SE454301B - Forfarande for framstellning av tarmglukagonantigen och motsvarande antikropp - Google Patents

Description

454 301 2 .

CYS . 1 cystin Cys Gly: glycin His: histidin Pro: prolin Z: karbobensoxigrupp Su: succinimidogrupp Tos: p-toluensulfonylgrupp Boc: tert-butoxikarbonylgrupp.

Tarmglukagon är ett hormon, som spelar en viktig roll vid sockerabsorptionsmetabolismen. Bestämning av tarmglukagon möjliggör diagnostisering av olikartade patologiska tillstånd, som tarmglukagon deltar i, t.ex. diabetes mellitus eller tarm- cancer, samt diagnostisering av sjukdomar såsom tarmsjukdomar (t.ex. diarré, förstoppning, etc.), duodenalulcer, karcinoid, tarmglukagonnoma, etc. Bestämning av tarmglukagon förekommer sålunda i allt större utsträckning inom diagnos, patologi, fysiologi, etc. Tarmglukagon bestämmes medelst en metod såsom en radioimmunoanalysmetod (RIA-metoden) med användning av en antikropp (antiserum), som reagerar med tarmglukagon.

Såsom den antikropp, som kan reagera med tarmglukagon, har man hittills använt antikropp R-64, framställd av Ravazzola et al [se Endocrinology, volym lO5, nr 2, sid. 499-508 (l979L7. En sådan antikropp uppvisar emellertid inte någon specificitet för tarmglukagon.

Under beaktande av den ovan beskrivna situationen har upp- finnarna intensivt försökt att utveckla ett förfarande för framställning av en antikropp med specificitet för tarm- glukagon, som är ytterst effektivt med avseende på bestämning av tarmglukagon enligt RIA-metoden eller liknande och, under loppet av denna undersökning, har uppfinnarna upptäckt att den peptidsekvens, som utgör den 93:e till den lO0:e amino- syran från N-avslutningen i porcinglicentin [§fr. Horm. Metab.

Res., s, 366-371 (197e)], avs.

H-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, är en antigendeterminant för en antikr0PP: Som har specificitet 454 301 till tarmglukagon. Såsom ett resultat av ytterligare forsk- ning baserad på de ovan beskrivna nya upptäckterna har upp- finnarna framgångsrikt syntetiserat ett antigen, som såsom hapten innehåller en peptid innehållande den ovan beskrivna specifika peptidsekvensen och som representeras av den all- männa formeln (1) nedan, och av detta antigen har man fram- ställt en avsedd utmärkt antikropp uppvisande hög specifici- tet för tarmglukagon, som utgör föreliggande uppfinning.

Uppfinníngen innefattar sålunda ett förfarande för framställ- ning av ett tarmglukagonantigen bestående av ett peptidbärar- komplex, vilket förfarande innefattar användning av en peptid representerad av följande allmänna formel (1) såsom hapten: R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH (1) vari R betecknar en väteatom, en aminosyragrupp eller en peptidgrupp innehållande 2-20 aminosyragrupper; samt reaktion av denna med en bärare i närvaro av ett bindemedel för bind- ning av haptenen och bäraren till varandra, samt ett för- farande för framställning av en antikropp med användning av denna antigen.

Fig. l-4 utgör kurvor, som visar specificiteten för antikrop- parna enligt uppfinningen. vid förfarandet enligt uppfinningen är det nödvändigt att såsom hapten använda en peptid, som representeras av den all- männa formeln (l) ovan. Såsom aminosyragrupp, som represen- teras av R i den allmänna formeln (1), belyses exempelvis de följande: H-Arg-, H-Trp-, H-Asn-, H-Ala-, H-Val-, H-Met-, H-Leu-, H-Phe-, H-Lys-, H-Tyr-, H-Ile-, H-Cys-, H-dys-, H-Gly-, H-Cys H-His-, H-Pro-.

Såsom peptidgrupp innehållande 2-20 aminosyragrupper användes exempelvis de följande: H-Gly-Lys-, H-Asn-Tyr-, H-Met-Thr-, H-Met-Asn-, H-Leu-Thr-, H-Trp-Thr-, H-Phe-Val-, H-Gln-Ala-, H-Asp-Arg-, H-Leu-Tyr-, H-Ser-Lys-, H-Met-Asn-Thr-, H-Leu-Met- 454 301 4 .

-Asn-Thr-, H-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- -Thr-, H-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Gln-Asp-Phe- -Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp- -Leu-Met-Asn-Thr-, H-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met- -Asn-Thr-, H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- -Thr-, H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- -Thr-, H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Tr§-Leu-Met- -Asn-Thr-, H-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp- -Leu-Met-Asn-Thr-, H-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe- -Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H~Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg- -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Ser-Lys-Tyr- -Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- -Thr-.

Av dessa föredrages peptider, vari R betecknar en peptidgrupp eller en aminosyragrupp bildad genom successiv avlägsning av l-l9 aminosyragrupper från N-avslutningen av den N-avslutande sekvensen 73-92 i porcinglicentin.

Såsom bärare, som skall vara bunden till haptenen, kan man använda en mängd olikartade högmolekylära naturliga eller syntetiska proteiner, vilka konventionellt användes för fram- ställning av antigener. Såsom exempel kan nämnas animala serumalbuminer (t.ex. hästserumalbumin, nötkreatursserum-, albumin, kaninserumalbumin, humanserumalbumin, fârserum- albumin, etc.), animala serumglobuliner (t.ex. hästserum- globulin, nötkreatursserumglobulin, kaninserumglobulin, human- serumglobulin, fârserumglobulin, etc.), tyroglobuliner från djur (t.ex. hästtyroglobulin, nötkreaturstyroglobulin, kanin- tyroglobulin, humantyroglobulin, fårtyroglobulin, etc.), hemo- globiner frân djur (t.ex. hästhemoglobin, nötkreaturshemo- globin, kaninhemoglobin, humanhemoglobin, fârhemoglobin, etc.), hemocyaniner från djur, proteinextrakt från Ascaris (Ascaris- -extrakt; jfr. den japanska patentansökan (OPI) nr 16414/81), polylysin, polyglutaminsyra, lysin-glutaminsyra-sampolymer, lysin- eller ornitinhaltiga sampolymerer, etc. 454 301 ¿ 5 Ascaris-extraktet beskrives i detalj nedan. Ascaris-extraktet erhålles genom extraktion av malt Ascaris suum enligt vanliga proteinextraktionsförfaranden. Såsom extraherande lösnings- medel kan man använda olikartade kända proteinextraherande lösningsmedel såsom vatten, fysiologisk saltlösning; en 50%-ig vattenlösning av metanol eller etanol, en ungefär neutral buffertlösning, etc., varvid fysiologisk saltlösning är före- 1 dragen. Närmare bestämt erhålles det ovannämnda extraktet exempelvis på följande sätt. Viscera-fri Ascaris suum tvättas med en fysiologisk saltlösning och uppdelas företrädesvis i i fina stycken för att underlätta extraktionen. De fina styckena sättes därefter till ett proteinextraherande lös- ningsmedel såsom en fysiologisk saltlösning âtföljt av extrak- tion under homogenisering av blandningen. Denna extraktion utföres vanligen vid låg temperatur, företrädesvis vid ungefär 2-lO°C. Den så erhållna extraktionslösningen centrifugeras därefter och den överflytande vätskan tillvaratages. Efter dialys av den överflytande vätskan lyofiliseras dialysatet.

