SE455646B - Fluorescensanordning - Google Patents

Description

30 35 455 646 raviolett ljus en fluorescens, vilken faller inom breda våg- Jängdsband med föga utpräglad struktur, varför en identifie- ring på spektroskopisk grund ställer sig besvärlig. Emeller- tid brukar man vid normal fluorescensanalys, t.ex. vid fluorescensmikroskopering, i det optiska systemet insätta ett filter för ett utvalt våglängdshflfll Om situationen är nä- gorlunda komplex, så störes observationen ofta genom bidrag från många olika föreningar i provet.

Det är ett syfte med föreliggande uppfinning att åstadkomma en fluorescensanordning, som möjliggör fluorescensavbildning med förbättrad signifikans, genom bortsållning av irrelevant fluorescensstrålning, och detta även då en viss spektral över- lappning föreligger mellan den fluorescensstrålning man önskar avbilda och den störande fluorescensstrâlningen.

Detta syfte uppnås enligt uppfinningen därigenom att en fluo- rescensanordning av inledningsvis angivet slag är försedd med de i den kännetecknande delen av patentkrav 1 angivna särdra- gen.

Som filter i anordningen bör man använda sådana filterkonstruk- tioner, som ger väldefinierade bandpasskurvor, och det är där- vid särskilt lämpligt att använda interferensfilter.

För att åskådliggöra skillnaden mellan vanlig fluorescensav- bildning och fluorescensavbildning enligt uppfinningen kan man lämpligen betrakta ett spektrum enligt fig. 2a.

Tumörceller uppvisar den egenskapen, att de selektivt kvar- hâller substansen hematoporfyrin-derivat (HPD).

Det karakteristiska fluorescensspektret för detta ämne ligger inom omrâdet 610 till -700 nm, samt motsvarar de toppar som i figuren betecknats A och C.

Andra ämnen i cellerna fluorescerar emellertid mycket kraftigt 10 15 20 25 30 35 455 646 och ger ett brett bandspektrum såsom B i fig. 2a. Den strecke- de delen av kurvan visar den sluttande bakgrund av irrelevant fluorescensstrâlning.

HPD är överlagrade. på vilken bandstrukturerna A och C från Uppfinníngen gör det möjligt att i mycket stor utsträckning eliminera denna källa till irrelevanta stör- ningar. vilka fördärvar kontrasten i avbildningen, så- som vid konventionell fluorescensmikroskopering, utnyttjar ett för den relevanta strålningen avpassat filter.

OI! man, Uppfinningen kommer nu att ytterligare förklaras med hänvis- ning till figurerna.

Fíg. 1 visar ett principschema av en fluorescensanordning i enlighet med uppfinningens principer.

Fig. 2a. delvis redan kommenterad. visar ett spektrum av fluorescensstrâlníng från ett cancercellspreparat markerat med HPD.

Fig. 2b avbildar två svårskiljbara fluorescensspektra.

