[go: up one dir, main page]

SE470273B - Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer - Google Patents

Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer

Info

Publication number
SE470273B
SE470273B SE9003025A SE9003025A SE470273B SE 470273 B SE470273 B SE 470273B SE 9003025 A SE9003025 A SE 9003025A SE 9003025 A SE9003025 A SE 9003025A SE 470273 B SE470273 B SE 470273B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
cytokeratin
fragments
cytokeratins
digestion
monoclonal antibodies
Prior art date
Application number
SE9003025A
Other languages
English (en)
Other versions
SE9003025L (sv
SE9003025D0 (sv
Inventor
B Wiklund
Aa Silen
Original Assignee
Idl Immunodeveloplab Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idl Immunodeveloplab Ab filed Critical Idl Immunodeveloplab Ab
Priority to SE9003025A priority Critical patent/SE470273B/sv
Publication of SE9003025D0 publication Critical patent/SE9003025D0/sv
Priority to AT91917180T priority patent/ATE191921T1/de
Priority to EP91917180A priority patent/EP0550561B1/en
Priority to JP51612591A priority patent/JP3210666B2/ja
Priority to US08/030,100 priority patent/US5728537A/en
Priority to DE69132122T priority patent/DE69132122T2/de
Priority to AU85463/91A priority patent/AU8546391A/en
Priority to PCT/SE1991/000638 priority patent/WO1992005197A1/en
Publication of SE9003025L publication Critical patent/SE9003025L/sv
Publication of SE470273B publication Critical patent/SE470273B/sv
Priority to US08/666,835 priority patent/US5780032A/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4741—Keratin; Cytokeratin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4742—Keratin; Cytokeratin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