Alternativt centrifugeras dialysatet åter och den överflytande vätskan tillvaratages och lyofiliseras efter avlägsning av suspenderat material. På så sätt framställes det avsedda Ascaris-extraktet. Detta kan användas vid föreliggande upp- finning, om så erfordras, efter ytterligare rening enligt vanliga proteinrenande metoder, såsom genom dialys, gelfiltre- ring, adsorption, kromatografi, etc. Ascaris-extrakt beskri- ves exempelvis i J. Immun., lll, 260-268 (1973), J. Immun., 122, 302-308 (1979), J. Immun., 98, 893-900 (1967) och Am. J.

Physiol., 199, 575-578 (1960) eller också kan de som fram- ställes genom ytterligare rening av dessa extrakt användas enligt uppfinningen.

Såsom bindemedel för bindning av haptenen och bäraren till varandra kan man använda de som konventionellt användes för framställning av antigener. Dessa kan närmare bestämt exemp- lifieras med alifatiska dialdehyder, som kan tvärbinda amino- grupperna till varandra, t.ex. glyoxal, malondialdehyd, glutaraldehyd, succinaldehyd, adipoaldehyd, etc.; dimaleimider, som kan tvärbinda tiolgrupperna till varandra, t.ex. N,N'-o- 454 301 6 o -fenylendimaleimid, N,N'-m-fenylendimaleimid, etc.; male- imidokarboxyl-N-hydroxisuccinimidesterföreningar, som kan tvärbinda aminogrupper till tiolgrupper, t.ex. m-maleimido- bensoyl-N-hydroxisuccinimidester, 4-(maleimidometyl)-cykle- hexan-l-karboxyl-N'-hydroxisuccinimidester, etc.; reagenter för användning vid vanliga peptidbindningsbildande reaktioner, som kan binda en aminogrupp till en karboxylgrupp genom en amidobindning, t.ex. dehydratkondenserande medel i form av karbodiimider (såsom N,N-dicyklohexylkarbodiimid, N-etyl-N'- -dimetylaminokarbodiimid, l-etyl-3-diisopropylaminokarbo- diimid, l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-4-etyl)-karbodiimid, etc.); och liknande. Vidare kan man använda en kombination av en diazoniumarylkarboxylsyra (t.ex. p-diazoniumfenylättik- syra) och en vanlig peptidbindningsbildande reagent (t.ex. det ovan beskrivna dehydratkondenserande medlet).

Antigenet enligt uppfinningen framställes genom reaktion av den ovan beskrivna haptenen med bäraren i närvaro av det bindande medlet för bindning av haptenen och bäraren till varandra. Denna reaktion utföres i en vattenlösning eller en vanlig buffertlösning med pH 7-10, företrädesvis 8-9, vid O-40°C, företrädesvis ungefär vid rumstemperatur. Denna reaktion går till fullbordan på ungefär 1-24 timmar. Såsom typiska exempel på den buffert som skall användas vid denna reaktion kan nämnas de följande: ' 0,2 M natriumhydroxid-0,2 M borsyra-0,2 M kalium- kloridbuffert; 0,2 M natriumkarbonat-0,2 M borsyra-0,2 M kalium- kloridbuffert; 0,05 M natriumtetraborat~O,2 M borsyra-0,05 M natrium- kloridbuffert; och 0,1 M natriumdivätefosfat-0,05 M natriumtetraborat- buffert.

Vid den ovan beskrivna reaktionen kan proportionen mellan hapten, bindande medel och bärare rätt bestämmas. Vanligen användes emellertid en föredragen proportion, beräknad på 454 301 7 . vikten, mellan bärare och hapten motsvarande 2:1 till 6:1, mer föredraget 3:1 till 5:1, och ett föredraget molförhål- lande mellan bindemedel och hapten är 5:1 till lO:l. Den ovan beskrivna reaktionen ger ett tarmglukagonantigen enligt uppfinningen, som består av det peptidbärarkomplex, vari bäraren och haptenen är bundna till varandra via bindemedlet för bindning av haptenen och bäraren till varandra. Det antigen, som bildas vid reaktionen, kan lätt isoleras och renas på konventionellt sätt, exempelvis genom dialys, gel- filtrering, fraktionerad fällning eller liknande. Det resul- terande antigenet kan lagras genom lyofilisering på konven- tionellt sätt. I de så erhållna antigenerna enligt uppfin- ningen är vanligen 5-20 mol i medeltal av peptiden bundna till l mol av proteinet. Varje sådant antigen möjliggör framställning av en antikropp med hög specificitet till tarm- glukagon med god reproducerbarhet. Antigener med ett mol- bindningsförhållande peptid till protein av 1:8 till l:l5 har speciellt hög specificitet och möjliggör framställning av en antikropp med hög aktivitet och hög sensitivitet, vilket sålunda är föredraget.

Peptiden med den allmänna formeln (1), som användes enligt uppfinningen, innefattar kända eller nya föreningar, vilka kan framställas enligt de förfaranden som beskrives nedan.

Peptiden med den allmänna formeln (l) kan framställas enligt ett konventionellt sätt för syntetisering av peptider. Man kan använda antingen fastfasförfaranden eller förfaranden i flytande fas, varvid de senare kan vara fördelaktiga i många fall. Sådana förfaranden för syntetisering av peptider beskrivas exempelvis i “The Peptides", volym l (1966) av Schröder och Luhke (Academic Press, New York, A.f.s.) eller "Peptide Synthesis" av Izumiya, et al [Maruzen Co., Ltd. (l975)] och där belyses exempelvis ett azidförfarande, ett kloridförfarande, ett syraanhydridförfarande, ett blandat syraanhydridförfarande, ett DCC-förfarande, ett aktiv ester- förfarande, ett förfarande med användning av Woodwards reagens K, ett karbodiimidazolförfarande, ett oxidations/- 454 501 8 . reduktions-förfarande, ett DCC/additiv~förfarande (t.ex.

HONB, HOBt, HOSu, etc.) och liknande.

Peptiden med den allmänna formeln (1) kan lätt syntetiseras enligt ett förfarande för syntetisering av polypeptider i allmänhet, exempelvis enligt ett s.k. stegvis förfarande för kondensering av aminosyror en efter en till den terminala aminosyran eller enligt ett förfarande för koppling av flera fragment. Den ovan beskrivna peptiden kan närmare bestämt framställas genom kondensering av ett utgângsmaterial, som innehåller en reaktiv karboxylgrupp svarande mot ett av de två fragment som bildas genom separering av peptiden vid en godtycklig bindningsposition med ett annat utgângsmaterial innehållande en reaktiv aminogrupp svarande mot det andra fragmentet på ett sätt som konventionellt användes för syntes av peptider och, när det erhållna kondensatet innehåller en eller flera skyddsgrupper, avlägsning av skyddsgruppen eller -grupperna pâ konventionellt sätt.

Vid reaktionssteget för framställning av peptiden med den all- männa formeln (1) skyddas lämpligen aspartinsyra i många fall och i slutsteget avlägsnas alla skyddsgrupper från den skyd- dade peptiden innehållande minst en skyddad aminosyragrupp för framställning av den avsedda peptiden.

Skydd av de funktionella grupperna,som inte deltar i reak- tionen, skyddsgrupper, avlägsning av skyddsgrupperna samt aktivering av funktionella grupper, som deltar i reaktionen, kan lätt utföras på konventionellt sätt eller utväljas från kända sätt.

