SE468480B - Modifierat tioredoxin och dess anvaendning - Google Patents

Description

468 480 10 15 20 25 30 35 2 av denaturerade, ickeveckade reducerade proteiner som modeller. Det klassiska modellsystemet är ribonukleas A (RNase). Studier av ribonukleas har lett till upptäckten av PDI som ett luminalt, endoplasmatiskt reticulum-protein i eukaryota celler katalyserande disulfidutbyte och bild- ning av nativa disulfider. In vivo-oxidanten vid bildning av disulfider fràn ditioler är emellertid okänd.

Nyliga utvecklingar av rekombinant teknik möjliggör konstruktion och expression i bakterier, jäst eller andra system av vilken som helst given sekvens av DNA kodande för ett känt eller modifierat protein. Denna procedur är av stor biomedicinsk betydelse, vilket kan exemplifieras genom rekombinant produktion av insulin, insulinliknande tillväxtfaktorer, tillväxthormon, vävnadsplasminogenakti- vator, interferoner, faktor VIII och mànga andra prote- iner. Eftersom huvuddelen av dessa biomedicinskt intres- santa proteiner innehåller ett otal disulfidbindningar kompliceras pà ett allvarligt sätt den allmänna produk- tionen i bakterier, som är ekonomiskt gynnsam, genom bild- ningen av non-nativa, ofta aggregerade och olösliga pro- teiner. Processen kräver därför endera en veckning in vitro eller produktionen mäste utföras i eukaryota cell- system med mycket högre kostnader. Idealiskt skulle pro- duktion av ett rekombinant protein i en bakterieliknande Escherichia coli involvera en konstruktion, där protein- veckning och nativ disulfidbildning skulle uppträda. Al- ternativt skulle en effektiv in vitro-process för alstring av höga utbyten av nativt veckat disulfidbundet protein tillämpas.

Proteindisulfidisomeras.

Den mekanism som innebär bildning av nativa disulfi- der är en nätoxidation, där två tiolgrupper bildar en di- sulfid och avger två protoner och två elektroner (Reaktion 1). + 2 H+ + 2 e (1) R-(SH)2 ----- --> RS 2 10 15 20 25 30 35 _t> O\ 03 h O) C) 3 In vivo-oxidanten i denna reaktion är okänd. In vitro-system utnyttjar endera syre i luft som en terminal- oxidant resulterande i en långsam process eller utnyttjar en redox-buffert sammansatt av exempelvis glutation och glutationdisulfid (GSH-GSSG). De principiella reaktionerna i denna process är tiol-disulfidutbytet och den för när- varande tillgängliga kunskapen visar, att nativa disul- fider i ett protein bildas genom en utbytesprocess via non-nativa disulfider under veckning (Creighton, 1990).

PDI katalyserar disulfidisomerisering till bildning av en slutstruktur med korrekta disulfider. Enzymet är ett 57 kDa surt protein beläget i lumen av det endoplasmatiska reticulum (ER). Kloning av PDI har avslöjat att den inne- håller två domäner om ca 100 rester med stark likhet med tioredoxin (Edman et al., 1985). Detta antyder, att det aktiva stället i PDI och proteinets mekanism var likartat med tioredoxin. Detta bevisades genom upptäckten att PDI är ett substrat för mammaliskt tioredoxinreduktas (Lund- ström och Holmgren, 1990). Tioredoxin har långtgående karakteriserats under loppet av 25 år, och dess primär- struktur och tredimensionella struktur är känd från rönt- genkristallografi, 2D NMR~och ett omfattande proteinkon- struktionsarbete (beträffande referenser se Holmgren, 1985, 1989 och Dyson et al., 1990; Eklund et al., 1991). I en serie av tidigare publikationer har det visats, att tioredoxin är ett kraftfullt proteindisulfidreduktas vid koppling till NADPH och tioredoxinreduktas (Holmgren, 1984). Tioredoxin innehåller en aktiv redoxdisulfid i dess oxiderade form med aminosyrasekvensen Trp-Cys-Gly-yro-Cys.

