v) Ida-250-30.6-konjugat. Totalt gavs 275 pg Ida i en serie om 5 intravenösa injektioner på dag 4, 5, 6, 10 och 12 efter tumörinokulation.

Ingen terapeutisk effekt visade sig i de grupper av möss som behandlats med PBS eller med okonjugerad 250-30.6. Med Ida enbart överlevde 2 av 10 möss, medan alla mössen i den grupp som erhållit icke-konjugerat Ida plus 250-30.6 var döda vid dag 7, efter att tidigare ha visat symtom på toxicitet såsom viktförlust. De möss som erhållit Ida-250-30.6-konjugat visade en dramatisk reduktion av tumörstorlek. Dessa resultat belyses i fig. ll. Som kontrast visade tumörtillväxtkurvor för indi- viduella möss (fig. 12) att 5 av 10 möss hade tumörer som hade gått tillbaka vid dag 7; dessa tumörer fortsatte sedan att växa, och lämnade 2 av 10 möss utan tumörer. Dessa möss visade 503 402 20 inga effekter på grund av toxicitet.

Intratumörbehandling Intratumörterapi har visat sig vara en användbar teknik för immunterapi av animala och humana tumörer. Följaktligen genomfördes studier för att karaktärisera anti-tumöraktivi- teten hos Ida-anti-Ly-2.l-konjugat administrerade direkt i solid E3-tumör. Grupper om l0 CBFl-möss implanterade s.c. med 3,0 x lO6 E3-celler utvecklade tumörer (0,l - 0,2 cmz) 5 dagar efter tumörinokulation. Behandlingarna bestod av 2 injektioner på dag 5 och 6 efter tumörimplantation, varvid mössen erhöll en av följande behandlingar; (l) PBS; (2) Ida; (3) anti-Ly-2.1; eller (4) Ida-anti-Ly-2.1 (total Ida = 30 pg).

Ida-anti-Ly-2.1 visade den största anti-tumöraktiviteten, fritt Ida och anti-Ly-2.l enbart påverkade inte tumörtillväx- ten när de administrerades direkt i tumören. Ida-anti-Ly-2.l- behandlade möss hade en medeltumörstorlek 60% av den hos PBS- behandlade möss på dag 8 och 30% av den hos PBS-behandlade möss på dag l3 (fig. 10). Individuella tumörtillväxtkurvor (data inte visade) för Ida-anti-Ly-2.l-behandlade möss visade enfullständig regression medan de återstående mössen visade en fördröjd reduktion av tumörtillväxten 3 dagar efter behand- lingens slutförande.

Toxicitet För akuta toxicitetsförsök gavs grupper om l0 CBA (Ly2.l+)- möss en singelinjektion av olika doser av antingen Ida, Ida- anti-Ly-2.l eller Ida-anti-TFR. Alla möss som injicerats med Ida visade en initial viktförlust på upp till 25% av ur- sprungsvikten; emellertid observerades ingen viktförlust hos möss som behandlats med något Ida-MoAb-konjugat. Tabell 2 visar toxociteten hos Ida och Ida-MoAb-konjugat som den åter- speglas i LD50- och LDl0-värden. Som synes var LDlo för Ida- anti-Ly-2.l 10,0 mg/kg av Ida jämfört med endast 0,75 mg/kg för fritt Ida. Därtill kommer att Ida-anti-TFR-konjugat hade 503 402 21 ett LDlO på 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-konjugat testades inte på en LD50-dos. Dessa resultat visar det större terapeutiska indexet hos Ida-MoAb-konjugat jämfört med fritt Ida.

TABELL 2 Effekten av Idarubicin-monoklonal antikroppskonjugat på CBA-möss.

Ida (mg/kg) L.D lo L.D.50 Ida 0,75 3,00 Ida-anti-Ly-2.1 10,00 N.T.