470 275 Man känner till att tumörmarkörer (substanser relaterade till tumörsjukdomar) finns i både normala och neoplastiska celler, med den skillnaden att tumörmarkörerna produceras i mycket större mängd från de neoplastiska cellerna. Dessa tumörmarkörer kan vara t.ex. proteiner, glykoproteiner eller polysackarider, vilka antingen, är belägna. på cellytan eller utsöndras från cellen. Substanser som utsöndras från celler och är lösliga, kommer ut i cirkulationen i omgivande vätskor och blodbanan och kan där haltbestämmas med lämpliga testsystem.
Det finns ett behov av att kunna karakterisera vilken cellkate- gori/typ en tumör tillhör för att kunna behandla patienterna på ett korrekt sätt. Detta är endast möjligt med väl karakterise- rade och kvantifierbara cirkulerande, lösliga tumörmarkörer.
Det är känt fràn immunohistologiska och immunocytologiska tester att vissa carcinom, dvs.tumörvävnad av' epitelialt ursprung, innehåller tumörmarkörer i form av cytokeratiner av olika slag.
Det finns 19 st olika karakteriserade cytokeratiner, alla uppbyggda av proteiner. Dessa cytokeratiner bildar sk. interme- diära filament i cellerna.
TPA, Tissue Polypeptide Antigen, är en känd tumörmarkör relaterad till cytokeratiner. Det är känt att framställa antikroppar mot TPA, t.ex. såsom beskrivs i US-A-4 775 620, vilka används för att detektera TPA i cancerpatienters serum. Förhöjd koncentration av TPA i blodbanan indikerar att tumörer håller på att växa. TPA är dåligt biologiskt specificerad, men man har visat pà en relation till cytokeratiner 8, 18 och 19 som förekommer i enkelt och icke skvamöst epitel och carcinom härstammande från dessa epitel.
Nackdelarna med ovanstående US-patent och liknande uppfinning- ar, är att förfarandet för att framställa monoklonala anti- kroppar är mycket ospecifikt, eftersom man inte exakt vet vilket antigen som är själva tumörmarkören när man använder 470 273 3 sig av ospecifikt immunogen, oftast helt cellmaterial. Eftersom ospecifikt cellskelettmaterial även används som referens vid de ovan. nämnda testerna blir dessa otillförlitliga vad gäller kvantifiering' och specificitet. I sin förlängning leder an- vändningen av denna typ av tester till att uppföljning av och behandling av cancerpatienter blir lidande.
Det kända US-förfarandet är alldeles för dyrt, arbetsintensivt och är ett för slumpvist förfarande för att vara lämpligt att användas för produktion av monoklonala anti-tumörmarkör anti- kroppar avsedda för rutinmässig testning. Om dessa kloner dör eller tappar sin antikropp producerande förmåga går proceduren bara hypotetiskt att upprepa.
Det är därför föreliggande uppfinnings uppgift att tillhanda- hålla ett förbättrat, entydigt förfarande i enlighet med krav från användare och myndigheter för framställning av antigent tumörmarkörmaterial och antikroppar, monoklonala såväl som polyklonala, där lösliga och väldefinierade antigener används och högspecifika monoklonala antikroppar erhålls på ett snabbt enkelt och repeterbart sätt.
Föreliggande uppfinnare har antagit att carcinomtumörer sonxväxer snabbt, har snabbare omsättnings- och lyseringshastighet än normala vävnader och utsöndrar abnormt förhöjda koncentrationer av cytokeratiner även i det fallet där tumören har en lokalise- ring som är annorlunda, dvs. i det fallet där carcinomtumörer penetrerar och växer i icke-epitelial vävnad.
Vidare är föreliggande uppfinning baserad på upptäckten att de olösliga intracellulära cytokeratinerna 8, 18 och 19, frag- menteras i tumörvävnader, varvid en stor fraktion av cytokera- tinerna blir lösliga och exponeras mot omkringliggande vätskor, där fragmenten kan påvisas med diagnostiska tester.
De lösliga cytokeratinfragmenten läcker ut till omkringliggande kroppsvätskor, t.ex. blod, urin, ascites och pleura. Således 470 273 A existerar ingen speciell form av extracellulära cytokeratiner, såsom patentsökts i ovannämnda US-ansökan, utan i själva verket härstammar de extracellulära cytokeratinerna från de intracellu- lära cytokeratinerna som har fragmenterats och utsöndrats extracellulärt och kan följaktligen detekteras i blodbanan med immunokemiska tester (antigen-antikropp reaktioner).
Nedan kommer uppfinningen att beskrivas på exemplariskt sätt, varvid de använda förkortningarna anges i slutet av beskriv- ningen.
Framställning av cytokeratinerna (CYK) 8, 18 och 19.
Tumörcellinjen MCF-7, ATCC nr. HTB 22, en human bröst adenocarcinom cellinje från pleuravätska, odlades i "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" (DMEM, Gibco) med tillsatser av L-Glutamin, PEST IOOOOU, 8% FCS i Costar-odlingsflaskor. Även andra tumörcellinjer av epitelialt ursprung kan användas, t ex DU 145 (ATCC nr HTB 81), HeLa (ATCC nr CCL 2) m.fl.