Molekylen är så veckad, att en utskjutande del bildas innehållande det aktiva stället inne i en hydrofob yta involverande Trp-31, Cys-32, Pro-34, Pro-76, Gly-92, Ala- 93. Denna yta är konserverad i tioredoxiner från alla ar- ter (Eklund et al., 1991). Mekanismen för tioredoxin har föreslagits involvera en transcient blandad disulfid mel- lan Cys-32 och proteindisulfiden. Ett väsentligt element i denna mekanism är bildningen av ett komplex mellan pro- 468 480 10 15 20 25 30 35 4 teinsubstratet och tioredoxinets hydrofoba yta. Detta gör det möjligt för tioredoxin att katalysera tioldisulfid- utbytesreaktioner med hastighetskonstanter inom inter- vallar 1o4-1o5 M* s* i møtsats till làgmolekylära tiol- er, såsom glutation, merkaptoetanol eller DTT, vilka rea- gerar vid fysiologiskt.pH med hastighetskonstanter av 1 s_l (Holmgren, 1985). Tiore- storleksordningen 1-10 M- doxin visar sålunda i allmänhet en mycket snabb reaktions- kinetik. I andra reaktioner kan tioredoxin uppvisa en unikt högre aktivitet gentemot specifika disulfider, vil- ken väsentligt överskrider den för lågmolekylära tioler. I detta fall kan det antas att tioredoxin, genom bildning av ett komplex med ett protein, alstrar en konformationell ändring som gör en annars begravd disulfid reaktiv. Detta är en central idé för tioredoxin katalyserande tioldisul- fidutbytesprocesser med proteiner, nämligen att vägen för proteinveckning och åtföljande disulfidbildning kan riktas genom katalysatorn. Man kan anta att en liknande mekanism är aktuell vid proteindisulfidisomeras.

En tidigare rapport (Pigiet och Schuster, 1986) be- skriver veckning av ribonukleas RNase i närvaro av höga koncentrationer av tioredoxin från E.coli. En hastighets- förhöjning observerades, ävensom ett bättre utbyte av slutligt RNase. Kvantiteten av tioredoxin som användes vid denna process var emellertid kemiska snarare än kataly- tiska (25 pM RNase-SH2 och 500 pM Trx-S2). Ingen jämför- else gjordes med PDI och processen krävde mycket långa tider och höga koncentrationer av tioredoxin.

Till följd av bättre tillgänglighet av tioredoxiner jämfört med exempelvis enzymproteinet disulfidisomeras (PDI) skulle det vara en fördel om tioredoxiner kunde ef- fektivt användas vid korrekt veckning eller omveckning av biologiskt aktiva proteiner innehållande disulfidbryggor.

Huvudändamålet med föreliggande uppfinning är därför att åstadkomma nya tioredoxiner, vilka är redoxaktiva och vil- ka uppvisar en förbättrad redoxpotential jämfört med nati- va tioredoxiner. 10 15 20 25 30 35 -ß ox oo |> oo o 5 Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma förfaranden för korrekt veckning eller omveckning av di- sulfidförnätade proteiner under användning av sådant mo- difierat tioredoxin.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma förfaranden för korrekt veckning eller omveckning av di- sulfidförnätade proteiner under förbättrad effektivitet av sådana förfaranden.

Andra ändamål och fördelar med uppfinningen kommer att fullständigt framgå av följande beskrivning.

För ovan identifierade ändamål och andra ändamål åstadkommas genom uppfinningen nya tioredoxiner och funk- tionella derivat därav innefattande ett redoxaktivt Cys- Gly-Pro-Cys-ställe, vari aminosyraresten Pro i 34-position har ersatts med His, och vari aminosyrarester med 33-posi- tion är utvald bland Gly och Ala. I detta redox-aktiva ställe eller sekvens avser positionerna 32 till 35 mot- svarande aminosyraresterna Cys, Gly, Pro respektive Cys i E.coli-numrering.

Den substitution som utföres i ovan definierade redoxaktiva ställe resulterar i_en oväntad förhöjning av redoxpotentialen förutom det faktum att de modifierade tioredoxinerna erhålles med mycket höga utbyten och vidare att de är stabila. Det rön som är förknippat med förelig- gande uppfinning är så mycket mera oväntat som andra ve- tenskapsmän har uttryckt åsikten, att den relativt större effektiviteten av en PDI jämfört med tioredoxin betrakta- des snarare bero på närvaron av katalytiska multipeldomä- ner i PDI än i skillnader i deras aktiv-ställe sekvenser.

I detta avseende hänvisas till artikeln i Bio.Chem.J. (1991) 275, 349-353, av Hilary C. Hawkins et al., jfr. dess inledande sammanfattning.

Vid en föredragen utföringsform av uppfinningen har tioredoxinerna eller de funktionella derivaten därav i 33- position aminosyraresten Gly. Tioredoxinet enligt förelig- gande uppfinning erhålles företrädesvis från naturligt uppträdande redoxiner genom site-riktad mutagenes. 468 480 10 15 20 25 30 'ss 6 Genom uppfinningen åstadkommes även ett förfarande för framställning in vitro av ett veckat, biologiskt ak- tivt, disulfidbundet protein, vilket förfarande består i omsättning av ett motsvarande oveckat och reducerat prote- in med ett tioredoxin eller funktionellt derivat därav, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari amino- syraresten i 33-position är utvald bland Gly och Ala, vilket resulterar i bildning av nativ disulfid. Även i detta förfarande är det föredraget att position 33 upptas av aminsyraresten Gly.

Enligt en ytterligare förbättring med avseende på föreliggande uppfinning utföres en sådan reaktion i när- varo av en katalytisk mängd av en selenit. Sådan kata- lytisk mängd kan ligga inom koncentrationsintervallet från ca 0,1 pM till ca 100 um, speciellt från ca 0,5 till ca 10 pM.

