SE467308B - Fast yta belagd med ett hydrofilt ytterskikt med kovalent bundna biopolymerer, saett att framstaella en saadan yta och ett konjugat daerfoer - Google Patents

Description

“467 enzymer är därför av intresse för de flesta storskaliga enzymatiska processer.

Vid. behandling av implantat binds en biopolymer till ytan som kommer i kontakt med biologisk vävnad. Biopolymeren, till exempel collagen, underlättar vävnadstillväxt och stimu- lerar cellkolonisering på implantatet, varvid biokompatibili-_ teten ökar. Tekniken kan även utnyttjas för in vitro behand- ling av cellodlingsskálar för att förbättra celladhesion.

Immobilisering av proteiner till såväl organiska som oorganiska ytor är, som ovan nämnts, en väl beprövad teknik idag (se kapitel 4: Principles of Immobilization of Enzymes, Handbook of Enzyme Biotechnology, Edition, Ellis Horwood Limited 1985) och man kan binda in en stor mängd till bibehållande av aktivitet.

Det har emellertid visat sig att de flesta fasta ytor är Second protein ytan med god biologisk så beskaffade, att de spontant adsorberar proteiner och andra biopolymerer. Adsorption i vattenlösning drivs av främst två typer av fysikaliska krafter, elektrostatisk attraktion och hydrofob växelverkan. De flesta ytor är vid normalt pH negativt laddade men innehåller vanligtvis också hydrofoba domäner. Ett protein har vanligtvis både positiva, negativa och hydrofoba säten. flesta dels positiva säten och negativt laddade grupper i ytan, dels Ett protein attraheras därför till de ytor genom elektrostatisk attraktion mellan genom hydrofob växelverkan mellan hydrofoba domäner hos proteinet och hos ytan. Detta är t ex beskrivet i Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, Ed. J.D. Andrade, Plenum Press 1985, Vol. 2, pp 81.

Denna de- Vid fastfasdiagnostik leder den till en försämrad känslighet och en kortare livs- ospecifika adsorption är för ovan nämnda applikationerna ett oönskat fenomen. längdß hos det diagnostiska kitet. Vid såväl extrakorporal terapi som bioorganisk syntes leder spontanadsorptionen till försämrad aktivitet och en kortare livslängd hos produkten.

Ett sätt att drastiskt reducera adsorption av proteiner och andra biopolymerer på fasta ytor är att förse ytorna med 467 308 ett skikt av en oladdad hydrofil polymer. Polyetylenglykol är ett exempel på en polymer som har använts för detta ändamål (se C.-G. Gölander: Preparation and Properties of Functional- ized Polymer Surfaces, Dissertation, Royal Institute of Technology, Stockholm 1986), men också andra ämnen som polysackarider, t ex dextran, cellulosaetrar och stärkelse, polyvinylalkohol, och neutral silikasol har använts för ändamålet.

Genom att täcka ytan. med ett skikt av den oladdade, hydrofila polymeren kan såväl elektrostatisk attraktion som hydrofob växelverkan undvikas.

Ett sätt att införa polyetylenglykolsvansar på en fast polymeryta är att först ursätta ytan för s ]< syraetsning, därefter adsorbera en katjonisk polymer, polyetylenimin, till ytan och slutligen reagera ett reaktivt polyetylenglykol- derivat till tillgängliga aminogrupper i polyetylenimin- skiktet. Detta tillvägagångssätt har beskrivits i Prog.

Colloid Polym. Sci. 74, 113-119 (l987); Vid syraetsningen, som utföres med kaliumpermanganat i koncentrerad svavelsyra, bildas karboxylsyra- och sulfonsyragrupper liksom svavelsyra- estrar på ytan. Till denna starkt negativt laddade polymeryta binds den katjoniska polyetyleniminen mycket starkt genom elektrostatiska krafter. Det är dessutom sannolikt att salt- bindningar mellan aminogrupper i polyetyleniminen och karboxylat- och sulfonatgrupper på ytan vid torkning efter hand övergår till amidbindningar, vilket leder till en ännu stabilare förankring av polyetylenimiden till ytan. Även om .hydrofiliserade ytor framställda med den i artikeln beskrivna metoden ger en förbättrad avvisning av biopolymerer, är ändå adsorptionen därav besvärande hög för ett flertal applikationsområden.