I fig. 1 visas den principiella uppbyggnaden av en fluore- scensanordning enligt uppfinningen. Som ljuskälla för ultra- violett strålning användes antingen en pulsad kvävelaser l eller en pulsad eller kontinuerlig ljuskälla l'. Vid en före- dragen utföríngsform användes en pulsad N2-laser. sådan som utsände: ljusstrålning vid 337 nm. i 5 ns pulser med en repe- titionsfrekvens om 10-100 Hz. Ett exempel på en dylik är FRA Model LN 250. Om mycket nög effekt erfordras. kan en XeCl- -excimer-laser användas. Ett exempel på en dylik är Lambda' Physik Model 102 E. I vissa fall kan det räcka med en filter- försedd kvicksilver- eller xenonlampa (Oriel. Osram), antingen pulsad eller kontinuerlig. Objektet belyses via något slags kollímatoranordníng, så att det föremål som skall studeras blir välbelyst. Denna kan göras genom cylinderlinser 2 av kvarts (Esco Products). För detta ändamål användes en dikroi- tisk UV-spegel 3 (Balzers), som nelt och hållet reflekterar ultraviolett strålning men är mycket transparent för fluore- 10 15 20 25 30 35 455 646 scenssträlning i det synliga och nära IR-omrâdet. Denna spegel bör vara tillräckligt stor för att täcka hela den använda öpp- ningen till det optiska systemet S, som kan vara ett endoskop, ett mikroskop eller ett teleskop. Det optiska systemet 5 har ett objektplan vid 4. I den enklaste versionen av systemet är objektet placerat i detta objektplan. Detta objektplan 4 av- bildas på en detektor ll genom en sfärisk, ytaluminiserad spe- gel. Sådana speglar kan erhållas från firma Bernhard Halle. En dylik spegel är till sin funktion akromatisk. Spegeln är delad i fyra delar, vilka är justerbara var för sig, så att de fyra delarna kan bringas att avbilda objektplanet 4 var för sig i fyra olika fält Ål. Å2. Å3. Ä4. Detektorn ll är vid det föreliggande exemplet en matrisdioddetektor från Reticon. med t.ex. 5l2x5l2 ljuskänsliga detektorelement. Alternativt kan exempelvis ett vidikonrör användas. Normalt sätter man en bildförstärkare (VARO) framför detektorn. vilken aktiveras synkront med de från den pulsade ljuskällan kommande pulserna. varigenom klarare bilder. undertryckning av rumsljus och bätt- re signal/brus-förhállande kan erhållas. Framför detektorsys- temet sitter fyra kvadratiska filter. som släpper igenom var sina vâglängdsband. Företrädesvis utgöres de av interferens- filter. men även färgfilter kan i vissa fall vara användbara.

Interferensfilter kan erhållas från någon av firmorna Oriel eller Coríon.

Detektorsignalerna överföres efter integration i detektorn till ett datorsystem 12. som utför signalbehandlingen. Signa- lerna ackumuleras under tillräckligt tidsintervall för att er- hålla gott signal/brusförhàllande. vid behov. exempelvis på grund av distorsioner i optiken, kan en koordinatrektifiering till en början utföras.

För varje bildpunkt erhålles alltså från detektorn ll fyra olika signaler. vilka matematiskt behandlas på sätt som kommer att beskrivas. varefter resultatet kan betraktas på en skärm 13 eller permanent utskrivas via en skrivaranordning 14. Till datorsystemet l2 hör en terminal 15, varigenom man kan styra nur bilabenanaiingen skall utföras. 10 15 20 25 30 35 455 646 Det för uppfinningen vâsentligaste, som framgår av fig. l. är att fluorescensstrålningen från det optiska systemet 5 och mellanbildsplanet 4 uppdelas i flera bilder, vilka genom filt- rering representerar den tvâdimensionella avbildningen i var sin fluorescensfärg.

Ett belysande exempel på anordningens tillämpning kommer nu att beskrivas i anslutning till fig. 2a. som visar ett typiskt fluorescensspektrum för en cancertumör. som selektivt kvarhål- lit HPD-molekyler. Den karakteristiska signaturen för detta ämne infaller i spektralområdet 610-700 nm. Den fluorescens B som kommer av själva vävnaderna och utgör bakgrund kan vara mycket starkare än vad som framgår av figuren. En optimerad kontrastfunktion Fc kan vara A'-KD F: C B där A'. D och B är de intensíteter som framgår i figuren, un- der det att k är en konstant. signalnivaerna för A'. D och B avkännes genom interferensfilter. centrerade vid 630, 600 resp. 480 nm. Kenstanten k beräknas ur den sluttande bak- grundskurva. som är bestämd genom signalnivåerna vid B och D.