Enligt ett annat alternativ för att utföra detta för- farande kan proteinets reaktion äga rum i närvaro av en redox buffert, såsom en buffert av reducerat och oxiderat glutation, ß-merkaptoetanol eller ditiotreitol.

Föreliggande-uppfinning är tillämpbar även på omveck- ning av felaktigt veckade proteiner, såsom scramble-pro- teiner, till bildning av den korrekta veckningen med di- sulfidbindningar. En sådan process karakteriseras av om- sättning av ett scramble-protein med ett tioredoxin eller funktionellt derivat därav, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari aminosyraresten i 33-position är utvald bland Gly och Ala, i närvaro av en reduktant eller en re- doxbuffert, glutation, ß-merkaptoetanol eller ditiotreitol. Även denna såsom en buffert av reducerat och oxiderat reaktion kan äga rum i närvaro av en selenit vid koncen- trationsbetingelser liknande de som angivits ovan.

Enligt ännu en sida av uppfinningen åstadkommes ett förfarande för bildning av korrekt vikveckning in vitro av ett oveckat och reducerat protein till bildning av ett di- sulfidförnätat protein. I nämnda förfarande omsättes det oveckade och reducerade proteinet med tioredoxin, ett tio- 10 15 20 25 30 35 7 redoxin, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari aminosyraresten i 33-position är utvald från Gly och Ala eller ett funktionellt derivat därav, eller PDI i närvaro av en katalytisk mängd av en selenit, resulterande i bild- ning av nativ disulfid.

Enligt nämnda aspekt består ett alternativt förfaran- de i korrekt omveckning av ett felaktigt veckat protein genom omsättning med ett tioredoxin, ett tioredoxin, vari Pro i 34-position har ersatts med His, och vari aminosyra- resten i 33-position är utvald från Gly och Ala, eller ett funktionellt derivat därav, eller PDI i närvaro av en NADPH och ett tioredoxinreduktas och en katalytisk mängd av en selenit resulterande i bildning av nativ disulfid.

Under användning av jämvikten mellan Trx och NADPH i den tioredoxinreduktas(TR)-katalyserade reaktionen (Reak- tion 2) har det befunnits, att redoxpotentialen av P34H- Trx vid pH 7,0 var -235mV jämfört med -270 mV för den vil- da typen (wt) Trx.

TR E > Trx-suz + NADP* (2) Trxz + NADPH + H* Skillnaden i E0' om 35 mV motsvarar ungefär en faktor av 20 i Keq för Reaktion 3.

Keq (3) TIK-S2 + Pr0tGiH-SH2 1g====r> Trx-SH2 + protein-S2 Det högre EQ'-värdet gjorde även P34H-Trx mera likar- tad PDI och bidrog till väsentliga ändringar i Trx-funk- tioner, nämligen förbättrad aktivitet med TR men lägre re- duktion av proteindisulfider. Jämfört med wt-Trx var P34H Trx-S2 ca två gånger så bra som substrat för TR från E.coli och fyra gånger så effektiv med kalvtymus TR. En nyutvecklad fluorometrisk syra tillät direkt registrering av reaktionen mellan insulindisulfider och Trx-SH2. pH 8 och l5°C, andra ordningens konstant för vildtyptioredoxin eller 2 x 104 M_l s-1 och för P34H-Trx om 3 x 103 M'1 s'1 erhölls och en annan jämvikt observerades vilken var för- 10 15 20 25 30 35 468 480 8 enlig med skillnaderna i EQ'-värden.

Föreliggande uppfinning är helt allmänt tillämpbar på produktion av biologiskt aktiva disulfid-förnätade prote- iner, och bland proteiner av intresse kan nämnas insulin, proinsulin, Igf-I Igf-II, t-PA, tillväxthormonfaktor VIIIF och koagulationsfaktorer, interleuciner, pankreatiska mam- malieribonukleaser, lysozymer, pankreatiska mammalietryp- sininhibitorer, interferoner, rennin, prolaktin, human a- l-trypsininhibitor, etc. Gemensamt för samtliga dessa pro- teiner är det förhållandet, att de i korrekt veckad form innehåller disulfidbryggor som åstadkommer korrekt kon- figuration.

Med avseende på den sida av uppfinningen vid vilken man vid veckningsreaktionen använder en selenit är mot- jonen eller katjonen som användes ej av väsentlig betyd- else så länge som den är inert i förhållande till reak- tionen, men det är föredraget att använda alkalimetaller eller jordalkalimetaller, varvid natrium och kalium är speciellt föredragna.

Uppfinningen kommer i det följande att ytterligare beskrivas mera i detalj genom icke inskränkande konkreta exempel. Denna illustration göres i anslutning till bi- lagda ritningar.