Cellerna får växa ut till ett konfluent monolager (5-7 dagar).
Därefter trypsineras och expanderas cellerna på konventionellt sätt. Cellerna skördas genom att mediumet hälls av och sköljs med PBS-EDTA (1 mM) två gånger. Ny PBS-EDTA lösning tillsätts, cellerna lossnar succesivt från flaskan (cza 20 min i 37°C).
Cellerna skakas loss samt tvättas två gånger. Mellan tvättarna centrifugerades cellerna vid 200 x g, 37°C i 5 min. De sedi- menterade cellerna vägdes som vàtvikt celler, samt fryses direkt i 20°C.
Cytoskelett av t ex. MCF-7 celler framställs med känd teknik.
Detta material renades genom preparativ SDS-PAGE,varvid mole- kylvikterna relaterat till molekylviktsreferenser, visade cza 53, 45 och 41 Kd för cytokeratinerna 8, 18 respektive 19. Detta mönster har tidigare publicerats för dessa cytokeratiner.
De således isolerade och renade cytokeratinerna 8, 18 och 19 4TO 273 5 eluerades från gelen med O,l% SDS, PBS pH 7,5 enligt konven- tionell teknik och kördes om på SDS-PAGE för att verifiera renheten; resultatet var enskilda band för vardera cytokeratin 8, 18 och 19, med samma mobilitet som de tre banden i ursprungs- materialet. Detta verifierar att cytokeratiner 8, 18 och 19 har renats och bibehållit sin storlek.
Därefter eluerades cytokeratinerna 8, 18 och 19 från gelen enligt ovan.
Fragmentering av de renade cytokeratinerna 8, 18 och 19 Eftersom hela cytokeratiner (t.ex. nr 8, 18 och 19) är olösliga vid normala fysiologiska betingelser, har man enligt tidigare känd teknik försökt att göra dessa lösliga genom tillsats av detergenter såsom SDS, urea, etc. Emellertid medför detta ofta komplikationer' i vissa biokemiska sammanhang och stör anti- gen-antikropp reaktioner.
Enligt föreliggande uppfinning görs de olösliga cytokeratinerna lösliga, med bibehållna antigena och immunokemiska egenskaper, genom att de fragmenteras till storlekar mellan 10-50 Kd, varvid ovannämnda komplikationer undviks. I det följande av beskriv- ningen kommer det att framgå att dessa proteiner fortfarande är: -immunogena i däggdjur -behåller majoriteten av den immunokemiska specificiteten, dvs en stor del av de epitoper som funnits i de hela cytokeratinerna -behåller en stor del av den antigena reaktiviteten mot anti- kroppar Fragmenteringen av cytokeratiner kan göras antingen enzymatiskt eller kemiskt, med t.ex. chymotrypsin, V8-proteas, pepsin, TPCK-trypsin, BrCN, partiell hydrolys, BNPS-Saktole bl a, förutsatt att ett reproducerbart klyvningsmönster erhålls med molekylvikter mellan ca 10 till ca 50 Kd för cytokeratinfrag- IIIQITÜEII .
I en föredragen utföringsform av uppfinningen fragmenteras de 470 273 6 renade cytokeratinerna 8, 18 och 19, var och en för sig, på ett kontrollerat sätt med hjälp av chymotrypsin (t ex det som säljs av Sigma under beteckningen C 3142), med ett viktsförhállande enzymzcytokeratin av ca. 1:50-1:1000, varvid de föredragna viktsförhàllandena är 1:40O (CYK 8), 1:10O (CYK 18) och 1:75 (CYK 19). Aktiviteten på enzymet är 40-60 Units per mg protein.
Dessa fragment har då följaktligen inga blockerade N-terminala aminosyror såsom i ovan nämnda US-patent. Fragmenten som ligger i storleksintervallet ca 10-50 Kd eluerades enligt ovan.
Framställning av monoklonala antikroppar riktade mot fragmen- terade cytokeratiner 8, 18 och 19.
Cytokeratinfragment från renade CK 8, 18 och 19 var för sig, dialyserades mot fysiologisk koksaltlösning, varefter de immu- niserades i Balb/c-möss enligt standardprocedur 10 pg fragment per mus i FCA (subcutant), 10 pg per mus i FIA, följt av 1 ug per mus i FIA 2 ggr, allt med 1 veckas mellanrum. Mössen boostrades 3 ggr med 1 dags mellanrum innan fusion.
Tre dygn senare gjordes uttag av lymfocyter från musens mjälte, som fuserades med Sp2/0 myelomceller i förhållandet 1:1.
Naturligvis kan även andra mus-arter och myelomceller användas.
Hybridomcellerna fick växa ut, samt klonerades enligt gängse metod två gånger med utspädningteknik. Kontroll med mikroskop i mikrotiterplattor gjordes för att konstatera en cell per brunn.
Hybridomcellerna fick växa ut, stabiliserades och etablerades.
Totalt etablerades 15 st kloner, som producerade monoklonala antikroppar med nedan beskrivna specificitet och reaktivivtet.
Uppfinningen avser också framställning av polyklonala anti- kroppar mot cytokeratinfragment av storlek 10-50 Kd, vilket sker med väl beskriven teknik i däggdjur, via immunisering t.ex. intramuskulärt eller subcutant där antigenet är blandat 1:1 med Freund's adjuvans. 470 273 7 Test av de erhållna monoklonalernas specificitet och reaktivi- tet ___-______-____-______-_____-________________-____-_________ A. ELISA-TEST MED HELA CYTOKERATINER 8, 18 OCH 19 Vid test av de erhållna monoklonala antikropparna i Elisa, mot renad cytokeratin 8, 18, 19 kopplade till mikrotiterplattor medelst absorption vid pH 9,0, visar det sig att vissa mono- klonaler har specificitet mot en, två eller alla tre cytokera- tinerna, men med olika reaktivitet.