Såsom skyddsgrupp för aminogruppen i ett utgångsmateríal kan man exempelvis använda karbobensoxi, tert-butoxikarbonyl, tert-amyloxikarbonyl, isobornyloxikarbonyl, p-metoxibensyl- oxikarbonyl, 2-klorobensyloxikarbonyl, adamantyloxikarbonyl, trifluoroacetyl, ftalyl, formyl, o-nitrofenylsulfenyl, di- fenylfosfinotioyl, etc. Såsom skyddsgrupp för karboxyl- gruppen kan man exempelvis använda en alkylestergrupp (t.ex. 454 501 9 . metylester, etylester, propylester, butylester, tert-butyl- ester, etc.), en bensylester, en p-nitrobensylester, en p-metoxibensylester, en p-klorobensylester, en benshydryl- ester, en karbobensoxihydrazidogrupp, en tert-butyloxikarbo- nylhydrazidogruppf en tritylhydrazídogrupp, eté.

Såsom skyddsgrupp för guanidinogruppen i arginin kan man exempelvis använda en nitrogrupp, en tosylgrupp, en p-metoxi- bensensulfonylgrupp, en karbobensoxigrupp, en isobornyloxi~ karbonylgrupp, en adamantyloxikarbonylgrupp, etc. Guanidino- gruppen kan även skyddas i form av ett salt med en syra (t.ex. bensensulfonsyra, toluensulfonsyra, klorvätesyra, svavelsyra, etc.).

Hydroxigruppen i treonin kan skyddas genom förestring eller företring. Såsom grupp som är lämplig för förestring användes exempelvis lägre alkanoylgrupper (t.ex. en acetylgrupp, etc.), aroylgrupper (t.ex. en bensoylgrupp, etc.), karbonsyragrupper (t.ex. en bensoyloxikarbonylgrupp, en etyloxikarbonylgrupp, etc.) och liknande, såsom grupp lämplig för företring användes exempelvis en bensylgrupp, en tetrahydropyranylgrupp, en tert- -butylgrupp, etc. Hydroxigruppen i treonin behöver emellertid inte nödvändigtvis skyddas. Metionin kan skyddas i form av sulfoxiden.

Såsom exempel på aktiverade karboxylgrupper i utgångsmate- rialet kan exempelvis nämnas syraanhydrider, azider, aktiva estrar (estrar med pentaklorofenol, p-nitrofenol, N-hydroxi- succinimid, N-hydroxibensotriazol, N-hydroxi-5-norbornen-2,3~ -dikarboximid, etc.) och liknande.

Den peptidbindningsbildande reaktionen genomföres i vissa fall i närvaro av ett dehydratiseringsmedel såsom ett karbo- diimidreagens (t.ex. dicyklohexylkarbodiimid eller karbodi- imidazol).

Den peptidbindningsbildande reaktionen kan genomföras 1 när- varo av ett lösningsmedel. Såsom lösningsmedel kan man ut- 454 301 10 välja ett bland de som är kända för att vara användbara vid en peptidkondensationsreaktion. Exempel därpå innefattar vattenfri och vattenhaltig dimetylformamid, dimetylsulfoxid, pyridin, kloroform, dioxan, diklorometan, tetrahydrofuran, etylacetat, N-metylpyrrolidon samt blandningar därav.

Reaktionstemperaturen utväljes lämpligen inom det intervall, som är känt för att vara användbart för peptidbindningsbil- dande reaktioner, vanligen från ungefär -40 till ungefär 60°C, företrädesvis från ungefär -zo till ungefär o°c.

Efter det att den ovan beskrivna kondensationsreaktionen av- slutats kan eventuellt närvarande skyddsgrupper i produkten avlägsnas på konventionellt sätt. Såsom sådant konventio- nellt sätt kan exempelvis nämnas ett reduktionsförfarande (exempelvis hydrogenering med användning av en katalysator såsom palladiumsvart, reduktion med användning av natrium- metall i flytande ammoniak, etc.), acidolys (exempelvis acidolys med en stark syra såsom trifluoroättiksyra, väte- fluorid eller metansulfonsyra).

Peptiden med den allmänna formeln (1) ovan isoleras ur reak- tionsblandningen och renas genom peptidseparerande åtgärder såsom extraktion, fördelning, kolonnkromatografi, etc.

En märkt peptid, som utgör ett utgångsmaterial för framställ- ning av en märkt antigen, som skall användas vid RIA-metoden, framställes genom införande av radioaktiv jod, såsom 1251 1311, i den ovan framställda peptiden. Införande av eller radioaktiv jod genomföres enligt ett vanligt joderingsför- farande, exempelvis oxidativ jodering med användning av kloramin T Åïfr. W.M. Hunter & F.C. Greenwood: Nature, 194, 495 (1962), Biochem. J., 89, ll4 (l963L]. Detta joderings- förfarande genomföres exempelvis i ett lämpligt lösningsmedel såsom 0,2 M fosfatbuffertlösning (pH 7,4) i närvaro av klor- amin T vid ungefär rumstemperatur i 10-30 sekunder. Med av- seende på den proportion mellan peptid, radioaktiv jod och kloramin T, som skall användas, kan nämnas att det föredrages 454 301 ll att använda ungefär l mc radioaktiv jod och ungefär 10-100 nanomol kloramin T per nanomol tyrosinmolekyl, som förekommer i peptiden, varvid en radioaktiv jodatom införes i tyrosin, och att använda ungefär 2 mc radioaktiv jod och ungefär 10-100 nanomol kloramin T per nanomol tyrosinmolekyl, som förekommer i peptiden, varvid tvâ jodatomer införes i tyrosin.

Den så framställda radiojodhaltiga peptiden isoleras och renas enligt ett vanligt separeringsförfarande, t.ex. extrak- tion, fördelning, kolonnkromatografi, dialys, etc. Den så erhållna peptiden kan lagras, om så erfordras genom lyofili- sering.

För framställning av antikroppen med användning av det er- hållna antigenet administreras antigenet till ett däggdjur på konventionellt sätt och den in vivo bildade antikroppen till- varatas. Det däggdjur som användes för framställning av antikroppen är inte särskilt begränsat. Kaniner och marsvin är emellertid vanligen önskvärda. vid framställning av anti- kroppen utspädes en förutbestämd mängd av det enligt det ovan angivna erhållna antigenet med en fysiologisk saltlösning till en förutbestämd koncentration. Denna lösning blandas därefter med Freunds kompletta tillsatsmedel för framställning av en dispersion, som därefter tillföres däggdjuret. Den ovan beskrivna dispersionen tillföres exempelvis en kanin intra- dermalt i en dos av 0,5-5 mg av antigenet per gäng. Därefter upprepas tillförseln vid en dos av 0,5-5 mg en gång varannan vecka i 2-10 månader, företrädesvis 4-6 månader, för immunise- ring av kaninen.

Tillvaratagning av antikroppen kan ske genom blödning av den immuniserade kaninen, när en stor mängd av antikroppen bildas efter den sista tillförseln av dispersionen innehållande antigenet, vanligen l-2 veckor efter den sista tillförseln, samt centrifugering av det så erhållna blodet för separering av antiserum.

Förfarandet enligt uppfinningen har den fördelen att en hög- gradigt aktiv och höggradigt sensitiv antikropp stabilt kan 454 501 12 ' erhållas med god reproducerbarhet, vilken antikropp har en ytterst god specificitet för humant och animalt tarmglukagon baserat på det använda antigenets unikhet.

Den så erhållna antikroppen har en speciellt utmärkt specifi- citet såsom beskrivits ovan och möjliggör bestämning av humant tarmglukagon med hög noggrannhet enligt RIA-metoden. Denna antikropp kan även användas för ett enzym-immunobestämnings- förfarande (EIA), ett fluorescerande immunoanalysförfarande (FIA), etc. genom märkning med ett enzym eller ett fluoresce- rande material. Denna antikropp kan vidare bringas att rea- gera med ett känt olösliggörande material för framställning av en olöslig antikropp.

