SE455949B - Sett att diagnostisera kikhosta med ett pertussistoxinkensligt kromatoforhaltigt fiskfjell - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 455 949 2 (ed.) International Symposium on pertussis. US Depart- ment of Health, Education and Welfare. Bethesda, Md. p 3-18). §§r9l9¶i§1s_fߧ§9§ Det finns ett flertal serologiska metoder för diagnostisering av kikhosta som alla bygger på detekte- ring av specifik antikroppsrespons mot kikhostebakterien eller mot proteiner som alstras av kikhostebakterien.

Den för närvarande känsligaste metoden utnyttjar ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), varvid det av kikhostebakterien alstrade FHA (fimbrialt hemag- glutinin) användes som antigen (Granström, M., Granström, G., Lindfors, A. and Askelöf, P. 1982.

Serologic diagnosis of whooping cough by an enzyme- -linked immunosorbent assay using fimbrial hemagglu- tinin as antigen. J. Inf. Dís. 146: 741-745).

Vid denna metod uppgår känsligheten till 96% och metoden är den som för närvarande är det känsligaste sättet att diagnostisera kikhosta. Nackdelen med denna metod är att den i de flesta fall kräver två blodpro- ver tagna med flera veckors mellanrum för att påvisa en eventuell ökning av de specifika antikropparna.

En sådan ökning av de specifika antikropparna indike- rar att patienten har en pågående infektion. Diagnosen kan allstå ställas med relativt stor säkerhet, men någon behandling av värde för patienten (till exempel antibiotika) är det i allmänhet för sent att påbörja när diagnosen fastställts.

Det föreligger alltså ett stort behov av ett sätt att diagnostisera kikhosta som är känsligt och går att utföra på relativt kort tid för att uppkomst av epidemier skall kunna förhindras och för att en behandling av värde för patienten (till exempel anti- biotika) skall kunna ges i ett tidigt skede av sjuk- domsförloppet. 10 15 20 25 30 35 s; 455 949 3 Ändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett sådant sätt att diagnostisera kikhosta som är känsligt och går att utföra på relativt kort tid samt en testsats för utförande av sättet.

Beskrivning av uppfinningen I en aspekt av uppfinningen åstadkommes ett helt nytt sätt att diagnostisera kikhosta, vilket sätt genomföres så U att ett prov av kroppsvätska (sputum, nasofarynx- sekret, saliv eller blod) från en patient inkuberas med åtminstone en del av ett pertussistoxinkänsligt, kromatoforhaltigt fiskfjäll under en förutbestämd, lämplig tidsperiod, att fiskfjällsfärgen därefter en första gáng observeras visuellt, eventuellt med hjälp av mikroskop, att en substans som inducerar färgförändring hos fiskfjället tillsättes, att fiskfjällsfärgen sedan en andra gäng observeras visuellt, eventuellt med hjälp av mikroskop, och att den första observerade fiskfjällsfärgen jäm- föres med den andra observerade fiskfjällsfärgen, varvid utebliven eller ringa färgförändring indikerar förekomst av pertussistoxin i provet av kroppsvätska.

Fiskfjäll som innehåller kromatoforer kan förändra sin färg. När pigmentkornen i kromatoforerna är ihop- dragna till mitten av cellen är fjällen ljusare än när de inte är ihopdragna. Denna ihopdragning kan åstadkommas på konstgjord väg genom tillsats av sub- stanser som inducerar färgförändring hos fiskfjället.

Pertussistoxin kan inhibera sådana substansers verkan på kromatoforerna, varigenom den förväntade färgför- ändringen uteblir om pertussistoxin först fått inverka pà kromatoforerna.