Hydrofiliserade ytor av detta slag är av stort intresse för bl a de ovan nämnda tillämpningarna av immobiliserade proteiner. För att kovalent binda in protein till en sådan yta krävs att man inför reaktiva funktionella grupper i det hydrofila skiktet, vilka kan tjäna som förankringspunkter för proteinet. Det har dock visat sig mycket svårt att åstadkomma kovalent inbindning av protein till väl hydrofiliserade ytor, även om dessa innehåller en hög koncentration reaktiva grupper. Den hydrofila ytan attraherar inte proteinet. Den verkar tvärtom avstötande, eftersom det är energetiskt ofördelaktigt för ett protein i vattenlösning att närma sig en sådan yta. Detta medför att mängden immobiliserat protein vanligtvis blir låg, oavsett om det är fråga om en antikropp för fastfasdiagnostik, ett immunförsvarsstimulerande ämne för extrakorporal terapi eller ett enzym för bioorganisk syntes.

Det finns således både ett behov av förbättrade immobi- liseringsmetoder av biopolymerer till hydrofila skikt och ett behov av att göra det hydrofila skiktet ännu mer välutvecklat för att ge låg spontanadsorption. Ett väl utvecklat hydrofilt skikt försvårar dock införandet av önskvärda biopolymerer.

Enligt uppfinningen har det nu visat sig möjligt att förbättra immobiliseringen av önskvärda biopolymerer och samtidigt erhålla ett välutvecklat hydrofilt skikt med låg spontanadsorption. Enligt uppfinningen uppnås detta genom att man a) bringar ett vattenlösligt konjugat bestående av non- joniska, hydrofila polymerkedjor, vilka är kovalent bundna till en polyetylenimin och åtminstone delvis till biopoly- merer, att reagera med en fast yta med anjoniska grupper, som är reaktiva gentemot aminogruppen, eller b) bringar en fast yta med anjoniska grupper, som är reaktiva gentemot aminogrupper, att reagera med en polyety- lenimin som är substituerad med nonjoniska, hydrofila poly- merkedjor, varefter biopolymeren bringas att reagera med reaktiva grupper hos de nonjoniska, hydrofila polymerkedjorna i närvaro av ett reaktionsmedium med en dielektricitetskon- stant. mindre än 10% av dielektricitetskonstanten för rent vatten, eller c) bringar en fast yta med anjoniska grupper, som är reaktiva gentemot aminogrupper, att reagera med polyetylen- imin, som är substituerad med en nonjonisk, hydrofil polymer- kedja, vilken härrör från en nonjonisk, hydrofil polymer med en grumlingspunkt av minst 50 över den temperatur vid vilken få: 467 308 slutprodukten skall användas och dessutom uppvisar med bio- polymerer reaktiva grupper, varefter biopolymeren kovalent bindes på i och för sig känt sätt till den nonjoniska poly- merens reaktiva grupper i ett vattenbaserat reaktionsmedium vid en temperatur av över 5°C under den nonjoniska, hydrofila polymerens grumlingspunkt i reaktionsmediet.

Genom förfarandet erhålles en fast yta belagt med ett hydrofilt ytterskikt med kovalent bundna biopolymerer och be- stående av nonjoniska hydrofila kedjor, vilka även är bundna till en polyetylenimin, vilka via sina aminogrupper är bundna till anjoniska grupper i den fasta ytan. Genom förfarandet kan hydrofila nonjoniska polymerkedjor lätt införas i en sådan mängd att de utgör minst 50% räknat på polyetylenimin- ens vikt, vilket säkerställer en låg spontanadsorption.

Genom att först bilda det vattenlösliga konjugatet eller polyetyleniminderivatet med hydrofila, nonjoniska polymer- kedjor och låta dessa adsorbera på den negativt laddade ytan erhålles ett tätt och tjockt hydrofilt skikt.

Enligt uppfinningen kan det vattenlösliga konjugatet syntetiseras genom att man först bringar polyetyleniminen att reagera med en nonjonisk, hydrofil polymer, vilken uppvisar grupper som är reaktiva gentemot aminogrupperna. Exempel på sådana grupper är oxiranringar, aldehydgrupper, sulfonsyra- estrar, tresylat, mesylat, tosylat, cyanurklorid, karbonyl- imidazol och aktiva karboxylsyraestrar. Förhållandet mellan reaktiva aminogrupper i polyetyleniminen och reaktiva grupper i den nonjoniska polymeren anpassas så att den senare bindes med ett lågt antal bindningar.

Ett alternativt sätt att föra in hydrofila, nonjoniska polymerkedjor på polyetyleniminen är att till den senare anlagra etylenoxid eller etylenoxid och propylenoxid, buty- lenoxid och/eller tetrahydrofuran, till önskad kedjelängd. I det fall att en sampolymerisation utföres kan reaktanterna anlagras slumpvis eller i block eller en kombination därav.