Uppfinningen beskrives närmare i detalj medelst följande referensexempel och exempel, vilka emellertid inte avses begränsa uppfinningen.

Dessutom kan nämnas att Rf-värdena i referensexemplen bestäm- des tunnskiktskromatografiskt på kiselgel med användning av följande blandade lösningsmedel: Rš .... l-butanol/ättiksyra/vatten (4:l:5) R§I.... 1-butanol/pyriain/ättiksyra/vatten (31=2o=s=24). [?ramställning av peptiden med den allmänna formeln (lL].

Referensexempel 1. (l) Framställning av Z-Ile-Ala-OH. 10,87 g Z-Ile-OSu löst i 50 ml tetrahydrofuran sattes till 30 ml av en vattenlösning innehållande 2,67 g H-Ala-OH och 4,20 ml trietylamin under iskylning. Reaktionslösningen om- rördes vid rumstemperatur i 20 timmar, varefter lösningsmedlet avdestillerades. Återstoden löstes i 100 ml av en 2%-ig tri- etylaminlösning i vatten och tvättades tre gånger med etyl- acetat. Vid surgöring av vattenlösningen med 3 N citronsyra bildades en oljeartad fällning, som därefter extraherades med etylacetat. Extraktet tvättades sedan med l N citronsyra och mättad vattenlösning av natriumklorid, varefter lösningsmedlet 454 301 13 ' avdestillerades. Återstoden överfördes till fast form ur en lösning i metanol och eter för erhållande av 6,5 g slut- produkt; smäicpunkt 1ss-161°c; [äjâo -29,4°c (c = 1,0; metanol). (2) Framställning av Z-Asn-Ile-Ala-OH. 3,36 g Z-Ile-Ala-OH reducerades katalytiskt i ett blandat lösningsmedel bestående av 20 ml metanol och 15 ml vatten i närvaro av palladiumsvart. Den erhållna dipeptiden löstes i 20 ml vatten innehållande 1,4 ml trietylamin och 16 ml tetra- hydrofuran och kyldes till -l0°C. Till denna lösning sattes en blandad syraanhydrid erhållen av 3,46 g Z-Asn-OH, 1,67 ml isobutylkloroformiat och 1,42 ml N-metylmorfolin vid -10°C i en lösning av en blandning av 15 ml dimetylformamid och 20 ml tetrahydrofuran. Reaktionsblandningen omrördes vid OOC i 5 minuter, därefter vid l5°C i 30 minuter, varefter lösnings- medlet avdestillerades. Till återstoden sattes l N citron- syra och den sâ bildade fällningen tvättades med vatten, torkades och fälldes på nytt ur metanol/etylacetat för rening.

På så sätt erhölls 3,60 g av slutprodukten; smältpunkt 24o-244°c (sönaerdeining), [ajàg -13,a°c (c = 1,0; aimetyi- formamid). (3) Framställning av Z-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 4,74 g Z-Asn-Ile-Ala-OH löstes i 20 ml isättiksyra. Därefter tillsattes 25 ml 25%-ig vätebromid i ättiksyra och bland- ningen fick stå vid rumstemperatur i 60 minuter. En fällning bildades genom tillsats av vattenfri eter och denna tillvara- togs genom filtrering, tvättades med eter och torkades över kaliumhydroxid. Den så erhållna dekarbobensoxylerade pro- dukten löstes i 50 ml dimetylformamid innehållande 3,08 ml trietylamin och kyldes till -l0°C. Till denna lösning sattes en blandad syraanhydrid av Z-Asn framställd av 4,18 g Z-Asn-OH, l,60 ml N-metylmorfolin och isobutylkloroformiat. Efter- följande förfaranden genomfördes på samma sätt som beskrivits under (2) ovan för erhållande av 3,60 g av slutprodukten; smältpunkc 235°c (sönaerdelninql: [riff -1o,1°c (c = 0,5; 80 % ättiksyra). 454 301 14 (4) Framställning av Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 3,41 g Z-Asn-Asn-Ile-Ala-OH löstes i 15 ml isättiksyra och 25 ml 25%-ig vätebromid i ättiksyra sattes därtill för av- lägsnande av karbobensoxigruppen såsom beskrivits under (3) ovan. Den erhållna dekarbobensoxylerade produkten löstes i 30 ml dimetylformamid innehållande 1,70 ml trietylamin. Till denna lösning sattes en blandad syraanhydrid erhållen av 3,13 g Z-Lys(Tos)-OH, 0,73 ml N-metylmorfolin och 0,95 g isobutylkloroformiat. På det sätt som beskrivits under (2) ovan erhölls 4,01 g slutprodukt; smältpunkt 229-230°C (sönder- aeiningl; ÅRIÉ3 -19,4°c (c = 1,0; aimecyiformamia).

(S) Framställning av Z-Arg-(N09)-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile- -Ala-OH. 2,03 g Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH löstes i 20 ml isättik- syra. Därefter tillsattes 20 ml 25%-ig vätebromid/ättiksyra för avlägsnande av karbobensoxigruppen såsom beskrivits ovan under (2). I Å andra sidan kvarlämnades 4,l9 g Z-Arg(NO2)-Asn-N2H2-Boc i trifluoroättiksyra i 30 minuter vid rumstemperatur för av- lägsnande av Boc, varefter löstes i 20 ml dimetylformamid.

Till denna lösning sattes successivt 3,61 ml 6 N klorväte- syra/dioxan och 0,96 ml isoamylnitrit vid -l5?C och den er- hållna blandningen omrördes vid -l0°C i 5 sekunder åtföljt av inställning av pH på 7,5. Till denna lösning sattes vid -lO°C 30 ml av dimetylformamidlösningen innehållande den ovan beskrivna dekarbobensoxylerade produkten och 0,64 ml trietyl- amin och reaktionsblandningen omrördes vid 4°C i 20 timmar àtföljt av avlägsnande av lösningsmedlet. Till återstoden sattes lO%-ig ättiksyra och den på så sätt stelnade produkten tillvaratogs genom filtrering, tvättades med vatten, torkades och sköljdes på nytt ur metanol/etylacetat för erhållande av 2,19 g av siutproaukten; smäitpunkt 232-234°c; íëjål -14,3°c (C = 1,0; 80 % ättiksyra). 454 301 15 " - (6) Framställning av Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn- -Ile-Ala-OH. 2,14 g Z-Arg(NO2)-Asn-Lys(Tos)~Asn-Asn-Ile-Ala-OH reducerades katalytiskt i 50 ml 50%-ig ättiksyra i närvaro av palladium- svart för avlägsnande av karbobensoxigruppen. Den erhållna dekarbobensoxylerade produkten löstes i 20 ml dimetylformamid innehållande 2,52 ml trietylamin. Till denna lösning sattes Z-Lys(Tos)-OSu framställd genom reaktion av 2,40 g Z-Lys(Tos)- -OH med 0,64 g N-hydroxisuccinimid i närvaro av l,l4 g di- cyklohexylkarbodiimid utan rening. Reaktionsblandningen om- rördes vid rumstemperatur i 20 timmar, varefter lösnings- medlet avdestillerades. Till återstoden sattes 10 % ättik- syra för att förorsaka stelning. Pâ så sätt erhölls 1,42 g av slutproaukten; smälcpunkt zoo-2o4°c; [QIÉ3 -3o,s°c (c = 1,0; so % ättiksyra). ' (7) Framställning av Boc-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn- -Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 1,38 g Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH löstes i 5 ml isättiksyra och 7 ml 25%-ig vätebromid/ättiksyra sattes därtill för avlägsnande av karbobensoxigruppen såsom beskri- vits ovan under (3). 1,75 g Boc-Leu-Met-Asn-Thr-NZH3 löstes i l5 ml dimetylform- amid och behandlades med 1,43 ml 6 N klorvätesyra/dioxan och 0,38 ml isoamylnitrit på samma sätt som under (5) Qch där- efter sattes reaktionsblandningen till 15 ml dimetylformamid innehållande den ovan beskrivna dekarbobensoxylerade produkten och 0,28 ml trietylamin. Reaktionsblandningen omrördes vid 4°C i 20 timmar, varefter lösningsmedlet avdestillerades. Återstoden underkastades ett motströms fördelningsförfarande i ett l-butanol/2% ättiksyra-system och l-butanolskiktet tillvaratogs med efterföljande avdestillation av lösnings- medlet. Till återstoden sattes etylacetat och den stelnade produkten tvättades med metanol för erhållande av l,lO g av slutprodukten; Rš-värde: 0,28. 454 301 16 ' (8) Framställning av Boc-Trp-Leu-Met-Asn~Thr-Lys(Tos)-Arg- -Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 1,05 g Boc-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn- -Ile-Ala-OH förvarades i 6 ml trifluoroättiksyra vid rums- temperatur i 30 minuter och torr eter sattes därtill. Den så bildade fällningen tillvaratogs genom filtrering, tvättades med eter och torkades över kaliumhydroxid under förminskat tryck för erhållande av den Boc-fria produkten.