Ida-anti-TFR 15,00 N.T. inte testad Z >-3 n Histopatolggiska resultat Akut effekt: Den intravenösa administrationen av fritt Ida (1,0 mg/kg) resulterade i atrofi av den vita pulpan i mjäl- ten 15 dagar efter behandling och någon hypertrofi av hjärt- muskelfibrer (data inte visade). Som kontrast orsakade en singeldos av Ida-anti-Ly-2.1 (2,4 mg/kg) inte någon icke- specifik vävnadstoxicitet efter 15 och 30 dagar fastän någon svällning av hepatocyter observerades på dag 15.

Exemgel 2 Material och metoder Möss (DBA/2 x BALB/c)Fl- och CBA-möss producerades i Department of Pathology, University of Melbourne. Försöksgrupper på 10 till 20 möss, alla av samma kön och ålder, användes i varje 503 402 22 försök.

Tumörceller ____________ De i denna studie undersökta cellinjerna omfattade (Ly-2+) murine thymoma ITT(l)75NS E3 variant (E3), (L3T4+) lymfoma E14 (Horowitz et al, Science 1968 160 533-535), human kolon carcinoma Colo 205 (Semple et al, Cancer Res. 1978 38 1345 - 1355) och gy-zf, Lsfrf) human T-ceii-ieukemi cm (Foiey et al, Cancer 1965 18 522-529). Cellerna vidmakthölls in vitrg som beskrivits i exempel 1. P388Dl makrofagcellinjen vidmakthölls in Xiyg genom seriepassage i (DBA/2 x BALB/c)Fl-möss. Celler från ascites-vätskan tvättades och centrifugerades (400 g x 5 min) två gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,3), resuspenderades i PBS och injicerades s.c. i abdominalväggen på möss där de utvecklades till palpabla tumörtransplantat.

Mössen utsattes sedan för en serie i.v. behandlingar och storleken av tumörerna mättes dagligen med ett skjutmått, genom mätning längs tumörernas perpendikularaxlar. Data re- gistrerades som medeltumörstorlek (produkt av två diametrar + standardavvikelse).

Monoklonala antikroppar Monoklonala antikroppar till murin-cellytantigenerna L3T4, Ly-2 och Thy-1, som kännetecknar distinkta subpopulationer av lymfocyter, användes som ett modellsystem.

Använda MoAbs var: (i) anti-Ly-2.1 (murine IgG2a) reaktiv med murine Ly-2.1 specificitet (Horgarth et al, Immunology 1982 46 135-144), (ii) Hl29.19 (anti-L3T4) (råtta IgG2b) reaktiv med murine L3T4 specificitet (Pierres et al, J.

Immunology 1984 132 2775-2782) och (iii) anti-Thy-l (råtta IgG2b) reaktiv med murin T-celler (Marshak-Rothstein et al, J. Immunology 1979 122 2491-2497). Antikropparna isolerades, renades och lagrades som beskrivits i exempel 1. Antikropps- aktivitet bestämdes genom rosettförsök med får anti-mus 503 402 23 immunglobulin (SAMG) som beskrivits i exempel l.

Framställning av Idarubicin-monoklonal antikroppskonjugat En MoAb (l - 2 mg/ml) blandades med ett 5 - 20 molart över- skott av l4-bromo-4-demetoxidaunorubicin (Br-Ida) löst i (N,N)-dimetylformamid (10 mg/ml) under 4 timmar vid pH 8,0 (0,05M boratbuffert) och rumstemperatur. Reaktionen fullfölj- des, rening genomfördes och mängden Ida som inkorporerats i det erhållna konjugatet bestämdes som beskrivits i exempel l.

Läkemedelsaktivitet Två försök (24 timmar och 30 minuter) genomfördes för att be- stämma läkemedelsaktiviteten som beskrivits i exempel l, med användning av celler vid en koncentration av från (l till 5 X 106/mi).