Efter avslutad alkoxilering överföres terminala hydroxyl- grupper till någon av de ovan nämnda reaktiva grupperna. -_l..\...

O'\ NZ! (N CT! CO Biopolymeren bindes sedan på i och för sig känt sätt till polyetyleniminderivat genom reaktion mellan reaktiva grupper på de hydrofila, nonjoniska polymerkedjorna och funk- tionella grupper på biopolymeren. Antalet biopolymerer som inbindes per hydrofil, nonjonisk polymerkedja kan variera inom vida gränser beroende på typ av biopolymer och hydrofil, nonjonisk polymer samt på önskad grad av immobilisering.

Vanligtvis uppvisar minst 5% av de hydrofila polymerkedjorna kovalent bundna biopolymerer. I det fall att de nonjoniska, hydrofila polymerkedjorna kan ha tvâ eller flera med bio- polymeren reaktiva grupper, till exempel i det fall de är härledda från cellulosaetrar, kan antalet kovalent bundna biopolymerer per kedja vara mer än ett. Många sådana kopp- lingsreaktioner såsom för finns Chem.

Inbindningen av biopolymererna biopolymerer, proteiner beskrivna i litteraturen, till exempel Phys. 25 (1985) p. 325-373. utföres vanligtvis i vatten som reaktionsmedium och under- i Marcomol. lättas av det faktum att polyetyleniminderivatet är löst i vattnet och inte påförd en fast yta. Det är enligt upp- finningen även möjligt att ytterligare underlätta immobili- seringen genom att införa den i en sådan reaktionsmiljö och under sådana betingelser som beskrives i framställnings- alternativen b) detalj. Efter reaktiva grupper på de hydrofila, nonjoniska polymerkedjorna och c) och som längre fram beskrives i avslutad kvarvarande inbindning utreageras på lämpligt sätt, exempelvis genom reaktion med 2-merkapto- etanol och 2-aminoetanol, varvid erhålles ett vattenlösligt konjugat som är väl lämpat att pâföras en fast yta med anjoniska grupper.

Inbindningen av biopolymererna kan även ske genom att den hydrofila, nonjoniska polymeren först kopplas till bio- polymeren, varefter den bildade produkten på analogt sätt som ovan omsättes med polyetyleniminen.

Vid inbindning av proteiner och peptider utnyttjas lämp- ligen amino-, tiol- eller fenoliska hydroxylgrupper som genom attack elektrofila, grupper i ändarna på polyetylenglykolkedjorna. en nukleofil reagerar med reaktiva Exempel på Is (I , 467 ans sådana grupper är epoxider, aldehyder, sulfonsyraestrar, såsom tresylat, mesylat och tosylat, cyanurklorider, karbo- nylimidazoler och karboxylsyraestrar. Glykoproteiner och kolhydrater kan bindas in på omvänt sätt, genom att lämpliga grupper, såsom aminogrupper införs på ändarna av' polyety- lenglykolkedjorna och att dessa bringas att reagera med alde- hydgrupper eller karboxylsyragrupper som ursprungligen finns eller som till exempel genom perjodatoxidation genereras i polysackariden. Denna metodik är beskriven i det amerikanska patentet 4 217 338.

Det bildade lösliga konjugatet bringas sedan att adsorbera till en negativt laddad fast yta. Exempel på lämp- liga ytor är de som har en naturlig negativ nettoladdning, till exempel silika och glas, eller sådana där negativa ladd- ningar har genererats på kemisk eller fysikalisk väg. Nega- tiva laddningar kan induceras på organiska polymerytor till exempel genom syraetsning, d xr s behandling med kaliumper- manganat i koncentrerad svavelsyra, eller genom plasma- eller strålningsinducerad ympning av en anjonisk komponent som akrylsyra eller metakrylsyra. Exempel på organiska polymerer lämpliga för detta ändamål är polystyren, polyvinylklorid, polyeten, polymetylmetakrylat, polykarbonat, polysulfon och cellulosaacetat.

Förfarandet att immobilisera en biopolymer till en yta genom att först binda den i lösning till en vattenlöslig polymer och sedan adsorbera det lösliga konjugatet till ytan har beskrivits tidigare. Inbindning till bovint serum albumin är en teknik som kommer till viss användning för proteiner och peptider och i PCT/SE 88/00243 beskrivs användning av en hydrofoberad, vattenlöslig polymer, speciellt hydrofoberad, oladdad polysackarid, för detta ändamål. Föreliggande upp- finning beskriver emellertid en ny och förbättrad princip.