Boc-Trp-OSu (framställd genom reaktion av 700 mg Boo-Trp-OH med 265 mg N-hydroxisuccinimid under inverkan av 475 mg dicyklohexylkarbodiimid) löstes i 20 ml dioxan och denna lösning sattes till 15 ml dimetylformamidlösning innehållande den ovan beskrivna Boo-fria produkten och 0,16 ml trietylamin.

Denna reaktionsblandning omrördes vid rumstemperatur i 24 timmar ätföljt av avdestillation av lösningsmedlet. Till återstoden sattes etylacetat och den så stelnade produkten tvättades med etanol för erhållande av 798 mg av slutpro- dukten; Rš; 0,44. (9) Framställning av Boo-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr- -Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)~Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 777 mg Boc-Trp-Leu~Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn- -Asn-Ile-Ala-OH behandlades i 4 ml trifluoroättiksyra för avlägsnande av Boc såsom under (8).

En lösning av 513 mg Boc-Val-Gln-OSu i 10 ml dimetylformamid sattes till en lösning av den ovan beskrivna Boc-fria pro- dukten och 0,02 ml trietylamin i 5 ml dimetylformamid. Denna reaktionsblandning omrördes vid rumstemperatur i 24 timmar, varefter lösningsmedlet avdestillerades. Därefter sattes 10%-ig ättiksyra till återstoden och den så stelnade produk- ten tvättades med vatten och etanol för erhållande av 662 mg av slutprodukten; Rë: 0,26. (10) Framställning av H-Arg-Arg-AlafGln-Asp-2hefVal-GlnfTrp- -Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tosï=Asn*Asn-Ile- -Ala-OH. 454 301 17 645 mg Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn- -Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH förvarades vid rumstemperatur i 40 minuter i närvaro av 4 ml trifluoroättiksyra, 0,4 ml etan- ditiol och 0,2 ml anisol för avlägsnande av Boc såsom under (8) ovan. 783 mg Boc-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-N2H3 (smältpunkt 158-l63°C (sönaeraeiningn ZBIJÉZ -1,o°c (c = 1,0,- aimetyisuifoxian lös- tes i lO ml dimetylformamid och efter tillsats av 0,35 ml 6 N klorvätesyra/dioxan vid -l5°C sattes ytterligare 0,09 ml iso- amylnitrit därtill. Efter omrörning av lösningen vid -lO°C i 5 minuter inställdes lösningens pH på 7,5 med trietylamin.

Den erhållna lösningen sattes till en lösning av den ovan beskrivna Boc-fria produkten och 0,12 ml trietylamin i 10 ml dimetylformamid vid -l0°C. Denna reaktionsblandning omrördes vid 4°C i 20 timmar, varefter lösningsmedlet avdestillerades. Återstoden stelnades därefter genom tillsats av etylacetat, tillvaratogs genom filtrering och torkades.

Utan ytterligare rening underkastades denna reaktionsprodukt för steget innefattande avlägsnande av Boc med 5 ml tri- fluoroättiksyra i närvaro av 0,5 ml etanditiol. Den erhållna Boc-fria produkten löstes i 20 ml av en blandad lösning av l-butanol/metanol/vatten (l:l:l) och lösningen beskickades på en kolonn av "Amberlite IRA-410" (2 x 4 cm) för omvandling av produkten till ett acetat. Det så erhållna acetatet lyo- filiserades, löstes i 1 M ättiksyra, placerades på en "Sephadex G25"-kolonn (3 x 190 cm) och underkastades gel- filtrering med användning av l M ättiksyra såsom eluerings- medel. Fraktioner innehållande slutprodukten (nr 64-80) till- varatogs och lösningsmedlet avdestillerades med efterföljande lyofilisering av återstoden. Denna löstes därefter i 5 ml av ett lägre skikt i ett partridge-system (l-butanol:ättiksyra:- vatten = 4:l:5) och renades medelst ett motströms fördelnings- förfarande av vätskedropptyp med användning av ett övre skikt av samma lösningsmedelssystem. Fraktioner innehållande slut- produkten tillvaratogs och lösningsmedlet avdestillerades med efterföljande lyofilisering för erhållande av 260 mg av slut- 454 301 18 ' produkten; RI: 0,20; RII: 0,65. f f Aminosyraanalys av den syranedbrutna produkten var såsom följer: Lys (2) 2,11, Arg (3) 2,60, Asp (5) 4,74, Thr (1) 0,87, Glu (2) 2,08, Ala (2) 2,17, Val (1) 1,18, Met (1) l,03, Ile (1) 0,95, Leu (1) 1,02, Phe (1) 1,06. (ll) Framställning av H-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg- -Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln~Trp-Leu-Met-Asn-Thr- -Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 485 mg Boc-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-NZH3 (smältpunkt 174-175°c (sönderde1n1ng): ¿Q]š2 -21,s°c (c = 1,0; aimetyl- formamid)) kondenserades med H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val- -Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn- -Ile-Ala-OH enligt ett azidförfarande med användning av 0,15 ml 6 N klorvätesyra/dioxan och 0,31 ml 20%-ig isoamyl- nitrit/dimetylformamid-lösning på samma sätt som under (10).

Efter avslutad reaktion avdestillerades lösningsmedlet. Vid tillsats av etylacetat stelnade produkten. Denna råa produkt löstes i 5 ml av ett lägre skikt i ett partridge-system (l-butanol:ättiksyra:vatten = 4:l:5) och underkastades ett motströms fördelningsförfarande av väteskedropptyp för rening. dFraktioner innehållande slutprodukten tillvaratogs och lös- ningsmedlet avdestillerades. Återstoden löstes i 7 ml av en blandad lösning av l-butanol/metanol/vatten (l:l:l) och pâ- fördes en kolonn av "Sephadex LH 20" (3 x 108 cm) för gel- filtrering med användning av 1-butanol/metanol/vatten (l:l:l) såsom elueringsmedel. Fraktioner innehållande slutprodukten tillvaratogs och lösningsmedlet avdestillerades. Till åter- stoden sattes därefter etylacetat för stelning av produkten.