Förklaring av ritningar Figur 1. Kinetik för återvinnande av RNase-aktivitet från fullständigt reducerad RNase katalyserat genom PDI eller tioredoxiner i närvaro av 100 uM GSSG. RNase, 25 uM, in- kuberades vid 37° i 100 mM kaliumfosfat, pH 7,0, l mM EDTA i frånvaro av tioredoxin eller PDI X---X eller i närvaro av 10 pM ~----~ och 100 pM °----° E.coli w.t. Trx, 10 pM A----A och 100 pM A----A p34H Trx, och l uM I----I och 10 pM D----U PDI. Alikvota mängder avlägsnades från reak- tionsblandningarna och undersöktes med avseende på RNase- aktivitet med 160 pg/ml 2'3'cCMP i 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2. Hydrolys av nukleotiden följdes 10 15 20 25 30 35 468 480 9 spektrofotometriskt vid 288 nm, och återvinningen beräk- nades ur en standardkurva för nativ RNase.

Figur 2. Omveckning av fullt reducerad RNase i närvaro av katalytisk mängd selenit. Försöksbetingelserna var som i Fig. 1 bortsett ifrån tillsats av 1 uM Se032- i stället för GSSG: I frånvaro av PDI eller tioredoxin X----X, i närvaro av 10 pM ~----~ och 100 uM °----° E.coli w.t. Trx, 10 uM A----A och 100 pM A----A P34H tioredoxin, och 1 pM I----I och 10 uM D----D PDI.

Figur 3. Jämförelse av PDI, w.t. E.coli Trx och P34H Trx vid omveckning av sRNase i närvaro av 100 uM GSH. Slumpvis omoxiderad RNase (25 pM) inkuberades i 100 mM kaliumfosfat pH 7,0, l mM EDTA vid 37° i frånvaro av tioredoxin eller PDI X----X och i närvaro av 10 pM ~----~ och 100 pM °----° E.coli w.t. Trx, 10 pM A----A och 100 pM A----A P34H Trx, och 1 uM I----I och 10 uM D----U PDI. Alikvota mängder av- lägsnades och undersöktes med avseende på RNase-aktivitet såsom i Fig. 1.

Figur 4. Jämförelse av PDI, w.t. E.co1i Trx och P34H Trx vid omveckning av sRNase i närvaro av 100 pM NADPH och 10 nM bovint tioredoxinreduktas. Utan tioredoxin eller PDI X----X eller i närvaro av 10 pM 0----~ och 100 uM °----° E.coli w.t. Trx, 10 pM A----A och 100 pM A----A P34H tio- redoxin, och 1 uM I----I och 10 pM D----D PDI. Försöks- betingelserna var såsom i Fig. 1.

Figur 5. Effekter av olika koncentrationer av PDI, w.t.

Trx eller P34H Trx på återvinning av RNase-aktivitet från fullt reducerad RNase efter 24 timmar inkubation vid 37°. 5. endast luft §. i närvaro av 100 uM GSSG och Q. _. Värdena utgör medeltal av 2 till 5 i när- varo av l pM SeO3 olika experiment. w.t.

Figur 6. Effekter av olika koncentrationer av PDI, 468 480 10 15 20 25 30 '35 10 Trx eller P34H Trx pà återvinning av RNase-aktivitet fràn sRNase efter 24 timmar inkubation vid 37”. 5. i frånvaro av katalytisk tiol §. i närvaro av 100 pM GSH och Q. i närvaro av 10 nM bovint tioredoxinreduktas och 100 pM NADPH. Värdena utgör medeltal från 3 olika experiment.

EXEMPEL 1 EXPERIMENTELLA PROCEDURER.

Material - E.coli stam JF52l (A(lac-proAB), thi. supE, metE46, srl 300: :Tn 10 trxA2 (7004), recA.

(F'(raD36, proAB+,lac ZAM15)) (Langsetmo, K., Fuchs, J., och Woodward, (1989) Biochemistry 28, 3221-3220) hjälpar- fag M13K07, och plasmid pUCll8, Vieira, J., och Messing, J. (1987) Methods Enzymol 153, 3-11) var gåvor från Dr. J.

Fuchs, St Paul, Mn. Mutagenesvärdstammen E.coli CU 9276 (hsdR17, merAB, recA1, A(lac-proAB), (F'traD36, proAB+, 1ac1qZAM15))och testtemplatet och primer för mutagenes- systemet enligt Vandeyar, M.A., Weiner, M.P., Hutton, C.J. och Batt, C.A. (1988) Gene (Amst) 65, 129-133) tillhanda- hölls av Dr. E. Holmgren, KabiGen, Stockholm. Nukleotid- positioner i pUC1l8-trxA-P34H-kartan under schema 2 hänför sig till Yanisch-Perron, C., Vieira, J. och Messing, J. (1985) Gene (Amst) 33, 103-119).