Nästan alla fiskar tros ha pertussistoxin-känsliga, kromatoforhaltiga fiskfjäll. Det är dock fördelaktigt att välja sådana fiskfjäll för uppfinningens ändamål som ger så tydliga färgförändringar att de kan observeras med blotta ögat. Exempel på sådana fiskar är: 10 15 20 25 30 35 455 949 Embiotoca jacksoni, Brachyistius frenatus, Gíbbonsia montereyensis, Hepsopsietta Guttulata, Holocentrus-sp, och framför allt läppfiskar (Labridae) såsom Blágylta (Labrus ossifagus), Berggylta (Labrus berggylta), Seniorita (Oxyjulis californica), Rock wrasse (Halichoeres semicinctus).

I en föredragen utföringsform av sättet enligt uppfinningen utgörs substansen som inducerar färgföränd- ring hos fiskfjället av en katekolamin, till exempel adrenalin eller noradrenalin, och fiskfjället som användes härstammar från en läppfisk (Labridae) till exempel blågylta (Labrus ossifagus). I exemplen som följer har fiskfjäll från blàgylta använts, beroende på att kromatoforerna i dessa är melanoforer som mycket tydligt och snabbt ger färgförändring vid sättet enligt uppfinningen.

Provet av kroppsvätska spädes företrädesvis 20 ggr med buffert innan det inkuberas med åtminstone en del av fiskfjället. Vid diagnostiseringssättet enligt uppfinningen behövs endast en liten del av ett fisk- fjäll, men i praktiken kommer man antagligen att ut- nyttja hela fiskfjäll av praktiska skäl. Inkuberings- temperaturen och tiden är ej kritiska. Om en låg tempe- ratur användes krävs en längre inkuberingstid för att eventuell färgförändring hos fiskfjället skall ske. Dessutom är dessa två parametrar beroende av den använda fiskfjällstypen. När fiskfjäll från blàgylta användes har en inkuberingstid av 30 min vid en tem- peratur av 37°C befunnits vara lämplig.

Fiskfjällsfärgen och förändringen därav beror på de specifika kromatoforerna i det använda fisk- fjället och i många fall kan en sådan färgförändring uppfattas med blotta ögat,_men i vissa fall erhålles 10 15 20 25 30 35 ' 455 949 5 säkrare resultat om färgen och färgförändringen ob- serveras i mikroskop. Mikroskopet kan vara utrustat med en fotocell, i vilket fall färgtonsförändringen kan registreras optoelektriskt och därmed objektivt.

Föreliggande sätt att diagnostisera kikhosta är det hittills känsligaste sättet, och med hjälp av sättet har man nu för första gången kunnat konstate- ra att det förekommer pertussistoxin i nasofarynx- sekret och sputum hos en infekterad patient. Sättets enligt uppfinningen känslighet för pávisande av ren- framställt pertussistoxin har konstaterats vara i området pikogram-femtogram/milliliter, vilket kan jämföras med den känslighet som kan fås med enzyme- -linked immunosorbent assay (ELISA), vilken är i omrâdet 1-10 nanogram/milliliter.

I en annan aspekt av uppfinningen åstadkommes en testsats för diagnostisering av kikhosta. Testsat- sen omfattar fyra, separat förpackade lösningar, nämligen a) en lösning av specifika antikroppar mot per- tussistoxin, b) en lösning av väsentligen rent pertussistoxin, c) en näringslösning innehållande åtminstone ett pertussistoxin-känsligt, kromatoforhaltigt fiskfjäll, och d) en lösning av en substans som inducerar färg- förändring hos den typ av fiskfjäll som finns i lösning c).

Lösningarna a)-d) är vattenbaserade och de kan innehålla konventionella tillsatser såsom konserve- ringsmedel, t ex natriumazid eller metiolat, glycerol för att möjliggöra fryspunktssänkning, och/eller buf- fertar, t ex Tris-buffert eller fosfatbuffert.