Den sålunda stelnade produkten behandlades i närvaro av 3 ml trifluoroättiksyra och 0,2 ml etanditiol för avlägsnande av Boc. Den torkade Boc-fria produkten löstes i 5 ml l M ättik- syra och påfördes en kolonn av "Sephadex G50" (3 x 145 cm) för gelfiltrering med användning av l M ättiksyra såsom eluerings- medel. Fraktioner innehållande slutprodukten (nr 43-57) till- 454 301 19 varatogs, varefter lösningsmedlet avdestíllerades. Åter- stoden lyofiliserades därefter för erhållande av 93 mg av slutprodukten; Rš: 0,25; RÉI: 0,54.

Aminosyraanalys av den syranedbrutna produkten (6 N HCl; ll0°C; 24 timmar) var såsom följer: Lys (3) 2,80, Arg (3) 2,89, Asp (6) 6,10, Thr (l) 0,97, Ser (2) 1,79, Glu (2) 2,06, Ala (2) 2,03, Val (1) 0,99, Met (1) 0,87, Ile (1) 1,00, Leu (2) 1,98, Thr (1) 1,00, Phe (1) 1,00. (12) Framställning av H-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 25 mg Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH löstes i 30 ml flytande ammoniak och metalliskt natrium sattes där- till i små stycken. När reaktionslösningen blev blå till- sattes 0,5 g torr ammoniumklorid, varefter ammoniak avdestil- lerades. Återstoden löstes i l M ättiksyra och underkastades gelfiltrering med användning av "Sephadex G10" (4 x 43 cm) med användning av 1 M ättiksyra såsom elueringsmedel. Fraktioner innehållande slutprodukten tillvaratogs och lösningsmedlet avdestillerades, varefter återstoden lyofiliserades för er- hållande av 10 mg av slutprodukten; Rš: 0,01; RII- 0,27. f .

Aminosyraanalys av den syranedbrutna produkten var såsom följer: Lys (2) 1,84 Arg (1) 0,94, Asp (3) 3,08, Ala (1) 1,08 Ile (1) 1,05. (l3) Framställning av H-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg- -Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 10 mg Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn- -Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH behandlades i närvaro av l ml trifluoroättiksyra och 0,1 ml etanditiol för avlägsnande av Boc, varefter produkten behandlades med metalliskt natrium i flytande ammoniak på samma sätt som under (12) ovan för av- lägsnande av skyddsgrupperna. Rening genom gelfiltrering gav 5 mg av slutprodukten; Rš: 0,20; Ršïz 0,49; ÉQIÉ3 -50,0°C 454 301 20 (c = 9,07; 1 M ättiksyra). (14) Framställning av H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp- -Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 100 mg H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- -Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)~Asn-Asn-Ile-Ala-OH behandlades på samma sätt som under (12) ovan för avlägsnande av alla skyddsgrupper. Rening genom gelfíltrering gav 40 mg av slut- produkten; Rš: 0,20; Ršï: 0,51: ZÄIÉB -46,3°C (C = 0,2; l M ättiksyra). (15) Framställning av H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg~Arg-Ala- -Gln-Asp-Phe-Va1-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn- -Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH. 10 mg H-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe- -Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn- -Asn-Ile-Ala-OH behandlades på samma sätt som under (12) ovan för avlägsnande av alla skyddsgrupper och underkastades där- efter gelfiltrering på "Sephadex G-50" (2,5 x 135 cm) med användning av 1 M ättiksyra såsom elueringsmedel. Fraktioner innehållande slutprodukten tíllvaratogs och lyofiliserades för II_ erhållande av 4 mg av slutprodukten; Rš: 0,20; Rf . 0,49; @q7š3 -6o,9°c (c = o,1; 1 M äctiksyra).

[Framställning av antikropg].

Exempel l. 10 mg av den peptid, som erhållits enligt referensexempel l (14) (nedan för enkelhetens skull betecknad “Peptid A"), och 5 mg nötkreatursserumalbumin (nedan betecknat "BSA" för enkelhetens skull) löstes i 2 ml av en ammoniumacetatbuffert- lösning (0,1 M; pH 7,0) och 0,11 ml av en 0,1 M glutaraldehyd- lösning sattes därtill med efterföljande omrörning vid rums- temperatur i 5 timmar. Reaktionsblandningen dialyserades därefter i 48 timmar vid 4°C med användning av 1 liter vatten, varunder vattnet utbyttes 5 gånger. Den erhållna lösningen innehållande peptid/protein-komplex lyofiliserades därefter för erhållande av 14 mg av tarmglukagonantigenet (nedan 454 301 21 betecknat "Antigen I" för enkelhetens och korthetens skull).

Det så erhållna Antigen I underkastades ytterligare gelfilt- rering med användning av “Sephadex G-50" (elueringsmedel: fysiologisk koksaltlösning; detektion: OD 280 mm; eluerings- hastighet: 3 ml/h; dispenserad mängd: l ml portion). Frak- tion (I) innehållande Peptid A bundet till BSA separerades från fraktion (II) innehållande annan produkt (dimer av Peptid A) och fraktion (I) dialyserades mot 0,6 % natrium- klorid i vattenlösning vid 4°C i 24 timmar och lyofiliserades för erhållande av 7 mg vit, pulverartat komplex av Peptid A och BSA (nedan för enkelhetens skull betecknat "Antigen I' “).

Detta komplex utgjorde ett komplex av l mol BSA och i medel- tal 13 mol Peptid A kopplade därtill. Dessutom erhölls detta bindningsförhållande på följande sätt.

Detta sätt innebar att en standardkurva för koncentrationen av Peptid A-dimeren framställdes först, baserat på det faktum att icke-reagerad BSA och Peptid A icke visade sig åter- finnas, och mängden av Peptid A-dimeren i den ovannämnda fraktionen beräknades från standardkurvan. Därefter deduce~ rades mängden på basis av mängden initiellt tillförd Peptid A. Den erhållna mängden Peptid A antogs motsvara mängden Peptid A kopplad till BSA.

Exempel 2. 5 mg av peptiden H-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg~Asn-Lys-Asn-Asn~ -Ile-Ala-OH, som erhållits på samma sätt som beskrivits i referensexempel l (nedan för enkelhetens skull betecknad "Peptid B"), och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetat- buffert (O,l M; pH 7,0). 0,11 ml av en 0,1 M glutaraldehyd- lösning sattes till denna lösning åtföljt av omrörning vid rumstemperatur i 5 timmar. Reaktíonsblandningen dialyserades därefter mot 1 liter vatten vid 4°C i 48 timmar, varunder vattnet byttes 5 gånger. Den erhållna lösningen innehållande komplex av peptid och protein lyofiliserades för erhållande av 9 mg av ett tarmglukagonantigen (nedan för enkelhetens skull betecknat "Antigen II"). 454 301 22 ' Detta Antigen II underkastades ytterligare gelfiltrering med användning av "Sephadex G-50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid B kopplad till BSA från fraktion (II) innehållande annan produkt (Peptid B-dimer) och fraktion (I) dialyserades mot 0,6 % saltlösning vid 400 i 24 timmar och lyofiliserades för erhållande av 6 mg av vitt, pulverartat komplex av Peptid B och BSA. Detta komplex bestod av 1 mol BSA med i medeltal 10 mol Peptid B kopplade därtill.