Resultatet vid testning av de enligt ovan erhållna 15 klonerna vid koncentrationen 10 ng/ml av monoklonalerna, visas i figur 1 och 2, där reaktiviteten är uttryckt i absorbansenheter (490 nm) på y-axeln. §ig¿1 är ett stapeldiagram som visar de 15 olika monoklonala antikropparnas specificitet och reaktivitet i Elisa för cytokeratin 8 (vänstra stapeln), och 18 (högra sta- peln).
Koncentrationerna av de på plattorna kopplade antigenerna, dvs oytokeratin 8, 18 var 0,3 pg/ml vardera. De sekundära antik- ropparna var anti-mus IgG antikroppar kopplade till HRP och efter tillsats av substratet o-fenylendiamin avlästes absorbansen vid 490 nm enligt konventionell Elisa-teknik. Såsom framgår ur §ig¿ 1 har åtta av klonerna högst reaktivitet mot cytokeratin 8 medan de övriga sju har högst reaktivitet mot cytokeratin 18.
Stapeldiagrammet enligt Fig. 2 visar de 15 olika monoklonaler- nas specificitet och reaktivitet mot cytokeratin 19 i Elisa (som ovan), där högre koncentration av antigenet, nämligen 2,3 rg/ml, har använts. Fem kloner kan sägas reagera med cytokeratin 19.
Såsom framgår ur figurerna förekommer korsreaktivitet mellan de olika cytokeratinerna och detta beror sannolikt på de stora aminosyrasekvens-homologier som föreligger mellan cytokerati- nerna 8, 18 och 19, vilket också anges i litteraturen.
B. WESTERN-BLOT MED FRAGMENTERAD CYTOKERATIN 8, 18 OCH 19 Western-blot av cytokeratinfragment utfördes genom att de enligt ovan enzymdigererade cytokeratinerna kördes i SDS-PAGE 478 273 8 och därefter blottades över till nitrocellulosafilter enligt känd teknik. Pâ detta sätt visades att de monoklonala anti- kropparna identifierade majoriteten av cytokeratinfragmenten från respektive cytokeratiner. Såsom sekundär antikropp användes kanin anti-mus IgG antikroppar kopplade till HRP.
Fig. 3 visar ett Western-blot på nitrocellulosa efter SBS-PAGE, av renad cytokeratin 8 fragmenterad med chymotrypsin enligt uppfinningen. Varje strip av nitrocellulosa har fått reagera med olika monoklonala antikroppar framställda enligt ovan. En sekundär antikropp, kanin anti-mus IgG kopplad med HRP, tillsat- tes därefter och monoklonalens reaktion har visualiserats med ett substrat DAB (Sigma D-5905) enligt känd metod.
Resultatet visar att flera av de monoklonala antikropparna reage- rar med flera av cytokeratin 8 fragmenten inom storlek 10 till 50 Kd.
I Fig. 4 visar ett Western-blot på nitrocellulosa efter SDS-P- AGE, av renad cytokeratin 18 fragmenterad med chymotrypsin. Varje strip av nitrocellulosa har fátt reagera med olika monoklonala antikroppar framställda enligt ovan. En sekundär antikropp, kanin anti-mus IgG kopplad med HRP, tillsattes därefter och monoklona- lens reaktion har visualiserats med ett substrat DAB (Sigma D-5905) enligt känd metod.
Resultatet visar att flera av de monoklonala antikropparna reage- rar med flera av cytokeratin 18 fragmenten inom storlek 10 till 44 Kd. f I Fig. 5 visar ett Western-blot på nitrocellulosa efter SDS-P- AGE, av renad cytokeratin 19 fragmenterad med chymotrypsin. Varje strip av nitrocellulosa har fått reagera med olika monoklonala antikroppar framställda enligt ovan. En sekundär antikropp, kanin anti-mus IgG kopplad med HRP, tillsattes därefter och monoklona- lens reaktion har visualiserats med ett substrat DAB (Sigma D-5905) enligt känd metod.
I! 470 273 9 Resultatet visar att flera av de monoklonala antikropparna reage- rar med flera av cytokeratin 19 fragmenten inom storlek 10 till 38 Kd.
Det sammanlagda resultatet visar mycket god reaktivitet och specificitet mot en majoritet av fragmenten från cytokeratin 8 för 7 kloner, från cytokeratin 18 för 7 kloner och från cyto- keratin 19 för 5 kloner. Detta överenstämmer med de 15 klonernas specificitet för de hela cytokeratinerna.
I jämförelse med redan kända monoklonala antikroppar mot hela cytokeratiner 8, 18 och 19, vilka alltså är olösliga, visar de här ovan beskrivna antikropparna en bättre reaktivitet, vilket möjliggör användning i immunokemiska tester, där stor känslighet fordras. I jämförelse med kända monoklonala antikroppar mot "extracellulära“, lösliga cytokeratiner (t ex enligt US-A-4 775 620), ger antikropparna enligt föreliggande uppfinning bättre specificitet, vilket ger tillförlitligare tester eftersom väldefinierade antigener används som kan erhållas på reprodu- cerbart sätt.