Genom att biopolymeren bringas att bindas till ytan via ett tätt skikt av hydrofila, nonjoniska polymerkedjor erhålls en oladdad, hydrofil bakgrundsyta till vilken ospecifik adsorp- tion sker i mycket ringa omfattning, samtidigt som biopoly- meren, förankrad på spacerarmar, som när långt in i vatten- $> ON *J _ympsampolymeren. mellan hydrofila, (LN (ff) Ci) fasen, har' hög tillgänglighet till exempel för antikropp- antigen-reaktioner. n Skiktet mycket tätt enligt föreliggande förfarande och är betydligt av hydrofila, nonjoniska polymerkedjor blir tätare än vad som uppnås vid direkt inbindning av hydrofila, nonjoniska polymerer till en fast yta. Svårigheten att få ett tätpackat hydrofilt skikt ligger i att de enskilda hydrofila, nonjoniska polymererna repellerar varandra. Samma repulsion finns givetvis även då polyetylenimin omsätts med hydrofila, nonjoniska polymerderivat i lösning. Genom att först generera nonjoniska polymerer och polyetylenimin i lösning, därefter binda in biopolymeren samt slutligen adsorbera detta konjugat med polyetyleniminen ned mot den fasta ytan tvingas emellertid alla hydrofila, non- joniska polymerkedjor - både de som har bundit in biopoly- meren och de som har en fri ändgrupp - över mot vattensidan.

I det tvådimensionella perspektivet blir då antalet av de hydrofila, nonjoniska polymerkedjorna mot vattnet dubbelt så stort som då konjugatet var löst i vatten.

Det är enligt uppfinningen även möjligt att först be- lägga den fasta ytan med anjoniska grupper med det ovan beskrivna polyetyleniminderivatet, som utgöres av en polyety- lenimin, som är substituerad med nonjoniska, hydrofila poly- merkedjor, och därefter inbinda biopolymererna via reaktiva grupper i de nonjoniska, hydrofila polymerkedjorna. Vid denna metodik sker inbindningen i närvaro av ett reaktionsmedium med en dielektricitetskonstant mindre än 10%, företrädesvis mindre än 5%, av dielektricitetskonstanten för rent vatten. I det fall att de nonjoniska, hydrofila polymerkedjorna härrör från en nonjonisk, hydrofil polymer med en grumlingspunkt av minst 50 över den temperatur vid vilken slutprodukten skall användas kan biopolymererna även inbindas i ett vattenbaserat reaktionsmedium vid en temperatur av över 50 under den non- joniska, hydrofila polymerens grumlingspunkt i reaktions- mediet. De ovan beskrivna metoderna att införa biopolymerer finns beskrivna i. de svenska patentansökningarna 9002909-1 respektive 904397-8. u 'I 9 467 308 En speciellt föredragen form av reaktionsmedium med låg dielektricitetskonstant utgöres av en mikroemulsion. Mängden vatten i mikroemulsionen utgör vanligtvis 0,5-25 viktprocent, företrädesvis 1-15 viktprocent. _ Det opolära reaktionsmediet och den hydrofoba komponen- ten i mikroemulsionen är vanligtvis ett alifatiskt kolväte som hexan eller nonan eller en bredare destillationsfraktion som petroleumeter 60-80. I mikroemulsionen utgör den hydro- foba komponenten vanligtvis 63-98,5 viktprocent.

Den ytaktiva komponenten utgöres vanligtvis av en kombination av en ytaktiv förening och en s k hjälptensid.

Det ytaktiva ämnet kan vara anjoniskt, katjoniskt, amfotärt eller nonjoniskt, medan hjälptensiden vanligtvis är en alkohol eller en lågmolekylär alkylenoxidaddukt. Exempel på vanliga substanser av denna typ är butanol, pentanol, hexanol, etylenglykolmonobutyleter och dietylenglykolmono- butyleter. Mängden ytaktiv komponent är vanligtvis . 0,5-20 viktprocent av mikroemulsionens vikt.

Det har visat sig speciellt fördelaktigt att använda en ytaktiv förening, som kan bilda mikroemulsioner utan närvaro av hjälptensid. Ytaktiva föreningar som har denna förmåga är vissa nonjoniska föreningar, vilka som hydrofil grupp har en polyalkylenglykolkedja framställd genom polymerisation av etenoxid eller av kombinationer av etenoxid och propen- och/eller butenoxid, samt vissa joniska föreningar som har den joniska, hydrofila gruppen i en icke-terminal position på kolvätekedjan.