Exempel 3. 4 mg av den peptid som erhölls i referensexempel 1 (12) (nedan för enkelhetens skull betecknad "Peptid C“) och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetatbuffertlösning (0,1 M; pH 7,0). Till denna lösning sattes 0,11 ml av en 0,1 M glutaraldehydlösning, varefter omrördes vid rumstemperatur i 5 timmar. Reaktionsblandningen dialyserades därefter mot 1 liter vatten vid 4°C i 48 timmar, varunder vattnet byttes 5 gånger. Den erhållna lösningen innehållande ett peptid/- protein-komplex lyofiliserades för erhållande av 7,5 mg av ett tarmglukagonantigen (nedan för enkelhetens skull beteck- nat "Antigen III“).

Detta Antigen III underkastades ytterligare gelfiltrering med användning av "Sephadex G-50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid C kopplad till BSA från fraktion (II) innehållande annan produkt (Peptid C-dimer) och fraktion (I) dialyserades mot 0,6 % saltlösning vid 4°C i 24 timmar och lyofiliserades för erhållande av 5,5 mg vitt, pulverartat komplex av Peptid C och BSA. Detta komplex var ett komplex av 1 mol BSA med i medeltal 8 mol Peptid C kopplade därtill- Exempel 4. 4 mg av peptiden H-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn~Asn-Ile-Ala-OH, som erhållits såsom i referensexempel l (nedan förkortad till "Peptid D"), och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetat- buffertlösning (0,1 M; pH 7,0). Till denna lösning sattes 0,11 ml av en 0,1 M glutaraldehydlösning âtföljt av omrörning vid rumstemperatur i 5 timmar. Reaktionsblandningen dialyse- 454 301 23 ' rades därefter mot l liter vatten vid 4°C i 48 timmar, var- under vattnet byttes 5 gånger. Den erhållna lösningen inne- hållande peptid/protein-komplex lyofiliserades för erhållande av 8 mg av ett tarmglukagonantigen (nedan för korthetens skull benämnt "Antigen IV").

Detta Antigen IV underkastades vidare gelfiltrering med an- vändning av "Sephadex G-50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid D bundet till BSA och fraktion (II) inne- hållande annan produkt (Peptid D-dimer) och fraktion (I) dia- lyserades mot 0,6 % saltlösning vid 4°C i 24 timmar och lyo- filiserades för erhållande av 6 mg vitt, pulverartat komplex av Peptid D och BSA. Detta komplex var ett komplex av 1 mol BSA med i medeltal 9 mol Peptid D kopplade därtill.

Exempel 5. 4 mg av peptiden H-Tyr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, som erhållits såsom i referensexempel l (nedan för korthetens skull benämnd "Peptid E"), och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetatbuffertlösninq (0,1 M; pH 7,0). Till denna lösning sattes O,ll ml av en 0,1 M glutaraldehydlösning åtföljt av omrörning vid rumstemperatur i 5 timmar. Reak- tionsblandningen dialyserades därefter mot l liter vatten vid 4°C i 48 timmar, varunder vattnet byttes 5 gånger. Den er- hållna lösningen innehållande peptid/protein-komplex lyofili- serades för erhållande av 7 mg av ett tarmglukagonantigen V (nedan förkortat till "Antigen V").

Detta Antigen V underkastades ytterligare gelfiltrering med användning av "Sephadex G~50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid E bunden till BSA och fraktion (II) inne- hållande annan produkt (Peptid E-dimer) och fraktion (I) dia- lyserades mot 0,6 % saltlösning vid 4°C i 24 timmar, lyofili- serades för erhållande av 5 mg vitt, pulverartat komplex av Peptid E och BSA. Detta komplex var ett komplex av l mol BSA med i medeltal 6 mol Peptid E kopplade därtill. 454 301 24 Exempel 6. 5 mg av peptiden H-Gly-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, framställd enligt referensexempel l (nedan för korthetens skull betecknad "Peptid F“), och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetatbuffertlösning (0,1 M; pH 7,0). Till denna lösning sattes 0,11 ml av en 0,1 M glutaraldehydlösning åt- följt av omrörning vid rumstemperatur i 5 timmar. Reaktions- blandningen dialyserades därefter mot l liter vatten vid 4°C i 48 timmar, varunder vattnet byttes 5 gånger. Den erhållna lösningen innehållande peptid/protein-komplex lyofiliserades för erhållande av 9 mg av ett tarmglukagonantigen (nedan för korthetens skull betecknat "Antigen VI").

Detta Antigen VI underkastades vidare gelfiltrering med an- vändning av "Sephadex G-50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid F bunden till BSA och fraktion (II) inne- hållande annan produkt (Peptid F-dimer) och fraktion (I) dialyserades mot 0,6 % saltlösning vid 400 i 24 timmar och lyofiliserades för erhållande av 6 mg vitt, pulverartat komplex av Peptid F och BSA. Detta komplex var ett komplex av l mol BSA med i medeltal l4 mol Peptid F kopplade därtill.

Exempel 7. 4 mg av peptiden H-Ala-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, framställd såsom i referensexempel l (nedan för korthetens skull betecknad "Peptid G“), och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetatbuffertlösning (0,1 M; pH 7,0). Till denna lösning sattes 0,11 ml av en 0,1 M glutaraldehydlösning åt- följt av omrörning vid rumstemperatur i 5 timmar. Reaktions- blandningen dialyserades därefter mot l liter vatten vid 4°C i 48 timmar, varunder vattnet byttes 5 gånger. Den erhållna lösningen innehållande peptid/protein-komplex lyofiliserades för erhållande av 7,5 mg av ett tarmglukagonantigen (nedan för korthetens skull betecknat "Antigen VII").

Detta Antigen VII underkastades ytterligare gelfiltrering med användning av “Sephadex G-50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid G bunden till BSA och fraktion (II) inne- 454 301 25 ' hållande annan produkt (Peptid G-dimer) och fraktion (I) analyserades ma: o,s æ saltlösning vid 4°c i 24 timmar och lyofiliserades för erhållande av 5,5 mg vitt, pulverartat komplex av Peptid G och BSA. Detta komplex var ett komplex av l mol BSA med i medeltal 9 mol av Peptid G kopplade där- till.

Exempel 8. 4 mg av peptiden H-Gly-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, framställd såsom i referensexempel l (nedan för korthetens skull betecknad "Peptid H"), och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetatbuffertlösning (0,1 M; pH 7,0). Till denna lösning sattes 0,11 ml av en 0,1 M glutaraldehydlösning åtföljt av omrörning vid rumstemperatur i 5 timmar. Reaktions- blandningen dialyserades därefter mot 1 liter vatten vid 4°C i 48 timmar, varunder vattnet byttes 5 gånger. Den erhållna lösningen innehållande peptid/protein-komplex lyofiliserades för erhållande av 7,5 mg av ett tarmglukagonantigen (nedan för korthetens skull betecknat "Antigen VIII").

Detta Antigen VIII underkastades ytterligare gelfiltrering med användning av "Sephadex G-50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid H bunden till BSA och fraktion (II) innehållande annan produkt (Peptid H-dimer) och fraktion (I) dialyserades mot 0,6 % saltlösning vid 4°C i 24 timmar och lyofiliserades för erhållande av 6 mg vitt, pulverartat komplex av Peptid H och BSA. Detta komplex var ett komplex av l mol BSA med i medeltal 10 mol Peptid H kopplade därtill.