Enligt föreliggande uppfinning används antikropparna för: -detektion och diagnostik av tillstånd relaterade till frislä- ppning av cytokeratinfragment i kroppsvätskor -lokalisation och diagnostik av tumörer in vivo genom koppling av antikropparna till lämplig detekterbar markör -koppling av antikropparna till cellgifter och radioaktiva isotoper för att oskadliggöra tumörer in vivo -immunohistologi av vävnadssnitt -immunocytologi av t ex cervix smears -immunokemiska tester, t ex Elisa, EIA, IRMA, LIA Cytokeratinfragmenten enligt uppfinningen kan, förutom att användas för framställning av antikroppar, även användas för: -vaccinering av människa för att bilda kroppsegna antikroppar som kan bekämpa egna tumörer, själva eller i kombination med andra behandlingsmetoder 470 273 10 -kompetitiva tester, t ex RIA, för undersökning med avseende på förekomst och kvantifiering av cytokeratinfragment Antikropparnaenligtuppfinningenoch/ellercytokeratinfragmenten kan innefattas i speciella kits för utförande av immonokemiska tester. I "sandwich-assays“ eller "double site-assays", används cytokeratinfragmenten som standard- och referensmaterial och antikropparna används antingen som "catching" antikropp kopplade till fastfas, t ex mikrotiterplattor, eller som "tracer" antikropp, märkt på lämpligt sätt för pàvisning av den i testet eftersökta substansen, dvs cytokeratinfragment. I "single site- assays" kopplas cytokeratinfragmenten till fastfas och en anti- antikropp används för påvisning av den eftersökta substansen, dvs antikroppen mot cytokeratinfragment.
En annan aspekt av uppfinningen är att immunisera djur med enbart ett eller några få cytokeratinfragment. Det eller de speciella fragment som ger särskilt reaktiva antikroppar sekveneras. Med utgångspunkt från denna sekvens framställs en syntetisk nukleotidsekvens, vilken förs in i en vektor, t ex plasmid, och kloneras i t ex en bakterie för massproduktion av det önskade fragmentet, vilket därefter används som immunogen enligt ovan.
Testning av serumprov från cancerpatienter samt friska personer Med hjälp av en IRMA metod, där monoklonal antikropp kopplats till fastfas (plaströr) och där polyklonal eller monoklonal antikropp radioaktiv märkts, testades sera från synbarligen friska personer (blodgivare) samt sera från cancerpatienter.
Som referens- och standardmaterial användes lösliga cytokera- tinfragment i buffertlösningar resp. human serum. Niváerna från de olika grupperna visade 'klart olika. kvantiteter (CPM) av cytokeratinfragment.
Resultatet i Fig. 6 visar att serum från synbarligen friska personer har ett lågt utslag i testet, med mycket liten sprid- ning. Under 800 CPM faller majoriteten (90%) av populationen. 470 273 ll För serum från majoriteten (90%) av cancerpatienterna faller värdena på signifikant högre värden (800-4800 CPM) än för friska människor vilket visas i Fig. 7.
Det ovan beskivna visar att vi har kunnat detektera cytokeratin fragment i serum distribuerade från tumörer hos cancersjuka patienter, med hjälp av de antikroppar och reagens som beskri- vits i denna ansökan. Antikropparna enligt uppfinningen har förmåga att reagera med de mest representativa fragmenten från ovannämnda cytokeratiner i kroppsvätskor från människa.
Att dessa cytokeratinfragment verkligen härstammar från intra- cellulära cytokeratiner, och att även intracellulära cytokera- tiner kan påvisas med antikropparna enligt föreliggande upp- finning;'visasi.immunohistologiskacxflximmunocytologiska.tester, t.ex. immunofluorescens på odlade celler. I Fig. 8 visas odlade tumörceller (MCF-7) som. metanolfixerats (penetrerar cellmem- branet) och därefter inkuberats med en av de monoklonala anti- kropparna (IDLl-1) enligt uppfinningen, följt av en sekundär antikropp med FITC kopplad till sig. Vid belysning genom ett UV- -ljus mikroskop ser man det typiska cytoskeleton mönstret inne i cellen på flera av cellerna. Detta visar att antikropparna enligt uppfinningen ser den intracellulära strukturen.
Förkortningar: ATCC American Type Culture Collection CPM Counts per minute för radioaktivitet CYK el. CK Cytokeratin DAB 3,3'-Diaminobenzidine-tetra-hydrochloride FIA Freund's incomplete adjuvans FCA Freund's complete adjuvans FCS Fetal calf serum IRMA Immunoradiometric assay Elisa Enzyme linked immunosorbent assay LIA Luminiscence immunoassay Kd Kilodalton HRP Horse Redish Peroxidase 470 273 12 FITC Fluorescein Isothiocyanate PEST Penicilline Streptomycine PBS-EDTA Phosphate buffered saline- etylhelene diamine tetra acetic acid RIA Radio Immuno Assay SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamid gel electropho- resls