Restriktions- och DNA-modifierande enzymer, M13- vektor-DNA, la-35S]dATP, och andra molekylära biologiska material inköptes från Boehringer Mannheim, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., och Amersham Corp. För eluering av DNA från agaros användes GeneC1ean-kiten av Bio10l. DNA-sekve- neringsutrustning och T7-DNA-polymeras var frán Pharmacia. 5-Brom-4-k1or-3-indoyl-ß-D-galaktosid och isopropyl-l-tio- ß-D-galaktopyranosid, DTNB, och DTT inköptes fràn Sigma.

Tioredoxin av vildtyp renad från E.coli SK3981 (Dyson, H.J., Holmgren, A. och Wright, P.E. (1989) Bio- chemistry 28, 7074-7087), PDI från kalvlever (Hillson, D.A., Lambert, N. och Freedman, R.B. (1984) Methods Enzymol. 107, 281-294, Lundström, J. och Holmgren, A. (1990) J.Biol.Chem. 265, 9114-9120), och tioredoxin- ”l 10 15 20 25 30 35 11 reduktas fràn E.co1i BH 215/pMR13 (Russel, M. och Model, P. (1985) J.Bacterio1. 163, 238-242) och kalvtymus (Luthman, M. och Holmgren, A. (1982) Biochemistry 21, 6628-6633) var homogena beredningar tillgängliga i vàrt laboratorium.

Mutantkonstruktion - Ett 0,5-kilobas HindII-fragment innehållande trxA-genen transfererades från pBHK8 (Wallace, B.J. och Kushner, S.R. (1984) Gene (Amst) 32, 399-408) till M13 mp18 under utnyttjning av SmaI-stället av dess polylinkerregion. Ml3-kloner med rätt insats- orientering identifierades genom dideoxisekvenering.

En 19-mer oligonukleotid med sekvensen 5' CAT TTT GLA x GLA CTG ACC GCA C 3' syntetiserades av Dr. Sune Kvist, Ludwig Institute for Cancer Research, Stockholms-grenen, och fuserades till M13 mp 18-trxA (schema 2). Detaljer be- träffande den oligonukleotidriktade mutagenesen enligt Vandeyar, M.A., Weiner, M.P., Hutton, C.J. och Batt, C.A. (1988) Gene (Amst) 65, 129-133 och screening med avseende pá mutant direkt genom sekvenering, ävensom subklonings- procedurerna resulterande i expressionsplasmiden pUC118- trxA-P34H var såsom tidigare beskrivits (Krause, G. och Holmgren, A. (1991) J.Biol.Chem. 266, 4056-4066). Enkel- strängad DNA erhállen från hybridfagmiden närvarande i schema 2 tjänade som templat för en annan sekvensbekräf- telse för att exkludera sekundära mutationer. Överexpres- sion av mutanttioredoxin i JF521, en trxA-bakgrund, och rening av mutantproteinet utfördes såsom tidigare rappor- terats (Krause, G. och Holmgren, A. (1991) J.Biol.Chem. 266, 4056-4066).

För jämförelses skull visar schema 1 domänstruktur av lever-PDI och aktiv sitehomologi till tioredoxin från E.co1i.

EXEMPEL 2 EFFEKTIV OMVECKNINGSKATALYS MED P34H TRX OCH ETT NYTT OXIDERINGSSYSTEM UNDER ANVÄNDNING AV KATALYTISKA MÄNGDER AV SELENIT I LUFT. 468 480 10 15 20 25 30 35 12 Resultat Oxidativ veckning_av reducerad RNase Fullt reducerad inaktiv RNase med 8 sulfhydrylgrupper användes som substrat vid omveckningsförsök vid en kon- centration av 25 pM. Dessa betingelser användes tidigare av Pigiet och Schuster, 1986, vilka fann att 500 uM E.co1i Trx gav maximal reaktivering av RNase-aktivitet efter 30- 50 timmar inkubation. En koncentration av 25 uM är även 3- 5 gånger högre än det skenbara Km-värdet för RNase för PDI som nyligen rapporterats av Hawkins et al., 1991, och Lyles och Gilbert, 1991. Inkuberingar utfördes vid 37°C vid pH 7,0 i närvaro av 1 mM EDTA i luft. Under dessa be- tingelser observerades ingen signifikant återvinning av RNase-aktivitet efter 6 timmar inkubation med 1 eller 10 uM PDI, 1, 10 eller 100 pM wt Trx eller 1 eller 10 pM P34H Trx, samtliga tillsatta i dess oxiderade tillstånd (data ej visade). Med 100 pM P34H Trx noterades signifikant re- aktivering (15%). Tidigare har det visats, att en disulfid med låg molekylvikt erfordras för reaktivering: Creighton och Freedman, 1980, använde 100 pM GSSG som oxidant vid sina RNase-omveckningsstudier. Såsom visas i Fig. 1 med 100 uM GSSG var återvinning av RNase-aktivitet nu väsent- lig när reaktionerna följdes under 6 timmar. Två slutsat- ser kan dras från dessa data. För det första var PDI den bästa katalysatorn och var ca 100-faldigt aktivare än wt Trx på en molär basis. För det andra och mest väsentligt var P34H Trx aktivare än wt Trx; i själva verket syntes 10 pM P34H Trx vara aktivare än 100 pM wt Trx. Relationen mellan PDI och P34H Trx var även en faktor 10 i aktivitet på molbas. Utbytet av Pro-34 till His i Trx höjde sålunda disulfidisomerasaktiviteten mycket dramatiskt.