Serologi Ett rosettförfarande användes genomgående i dessa försök för att bestämma antikroppstiter och antal L3T4+- och Ly-2+- celler. Detta förfarande innefattar bindning av SAMG som även detekterar rått-immunglobulin (Ig) kopplat till röda celler hos får (SRC) för att detektera antikroppar pâ ytan av lymfoidceller. Ig+ mjältceller hade fått Yt-Ig avlägsnat genom täckning med SAMG (25 ul och 2 ml celler vid 107/yl); cellerna hölls sedan på is i medium innehållande 0,0l% natriumazid för att förhindra resyntetisering av immun- globulin.

Resultat Studien genomfördes i olika faser: (a) in vitro-karaktärisering av tre olika Ida-MoAb-konjugat, och 503 402 24 fb) påföljande demonstration av deras användning vid aktivt utrotande av T-cellundergrupper före eller under avstötningen en tumörcellallograft.

Framställning och karaktärisering av konjugat Br-Ida kopplades kovalent till MoAb mot murine L3T4, Ly-2 och Thy-l antigener. Reaktionsbetingelser åstadkoms för konjuge- ringen genom att variera det molara överskottet av Br-Ida som sattes till MoAb och genom att göra en kompromiss mellan högre Ida-inkorporering och lägre proteinåtervinning. Ida- anti-L3T4 (fig. 13), Ida-anti-Ly-2.l och Ida-anti-Thy-l (data inte visade) inkorporerade 3 -6 molekyler Ida, med protein- återvinning större än 50%.

Antikroppsaktivitet Antikroppstitrarna före och efter konjugering mättes genom rosettmetoden och bestämdes som den spädning vid vilken 50% av E3-mälcellerna visade rosetter. Ida-anti-Thy-l-konjugat innehållande l, 4 och 7 molekyler Ida hade antikroppstitrar på l:425.000, l:l70.000 och l:l30.000 respektive, medan den omodifierade antikroppstitern var l:550.000 (fig. 14). Där är sålunda någon förlust i antikroppsaktivitet vid konjuge- ring till Ida; emellertid användes konjugat med mindre än 4 molekyler av Ida-molekyl till MoAb för in vitro- och in yiyo-studier. På samma sätt minskade antikroppsaktivite- ten hos både Ida-anti-Ly-2.1 och Ida-anti-L3T4-konjugat (data inte visade) signifikant med inkorporering av mer än 6 mole- kyler av Ida-molekyl MoAb.

In vitro-läkemedelsaktivitet Cytotoxiciteten hos Ida-MoAb-konjugaten testades på olika reaktiva målceller med användning av ett 24-timmars försök och jämfördes med fritt Ida. Aktiviteten hos fritt Ida var 4 - l0 gånger större än Ida-MoAb-konjugaten, med I.D.5O 503 402 25 (50% inhibition i /3H/-tymidin-inkorporering av kontroller) hos fritt Ida vid 6,6 - 9,0 x l0_8M mot de testade tumörcell- linjerna. Det var tydligt att Ida-anti-Ly-2.l-konjugatet var det mest cytotoxiska konjugatet (I.D.50 = 4,3 x l0_7M) när det testades mot ITT(l)75NS E3-cellinjen, som är en variant av den nativa cellinjen anrikad för Ly-2-antigen. För att under- söka selektiviteten av konjugateffekt på målceller, inkubera- des Ida-Moab-konjugat under 3 minuter med målceller, före borttvättning av obundet konjugat och mätning av cytotoxici- teten. Med användning av detta 30-minuters försök, de icke- reaktiva Ida-MoAb-konjugaten hade en I.D.50 lO - 50 gånger större än den för fritt Ida, visades att antikroppsbindningen var nödvändig för Ida-MoAb-konjugatcytotoxicitet. Det är att märka att ingen av de använda MoAb i studien hade en cyto- toxisk effekt på målceller in vitro i frånvaro av komplement.