Claims (14)

470 273 L3 PATENTKRAV
1. . Sätt för reproducerbar framställning av cytokeratinantigen/- immunogen, innefattande: rening av cytokeratiner från epiteliala carcinomceller genom preparativ SDS-PAGE; eluering av banden motsvarande cytckeratin 8, 18 och 19 från gelen; k ä n n e t e c k n a t av steget digerering av de eluerade cytokeratinerna för att producera en blandning' av fragment i storleksordningen 10-50 Kd, vilken blandning är avsedd för immunisering samt att vara reagens-, standard- eller referensmaterial.
2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att digestionen görs enzymatiskt.
3. dSätt enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att digestionen gör med ett enzym valt från guppen bestående av chymotrypsin, V8 proteas, pepsin och TPCK-trypsin.
4. Sätt enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att cytokeratinerna enzymdigereras med chymotrypsin, 40-60 U per mg protein, i viktsförhàllandet enzymzcytokeratin 1:50 till l:lO00.
5. Sätt enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att enzym- digereringen sker i följande viktsförhàllande enzymzcytokeratin, l:40O för cytokeratin 8, l:l000 för cytokeratin 18 och 1:75 för cytokeratin 19.
6. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att digereringen görs kemiskt med BrCN, hydrolys eller BNPS-Skatole. 470 273 w
7. Sätt enligt något eller några av kraven 1-6, k ä n n e - t e c k n a t av att 10-50 Kd fragmenten separeras på en preparativ SDS-PAGE, och att valda fragment elueras fràn gelen.
8. Cytokeratinfragmentblandning, k ä n n e t e c k n a d e av att den framställs genom rening av cytokeratiner från epiteliala carcinomceller genom preparativ SBS-PAGE; eluering av banden motsvarande cytokeratin 8, 18 och 19 från gelen och; digerering av de eluerade cytokeratinerna för att producera en blandning av fragment i storleksordningen 10-50 Kd.
9. Sätt att framställa antikroppar mot cytokeratinfragment, innefattande immunisering av ett djur med en lösning innefattande cytokeratinfragment och utvinning av antikroppar från djuret som är riktade mot cytokeratinfragment, k ä n n e t e c k n a t av att cytokeratinfragmenten framställs genom rening av cytokerati- ner från epiteliala carcinomceller genom preparativ SBS-PAGE; eluering av banden motsvarande cytokeratin 8, 18 och 19 från gelen och; digerering av de eluerade cytokeratinerna för att producera en blandning av fragment i storleksordningen 10-50 Kd.
10. Sätt att framställa monoklonala antikroppar mot cytokeratin- fragment, innefattande immunisering av en mus med en lösning innefattande cytokeratinfragment; utvinning av lymfocyter från musens mj älte; fusering av lymfocyterna med myelomceller; klonering och växning av hybridomcellerna; Stabilisering och etablering av enskilda kloner och; utvinning av monoklonala antikroppar mot cytokeratinfragment från klonerna, k ä n n e - t e c k n a t av att cytokeratinfragmenten framställs genom rening av cytokeratiner från epiteliala carcinomceller genom preparativ SDS-PAGE; eluering av banden motsvarande cytokeratin 8, 18 och 19 från gelen och; digerering av de eluerade cytokera- tinerna för att producera en blandning av fragment i storleks- ordningen lO-SO Kd.
11. ll. Testkit för att detektera cancer av epitelialt ursprung, k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar en cytokeratin- ff 470 273 fragmentblandning framställd med sättet enligt krav 8 och monoklonala antikroppar framställda med sättet enligt krav 10.
12. Användning av monoklonala antikroppar framställda med sättet enligt krav lO kopplade till cellgifter eller radioaktiva isotoper för beredning av ett läkemedel för behandling av epiteliala tumörer.
13. . Användning av monoklonala antikroppar framställda med sättet enligt krav 10 kopplade till detekterbara markörer för immunohis- tologi eller immunocytologi.
14. Användning av en cytokeratinblandning enligt krav 8 för framställning av ett vaccin för bekämpning av kroppsegna tumörer.
SE9003025A 1990-09-24 1990-09-24 Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer SE470273B (sv)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9003025A SE470273B (sv) 1990-09-24 1990-09-24 Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer
PCT/SE1991/000638 WO1992005197A1 (en) 1990-09-24 1991-09-24 Purification of cytokeratin fragments
US08/030,100 US5728537A (en) 1990-09-24 1991-09-24 Methods of producing antibodies against cytokeraton fragments and test kits containing such fragments
EP91917180A EP0550561B1 (en) 1990-09-24 1991-09-24 Purification of cytokeratin fragments
JP51612591A JP3210666B2 (ja) 1990-09-24 1991-09-24 サイトケラチン断片の精製
AT91917180T ATE191921T1 (de) 1990-09-24 1991-09-24 Reinigung von cytokeratinfragmenten
DE69132122T DE69132122T2 (de) 1990-09-24 1991-09-24 Reinigung von cytokeratinfragmenten
AU85463/91A AU8546391A (en) 1990-09-24 1991-09-24 Purification of cytokeratin fragments
US08/666,835 US5780032A (en) 1990-09-24 1996-06-19 Method of using monoclonal antibodies to cytokeratin fragments