Experiment med användning av en non-disulfid oxidant ledde till upptäckten att selenit är användbar. Såsom framgår av Fig. 2 fungerar natriumselenit vid en kata- lytisk konstellation av 1 uM väl som oxidant för PDI även- som för tioredoxiner; det slutliga utbytet vid 6 timmar var likartat experimenten i närvaro av 100 pM GSSG. Se- *r 10 15 20 25 30 35 480 13 lenit är en effektiv oxidant av aktiv-siteditiol i tio- redoxin och befrämjar icke-stochiometrisk oxidation genom redoxcykling med syre i luft (Holmgren och Kumar, 1989; Kumar, Björnstedt, Holmgren, manuskript under framställ- ning). Användning av selenit är sålunda ett sätt att undvika tillsats av en redoxbuffert till systemet. Den relativa effektiviteten av P34H Trx var åter lika med eller större än den för 100 pM wt Trx. Även i detta system var sålunda P34H Trx ca tiofaldigt effektivare än wt tio- redoxin.

Omveckning av scramble-RNase (sRNase) Återvinning av RNase-aktivitet från den inaktiva, slumpvis oxiderade molekylen kräver isomerisering av di- sulfidbindningar genom tiol-disulfidutbyte; detta innebär reduktion- och oxidationcykler. Processen kräver sålunda en tiol, såsom GSH eller DTT, för att initiera reduktion (Creighton och Freedman, 1980). Vi jämförde PDI, wt Trx och P34H Trx under användning av 100 pM GSH som tiol. Un- der dessa betingelser (Fig. 3) uppvisade wt Trx nästan ingen effekt på återvinning av aktivitet vid vare sig lO_ eller 100 pM jämfört med en kontroll utan enzym. I motsats härtill gav P34H Trx väsentlig aktivitet vid 10 uM. Den snabbaste aktiveringen erhölls emellertid med 1 eller 10 pM PDI. Med 100 uM GSH var sålunda P34H Trx aktivare än wt Trx; detta är förmodligen ett uttryck för den högre redox- potentialen (Eo') av P34H Trx. Det är känt, att wt Trx S ej reduceras av 100 pM GSH (opublicerade resultat). 2 Eftersom PDI är ett substrat för mammaliskt tiore- doxinreduktas har vi försökt att använda NADPH och tiore- doxinreduktas som en källa för reducerande ekvivalens för tiol-disulfidutbyte. Såsom framgår av Fig. 4 fungerade 100 pM NADPH och en mycket låg koncentration av tioredoxin- reduktas väl. I teorin är 100 pM NADPH tillräckligt för fullständig reduktion av 25 uM sRNase med 4 disulfider.

Med 10 nM tioredoxin erhölls effektiv återvinning av ribo- nukleasaktivitet. Återvinningen av aktiviteten var snab- 468 48Û 10 15 20 25 30 35 14 bare och generellt högre än med 100 pM GSH. Under dessa betingelser var PDI den bästa katalysatorn åtföljt av P34H Trx. Relationen mellan wt Trx och P34H Trx var även här en faktor av 10, såsom illustreras av den likadana aktiver- ingen med 100 pM Trx och 10 uM P34H (Fig. 4). Med samtliga dessa tre proteiner fungerar sålunda NADPH och tioredoxin- reduktas som en utmärkt källa till reducerande ekvivalens för disulfidutbytet. Syre i luft konsumerar sedan NADPH, men denna procedur har ej studerats. Dessa resultat visar även att det föreligger inget obligatoriskt krav på gluta- tion eller annan liten disulfid, såsom cystamin, vid pro- teindisulfidisomeringsreaktioner.

Slutligtgutbyte av ribonukleasaktivitet Vid alla jämförelser användes en enkel sats av fullt reducerad eller sRNase. Olika satser uppvisade emellertid olika slutlig återvinning av aktivitet varierande mellan 60 och 95%. Detta har noterats av andra (se Hawkins och Freedman, 1991). I en separat serie av experiment användes ett flertal beredningar och vi bestämde det slutliga ut- bytet av aktivt ribonukleas genom avlägsnande av prover vid 2 timmar (data ej visade) och 24 timmar. Med reducerad RNase resulterade enbart exponering till luft under 24 timmar i hög återvinning av aktivitet, speciellt för 100 pM P34H Trx och 10 pM PDI. Av speciell betydelse är det att långa inkubationer med 1 uM selenit helt allmänt re- sulterade i bättre återvinning av aktivitet än med GSSG.