Resultaten sammanfattas i tabell 3. 503 402 26 TABELL 3 Effekten av Idarubicin-monoklonal antikroppskonjugat Medel IDSO på tumörcellerl Medel I.D.5O-värden (Ida (M)) bestämda för Ida-anti- Ida-anti- Ida-anti- Tumör- Försök Ida Iy-2.1 L3T4 Thy-l cell- linje E3 24 nz 7,8-lo'8 4,3-1o'7 N.T. 9,oxlo'7 30 mln3 l,sxlo'7 4,3xlo'7 N.T. l,2xlo'6 EL4 24 n e,6xlo'8 N.T. 6,oxlo'7 N.T. 30 min l,6xlo'7 N.T. 6,2xlo'7 N.T. cam 24 n 9,oxlo'8 N.T. N.T. N.T. 30 min 2,2xlo'7 6,oxlo'6 N.T. N.T. cele 205 24 h 8,oxlo'8 N.T. N.T. N.T. 30 min l,2xlo'7 N.T. 4,oxlo'6 s,sxlo'6 l I.D.50 = 50% inhibition i /3H/-tymidin-inkorporering av kontroller användning av ett 24-timmars cytotoxicitetsförsök användning av ett 30-minuters försök N.T. = inte testad.

In vivo-styrka av Idarubicin-monoklonal antikroppskonjugat Den in yívg-immunosuppressiva styrkan hos Ida-Moab-konjugaten jämfördes med den hos MoAb enbart genom testning av förmågan hos konjugaten att selektivt utrota L3T4+ eller Ly-2+ celler från mjälten. CBA-möss erhöll 4 i.v. injektioner av anti-Ly- 2.1 eller anti-L3T4-konjugat (30 pg Ida/l,5 mg MoAb) på dag o, 2, 5 een lo, een antalet Ly-2* eller L3T4* celler 1 mjäl- ten kontrollerades genom rosettförsöket. För varje behandling undersöktes mjältcellerna hos två behandlade möss varje dag och genomsnittet av resultaten beräknades (fig. l5). Det var ett snabbt fall i antalet L3T4+-celler från ungefär 30% av 503 402 27 totalantalet mjältceller hos normala möss på dag 0 till unge- fär 4% hos Ida-anti-L3T4-behandlade möss på dag 20. Dessa L3T4+-celler förblev utrotade under mer än 60 dagar innan en gradvis ökning syntes. Utrotningen efter in vivg-behandling med anti-L3T4 enbart ledde även till en stark minskning i Lrrf-cellantal (3o% till 5%).

Ida-anti-Ly-2.l-konjugatet minskade mjält-Ly-2+-cellantalet från 25% till 5% på dag 10; emellertid började antalet Ly-2+- celler att öka på dag l5, och återgick till det normala på dag 40 - 50. Det var av intresse att anti-Ly-2.l MoAb enbart var ur stånd att utrota Ly-2+-celler signifikant; variation i antalet Ly-2+ och L3T4+-celler hos obehandlade kontrollmöss antogs bero på den naturliga variationen mellan möss. Det var sålunda tydligt att både Ida-anti-L3T4 och Ida-anti-Ly-2.l kunde utrota L3T4+ eller Ly-2+-celler respektive från mjälten lmß behandlade möss mer effektivt än MoAb enbart. Effekten av Ida-anti-Ly-2.l-konjugatet är viktigt eftersom anti-Ly-2.l MoAb är fullständigt utan effekt när det användes enbart, men kan omvandlas till ett kraftigt immunsuppressivt medel när det kopplas till Ida. Utrotning upprätthållen av läke- medel-MoAb-konjugat var därför lämplig för undersökning av Ly-2+ och L3T4+-cellers roll in vivg i transplantatavstöt- ningsrespons.

Effekt av Ida-anti-L3T4, Ida-anti-Ly-2.l och Ida-anti-Thy-l på tumörtransplantatöverlevnad I dessa försök användes Ida-anti-L3T4, Ida-anti-Ly-2.1 och Ida-anti-Thy-l-konjugat för att öka överlevandetiden hos P399Dl tumörtransplantat hos CBA-möss,där allografterna var över H-2 (klass I och II) och icke-H-2-barriärer. (a) Kombinerad konjugatbehandlipg Grupper om l0 - l5 CBA-möss injicerades s.c. med 8,0 x 106 P388Dl tumörceller och erhöll i.v., på dag -l, 0 (=dag för 503 402 28 tumörinokulation), 3, 5 och 10, en av följande: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 och anti-Ly-2.1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti-Ly-2.1 och (v) Ida-anti-L3T4 och Ida-anti-Ly-2.1.