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9003025A SE470273B (sv) 1990-09-24 1990-09-24 Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE9003025D0 SE9003025D0 (sv) 1990-09-24
SE9003025L SE9003025L (sv) 1992-03-25
SE470273B true SE470273B (sv) 1993-12-20

Family

ID=20380430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE9003025A SE470273B (sv) 1990-09-24 1990-09-24 Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer

Country Status (8)

Country Link
US (2) US5728537A (sv)
EP (1) EP0550561B1 (sv)
JP (1) JP3210666B2 (sv)
AT (1) ATE191921T1 (sv)
AU (1) AU8546391A (sv)
DE (1) DE69132122T2 (sv)
SE (1) SE470273B (sv)
WO (1) WO1992005197A1 (sv)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5547928A (en) * 1993-12-17 1996-08-20 Matritech, Inc. Methods and compositions for the detection of colon cancers
ES2116906B1 (es) * 1996-03-28 1999-03-01 Consejo Superior Investigacion Anticuerpo monocional pc2.27 asociado a tumores.
US6890311B2 (en) 1997-09-16 2005-05-10 The Regents Of The University Of California Methods for performing medical procedures within a breast duct
US6168779B1 (en) * 1997-09-16 2001-01-02 The Regents Of The University Of California Methods and kits for identifying ductal orifices
EP1019438B1 (en) * 1997-09-30 2009-01-21 Peviva AB Apoptosis-related compounds and their use
CA2366514C (en) * 1999-04-13 2009-09-15 Manfred Schmitt Diagnostic and therapeutic use of antibodies against the urokinase receptor
EP1345961A2 (en) * 2000-12-21 2003-09-24 Genzyme Corporation Antigenic ck-18 compounds for therapy and diagnosis and methods for using same
DE10130985B4 (de) * 2001-06-27 2004-03-18 B.R.A.H.M.S Ag Verfahren zur Diagnose von Sepsis und schweren Infektionen unter Bestimmung löslicher Cytokeratin-1-Fragmente
US20030138425A1 (en) * 2001-09-21 2003-07-24 Mather Jennie Powell Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
US8980568B2 (en) 2001-10-11 2015-03-17 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample
US8986944B2 (en) 2001-10-11 2015-03-24 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples
US7306919B1 (en) * 2001-10-31 2007-12-11 Thornthwaite Jerry T Antigen-antibody cancer recognition system
JP2005523888A (ja) * 2002-01-03 2005-08-11 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 癌関連エピトープ
EP1698899A4 (en) * 2003-10-30 2007-05-23 Sysmex Corp UTERINE GLAND CANCER DIAGNOSIS AND METHOD FOR DETECTION OF CANCER CELLS OF UTERINE GLAND
CA2657621A1 (en) * 2006-07-14 2008-01-17 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample
KR101292163B1 (ko) 2010-11-23 2013-08-12 한양대학교 산학협력단 Ｋｒｔ１９ 항체를 포함하는 항암용 조성물
SE538211C2 (sv) * 2013-04-05 2016-04-05 Idl Biotech Ab Metod för detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller lösliga fragment därav