När det gäller nonjoniska tensider är en polyetenglykol- kedja föredragen som hydrofil del och polyetylenglykolkedjans längd är i det mest föredragna fallet mellan 3 och 8 etylen- oxienheter i genomsnitt. Den hydrofoba delen kan härröra från hydroxylföreningar eller karboxylföreningar, vilka innehåller en alkylkedja bestående av 8-20 kolatomer eller av en alkyl- arylgrupp bestående av totalt 9-24 kolatomer. Exempel på sådana föreningar är etylenoxidaddukter av nonylfenol, oktyl- fenol och fettalkoholer, 4> Cm LN CD OG 10 När det gäller joniska tensider är anjoniska grupper sulfat, fosfat föredragna. Sulfonat är speciellt föredraget. Eventuellt kan såsom sulfonat, karboxylat, och fosfonat dessa tensider även innehålla alkylenoxigrupper såsom etylen- oxid som kopplingselement mellan den anjoniska gruppen och den hydrofoba gruppen. Den hydrofoba delen kan utgöras av en alkylkedja bestående av 10-22 kolatomer eller av en alkyl- arylgrupp bestående av totalt 9-24 kolatomer. Enstaka eter-, ester- eller amidbindningar kan finnas i den hydrofoba delen.

Exempel på lämpliga joniska föreningar är di(2-etylhexyl)sul- fosuccinat och karboxymetylerade nonylfenoletoxilat inne- hållande 1-4 etylenoxigrupper.

Som ovan sagts kan man även utnyttja det ovanliga tem- peraturberoendet som vissa nonjoniska vattenlösliga polymerer uppvisar och utföra immobiliseringen av biopolymererna i vattenmiljö. Sålunda uppvisar polyalkylenglykoler och non- joniska cellulosaetrar avtagande vattenlöslighet vid förhöjd temperatur. Mekanismen bakom detta temperaturberoende är fortfarande omdiskuterat men mycket pekar på att etylenoxid- gruppernas konformation ändras i samband med att temperaturen ökar, vilket medför att de får ökad hydrofob karaktär och därmed minskad löslighet i vatten. Vid en viss temperatur är polymerernas vattenlöslighet så låg, att lösningen fassepa- kallas grumlingspunkt. Såväl polyalkylenglykoler som cellulosaetrar kan framställas med rerar. Denna temperatur allmänt för lösningens definierade grumlingspunkter och speciellt lämpliga att använda är de polymerer, 30-1oo°c, polymeren som har grumlingspunkter i intervallet företrädesvis 30-5o°c. Den hyarafila skall hydrofil vid den temperatur, där den med protein belagda ytan användes. Den väljes på ett sådant sätt, att grumlingspunkten nonjoniska vara är minst SOC, företrädesvis minst l0OC över den belagda ytans användningstemperatur. Föredragen temperatur vid immobilise- ringen av proteinet är från BOC under den nonjoniska hydro- fila polymerens flockningstemperatur i reaktionsmediet till 5o°c. ,¿¿ 'l 11 467 sne Exempel på lämpliga polyalkylenglykoler är sådana, där etylenoxid och alkylenoxider med 3-4 kolatomer eller tetra- hydrofuran är slumpvis anlagrade eller anlagrade i block.

Speciellt lämpliga är polyalkylenglykoler med en molekylvikt av 2.000-10.000, som innehåller en eller flera block av polyoxipropylen och polyoxietylen med en molekylvikt av 306-3.000. Andra typer av lämpliga polyalkylenglykoler är addukter av etylenoxid i kombination med högre alkylenoxider eller tetrahydrofuran med en dihydroxi- eller polyhydroxi- förening, såsom glycerol eller pentaerytritol.

Cellulosaetrarna har lämpligen en sådan polymerisations- grad, att en 1%-ig vattenlösning därav har en viskositet av l0-10.000 cP, företrädesvis 30-5.000 cP, mätt enligt Brookfield, LV, 12 rpn1 vid 20OC. De kan uppvisa hydrofoba kolvätegrupper, såsom metyl-, etyl-, propyl-, butyl-, benzyl- och högre kolvätegrupper med 8-24 kolatomer, eller polära hydroxylgrupper, såsom hydroxietyl, hydroxipropyl och hydroxibutyl, eller blandningar av kolvätegrupper och polära grupper. Exempel på lämpliga cellulosaetrar är metylcellu- losa, etylcellulosa, hydroxietylcellulosa, hydroxipropyl- cellulosa, metylhydroxietylcellulosa, metylhydroxipropyl- cellulosa, etylhydroxietylcellulosa och benzyletylhydroxi- etylcellulosa. Alkylhydroxialkylcellulosa är föredragna cellulosaetrar.