Den totalt erhållna mängden Ida och MoAb var 125 g och 5,75 mg respektive. Tumörtransplantaten hos både PBS och MoAb-behandlade möss överlevde under 14 - 17 dagar med en maximal medeltumörstorlek på 0,31 cm2, som visade att båda okonjugerade MoAb tillsammans var ur stånd att effektivt ut- rota L3T4+ och Ly-2+-celler så att tumörtransplantatet kunde överleva (fig. 16). Dessutom kunde Ida-anti-Ly-2.1 eller Ida- anti-L3T4 enbart endast förlänga transplantatöverlevnad (dag 20 - 28) med maximala medeltumörstorlekar på 0,40 cmz till 0,50 cmz. Det är troligt att Ida-anti-Ly-Ll eller Ida-anti- L3T4 enbart inte avlägsnar alla T-celler, och en stark anti- genutmaning (som ses med hela MHC-skillnader) kunde stimulera de återstående Ly-2) och L3T4+-cellerna att växa till och framkalla en avstötningsrespons. Däremot möjliggjorde en kom- bination av båda Ida-anti-Ly-2.1 och Ida-anti-L3T4-konjugaten 14/15 P388Dl tumörtransplantat att undgå avstötning, och öka i storlek tills mössen avlivades (dag 50 - 2,00 cm2). Det noterades att ett fåtal av dessa konjugatbehandlade P388Dl- tumörer visade någon regression i storlek från dag 8 till 16; emellertid möjliggjorde fortsatt utrotning av L3T4+ och Ly-2+-celler (dag 10) P388Dl tumörtransplantaten att etablera jämn tumörtillväxt. (b) Ida-anti-Thy-1-konjugat Grupper om 10 CBA-möss injicerades s.c. med 107 P388Dl-tumör- celler och fick en av följande i.v. på dag -1, 0, 5 och 6: (i) PBS, (ii) anti-Thy-1 och (iii) Ida-anti-Thy-1. Total- mängden erhållen Ida och anti-Thy-l var 130 pg och 5,4 mg respektive, och tumörtransplantaten hos PBS-behandlade möss överlevde under 15 dagar. Anti-Thy-1 MoAb enbart vidmakthöll tumörtransplantatöverlevnad under 28 - 32 dagar, med en maxi- mal medeltumörstorlek på 0,58 cmz (dag 6) (fi9- 17)- På Ida- anti-Thy-l-behandlade möss var 30% av tumörtransplantaten 503 402 29 fullständigt avstötta vid dag 40, medan de återstående 70% fortsatte att växa, och eventuellt (dag 32) möjliggöra att öka medeltumörstorleken i gruppen. Därför var Ida-anti-Thy-l, liksom kombinationen av Ida-anti-Ly-2.l och Ida-anti-L3T4, i stånd att utrota Ly-2+ och L3T4+-celler så att en majoritet av P388Dl tumörtransplantat överlevde hos CBA-möss i frånvaro av en normalt snabb avstötningsrespons.

Exempel 3 Konjugat framställdes enligt det förfarande som beskrivits i exempel l mellan Ida och den monoklonala antikroppen l7.l (Thompson et al, Proc Natl Cancer Inst 70, 409-4l9, 1983; Murine IGGZA) och mellan Ida och den monoklonala antikroppen 30.6 (Thompson et al, Br J Cancer 47, 595-605, 1983; Murine IGGZB). Human koloncarcinom Colo 205-celler-(30.6+, l7.l+) inokulerades s.c. i nakna möss med 8xl06 celler/mus som be- skrivits i exempel 2. De inokulerade mössen utsattes sedan för en serie i.p. behandlingar. Storleken av tumörerna mättes med ett skjutmâtt, genom mätning längs tumörernas perpendi- kularaxlar. Data registrerades som medeltumörstorlek (produkt av två diametrar I standardavvikelse). Resultaten visas i figur l8.