Genom denna procedur kan man lyfta ut den röda toppen för HPD och frigöra den från bakgrunden. Genom att man dividerar med signalen B. erhålles en dimensionslös storhet. Detta är en fördel. eftersom den dimensionslösa storheten är immun för geometriska artefakter på grund av ytans beskaffenhet, så att endast ändringar i den molekylära sammansättningen kommer att visa sig. Olikformigheter i belysningen (variationer i tid och rum) får likaså ringa betydelse. Vidare uppnås en stark ytter- ligare kontrastförbättring genom att, som experimentellt kon- staterats. fluorescensen i blått (B) tenderar att minska i vissa tumörvävnader, så att just där tumören ligger. täljaren ökar samtidigt som nämnaren minskar i det ovanstående ut- trycket. I vissa fall, då t.ex. tumören är kraftigt färgad av blod. minskas fluorescensen kraftigt på grund av dämpning ge- nom absorption. Emellertid kvarstår kvoten A/B väsentligen oförändrad och visar närvaron av tumören. Detta står i stark 10 15 20 25 30 35 455§ 646 kontrast till de felaktiga resultat som man får vid hittills använda metoder, där endast den totala fluorescensen i rött nätes. Vissa normala vävnader (exempelvis huden hos råttor) uppvisar en naturlig röd fluorescenstopp vid omkring 630 nm, vilken kan förväxlas med HPD. I dylika fall avviker emellertid kvoten A/C (se fig. Za) från vad som är karakteristiskt för HPD. Om man använder den fjärde bilden i systemet för signalen C. kan kvoten A/C bildas i datorn och användas som ett krite- rium för acceptans eller förkastande på data för Fc, som er- hâlles från de andra tre kanalerna. På så sätt är det möjligt att genom att inställa lämpliga tröskelnivåer för denna disk- riminering att bara visa de vävnadsdelar. som har cancervävna- dens typiska egenskaper. Samma typ av kontrastfunktíon (X-Y)/Z kan användas i andra fall, där det föreligger en någorlunda karakteristisk. skarp topp. Exempel på detta är växter, då klorofyll-a uppvisar en skarp topp vid 685 nm.

Detektion av cancervävnader genom HPD är ett särskilt intres- sant exempel pâ uppfinningens användning. eftersom man även vid närvaro av stark bakgrundsfluorescens genom uppfinningen kan använda den för tidig upptäckt av eljest odiagnostiserad- bara cancertumörer i lungor, urinblåsa. matstrupe. magsäck. etc. Normal endoskopisk teknik kan då användas tillsammans med uppfinningen. Tumörstorleken kan uppskattas. och man kan post- operativt kontrollera att tillräckligt mycket vävnad bortta- gits. Den starka ökningen i kontrasten. som erhålles genom uppfinningen jämfört med konventionell avbildning i röd att den tillförda mängden av HPD kan minskas. En fördel därmed är att patientens fluorescens. medför även den fördelen. fotosensibiliseríng minskar. Hed den teknik som för närvarande användes maste patienten undvika starkt dagsljus under en månâd efter en dylik undersökning. Når dosen genom uppfinnin- gen kan minskas. kan detta försiktighetsmått kraftigt reduce- ras, så att man till och med kan tänka sig användning av meto- den för att övervaka vissa riskgrupper av populationen. Det förmodas även att små, tidigare ej observerbara ändringar i fluorescensstrålningen från tumörceller. som så att säga upp- träder naturligt. i framtiden skall kunna utnyttjas för detek- 10 15 20 25 30 35 455 646 tion av tumörer. så att intravenös injektion av främmande äm- nen L kroppen skall kunna undvikas.