Polyetyleniminen med de hydrofila polymerkedjorna består lämpligen av ett polyetyleniminskelett med en molekylvikt av 10 000 - 1000 000, företrädesvis från 50 000 till 500 000, vilket till minst 90 viktprocent är uppbyggt av enheterna -C2H4NH-, C2H4N och -C2H4NH2, där företrädesvis mindre än 20% av antalet imino- och aminogruppernas reaktiva väten är substituerade med hydrofila polymerkedjor och eventuellt andra substituenter, såsom alkylgrupper, hydroxylgruppinne- hållande grupper, som utnyttjas vid inympning av de hydrofila polymerkedjorna. De hydrofila polymerkedjorna härstammar lämpligen från nonjoniska alkylenoxidaddukter såsom poly- etylenglykol eller slumpvis anlagrade eller blockanlagrade polyalkylenglykoler mellan etylenoxid och alkylenoxider med 4> (IQ (AI) OO 12 3-4 kolatomer eller tetrahydrofuran. Andra typer av alkylen- oxidaddukter är addukter av etylenoxid, eventuellt i kombina- tion med högre alkylenoxider eller tetrahydrofuran, med en dihydroxi- eller polyhydroxiförening, såsom glycerol och pentaerytrinol. Polysackarider, såsom dextran och stärkelse; cellulosaetrar, såsom metylcellulosa, metylhydroxipropyl- cellulosa eller etylhydroxietylcellulosa; och polyvinylalko- De hydrofila polymerkedjorna är vattenlösliga och deras molekylvikt är vanligtvis från 400 till 200 000, till 100 000.

Föreliggande hol är andra lämpliga hydrofila polymerer. företrädesvis från l 000 uppfinning àskådliggöres ytterligare av nedanstående exempel.

Exemgel 1 En polyetenplatta med dimensionen 2 x 2 cm tvättades i 70%-ig etanol under 3 minuter i ultraljudsbad. Plattan luft- sekunder i 2 g/1 KMnO4/HZSO4. Plattan sköljdes med destillerat vatten.

En lösning innehållande 5% humant albumin och 10% av en torkades och oxiderades sedan 30 epoxiderad polyetylenglykol (PEG), erhållen genom att anlagra 320 etylenoxidenheter till di(trimetylolpropan), fick reagera i 15 h vid 30°C vid pH 7.0, varefter pH justerades till 9.5 med natriumhydroxid. Polyetylenimin (PEI) tillsattes till en slutkoncentration av 0.07% och fick reagera vid 45OC under omrörning. Efter 2.5 h lades polyetenplattan ned i lösningen och albumin-PEG-PEI-komplexet fick adsorbera 2 h vid 40oC.

Parallellt syntetiserades enbart PEG-PEI-addukten enligt ovan och en polyetenplatta hydrofiliserades. Oreagerade epoxider utreagerades med merkaptoetanol. Till den utreagera- de PEG-PEI-addukten sattes även albumin och sampolymeren med fritt albumin fick adsorbera till en polyetenplatta. Tjock- leken hos PEG-skiktet bestämdes med ellipsometri till 27 nm.

Härvid uppmättes först tjockleken för ett skikt av enbart PEI och för PEG-PEI-skiktet, herades från det senare. varefter det förra värdet subtra- W 467 508 13 Mängd inbunden albumin detekterades med hjälp av ELISA- teknik med peroxidas-konjugerade antikroppar mot albumin.

Mängden adsorberat protein är proportionell mot adsorbansen vid 490 nm. Följande resultat erhölls.

PEG/PEI, Prov OD 495 nm viktprocent Immobiliserad albumin enligt uppfinningen 1.266 78 Kontroll, utan albumin 0.054 78 Kontroll, med albumin 0.178 78 Resultaten visar att plattan enligt uppfinningen har en hög halt albumin och att det hydrofila skiktet har en låg spontanadsorption av biopolymer.

Exempel 2 En 96-håls mikroplatta i polystyren ympades med kroton- syra under gamma-bestrâlning.

En lösning innehållande 0,07% polyetylenimin och 10% av en tresylerad polyetylenglykol med. molekylvikt 7 000 fick reagera under 2 h vid 37OC vid pH 9.0. Immunoglobulin G (IgG) tillsattes till en koncentration av 1% och fick reagera ytterligare 3 h vid 37oC. Lösningen dispenserades upp i mikroplattan och fick adsorbera under 2 h vid 40OC.

Parallellt syntetiserades enbart PEG-PEI-addukten enligt ovan och en mikroplatta hydrofiliserades. Oreagerade tresylat- grupper utreagerades med 1 M natriumhydroxid.

Mängd inbunden IgG detekterades med hjälp av ELISA- teknik med peroxidas-konjugerade antikroppar mot IgG. Följ- ande resultat erhölls.