Exempel 4 Konjugat framställdes enligt det förfarande som beskrivits i exempel l mellan Ida och den monoklonala antikroppen l7.l, mellan Ida och den monoklonala antikroppen JGT-l3 \(mus IGGl, reaktiv med carcinoembryoniskt antigen på koloncarcinom men inte med normal vävnad), mellan Ida och den monoklonala anti- kroppen 27.1 (mus IGGl, reaktiv med humant mjölkfettglubo- linantigen på ett antal kolontumörer) och mellan Ida och den monoklonala antikroppen 30.6. En LIM22l0 human kolontumör- xenograft (1 - 5 mg) implanterades SC i nakna möss. De implan- terade mössen utsattes sedan för en serie i.v. behandlingar.

Tumörstorleken mättes med ett skjutmått, genom mätning längs 503 402 30 tumörernas perpendikularaxlar.

Data registrerades som medel- tumörstorlek (produkt av tvâ diametrar I standardavvikelse).

Resultaten visas i figur l9.

Claims (10)

1b\ 503 402 PATENTKRAV

1. Immunoglobulin-konjugat omfattande en antracyklin konjugerad till en monoklonal antikropp specifik för en human neoplasm eller till ett fragment av nämnda antikropp omfattande minst en av de antigena bindningsplatserna hos antikroppen, k ä n n e t e c k - n a t av att idarubicin är konjugerad vid C-14-ställningen till nämnda antikropp eller fragment därav.

2. Konjugat enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a t av att fràn 2 till 8 idarubicinmolekyler är kovalent bundna till varje antikroppsmolekyl.

3. Konjugat enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att antikroppen eller fragmentet därav är specifikt för human transferrin-receptor.

4. Konjugat enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att antikroppen eller fragmentet därav är specifikt för en neoplasm i bröst, colon, lunga, prostata eller ovarium.

5. Förfarande för framställning av ett immunoglobulin-konjugat genom konjugering av en antracyklin till en monoklonal antikropp specifik för en human neoplasm eller till ett fragment av nämnda antikropp omfattande minst en av bindningsplatserna hos anti- kroppen, k ä n n e t e c k n a t av att man omsätter en 14- halogen-idarubicin med nämnda antikropp eller fragment därav.

6. Förfarande enligt patentkrav 5, k ä n n e t e c k n a t av att 14-halogen-idarubicinen är 14-brom-idarubicin.

7. Förfarande enligt patentkrav 5 eller 6, k ä n n e t e c k - n a t av att det omfattar (a) blandning av nämnda antikropp eller fragment därav med ett molärt överskott av 14-halogen-idarubicinen, (b) omsättning av blandningen vid från 18 till 37°C, (c) avlägsnande av varje fällning, (d) avlägsnande av oreagerat utgàngsmaterial genom gelfiltrering, och (e) avlägsnande av adsorberad idarubicin genom adsorptionskroma- tografi eller jonbyteskromatografi. si 503 402

8. Förfarande enligt något av patentkraven 5-7, k ä n n e - t e c k n a t av att antikroppen eller fragmentet därav är specifikt för human transferrin-receptor.

9. Förfarande enligt något av patentkraven 5-7, k ä n n e - t e c k n a t av att antikroppen eller fragmentet därav är specifikt för en neoplasm i bröst, colon, lunga, prostata eller ovarium.

10. Farmaceutisk komposition k ä n n e t e c k n a d av att den omfattar en farmaceutiskt godtagbar bärare eller utspädningsmedel, och som aktiv ingrediens, ett immunoglobulin-konjugat enligt något av patentkraven 1-4 eller som har framställts medelst ett för- farande enligt nágot av patentkraven 5-9.