P34H Trx och selenit utgör sålunda ett utmärkt omveck- ningssystem för ett fullt reducerat protein.

Under användning av likadana inkubationer med sRNase (Fig. 6) erhölls i huvudsak ingen återvinning av aktivitet utan tillsats av en reduktant. Tillsatsen av PDI gav emel- lertid låg men signifikant återvinning av aktivitet, möj- ligen beroende på det faktum att eftersom isolerat PDI innehåller ca en fri sulfhydrylgrupp (Lyles och Gilbert, 1991). Under användning av 100 pM GSH återvanns väsentlig aktivitet utan enzym och låga koncentrationer av wt Trx f) 10 15 20 25 30 35 .P- O”\ OO -PI- OD CD 15 uppvisade ingen effekt i jämförelse med P34H Trx och PDI.

Utbytena efter 24 timmar under användning av 100 uM NADPH och 10 nM TR uppvisade en gradvis förhöjning i relativ aktivitet i ordningsföljden wt Trx, P34H Trx och PDI.

Slutsatser Pro-34 till His i tioredoxin är ett effektivt pro- teindisulfidisomeras och katalyserar proteinveckning och bildning av nativ disulfid. Proteinet kan erhållas i homo- gen form i stora kvantiteter frán stammen JF521/pUCll8 trxA P34H och är en användbar lättillgänglig mycket stabil och lämplig katalysator.

Selenit använd aerobiskt i katalytiska mängder liksom 1 pM kan ersätta tidigare använda redoxbuffertar av exem- pelvis GSH och GSSG som en oxidant under omveckning och bildning av disulfider i proteiner katalyserade av PDI eller P34H Trx. Natriumselenit och andra selenderivat är billiga och lättillgängliga. Som reduktant för induktion av tiol-disulfidutbytet involverat i disulfidisomerisering fungerar en låg nivå av tioredoxinreduktas och NADPH väl.

E.coli stam JF 521, innehållande expressionsvektorn pUC1l8-trxA-P34H, har deponerats hos DSM 24 maj 1991 med depositionsnummer 6528.

Claims (16)

468 480 10 15 20 25 30 35 16 PATENTKRAV

1. Tioredoxin innefattande ett redoxaktivt Cys32-X- Pro34-Cys35-ställe (E.coli-numrering) eller ett funktio- nellt derivat därav, vari aminosyraresten Pro i 34-posi- tion has ersatts med His, och vari aminosyraresten X i 33- position är utvald bland Gly och Ala.

2. Tioredoxin enligt patentkravet 1, vari 33-positio- nen upptas av aminosyraresten Gly.

3. Tioredoxin enligt patentkravet 1 eller 2 erhållet från ett naturligt uppträdande tioredoxin genom site-rik- tad mutagenes.

4. Förfarande för produktion in vitro av ett veckat, biologiskt aktivt, disulfidtvärbundet protein, k ä n - n e t e c k n a t därav, att man omsätter ett motsvarande oveckat och reducerat protein med ett tioredoxin eller funktionellt derivat därav, vari Pro i 34-position har er- satts med His, och vari aminosyraresten i 33-position är utvald bland Gly och Ala, resulterande i bildning av nativ disulfid.

5. Förfarande enligt patentkravet 3, vari 33-positio- nen upptas av aminosyraresten Gly.

6. Förfarande enligt patentkravet 4 eller 5, k ä n - n e t e c k n a t därav, att nämnda protein omsättes i närvaro av en katalytisk mängd av en selenit.

7. Förfarande enligt patentkravet 6, vari nämnda se- lenit användes vid en koncentration av från ca 0,1 pM till ca 100 pM, speciellt från ca 0,5 till ca 10 pM.

8. Förfarande enligt patentkravet 4 eller 5, k ä n - n e t e c k n a t därav, att man omsätter nämnda protein i närvaro av en redox buffert, såsom en buffert av redu- cerad och oxiderad glutation, ß-merkaptoetanol eller di- tiotreitol.

9. Förfarande för framställning in vitro av ett veckat, disulfidtvärbundet protein, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man omsätter ett felaktigt veckat prote- in med ett tioredoxin eller funktionellt derivat därav, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari amino- 10 15 20 25 30 35 468 480 17 syraresten i 33-position är utvald bland Gly och Ala i närvaro av en reduktant eller en redox buffert, såsom en buffert av reducerad och oxiderad glutation, ß-merkapto- etanol eller ditiotreitol, resulterande i bildning av na- tiv disulfid.

10. Förfarande enligt patentkravet 9, vari 33-posi- tionen upptas av aminosyraresten Gly.

11. Förfarande enligt patentkravet 9 eller 10, k ä n n e t e c k n a t därav, att man omsätter nämnda protein i närvaro av en katalytisk mängd av en selenit.