Förutom de ovan angivna lösningarna a)-d) krävs naturligtvis för diagnostiseringen ett prov av kropps- vätska från en patient. 10 15 20 25 30 35 455 949; 6 Lösningen a) av specifika antikroppar mot per- tussistoxin användes för att kontrollera specifici- teten, varvid ett spätt prov av kroppsvätska prein- kuheras med de specifika antikropparna mot pertus- sistoxin, vilka kan utgöras av monoklonala antikroppar eller ett specifikt antiserum, lämpligen vid 37°C under 1 h. Efter inkuberingen sammanförs provet-med åtminstone en del av ett fiskfjäll fràn näringslösningen c). Eftersom antikropparna reagera med eventuellt närvarande pertussistoxin i provet kommer fiskfjälls- färgen att förändras från den första observerade färgen till den andra observerade färgen.

Lösningen b) av ett väsentligen rent pertussis- toxin användes för att kontrollera att fiskfjäll från lösningen c) har intakta kromatoforer, varvid lösningen d), lämpligen av noradrenalin, sättes till fiskfjäl- let som inkuberats med lösningen b) (koncentrationen av pertussistoxin i lösningen är t ex 0,01 ng/ml).

Nu skall färgförändringen utebli om fiskfjället är intakt.

När fiskfjällen i lösningen c) sålunda konstaterats fungera utföres själva diagnostiseringen pá så sätt att ett prov av kroppsvätska fràn en patient med miss- tänkt kikhosta inkuberas med åtminstone en del av ett fiskfjäll från lösning c) under en förutbestämd, lämplig tidsperiod. Därefter observeras fiskfjällsfärgen visuellt, eller med hjälp av mikroskop. Sedan tillsät- tes en avpassad mängd av lösningen d). Slutligen obser- veras fiskfjällsfärgen visuellt, eventuellt med hjälp av ett mikroskop, och om färgförändring mellan de tvâ visuella observationerna uteblir tyder det på förekomst av pertussistoxin i provet av kroppsvätska.

Om däremot det sker en färgförändring mellan den första och den andra visuella observationen tyder det pá att pertussistoxin saknas i provet av kroppsvätska, 10 15 20 25 30 35 455 949 7 och man kan på goda grunder antaga att patienten inte har en pågående kikhosteinfektion.

EXEMPEL 1 I detta Exempel visas resultat från diagnostise- ring av kikhosta i prover av sputum från patienter med misstänkt kikhosta. Proverna erhölls från Statens Bakteriologiska'Laboratorium (Stockholm, Sverige) (härefter förkortat SBL). De med sättet enligt uppfin- ningen erhàllna resultaten jämfördes med de resultat som erhållits för samma prov genom serologisk metod och genom odlingsmetod, båda utförda av SBL.

Varje sputumprov späddes 20 ggr med buffert (0,1 ml prov + 1,9 ml fosfatbuffrad fysiologisk koksaltlösning innehållande 1% fetalt kalvserum, pH=7,4). Parallellt gjordes prover (fràn samma serumprover som ovan) vilka förinkuberades med antiserum innehållande specifika antikroppar mot pertussistoxin (anti-PTX) för kontroll av specificiteten. Antiserumet var också från SBL. 0,2 ml av de spädda proven (triplikat) inkubera- des med fiskfjäll från blågylta vid 37°C i 30 min.

Därefter placerades fiskfjällen separat i 0,05 ml buffert på ett objektglas och fiskfjällen observerades visuellt och med hjälp av mikroskop. Fjällen framstod som mörka (svarta) för blotta ögat och i mikroskop observerades att melanoforerna ej var ihopdragna.

Fiskfjällsfärgen bedömdes med hjälp av mikroskop enligt en femgradig skala, varvid 1=maxima1 aggregation (ihop- dragna pigment i melanoforer) och 5=maximal dispersion (ej ihopdragna pigment i melanoforer).

Därpå tillsattes 0,005 ml 3xl0_5 till fiskfjällen i sin buffertlösning på objektglasen.

M noradrenalin En andra observation av fiskfjällsfärgen gjordes med blotta ögat och med hjälp av mikroskop. De prover som innehöll pertussistoxin förblev mörka för blotta ögat och de prover som inte innehöll pertussistoxin 10 15 20 455 949 8 framstod som ljusa (gråa) för blotta ögat. En bedömning av melanoforernas aggregation/dispersion utfördes igen på samma sätt som ovan. Ett färgindex beräknades för varje prov som skillnaden mellan det först bedömda värdet för dispersion/aggregation och det andra bedömda värdet för dispersion/aggregation (dvs efter tillsats av noradrenalin). Sålunda indikerar ett lågt värde för beräknat färgindex en hög pertussistoxinaktivitet.

Resultaten visas i nedanstående Tabell l.

Kontroll av fiskfjällen utfördes genom att noradre- nalin tillsattes i enlighet med ovan till fiskfjäll (triplikat), vilka inkuberats i enbart buffert (enligt ovan) eller i buffert innehållande rent pertussistoxin (0,1 ng/ml).

Förutom med sputumprover från patienter med miss- tänkt kikhosta (prov 1-8) utfördes diagnostisering pá samma sätt som ovan med salivprover från tre syn- barligen friska personer. Resultaten från dessa ges också i nedanstående Tabell l, varvid proverna be- tecknats A, B och C. 455 949 9 TABELL l Sputumprov Färgindex x Nr Färgíndex med anti_PTX A Serologí Odling 1 0,0 (_+_ 0,6) 3,5 (¿ 0,3) 2,7 - - 2 0,7 (¿ 1,3) 3,5 (3 0 ) 2,8 n.d. n d 3 0,3 (1 0,3) 3,8 (1 0,3) 3,5 - + 4 0 (3 0 ) 4 (i 0 ) 4 + + 5 1,7 (1 0,8) 3,8 (1 0,3) 2,1 + - 6 1,5 (¿ 1,3) 3,7 (3 0,3) 2,2 + + 7 2 (¿ 1,3) 4 (¿ 0 ) 2 - - 8 2,5 (¿ 0,7) 4 (1 O ) 1,5 - + A 3,8 c_+_ 0,3) 3,7 (ina) -0,1 B 3,7 (1 1,0) 3,8 (i 0,3) 0,1 C 3,5 (i 0,5) 3,5 (¿ 0,5) 0 *A är skillnaden mellan färgíndex och färgindex med anti-PTX I+ inte utförts. positiv cch negativ. värden anger standardavvikelser och n.d. anger att bestämning 10 15 20 455 949 10 Av ovanstående Tabell l framgår tydligt att samt- liga sputumprover l-8 från patienter med misstänkt kikhosta uppvisade pertussistoxinaktivitet och att samtliga salivprov A-C från till synes friska försöks- personer saknade pertussistoxinaktivitet. Vidare framgår det att sättet enligt uppfinningen är känsligare än både den serologiska metoden och odlingsmetoden som för närvarande allmänt används vid diagnostisering.

Sputumproverna nr l och nr 7 konstaterades vid sättet enligt uppfinningen komma från patienter som hade kikhosta, trots att dessa patienter vid både serologi och odling bedömts vara fria från kikhosta.

EXEMPEL 2 Detta exempel visar diagnostisering av kikhosta med nasofarynxprover från patienter med misstänkt kikhosta. Proverna erhölls från Statens Bakteriologiska Laboratorium (SBL). Även resultat från serologi och odling erhölls för dessa prover från SBL.

Nasofarynxproverna behandlades på samma sätt som i Exempel l. Resultaten visas i Tabell 2.

TABELL 2 Nasofarynxprov Färgindex x Färgindex A Nr med anti-PTX serologi Odling (i 015) 17 ll 5 (¿ 0 ) 3,5 + _ l Ü (1 0 ) 4 1 (¿ 0,5) 3,5 (¿ o ) 2,5 + + 1,8 (i 1,3) 4 o 7(¿cr3) ëblhälfl (1 0 ) 2,2 - _ 3,8 (1 0,3) 3,1 - + I+ är skillnaden mellan färgíndex och Färgindex med anti-PTX värden anger standardavvikelser pOSifiiV OCH negativ, 10 15 20 25 30 } 455 949 ll Även vid diagnostisering med nasofarynxprov kunde ett fall av kikhosta fastställas (prov nr 4) som inte kunde fastställas med serologi och odling.

EXEMPEL 3 I detta Exempel undersöktes förvaring av fjäll från blågylta i näringslösning.

Fjäll från blågylta inkuberades i vävnadsodlings- medium (HAM,sFl2 medium + 10% fetalt kalvserum (vol/vol) + 0,5% gentamycinsulfat 0,5% (vikt/vol)), ca 5 fjäll/milliliter medium vid 4°C. Mediet byttes var fjärde dag. Kromatoforernas viabilitet prövades hos utvalda fjäll med regelbundna mellanrum genom att noradrenalin sattes till fjällen, varefter melano- forernas dispersions/aggregationstillstànd (färgför- ändringar) bedömdes med hjälp av mikroskop. Kroma- toforerna bevarade sin viabilitet i detta närings- medium i tre veckor, varefter kromatoforerna gradvis förlorade sin viabilitet, vilket märktes genom att deras pigmentkorn förlorade sin dispersionsförmàga.

Sålunda kan fiskfjäll för föreliggande uppfinnings ändamål hållas intakta under minst 3 veckor, vilket är en acceptabel tidsperiod. Näringslösningens samman- sättning har ej ännu optimerats.

Såsom framgår av föreliggande beskrivning kan man på sättet enligt uppfinningen diagnostisera kikhosta mycket snabbare än tidigare och resultaten är tillförlit- ligare än de som tidigare erhållits med serologi och odling.

Claims (6)

10 15 20 25 30 455 949 12 PATENTKRAV

1. Sätt att diagnostisera kikhosta, k ä n n e - t e c k n a t därav, att ett prov av kroppsvätska från en patient inkuberas med åtminstone en del av ett pertussistoxin- -känsligt, kromatoforhaltigt fiskfjäll under en förut- bestämd, lämplig tidsperiod, att fiskfjällsfärgen därefter en första gång observeras visuellt, eventuellt med hjälp av mikroskop, att en substans som inducerar färgförändring hos fiskfjället tillsättes, att fiskfjällsfärgen sedan en andra gång observeras visuellt, eventuellt med hjälp av mikroskop, och att den första observerade fiskfjällsfärgen jäm- föres med den andra observerade fiskfjällsfärgen, varvid utebliven eller ringa färgförändring indikerar förekomst av pertussistoxin i provet av kroppsvätska.

2. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att provet av kroppsvätska är ett prov av naso- farynxsekret eller sputum.

3. Sätt enligt kravet l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att substansen som inducerar färgför- ändring hos fiskfjället är en katekolamin och att fiskfjället är från en läppfisk.

4. Sätt enligt något av krav 1-3, k ä n n e t e c k - n a t därav, att substansen som inducerar färg- förändring är noradrenalin och att fiskfjället är från blågylta.

5. Testsats för diagnostisering av kikhosta, k ä n n e t e c k n a d därav, att den omfattar följande, separat förpackade, lösningar, a) en lösning av specifika antikroppar mot per- tussistoxin, b) en lösning av väsentligen rent pertussistoxin, 455 949 13 c) en näringslösning innehållande åtminstone ett pertussistoxin-känsligt, kromatoforhaltigt fiskfjäll, och d) en lösning av en substans som inducerar färg- 5 sförändring hos den typ av fiskfjäll som finns i lösning c).

6. Testsats enligt kravet 5, k ä n n e t e c k - n a d därav, att fiskfjället i lösning c) är taget från blågylta och att substansen i lösning d) är norad- 10 renalin.