Likaså finnes viktiga industriella tillämpningar. Uppfinningen har sålunda redan experimentíellt provats för kontroll av yt- renhet på metallplát före dess målning. varvid i ett automa- tiskt system förorenade plâtar kan utplockas och utsättas för förnyad rengöring. Uppfinningen har även vidare användningsom- råden. Sålunda användes inom den forensiska tekniken fluore- scensmetoder för att göra fingeravtryck synliga, detektera förfalskningar osv. Genom uppfinningen kan dessa metoder för- bättras. möjliggörande exempelvis synliggörande av mycket sva- gare fingeravtryck. även på svåra och hittills såsom omöjliga betraktade bakgrundsmaterial. övervakning kan utföras på liknande sätt, när det gäller be- läggning med rostskyddande oljor och liknande, liksom av färg- skikt och limskikt, eller för studium av korrosion. Det optis- ka systemet kan då, för att erhålla lämpligt synfält. innefat- ta ett teleskop med avpassad synvinkel. Han kan också använda uppfinningen för inspektion av tryckta kretsar o.d. Vid avan- cerade kontrolluppgifter kan den observerade kontrastfunk- tionsbilden jämföras med en standardbild. registrerad i ett datorminne. varvid graden av överensstämmelse bestämmer god- kännande eller kassation. Om upplösningen göres tillräckligt hög. kan en av bildkanalerna utnyttjas för vanlig avbildning. t.ex. i reflekterat ljus. så att man får blandade mätningar i fluoresscens och i vanligt ljus. vid vissa processtyrningsope- rationer, t.ex. övervakning av en kemisk process. kan det räcka med icke-avbildande punktmätningar, så att man använder ett förenklat enpunktssystem med samma stråldelnings- och fil- terfeknik men utnytjar fotomultiplikatorer som detektorer.

Många värdefulla mineraler. och i särskilt hög grad volframmi- neralet scheelít, uppvisar fluorescens. Genom den kontrast- ökande anordningen enligt uppfinningen kan bergartsprover undersökas med hänsyn till bestämda mineralkristaller. Exem- pelvis kan med ett på ett fordon monterat instrument med en 10 15 20 25 30 35 455 646 teleskopadaptor inspektera i stenbrott bergväggar eller lik- nande samt genomskärningar för vägar.

Hed instrumentet utnyttjat i ett teleskop kan undersökningar utföras från luften, exempelvis av oljefläckar eller algblom- ning på vattenytor. I så fall användes företrädesvis en linjär detektoruppsättning. varvid de fyra filtren lägges på rad. och den flygande instrumentbärarens rörelse användes för att alst- ra successiva bildlinjer. ungefär såsom sker vid system för SLAR (Side Looking Airborne Radar). Excitationsljuskällan be- lyser då samtidigt en linje på ytan, vilket inducerar en linje av fluorescensljus. Genom den samtidiga flerfärgsdetektionen elimineras sådana problem som sammanhänger med den snabba rö- relsen. och där normal avsökning medför svårigheter. Hydro- sfärisk dynamik kan även studeras med användning av fluore- scensfärger. exempelvis Rhodamine B. Vidare kan metoden använ- das för att studera påkänningar på vegetationen på grund av torka. insektsangrepp eller sjukdomar.

Som redan nämnts. uppvisar de flesta fluorescensspektra föga av utmärkande struktur. vilket gör diskriminering med hänsyn till substanser svår att utföra med konventionell teknik. I fig. 2b visas tvâ exempel på i huvudsak strukturfria spektra.

Ehuru de båda spektra är mycket likartade, kan små ändringar i lutningarna användas för diskrimineringsändamål. I detta fall kan man bilda tvâ "derivator" vid lämpligt valda våglängder, och kvoten mellan derivatorna (utgörande en dimensionslös kvantitet som enligt ovan är fri från många oönskade störnin- gar) kan beräknas. En lämplig kontrastfunktion kan då vara A-B F = _ C C-D Genom en dylik kontrastfunktion framhäves andelar av den hel- dragna spektralbandskurvan i fig. 2b på bekostnad av den streckade, i det att den heldragna är brantare mellan A och B och lutar mindre mellan C och D än den streckade kurvan. Med hänsyn till att man utan vidare kan från tillverkare beställa 10 455 646 ínterferensfílter med i stort sett godtycklig frekvens och även bandbredd, är det möjligt att tillämpa uppfinningen med stor frihet och varíatíonsrikedom.