12. Förfarande enligt patentkravet 11, vari nämnda selenit användes vid en koncentration av fràn ca 0,1 uM till ca 100 pM, speciellt från ca 0,5 till ca 10 pM.

13. Förfarande för produktion in vivo av ett veckat, disulfidtvärbundet protein, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man omsätter ett motsvarande oveckat och reducerat protein med tioredoxin, ett tioredoxin, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari aminosyra- resten i 33-position är utvalt bland Gly och Ala, eller ett funktionellt derivat därav, eller PDI i närvaro av en katalytisk mängd av en selenit, resulterande i bildning av nativ disulfid.

14. Förfarande för framställning in vitro av ett veckat, disulfidtvärbundet protein, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man omsätter ett felaktigt veckat pro- tein med ett tioredoxin, ett tioredoxin, vari Pro i 34- position ersatts med His, och vari aminosyraresten i 33- position är utvald bland Gly och Ala, eller ett funktio- nellt derivat därav, eller PDI i närvaro av NADPH och ett tioredoxinreduktas och en katalytisk mängd av en selenit, resulterande i bildning av nativ disulfid.

15. Förfarande enligt patentkravet 13 eller 14, vari nämnda selenit användes vid en koncentration av från ca 0,1 uM till ca 100 pM, speciellt från ca 0,5 till ca 10 pM. 10 15 20 25 30 35 468 480 18

16. Förfarande enligt patentkravet 13, 14 eller 15, vari 22-positionen upptas av aminosyraresten Gly. 10 15 20 25 30 35 $> Ch CD /9 REFERENSER Anfinsen, C.B. (1937) Science 181, 223-230 Creighton, T.E. (1990) Biochem.J. 270, 1-16. Creighton, T.E., Hillson, D.A. och Freedman, R.B. (1980) J.Mol.Bio1. 142, 43-62. Dyson, H.J., Gippert, G.P., Case, D.E., Holmgren, Wright, P.E. (1990) Biochemistry 29, 4129-4136. Edman, J.C., Ellis, L., Blacher, R.W., Roth, R.A. Rutter, W.J. (1985) Nature 317, 267-270. Eklund, H., Gleason, F.K. och Holmgren, A. (1991) Proteins, under tryckning. Hawkins, H.C. och Freedman, R.B. (1991) Biochem.J. 275, 335-339. Holmgren, A. (1984) Methods Enzymol. 107, 295-300. Holmgren, A. (1985) Annu.Rev.Biochem. 54, 237-271. Holmgren, A. (1989) J.Biol.Chem. 264, 13963-13966. Holmgren, A och Kumar, S., Proceedings of the 4th Inter- national Symposium on Selenium in Biology and Medicine. Ed. A. Wendels et al., Springer-Verlag, Berlin 1989, 58- 62. Jaenicke, R. (1991) Biochemistry 30, 3147-3161. Lundström, J. och Holmgren, A. (1990) J.Biol.Chem. 265, 9114-9120. Lyles, M.M. och Gilbert, H.F. (1991) Biochemistry 30, 613- 619. Pigiet, V.P. och Schuster, B.J. (1986) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 7643-7647. A. och och f »20 468 4% scHEMA1 PDI 37 388 (v) PhäïaIGIuPhcTyrMaProTz-pcysfilyniscyny lnfauklaProïle Domänstruktur av lever PDI och aktiv-slre-homologi till tioredoxin från E.coli. I domändefinitionen och sekvens- streckningen enligt Edman et al. (1985) symboliserar fyrkanterna regioner om mer än 30% intern sekvenshomologi. Aminosyrasekvenserna i de streckade områdena (i a och a') innehållande de redoxaktiva disulfiderna/ditiolerna är jämförda med motsvarande del av E.co1i tioredoxin. f) i I É *rflï-”fffï 02/ SCHEMA 2 Ä: (2783) Cfr1OI (2255) B: az as :ng wrp ey: sly ars cys nya ua: coon rrx-Pa4a aktíu :ica 5' TGG TGC GGT CLQ TGC AAA ATG 3' 1220 1210 1200 TTT TAC 5' 350 puciia-;;;¿-Pscfl + sträng- _ kartpositiorer mutagenesprimer- 3' cacc _ _w __ ' sekvenseringpositioner CCÅ GIQ ÅCG 360 Konstruktion av P34H-mutanten av E.coli tioredoxin. A fysikalisk karta'av expressionsvektorn pUC118-trxA-P34H. Expression av mutanttioredoxinet erhölls efter induktion av lac-promotern. Insatsorienteringen är identisk med Ml3- templatet som användes för site-riktad mutagenes. Bind- ningsregionerna för universal sekveneringsprimern (S) och mutagenesprimern (M) anges. I B, aminosyra- och nukleotid- sekvenserna av aktiv-site-regionen av E.coli tioredoxin modifierat vid resten 34. De understrukna nukleotidposi- tionerna skiljer sig från vildtypgenen.