PEG/PEI, Prov OD 495 nm viktprocent Immobiliserad IgG enligt uppfinningen 0.983 80 Kontroll, utan IgG 0.026 80 "467 CN CD (30 14 Resultaten visar en hög immobilisering av IgG och en låg spontanadsorption till det hydrofila skiktet.

Exempel 3 En PVC-platta med dimensionen 2 x 6 cm aktiverades på samma sätt som polyetenplattan i Exempel 1.

En lösning innehållande 2% fibrinogen och 5% av en blockpolymer av etenoxid och propenoxid med en grumlingspunkt av 35OC och försedd med epoxidgrupper i båda ändarna fick reagera i 8 h vid 37oC vid pH 7.0. Därefter justerades pH till 9.5 med natriumhydroxid och polyetylenimin (PEI) till- sattes till en slutkoncentration av 0.03%. Reaktionen fick pågå vid 45°C under 2.5 h under omrörning. Därefter neddoppa- des den. aktiverade .PVC-plattan i. lösningen och fibrinogen- blockpolymer-PEI-komplexet fick adsorbera vid 40oC under l h.

Som referenser användes en PVC-platta hydrofiliserad med blockpolymer-PEI-addukten utan protein i vilken kvarvarande epoxidgrupper utreagerades genom l h behandling med lM HClO4.

Tjockleken på blockpolymerskiktet bestämdes med ellipsometri till 30 nm. Härvid uppmättes först skikttjocklekarna för PEI- skiktet blockpolymer-PEI-skiktet förra värdet subtraherades från det senare. respektive varefter det Mängden inbunden fibrinogen detekterades med hjälp av ELISA-teknik med peroxides-konjugerade antikroppar mot fibrinogen.

Blockpolymer/PEI, Prov OD 495 nm viktprocent Immobiliserad fibrinogen enligt uppfinningen 1.605 75 Kontroll, utan fibrinogen 0.070 75 Resultaten visar en hög immobilisering av fibrinogen och en låg spontanadsorption. ua I?

Claims (15)

-467 508 15 PATENTKRAV

1. Sätt att framställa en fast yta belagd med ett hydrofilt ytterskikt med kovalent bundna biopolymerer och bestående av nonjoniska polymerkedjor, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man a) bringar ett vattenlösligt konjugat bestående av non- joniska, hydrofila polymerkedjor, vilka är kovalent bundna till en polyetylenimin och åtminstone delvis till biopoly- merer, att reagera med en fast yta med anjoniska grupper, som är reaktiva gentemot aminogruppen, eller b) bringar en fast yta med anjoniska grupper, som är reaktiva gentemot aminogrupper, att reagera med en polyety- lenimin som är substituerad med nonjoniska, hydrofila poly- merkedjor, varefter biopolymeren bringas att reagera med reaktiva grupper hos de nonjoniska, hydrofila polymerkedjorna i närvaro av ett reaktionsmedium med en dielektricitetskon- stant mindre än 10% av dielektricitetskonstanten för rent vatten, eller c) bringar en fast yta med anjoniska grupper, som är reaktiva gentemot aminogrupper, att reagera med polyetylen- imin, som är substituerad med en nonjonisk, hydrofil polymer- kedja, vilken härrör från en nonjonisk, hydrofil polymer med en grumlingspunkt av minst 50 över den temperatur vid vilken slutprodukten skall användas och dessutom uppvisar med bio- polymerer reaktiva grupper, varefter biopolymeren kovalent bindes på i och för sig känt sätt till den nonjoniska poly- merens reaktiva grupper i ett vattenbaserat reaktionsmedium vid en temperatur av över SCC under den nonjoniska, hydrofila polymerens grumlingspunkt i reaktionsmediet.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att biopolymeren är ett protein eller en peptid, som via en amino-tiol- eller fenolisk hydroxylgrupp bindes till en epoxidgrupp, en aldehydgrupp, en sulfonsyraestergrupp, en cyanurkloridgrupp, en karbonylimidazolgrupp eller en karboxylsyraestergrupp i de hydrofila, nonjoniska polymer- kedjorna. 16

3. Sätt enligt krav 1, att biomolekylen är ett kolhydrat eller en biopolymer inne- hållande kolhydratrester, k ä n n e t e c k n a t därav, vilka via en eller befintlig genererad aldehydgrupp eller karboxylsyragrupp bindes till en NH2-grupp i den hydrofila, nonjoniska polymerkedjan.