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE125626T1 (de) * 1984-01-06 1995-08-15 Univ California Cytokeratin-tumormarkierer und test zu deren nachweis.
US4727021A (en) * 1984-06-01 1988-02-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Human monoclonal antibodies to cytokeratin
US4722895A (en) * 1984-09-25 1988-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Synthetic peptides for the production of specific keratin protein antibodies
DE3815932A1 (de) * 1988-01-26 1989-08-03 Progen Biotechnik Gmbh Verfahren zur identifizierung des ursprungs einer zellgewebsprobe
EP0267355B1 (de) * 1986-11-10 1991-09-18 PROGEN Biotechnik GmbH Verfahren zum Identifizieren gewebstypischer, unlöslicher Cytoskelettproteine
LU86654A1 (de) * 1986-11-10 1988-06-13 Progen Biotechnik Gmbh Verfahren und vorrichtung zum auffinden von zellaesionen
EP0627940B1 (en) * 1992-03-05 2003-05-07 Board of Regents, The University of Texas System Use of immunoconjugates for the diagnosis and/or therapy of vascularized tumors

Also Published As

Publication number Publication date
ATE191921T1 (de) 2000-05-15
SE9003025L (sv) 1992-03-25
AU8546391A (en) 1992-04-15
JP3210666B2 (ja) 2001-09-17
WO1992005197A1 (en) 1992-04-02
US5780032A (en) 1998-07-14
DE69132122T2 (de) 2001-01-11
SE9003025D0 (sv) 1990-09-24
US5728537A (en) 1998-03-17
EP0550561A1 (en) 1993-07-14
DE69132122D1 (de) 2000-05-25
JPH06501469A (ja) 1994-02-17
EP0550561B1 (en) 2000-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE470273B (sv) Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer
AU606605B2 (en) Monoclonal antibodies to unreduced, nonenzymatically- glycated proteins
WO1989010563A1 (en) Marker for colorectal carcinoma and methods of detecting the same
US4894442A (en) Monoclonal antibodies that bind to alpha-acid glycoprotein
JP2959837B2 (ja) 癌関連ハプトグロビン
WO2013031756A1 (ja) 大腸癌または食道癌の検出用マーカー及び検査方法
KR101777254B1 (ko) En2 단백질을 특이적으로 인식하는 특정 항원으로부터 얻어진 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물
DE3688204T2 (de) Monoklonaler antikoerper gegen ein p21-bezuegliches dodekapeptid des ras-onkogens.
US5298393A (en) Monoclonal antibody for human acid-glutathione S-transferase and process for preparation thereof
US11746146B2 (en) Antibody composition specifically recognizing an immunogenic fragment peptide of EN2 protein
AU618209B2 (en) Antigen recognized by mca 16-88
JPS63258898A (ja) ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法
WO1989010376A1 (en) Monoclonal antibody for colorectal carcinoma
EP0145373A2 (en) Purification of cancer-associated protein and preparation of antibody thereto
WO1984000758A1 (en) Immunoassay for carbohydrate antigenic determinant
KR100493932B1 (ko) 레지스틴에 대한 단클론 항체, 이의 제조 방법, 및 용도
EP0242727B1 (en) Method of assaying adenocarcinoma antigens
JP2012018119A (ja) 大腸癌検出用マーカーおよびそれを用いた大腸癌検出方法
KR20110009604A (ko) Ｐｓａ를 인지하는 단클론 항체 및 이의 용도
JPH0614041B2 (ja) 肺表面活性物質の検出方法及びそれに用いる試薬キツト
Mochizuki et al. An immunoenzymometric assay for a CA 125‐like antigen, CA602
JP2000065829A (ja) スタニオカルシンに対する抗体
JP2005143504A (ja) 抗体およびその用途
JPH067190A (ja) 抗モルヒネ抗体の抗イディオタイプ抗体、その製法及びモルヒネの測定法
JPWO2003052102A1 (ja) ブラディオン検出用特異的抗体

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 9003025-5

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed