SE455705B - Forfarande for framstellning av de antibiotiska foreningarna aklacinomycin a och b genom odling av streptomyces lavendofoliae cbs 26183 och streptomyces lavendofoliae cbs 26183 - Google Patents

Description

455 705 Aklacinomycinerna A och B tillhör antracyklinantibioti- kagruppen och är aktiva mot olika grampositiva bakterier samt förhindrar tillväxten av tumörer i djur. Aklacino- mycinerna A och B samt förfaranden för deras framställning beskrevs för första gången i JP-patentskriften 864851, ansökningsdag 27.7.1974. Motsvarigheter till nämnda JP- patent är t.ex.'GB-patent l,49l,266 och US-patent 3,988, 315 och 4,07l,4ll.

I ovannämnda patent används såsom aklacinomycin-produ- cerande stam Streptomyces galilaeus MA 144 Ml, vilken är deponerad i den amerikanska stamkollektionen American Type Culture Collection under A.T.C.C. Nr 31133, och vid det japanska institutet Fermentation Research Ins- titute under FERM no 2455.

Nämnda stam uppvisar följande kännetecken: svagt utveck- lat luftmycel på fast agar-växtsubstrat, till färgen grått. Bildar spiralfbrmiga sporbärare, sporerna har slät yta, är ovalformiga, till storleken 0,4 - 0,8 Fm.

Kolonierna är veckade och substratmycelet gulbrunt. Lös- ligt pigment saknas eller är ljusbrunt. På vissa agar- växtsubstrat bildas gulgrönt lösligt pigment.

Streptomyces galilaeus odlas aerobt, tillväxtoptimum är 24-30°C, vid 50 °C sker ingen tillväxt. Den hydrolyse- rar gelatin, peptoniserar mjölk och hydrolyserar svagt stärkelse. Melanoidpigment bildas på organiska substrat. Den växer på Pridheims och Gottliebs medium vilket innehåller D-glukos, D-xylos, L-arabinos, L-ramnos, D-galaktos eller inositol, men växer inte på ett medium, som innehåller D-mannitol.

Då stammen odlas i en näringslösning, som innehåller so- jamjöl, glukos, stärkelse samt olika salter, under aero- . ._.._,- _ _..- , _ ._.-.. -. ... ...alla 455 705 ba betingelser, erhålls efter 36 timmar 46 mg/1 aklaci- nomycin A och 23 mg/l aklacinomycin B.

Antíbioterna finns såväl i mycelet som i odlingslösningen. De extraheras från mycelet med ace- ton och från odlingslösningen med etylacetat. Extrakten förenas och aklacinomycinerna A och B separeras kolonnkromatografiskt. De erhållna aklacinomycinerna A och B innehåller såsom föroreningar antibiotika från E- pyrromycingruppen, vilka avlägsnas genom behandling med kopparjoner.

En nackdel med ovan nämnda kända förfarande är mikro- organismens svaga produktionsförmåga. Vid sidan om akla- cinomycinerna bildas vissa antibiotika ur E- pyrromycingruppen, vilket komplicerar den kemiska re- níngstekniken.

Huvudändamålet med föreliggande uppfinning har varit att finna nya, aklacinomycin A och B producerande kul- turer, vilka uppvisar en större aklacinomycin A- producerande aktivitet jämfört med de tidigare kända, och vilka såsom huvudkomponenter syntetiserar dessa an- tibiotíka.

Som resultat av dessa strävanden erhölls ur ett jord- prov från Central-Asien en ny stam 12/3-A, vilken till- hör arten Streptomyces lavendofoliae, och vilken såsom huvudkomponent bildar aklacinomycin A.

Denna Streptomyces lavendofoliae-stam är deponerad i antibíot-institutets stamkollektion under VNIIA nr 1670 den 20.1.1982. Detta instituts (VNIIA) mikro- organism-stamkollektion har registrerats i den interna- 455 795 tionella federatiønen av stamkollektíoner år 1972, nr.. 337.

Stammen 12/3-A av Streptomyces lavendofoliae har även deponerats vid depositionsinstítutet Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) den 31.3 1983 under nr.

CBS 261.83.

Streptomyces lavendofoliae-stammen 12/3-A uppvisar föl- jande morfologiska, fysiologiska och antagonistiska kännetecken.

MøRFoLoGIsKA KÄNNETECKEN Streptomyces lavendofolíae-stammen 12/3-A bildar ett rikligt lila-rosa (X 3) luftmycel. Spcrbärarna är spiralformiga, sporerna har slät yta, till storleken 0,7-1,4 Fm. Substratmycelet är beige-rosa, t.o.m. till smutsigt lila (Kl+M2). Det i växtsubstratet ut- söndrade pigmentet är mörkbrunt, t.o.m. till brunrosa- violett (Kl+ f2+ H2). Färgerna värderas i enlighet med Bondarzevs färgskala, USSR Vetenskapsakademíens publika- tion av år 1954.

Kulturen odlas vid en temperatur av 28°C under en tid av 28 dygn. 455 705 5 Tabell 1 Växtsubstrat Parameter Kännetecken 1 2 3 Czapeck's agar _1uftmycel välutveck1at,lila- rosa GK 3) substrat- beige-rosa- mycel lilafärgat (Kl+K2) lösligt brun-rosa (Kl) pigment Gause I agar luftmycel riklig växt, ljusrosafärgat (X3+D3) substratmycel brunt-smutsigt violett (F2+H2) lösligt brun-rosa (Kl) pigment Krasiljnikov's _luftmycel riklig växt, lila- växtsubstrat 1 rosa (X'3) substrat- beige-smutsigt violett mycel (Kl+ H2) lösligt brun-rosa-violett pigment (Kl+ f2+H2) Stärkelseagar' luftmycel måttlig växt, rosa (X 3) substrat- beige-rosa (Kl) mycel lösligt beige~rosa (Kl) pigment 455 705 Glukos-asparagin Waxmans agar Jäst- och löslig stärkelseagar Glukos-jäst-agar Havreagar luftmycel substrat- mycel löslígt pigment luftmycel substrat- mycel lösligt pigment luftmycel substrat- mytel lösligt pigment lnftmycel substrat- mycel lösligt pigment luftmycel substrat- mycel lösligt pigment riklig växt, ljusgrått (X6) sandbrunt till brunt (H7-K7) sandbrunt (J]7+ K7) riklig växt, rödaktígt grått (A 3) från brunt-kastanjebrunt till smutsigt violett (B2-H2) brunt-mörkbrunt (B2) riklig växt, rödak- tigt grått (A3) brunt (B7) sandbrunt till brunt (B72K7) riklig växt, ljust (DI) mörkbrunt (115) brunt (K7) god växt, rödaktigt grått (A3) mörkbrunt-brunt (B2) ljusbrunt (B7) Malt-agar Gause 2 agar MPA Tyrosín-agar Tresner's agar med järncitrat- lösning iuftmycel substrat- mycel löslígt pigment luftmycel substrat- mycel lösligt pigment luftmycel substrat- mycel lösligt pigment luftmycel substrat- mycel löslígt pigment luftmycel substrat- mycel lösligt pigment 455 705 riklig växt, rödak- tigt grått (A3) brunt-kastanjebrunt (K7+K4) mörkbrunt-brunt (B2+K7) måttlig växt, ljusgrått (A6) brunt (X7) brunt (K7) .svag växt beige-sandfärgat (B 5) saknas riklig växt, lila-rosa (X 3) plommonsvart (01) umbrafärgat (07) god växt, lila-rosa (RIB) mörkt umbrafärgat (H 2) mörkt umbrafärgat (H2) 455 705 8 , Potatisskivor luftmycel god växt, från vitt till rosa (03-X3) substrat- mörkbrunt mycel (Kl+Bl) lösligt mörkbrunt pigment (Kl+Bl) I FYsIoLoG1sKA xåuuzrßcxßu Aerob, optimaltillväxttemperatur 24-30°C. Vid tempera- turen 50°C ingen tillväxt. Löser gelatin måttligt, pep- toniserar mjölk, som mörknar, hydrolyserar måttligt stärkelse. Bildar melanoíder (Tresner's växtsubstrat med järncítrat, tyrosin-agar).

Streptomyces lavendøfoliae~stammen 12/3-A utnyttjar väl följande kolkällor: D-glukos, D-xylos, L-arabinos, D- fruktos, D-galaktos, ínositol. Den utnyttjar dåligt el- ler inte alls följande föreningar: L-ramnos, sackaros, raffinos och D-mannitol. Streptomyces lavendofoliae- stammen 12/3-A kan förvaras på snedagar under ett vase- linoljeskikt vid en temperatur av +5°C under en tid av sex månader.

ANTAGONISTISKA KÄNNETECKEN Streptomyces lavendotoliae 12/3-A odlas i ett vätske- førmigt näríngssubstrat i en skakanordning. Efter tre dygn har en mängd av cirka 56-60 mg/l aklacinomycin A bildats som uppvisar följande antimikrobiska verkan, cytotoxiska aktivitet och tumörförbindrande verkan hos testdjur (tabellerna 2-4).

Tabell 2 455 705 Antimíkrobiellt spektrum av aklacinomycin A producerad av Streptomyces lavendofoliae 12/3-A och av jämförelse- substansen _ X) Testorganísmer MIC épg/ml Aklacínomycin A Aklacinomycin A producerad av Str. framställd av lavendofolíae Zaidanhojin Bisei- 12/3-A butsu Kagaku Kenkyukaí, Tokyo, Japan 1. 2. 3.

Staphylococcus aureus 209P 15,56 7,8 Staph. aureus 209P streptomycin-resístent 15,56 15,56 penicillin-resistenp 15,56 15,56 gentamycín-resistent 15,56 15,56 kanamycín-resistent 11,6 11,6 oleandomycin-resístent 15,56 11,6 linkomycín-resístent 15,56 23,3 víolarín-resistent 23,3 19,0 erytromycín-resístent 31,2 23,2 daktinomycín-resístent 31,2 70,0 novobiocin-resistent >250,0 >250,0 rífampícín-resistent 125,0 125,0 vankomycin-resistent 125,0 125,0 E. coli 675 >250,0 >250,0 Pseudomonas aerugínosa >250,0 >250,0 Klebsiella pneumoniae 444 >250,0 >250,0 Providencía stuartií A-rcc 7240 >2sø,o >250,0 Candida albicans >250,0 >250,0 455 7ÛÉ 10 x) MIC, den minsta tillväxthämmande läkemedelskoncent- rationen bestäms genom att i tvâ parallellprov odla en mikrobstandardöverföring 105 st/ml i en provrörsserie innehållande pepton-buljong- näringssubstrat och växande läkemedelskoncentration, 20 timmar vid en temperatur av 37°C och pH 7. ' Tabell 3 Tumörförhindrande verkan av aklacinomycin A i djurförsök Stam - Admínistra- Optimal dos Medelök- Minskning djur tionstid (mg/kg) ning av av tumör- (dygn) livslång- tillväxthas- denj%) tígheten (§) li carl 1 ___; 9 2,5 92 LLc _ carl 1 ___¿ 9 s 67 S-37 _ möss av l --g 5 2,5 80 blandras Tabell 4 Cytostatisk verkan av aklacinomycin A och dess DNA- komplex på tumörceller P-388 i suspensionskultur ' /ml X) Preparat ED5u_J P9 Aklacínomycin A 0,01 Aklacínomycin A - DNA-komplex 0101 x) Den dos som minskar produktionen av nukleinsyror (DNA+RNA) med 50 %. 455 705 11 Resultaten av jämförelsen av kännetecknen hos stammen 12/3 enligt uppfinningen med kännetecknen hos den kända aklacinomycin A- och B-producenten, Strep- tomyces galilaeus MA 144Ml, bekräftar skillnaderna mel- lap de morfologiska och fysiologiska egenskaperna hos respektive kulturer.

A andra sidan motsvarar stammen enligt uppfinningen till sina nämnda kännetecken egenskaperna hos Streptomy- ces lavendofoliae enligt Bergey's definition (tabell 5).

Tabell 5 Jämförelse av de morfologiska och fysiologiska egenska- perna hos en kultur av stammen 12/3-A enligt uppfinnin- gen med egenskaperna hos prototypen Str. galílaeus MA 144Ml och Str. lavendofoliae.

Parameter Stammen \ Str. galílaeus Str.lavendofo- 12/3-A MA l44Ml liae (prototyp) 1 2 ' 3 ' 4 Sporbärare spiralform. spiralform. spiralform.

Sporer släta,oval- släta, oval- släta, oval- ' formiga formiga formiga Syntetiska växtsubstrat: Luftmycel god till rik- måttlig växt, god växt, lig vâxt,b1å- från ljusgrått lila-rosa rört (X 3) till grått 455 705 12 Substrat- från beige- gulbrunt, i från gulbrunt mycel rosa vissa substrat till mörkbrunt till smut- gulgrönt sigt lila . (Jl 7-142) Lösligt från mörkbrunt saknas eller gulbrunt eller pigment till mörkbrunt brunt ' mörkbrunt röd-violett (Kl+f2+H2) Organiska substrat: Luftmycel god växt,röd- måttlig växt, god växt, från aktigt grått ljusgrått lila-rosa till (A 3) violett Substrat- från sand- gulbrunt mörkbrunt eller mycel brunt till' mycket mörkbrunt brunt (fl7+B7-K7) Löslígt mörkbrunt brunt mörkbrunt eller pigment çn7~B2+ K7) mycket mörkbrunt Potatisskivcr: Luftmycel god växt,från god växt,ljus- god växt, mörk- vitt till grått brunt-rosa rödaktigt m3- X2) Substrat- mörkbrunt brungult mörkbrunt mycel (Kl+Bl) Lösligt pigment mörkbrunt (Kl+Bl) Melanoider bildas Tillväxt god på cellulosa Mjölk _peptoniseras till brun Stärkelse- måttlig hydrolys Gelatín- måttlig hydrolys Rörsocker - D-glukos D-xylos +++ L-arabinos L-ramnos D-fruktos D-galaktos ++ Raffinøs - D-mannitol - Inositol - 13 kastanje- brunt bildas måttlig peptoniseras måttligt svag svag l++++++++ + 455 705 mörkbrunt bildas god I peptoniseras till brun måttlig måttlig + För den taxonomiska bestämningen av kulturen 12/3-A an- vändes följande litteratur: Krasíljníkov H.A. “Strål- svamparna“, publ. ”Nauka“,l970, sidor 172, 328; Ber- gey's Manual of Determinative Bacteriology, Editors: Buchanan R.E. , Gibbons N.E. et al., s. 808-810, 455 705 14 Som näringssubstrat kan användas vilket som helst subs- trat som utnyttjas av en till arten Str. lavendofoliae tillhörande, aklacinomycin-producerande stam.

Som kolkälla i näringssubstratet används med fördel fruktos, glukos, arabínos, xylos, galaktos, stärkelse m.fl.

Som kvävekälla kan man använda köttextrakt, pepton, majsextrakt, jästextrakt, kaseinhydrolysat, majsmjöl, sojamjöl, bomullsmjöl m.fl. , samt även kväveföreningar innehållande organiska och oorganiska föreningar, såsom ammoniumsalter (nitrater, sulfater, fosfater m.fl.) urea och andra.

Växtsubstratet kan tillföras mineralsalter, såsom kal- ciumkarbonat, natrium- och kaliumfosfater, natrium- och kaliumklorid, magnesiumsalter, koppar m.fl.

För framställning av större mängder aklacinomycin A*och B utförs odlingen som en luftad djupodling i tvâ steg.

Ympningen av fermentorn sker med vegetativt mycel.

Substratet som används för odling av vegetativt mycel kan vara detsamma som används i biosyntesen av aklaci- nomycin A och B, men kan även vara ett annat.

En kontroll av olika substratalternativ visade att växtsubstraten B-2 och B-3 var de fördelaktigaste: Komponent Å växtsubstrat B-2 (%) B-3 (%) 1. Ammoníumsulfat 0,1 1,5 2. Sojamjöl 1,1 1,5 3. Potatisstärkelse 2,6 _ 3,0 455 705 15 4. Kalciumkarbonat . 0,8 1,4 5. Natriumklørid 0,3 0,3 6. Kopparsulfat 0,007 _ 0,007 7. Skumdämpningsmedel AC-60 0,5 0,5 Växtsubstraten steriliseras vid en temperatur av 124- l26°C under en tid av 30-40 minuter, varefter substra- tets pH är neutralt.

Str. lavendofoliae, stammen 12/3-A, ger vid odling under luftade betingelser 1 liter luft/liter växtsubstrat/min vid en temperatur av 20-30°C och ett pH av cirka 6-8,5, företrädesvis 6,9-7,9, efter 48-96 timmar aklacinomycin A i en mängd av upp till 60 mg/1 och aklacínomycin B i en mängd av 4-10 mg/1.

Tabell 6 Jämförelse av de fysißalísk-kemiska egenskaperna hos ak- lacinømycin A från Str. galílaeus (antibiot från firman Zaidanhojin Biseibutsu Kagaku Kenkyukai, Tokyo, Japan) och från Str. lavendofoliae. Q Antibiotproducerande stam Str.galilaeus MA l44Ml Str.lavendofo1iae l 2 3 X) UV-spektrum l 8 /K nm/E / max l cm 90 % MeOH 43l,5/l46,l/290/ll2,1/ 43l,5/l48,6/,289/l37,4/ 257/285,3/,228/485,7/; 257/302,9/,228/S02/; __” __ n: _ _....-._,_..- _ . 455 705 16 01N HC1 290/112,1/,228/485,7/: 431,5/146,1/,257/285,3/, 431,5/151,4/,289/137,4/, 257/302,9/228/499,2/7 O,1N Na0H 521,3/118,9/,317,3/64,5/,521,3/130/,318,3/78,5/, 285/101,9/,236/424,6 xx) IR-spektrum y cm'1 3450, 2980, 2945, 2020, max 2760, 1735, 1675, 1620, 1600, 1010. xxx) PMR-spektrum Å' ppm 12,55, lH, s.; 12,0, lH, s.; 7,15-7,85, 43, m.; 5,58, 1H, s., 5,31, 1H, s.; 4,95-5,20,2H,m.; 4,35-4,ss,ën,m.; 4,11,1H,s.; 3,68, 3H,S.; 2,25-2,65,5H,m.; 2,20, SH, s.; 1,45-2,15,8H,m.; 1,00-l,36,12H,m.; 284/126,2/,236/440,3/. 3480, 2980, 2950, 2825, 2775, 1735, 1680, 1625, 1600, 1010. 12,7, lH, s.; 12,0, lH, s,; 7,83,1H, Jl=l,8 Hz, J2=7,8 Hz; 7,68, lH, t.

J=7,8 Hz; 7,68, lH, s.; 7,30, lH, Jl=l,B Hz,J2=7,8Hz S,52,lH,m.;5,28,1H m.;4,95-5,20,2H,m.; 4,40-4,70,2H,m.; 4,11, lH, s.; 3,70, 3H,s.; 2,3-2,7 SH, m.; 2,23,6H,s.;l,40-2,15, BH, m.;1,32, BH, d., J=6,6 Hz; l,29,3H,d.,J=6,4 Hz; 1,17,3H,d.,J=6,2 Hz; l,08,3H,t.,J=7 Hz. 455 705 17 xxxx) Masspektrum m/2 x) xx) xxx) xxxx) Tabell 7 376/100 %/, 377/S0 %/, 794/15 %/, 812/30 %/, 114/2,6 %/, 376/100 %/, 377/42,8 %/, 394/5,1 8/, 416/1,5 %/, 794/10,2 %/, 812/28,8 %/.

UV-spektren registrerades med en Pye Unícam SP-8-100 apparat kalibrerad med standardfíl- tren HO-720540 och Di-720538 Pye Unicam.

IR-spektren registrerades med en UR-20-apparat från en KB:-tablett.

PMR-spektren registrerades med en 90 MHz “Bruker-WH-90"-apparat í CDCI3, TMS referens.

Fältdesorbtionens masspektra registrerades med en Varian Mat 311-A-apparat, kalíbrerad med PPK. Strömmen i emíttern 5-20 mA.

Jämförelse av de fysika1ísk4kemíska egenskaperna hos aklacínomycín B från Str. galílaeus och från Str. lavendofoliae Antíbíotgroducerande stam strigalílaeus MA 144M1 Str. lavendofoliae 2 3 455 705 18 1. 2. 3.

UV-spektrum 1 % Å nm/s / max 1 cm 90% MeOH 432/159/,289,5/137/, 431,5/149,2/,290/119/, I 259/313/,229,5/498/; 257/296/,228/508/; 0,1N HC1 431/162/,289,5/156/, 431,5/149/,290/119/, 259/355/,229/586/; 257/296/,228/503; 0,1N Na0H 522/145/,315/101/, 521,3/127/,316,3/77,3/, 284/160/,239/510/. 285/119/,236/453/.

IR-spektrum 3450, 2980, 2945,2820 3490, 2980, 2950, 2830, 17 cm'l 2760, 1730, 1675,1620, 2780, 1735, 1680, 1625, max 1600, 1010. 1605, 1015.

PMR-spektrum 12,2,lH,s.; J ppm 1l,5,1H, s.; 7,2-7,9, 4B, 5,5, 1H, s.: 5,1-5,3, 3H, 4,6-4,9, 2H, 4,5, 1H, s.; 4,3-4,4, lfl, 4,15, 1H, s.- 3,8-4,0, 3,7, 3H, 2,2-2,7, 2,2, 6H, 1,4-2,0, 0,9-1,4, 23, s.; 4H, s.: BH, III-F 12 H, m.; 12,68,lH,s.: 12,02, 1H, s.; 7,24-7,89, 4H, 5,48, 1H, 5.; 5,09-5,27, 3H, 4,62-4,90, 2H, 4,53, 18, s.; 4,36, lH, q.: 4,11, 1H, s.; 3,90-4,03, 2H, 3,75, 1H, s,; 3,69, 3H, s.; 2,58, 2H,d.; 2,46, lH, d.; 2,35, lH,s.; 2,15, 6H, s.; 1,45-2,01, 8H, m.; 0,89-1,45, 12H, m.. 10.7 455 705 19 UV-, IR- och PMR-spektren av aklacinomycin A och B återges i figurerna 1-6 (FIG 1-6).

FIG 1 visar UV-spektret av aklacinomycin A hydroklorid i 90 8 metanol, FIG 2 visar UV-spektret av aklacinomycin B hydroklorid i 90 % metanol, FIG 3 visar IR-spektret av aklacinomycin A hydroklorid från en KBr-tablett, FIG 4 visar IR-spektret av aklacinomycin B hydroklorid från en Kßrftablett, FIG 5 visar PMR-spektret av aklacinomy- cin A hyarokioria (cnci3-rms; -r=3o3°c) och mc; s mn- spektret av aklacínomycin B hydroklorid (CDCI3-TMS; T = 3o3°c) .

Aklacinomycinerna A och B finns i mycelet och i växtsubstratet. Efter fermentationen filtreras växt- substratet vid pH 4,5-6,0. Antíbioterna extraheras från växtsubstratet med etylacetat (per 10 volymdelar växt- substrat används 1 volymdel etylacetat).

Det antibíothaltiga organiska skiktet separeras från mycelet. Efter avlägsning av lösningsmedlen förenas vattenresterna och neutraliseras till pH 6,9. Härefter extraheras antibioterna med toluen och med den dubbla volymmängden 0,0lN HCl-lösning. Antibioterna extraheras från vattenlösníngen med kloroform, vilken torkas med vattenfritt Na2S04. Kloroformextraktet koncentreras i en roterande avdunstare till en 0,1-faldig volym och återstoden tillförs 10-12 volymdelar torr hexan. De ut- fällda antibioterna avskiljs och torkas. Rening och ' àtskiljning av antibioterna sker kromatografiskt med vattenhaltig kiselsyra i ett lösningsmedelssystem som utgörs av koltetraklorid och isopropanol.

I tabellerna 6 och 7 återges jämförelseresultaten för akla- cínomycinerna A och B, vilka erhållits med UV-, IR-, PMR- 455 705 zo och masspektroskopi, och vilka bekräftar likheten mel- lan de antibioter som erhållits med stammen enligt uppfin- ningen och de som erhållits med de redan kända stammarna.

Antibioterna aklacinomycin A och B, vilka produceras av stammen 12/3-A av Str. lavendofoliae, är alltså iden- tiska med de antibioter, som erhålls genom att odla Str. galilaeus MA l44Ml. Förmågan att producera aklaci- nomycin A och B var inte tidigare känd hos Str. laven- dofoliae. Förfarandet enligt uppfinningen kan åskådlig- göras med följande exempel.

Exempel l Streptomyces lavendofoliae stammen 12/3-A odlas på ett fast havre-agar-växtsubstrat vid en temperatur av 28°C under 12 dygn tills ett rikligt luftmycel har utveck- lats. Kulturen överförs till en 750 ml erlenmeyerflaska i ett B-2 växtsubstrat, vilket inte innehåller koppar- sulfat eller skumdämpande medel. Flaskan omrörs genom skakníng med hastigheten 250 rpm vid en temperatur av 28°C under en tid av'2 dygn.-Den i erlenmeyerflaska od- lade kulturen överförs i en mängd av 5 % i en 10 liters ympfermentor i ett B-2 växtsubstrat, vilket inte inne- håller kopparsulfat. Fermentorn omrörs med hastigheten 200 rpm och luftas med 10 liter/min vid en temperatur av 28°C under ett dygn. ' Tre liter i denna fermentor odlad kultur överförs i en 100 liters fermentor i 60 liter B-2-växtsubstrat. Fer- mentorn omrörs med hastigheten 200 rpm och luftas med 60 1/min vid en temperatur av 27°C under tre dygn. 455 705 21 Halten aklacinomycin A och B i växtsubstratet bestäms med följande metod. l. Bestämning av halten aklacinomycin A och B i mycelet I Efter fermenteringen avskiljs mycelet från 5 ml växt- substrat genom centrifugering vid 2000 rpm under en tid av 10 minuter. Från det så erhållna mycelet extraheras antibioterna under 2 timmar med 4 ml aceton, varvid blandningen omrörs med 15-20 minuters intervaller.

Acetonen avdunstas från l ml extrakt i vakuum vid en temperatur under 40°C och återstoden extraheras med 1,0 ml kloroform. Det koncentrerade kloroformextraktet an- vänds för kromatografisk separering av antibiotkomplexet. För detta ändamål används en skiva, vilken belagts med ett adsorbentskikt, och vars väns- tra sida och nedre kant lämnats fria på en sträcka av 2 cm. På skivan appliceras med en kapillär hela kloroformextraktet som ett band med en bredd av l-1,5 cm. På samma skiva appliceras en standardlösning av ak- lacinomycin A och B..Skivan placeras i en kromatografe- ringskammare vilken innehåller en kloroform-etylacetat- metanol-blandning i förhållandet 7:2:1. Då vätskefron- ten nått skivans kant uttas skivan och lufttorkas i 20 minuter.

De gula zonerna, vilka motsvarar mobilíteten av aklaci- nomycinerna A och B, elueras separat med 4 ml metanol (pH = 6) och mäts spektrofotometriskt vid en våglängd av 430 nm. Aklacinomycinmängderna (mg/1 kulturvätska) beräknas på basen av aklacinomycinernas extinktionsvär- den (filglcm för aklacinomycinerna A och B är 161 och 159, a. Antizšiotics, 1979 §_2_, no s, s. val-son) enligt följande formel 455 705 22 aklacinomycin A C mg/ml = 199 D aklacinomycín B C mg/ml = 201 D 2. Bestämning av halten aklacinomycin A och B i växtsubstratet I Från 5 ml växtsubstrat avskiljs mycelet genom centri- fugering. Man extraherar med etylacetat vid pH 6 genom att använda förhållandet 5 ml växtsubstrat och 5 ml etyla- cetat. 2 ml etylacetatextrakt indunstas i vakuum och återstoden extraheras med 2 ml kloroform. Upparbetning- en sker såsom i punkt 1.

Mängderna aklacinomycin A och B beräknas på basen av antibíoternas extinktionsvärden enligt följande formel: aklacinomycin A C mg/ml = 124,2 D aklacinomycin B C mg/ml = 125,8 D Efter tre dygns fermehtering i växtsubstratet B-2 producerar kulturen 12/3-A aklacinomycin A i en mängd av cirka 56 mg/l och aklacinomycin B i en mängd av cirka 4-8 mg/1. .

För separering av aklacínomycin A och B från växtsubs- tratet filtreras 60 1 på ett sugfílter vid pH 4,5-5,0.

Antibioterna i växtsubstratet extraheras med etylacetat i förhållandet l0:1. Det organiska skiktet avskiljs och .indunstas i vakuum i en roterande avdunstare vid en temperatur av högst 40°C tills återstoden utgörs av en vattenlösning. Det fuktiga mycelet (5 kg) extraheras två gånger med 10 l aceton. Mycelet separeras genom filtrering och slopas. Acetonextrakten förenas och in- dunstas. Vattenåterstoderna från etylacetat- och aceton- 23 455 705 indunstningarna förenas och det så erhållna koncentra- tet (5 l) neutraliseras till pH-värdet 6,8 med en 10 8- ig Na0H-lösning och antibioterna extraheras med 3 x 10 l toluen. Toluenextrakten förenas och vattenskiktet slopas. Toluenextraktet (30 l) indunstas i vakuum vid en temperatur av högst 40°C tills återstoden är 3 li- ter. Antibioterna extraheras från detta koncentrat med en 0,5-faldig volymmängd 0,0lN HC1. Den i extraktions- skedet bildade emulsionen söndras genom centrifdgering.

De i vattenlösningen befintliga antibioterna extraheras med en 0,5-faldig volymmängd kloroform. Extraktionsti- den är 20-30 minuter under kontinuerlig omröríng av blandningen.

Den erhållna emulsionen söndras genom centrifuge- ring. Kloroformskiktet (1,5 1) tillvaratas och torkas 4 timmar över vattenfritt Na2S04 (10 g Na2SO4 /100 ml extrakt). Na2S04 filtreras bort och kloroformen des- tilleras i vakuum i en roterande avdunstare till en 0,1-faldig volym. Återstoden tillförs l0-12 volymdelar torr hexan, varvid bildas en fällning, som får sedimen- tera (30 minuter). De utfällda antibioterna filtreras på glasfílter nr 4 och torkas. Filtratet indunstas till torrhet i en roterande avdunstare vid en temperatur av högst 40°C. Återstoden uppslammas i hexan och hexanet avlägsnas genom filtrering. Båda fällningarna förenas och renas kromatografiskt. Utbytet är 2,5 g râprodukt.

Kromatografisk separering av aklacinomycinerna En kolonn (8 x 95 cm) fylls med 5,5 1 suspension vilken består av 1,8 kg vattenhaltig kiselsyra (250-400 pm) och 5,5 1 kloroform i vilken lösts 0,5 % trietylamín och ättiksyra. Efter päfyllningen sköljs kolonnen med 3 455 705 24 1 kloroform. Den ovan nämnda râprodukten (10 g) till- förs, upplöst i 100 ml kloroform. Efter absorption av antibioterna elueras kolonnen. För separering av anti- bioterna utförs en stegvis gradienteluering. För detta ändamål tillförs kolonnen 1) 4 l koltetraklorid 2) 8 1 lösningsmedelsystem, som består av koltetraklo- rid och isopropanol (25:l) _ 3) 8,5 1 lösningsmedelsystem, som består av koltetra- klorid och isopropanol (20:l) 4) 20,5 1 lösningsmedelsystem, som består av koltetra- klorid och isopropanol (10:l).

Aklacinomycin B fås från kolonnen med systemet CCl4:isopropano1 (20:l) och aklacinomycin A med syste- met CCl4:isopropanol (l0:1). Eluaten (5-7 1), vilka in- nehåller aklacinomycin Å och B, extraheras separat med s 0,2 volymmängder 0,01 N HC1-lösning.

\ Antibioterna extraheras ur vattenfasen med 0,2 volym- mängder kloroform. Aklacínomycinernas A och B kloro- formextrakt torkas separat med vattenfritt Na2SO4 (2 g/100 ml lösning), natriumsulfatet filtreras och filtratet avdunstas i vakuum vid 40°C till en 0,1- faldig volymmängd. En 10-faldig volymmängd torr hexan tillsätts och blandningen får stå cirka 30 minuter.

Fällningen filtreras med glasfilter nr 4 och det er- hållna ämnet lufttorkas. Så erhålls från 2,5 g råpro- dukt 0,7 g aklacinomycin A och 0,1 g aklacinomycin B.

Exemgel 2 Streptomyces lavendofolíae stammen 12/3-A odlas 12 dygn på havreagar. Kulturen överförs till ett kärl, vilket 455 705 25 som växtsubstrat innehåller B-2 utan kopparsulfat. Kär- let skakas med en hastighet av 250 rpm vid en tempera- tur av 28°C under en tid av två dygn. Kulturen överförs 1 en erlenmeyerflaska. Den överförda delen motsvarar typiskt 5-10 % av växtsubstratets vo1ym..Som växtsubs- trat används B-3, vilket består av följande ämnen: soja- mjöl - 1,5 8, potatisstärkelse - 3%, kalcíumkarbonat - 1,4 8, natriumkloríd - 0,3 %, kopparsulfat 0,007 S. Od- lingsbetingelserna är desamma som i Exempel l och od- lingstiden 72 timmar. Härvid är växtsubstratets aktivi- tet 60 mg/1 aklacinomycin A och 10 mg/1 aklacinomycin B.

Den kemiska separeringen av aklacinomycinerna A och B sker på samma sätt som i Exempel l.

Såsom av exemplen framgår, uppvisar förfarandet för framställning av aklacinomycín A och B följande förde-_ lar i förhållande till de kända förfarandena: 1. Högre utbyte av aklacínomycin A. Prototypstammen producerar 46 pg/ml och stammen enligt uppfinningen t.o.m 60 pg/ml.- 2. Sínerubín A och B bildas inte varför ytterligare rengöring blir överflödig. I de kända förfaran- dena måste nämnda sidoprodukter avlägsnas som _ metalljon-komplex. 3. Det bildas en mindre mängd aklacinomycin B. Proto- typstammen producerar 23 pg/ml och stammen enligt upp- finningen 4-8 pg/ml.

Claims (2)

455 755 .ik PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av de antíbíotíska föreningarna aklacínomycín A och B med anticancerverkan eller blandningar därav, varvid nämnda aklacinomycín har formeln: där R för aklacinomycín A har formeln: CH3 m3 N(cH3)¿ 0 H ššï ' 3 o k ä n n e t e c k n a t därav, att Streptomyces lavendofoliae stammen 12/3-A med deponeríngsnumret CBS 26183 odlas under aeroba förhållanden i ett näringsmedium, som innehåller kol- och kvävehaltiga föreningar samt míneralsalter, vid en tempe- ß 455 705 ratur av ca 20-30°C och vid ett pH av ca 6 - 8,5, företrädes- vis 6,9 - 7,9, under 48-96 timmar, varefter de bildade aklacinomycinerna A och B tillvaratas, och aklacínomycínerna A och B åtskíljs och renas med i och för sig kända metoder,

2. Streptomyces layendofoíiae stammen 12/3-A med depo- neríngsnumret CBS 26183.