Uppfinningen kan även tillämpas med utnyttjande av kända meto- der för s.k. pseudo-färg, i det att man på en video-monitor kan med skilda, godtyckligt valda färger avbilda både skillna- der med hänsyn till våglängd vid olika bildpunkter och med hänsyn till skillnader i intensiteten eller beloppet av de olika. detekterade eller framräknade variablerna för varje bildpunkt.

Claims (9)

10 15 20 25 30 35 455 646 10 Patentkrav

1. Fluorescensanordníng. vari ingår en ljuskälla (1) för belysning av ett fluorescerande föremål. ett filter för utsor- tering av genom belysningen orsakad fluorescensstrålning kom- mande från föremålet och en detektoranordning för detektion av genom filtret transmitterad strålning, varvid mellan föremålet och detektoranordningen är anordnat ett avbildande optiskt system (5,6). vilket har ett föremålet avbildande bildplan. beläget vid detektoranordningen. k ä n n e t e c k n a d av att ett stråldelningssystem ingår i det optiska systemet. bestående av en spegel (6), som är uppdelad i flera före- trädesvis fyra, partier (7-10). vilka är inbördes vinklade för avbildning av föremålet på var sin del av objektplanet, mot- svarande olika delar av detektoranordningen. varvid de olika delarna av strålen är ledda genom var sitt filter (lll-114) med olika frekvenspassband. varigenom de olika delarna av detektoranordningen erhåller var sin avbíldning av föremålet inom olika våglängdsomrâden. vardera avbildningen omfattande ett flertal bildpunkter. för vilka detektoranordningen är anordnad att alstra var sin signal. varvid medel (12) är anordnade att för signaler för varje bildpunkt motsvarande en och samma föremålspunkt utföra en matematisk och/eller logisk operation för erhållande av ett sammanvägt signalvärde för resp. föremålspunkt, samt för att av de sammanvägda signal- värdena för de olika föremâlspunkterna alstra en bild av före- målet.

2. Fluorescensanordning enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d av att filtren är ínterferensfílter.

3. Fluorescensanordning enligt något av'föregâende krav. k ä n n e t e c k n a d av att uttrycket för det sammanvägda signalvärdet kan vara dimensíonslöst och därmed saknar samband med absolutvärden för signalernas intensiteter. 10 15 20 25 30 455 646 ll

4. Fluorescensanordning enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a d av att den matematiska och/eller logiska operationen är växlingsbar och anordnad att styras av en dator för utvärdering, jämförelse med lagrade data och ígenkänning.

5. Fluorescensanordning enligt krav l, k ä n n e t e c k - n a d av att den delade spegeln är en konkav spegel. varvid även dess partier är konkava. k ä n n e t e c k - av att före stråldelningssystemet är anordnat ett

6. Fluorescensanordning enligt krav l, n a d optiskt avbildningssystem (5), exempelvis ett mikroskop, tele- skop eller endoskop. som avbildar föremålet i ett objektplan (4)-

7. Fluorescensanordning enligt krav 6. k ä n n e t e c k - n a d av att ljuskällan är anordnad att via ett andra strål- delningssystem (3) belysa föremålet via det optiska avbild- níngssystemet (5).

8. Fluorescensanordning enligt krav l, k ä n n e t e c k - n a d av att de nämnda bildpunkterna utgöres av punkter på en linje. avbildande föremålet i en dimension. samt en tvådimen- sionell bild är anordnad att erhållas genom ett avsökningsför- farande.

9. Fluorescensanordning enligt något av föregående krav. K ä n n e t e c k n a d laser och att medel är anordnade för att aktivera detektor- av att ljuskällan är en pulseringsbar anordningen (ll) vid varje laserpuls.