4. Sätt enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k - n a t därav, att polyetyleniminen har en molekylvikt av 10 000 - 100 000 och att de hydrofila, nonjoniska polymer- kedjorna är kedjor av alkylenoxidaddukter eller cellulosa- etrar med en molekylvikt av 400 - 200 000, varvid mängden av de hydrofila, nonjoniska polymerkedjorna är minst 50 vikt% av polyetyleniminens vikt.

5. Sätt enligt något av kraven 1-4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att den fasta ytan utgöres av polystyren, poly- vinylklorid, polyeten, polymetylmetakrylat, polykarbonat, polysulfon eller cellulosaacetat, som är aktiverad med karboxylgrupper eller aldehydgrupper, vilka bringas att reagera med aminogrupper hos det vattenlösliga konjugatet eller med aminogrupper hos polyetyleniminderivatet.

6. En fast yta belagd med ett hydrofilt ytterskikt med kovalent bundna biopolymerer och bestående av nonjoniska polymerkedjor, k ä n n e t e c k n a d därav, att de non- joniska polymerkedjorna även är kovalent bundna till en polyetylenimin, vilken i sin tur är bunden till den fasta ytan, som är försedd med anjoniska grupper, som är reaktiva gentemot aminogrupper, varvid vikten av de nonjoniska poly- merkedjorna är minst 50% av polyetyleniminens vikt.

7. Fast yta enligt krav 6, k'ä n n e t e c k n a d därav, att biopolymeren är ett protein, som via en amino-tiol- eller fenolisk hydroxylgrupp bindes till en epoxidgrupp, en aldehydgrupp, en sulfonsyraestergrupp, en cyanurkloridgrupp, en karbonylimidazolgrupp eller en karboxylsyraestergrupp i de hydrofila, nonjoniska polymer- kedjorna. f! 467 308 17

8. Fast yta enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a d därav, att biopolymeren innehåller kolhydratrester, vilka via en befintlig eller genererad aldehydgrupp eller karboxylsyra- grupp bindes till en NH2-grupp i den hydrofila, nonjoniska polymerkedjan.

9. Fast yta enligt något av kraven 6-8, k ä n n e - t e c k n a d därav, att polvetyleniminen har en molekylvikt av 10 000 - 100 000 och att de hydrofila, nonjoniska polymer- kedjorna är kedjor av alkylenoxidaddukter eller cellulosa- etrar med en molekylvikt av 400 - 200 000, varvid mängden av de hydrofila, nonjoniska polymerkedjorna är minst 50 vikt% av polyetyleniminens vikt.

10. Fast yta enligt något av kraven 6-9, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den fasta ytan utgöres av polystyren, polyvinylklorid, polyeten, polymetylmetakrylat, polykarbonat, polysulfon eller cellulosaacetat, som är aktiverad med karboxylgrupper eller aldehydgrupper, vilka bringas att reagera med aminogrupper hos det vattenlösliga konjugatet eller med aminogrupper hos polyetylenimin- derivatet.

11. ll. Vattenlösligt konjugat, k ä n n e t e c k n a t därav, att det består av nonjoniska, hydrofila polymerkedjor, vilka är kovalent bundna till polyetylenimin och åtminstone delvis till biopolymerer.

12. Vattenlösligt konjugat enligt krav ll, k ä n n e - t e c k n a t därav, att de hydrofila, nonjoniska polymer- kedjornas vikt är minst 50% av polyetyleniminens vikt.

13. Vattenlösligt konjugat enligt krav 11 eller 12, k ä n n e t e c k n a t därav, att biopolymeren är ett protein eller en peptid, som via en amino-tiol- eller fenolisk hydroxylgrupp bindes till en epoxidgrupp, en alde- hydgrupp, en sulfonsyraestergrupp, en cyanurkloridgrupp, en karbonylimidazolgrupp eller en karboxylsyraestergrupp i de hydrofila, nonjoniska polymerkedjorna. CA! -..j CO 18

14. Vattenlösligt konjugat enligt krav ll och 12, k ä n n e t e c ]< n a t därav, att biopolymeren är ett kolhydrat eller en biopolymer innehållande kolhydratrester, vilka via en befintlig eller genererad aldehydgrupp eller karboxylsyragrupp bindes till en NH2-grupp i den hydrofila, nonjoniska polymerkedjan.

15. Vattenlösligt konjuqat enligt något av de tidigare kraven ll-14, att poly- etyleniminen har en molekylvikt av 10 000 - 100 000 och att de hydrofila, k ä n n e t e c k n a t därav, nonjoniska polymerkedjorna är kedjor av .alkylenoxidaddukter eller cellulosaetrar med en molekylvikt av 400 - 200 000, varvid mängden av de hydrofila, nonjoniska polymerkedjorna är minst 50 vikt% av polyetyleniminens vikt. åh'