Exempel 9. 12 mg av den peptid, som erhölls enligt referensexempel l (15) (nedan betecknad "Peptid I" för korthetens skull), och 5 mg BSA löstes i 2 ml av en ammoniumacetatbuffertlösning (0,1 M; pH 7,0). Till denna lösning sattes O,ll ml av en 0,l M glutaraldehydlösning âtföljt av omrörning vid rumstemperatur i 5 timmar. Reaktionsblandningen dialyserades därefter mot 1 liter vatten vid 4°C i 48 timmar, varunder vattnet byttes 5 gånger. Den erhållna lösningen innehållande peptid/protein- 454 301 26 ° -komplex lyofiliserades för erhållande av 15 mg av ett tarm- glukagonantigen (nedan för korthetens skull betecknat "Antigen IX").

Detta Antigen IX underkastades ytterligare gelfiltrering med användning av "Sephadex G-50" för separation av fraktion (I) innehållande Peptid I bunden till BSA och fraktion (II) inne- hållande annan produkt (Peptid I-dimer) och fraktion (I) aiaiyseraaes mot 0,6 % saltlösning vid 4°c 1 24 timmar och lyofiliserades för erhållande av 7,5 mg vitt, pulverartat komplex av Peptid K och BSA. Detta komplex var ett komplex av l mol BSA med i medeltal 10 mol Peptid I kopplade därtill.

[Pramställning av antikropp] Exempel 10. 3 mg Antigen I framställt enligt exempel l löstes i 1,5 ml fysiologisk koksaltlösning och 1,5 ml av Freunds kompletta tillsatsmedel sattes därtill till bildning av en dispersion.

Den så erhållna dispersionen tillfördes intradermalt på tre kaniner (vägande 2,5-3,0 kg). Därefter upprepades till- försel vid samma dosering 5 gånger en gång varannan vecka.

Ytterligare tillförsel vid doseringar om hälften av den initiella dosen upprepades 5 gånger en gång varje månad. 10 dagar efter den slntliga tillförseln avblöddes de immuni- serade djuren och det så erhållna blodet centrifugerades för separation av antiserum. På så sätt erhölls en tarmglukagon- antikropp enligt uppfinningen (nedan förkortad till “Antikropp I").

Exempel ll. 3 mg Antigen I' framställt enligt exempel l löstes i 1,5 ml av en fysiologisk koksaltlösning och 1,5 ml Freunds kompletta tillsatsmedel sattes därtill till bildning av en dispersion.

Den så erhållna dispersionen tillfördes intradermalt på tre kaniner (vägande 2,5-3,0 kg). Därefter upprepades tillförsel vid samma dosering 5 gånger en gång varannan vecka. Vidare upprepades tillförsel av halva den inítiella dosen 5 gånger 454 301 27 ' ' en gång varje månad. 10 dagar efter slutlig tillförsel av- blöddes de immuniserade djuren och det så erhållna blodet centrifugerades för separation av antiserum. Pâ så sätt erhölls en tarmglukagonantikropp enligt uppfinningen (nedan förkortad till "Antikropp II").

Exempel 12. 3 mg Antigen IX framställt enligt exempel 9 löstes i 1,5 ml av en fysiologisk koksaltlösning och 1,5 ml Freunds kompletta tillsatsmedel sattes därtill till bildning av en dispersion.

Den så erhållna dispersionen tillfördes intradermalt på tre kaniner (vägande 2,5-3,0 kg). Tillförsel vid samma dosering upprepades därefter 5 gånger en gång varannan vecka. Vidare upprepades tillförsel av halva den initiella dosen 5 gånger en gång varje månad. 10 dagar efter den slutliga tillförseln avblöddes de immuniserade djuren och det så erhållna blodet centrifugerades för separation av antiserum. På så sätt erhölls en tarmglukagonantikropp enligt uppfinningen (nedan betecknad "Antikropp III").

Exempel 13. 3 mg Antigen II framställt enligt exempel 2 löstes i 1,5 ml av en fysiologisk koksaltlösning och 1,5 ml Freunds kompletta tillsatsmedel sattes därtill till bildning av en dispersion.

Den så erhållna dispersionen tillfördes intradermalt på tre kaniner (vägande 2,5-3,0 kg). Därefter upprepades tillförsel vid samma dosering 5 gånger en gång varannan vecka. Vidare upprepades tillförsel av halva den initiella dosen 5 gånger en gång i månaden. 10 dagar efter den slutliga tillförseln avblöddes de immuniserade djuren och det så erhållna blodet centrifugerades för separation av antiserum. På så sätt erhölls en tarmglukagonantikropp enligt uppfinningen (nedan betecknad "Antikropp IV“).

Exempel 14. 3 mg Antigen III framställt enligt exempel 3 löstes i 1,5 ml av en fysiologisk koksaltlösning och 1,5 ml Freunds kompletta tillsatsmedel sattes därtill till bildning av en dispersion. e 454 301 28 ' Den så erhållna dispersionen tillfördes intradermalt på tre kaniner (vägande 2,5-3,0 kg). Därefter upprepades tillförsel vid samma dosering 5 gånger en gång varannan vecka. Vidare upprepades tillförsel av halva den initiella dosen 5 gånger en gång i månaden. 10 dagar efter den slutliga tillförseln avblöddes de immuniserade djuren och det så erhållna blodet centrifugerades för separation av antiserum. På så sätt erhölls en tarmglukagonantikropp enligt uppfinningen (nedan betecknad "Antikropp V").

Exempel 15.

När de antigener som erhållits enligt exemplen 4-8 användes och behandlades på samma sätt som i exempel 10, erhölls antikroppar med hög aktivitet och hög specificitet för tarm- glukagon.

Referensexempel 2.

Framställning av en märkt peptid.

H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln- -Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH märktes enligt ett förfarande med användning av kloramin T.

Därvid tillsattes gradvis lO,pl av en vattenlösning inne- hållande 5 mg av den ovan beskrivna peptiden och lO,ul av en vattenlösning innehållande 1 mc [í25L]Na(MEN) och 20,ug kloramin T till 20,ul av en 1,0 M fosfatbuffertlösning (pH 7,4). Efter 30 sekunder avbröts reaktionen genom till- sats av 5O;4l vattenlösning innehållande 100/zg natriummeta- bisulfat. Reaktionsblandningen påfördes därefter en kolonn av "Sephadex G-10" (1,0 x 30 cm) med användning av 0,1 M ättiksyra såsom elueringsmedel. Eluanten tillvaratogs i l ml-portioner och fraktionerna B-ll tillvaratogs för erhål- lande av en lösning innehållande H-Ser-Lys-[ïlzs-monojodo- -Tyr]-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- -Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys~Asn-Asn-Ile-Ala-OH.

Bestämning av antikroppsaktivitet.

Aktivíteten för var och en av de så erhållna antikropparna bestämdes på följande sätt. Var och en av antikropparna ut- 454 301 29 späddes initiellt med en fysiologisk koksaltlösning till kon- centrationer motsvarande 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, ... .

Till 100,11 av varje utspaaa lösning sattes ioo #1 ”SI-märkt peptid (framställd genom utspädning av den ovan beskrivna lösningen till ungefär 10.000 cpm) och 400¿yl av en 0,05 M fosfatbuffert (pH 7,5) [innehållande 0,25 % BSA, 0,01 M EDTA och "Trasylol" (500 KIV/m1)] och blandningen inkuberades vid 4°C i 66 timmar. Det erhållna komplexet av antikroppen och l25I-märkt antigen separerades från icke-reagerad eller fri 1251-märkt peptid med användning av dextranbelagt aktiverat kol och centrifugeríng vid 4°C vid en hastighet av 3000 varv per minut i 15 minuter. Radioaktiviteten för det så erhållna komplexet bestämdes för att konstatera bindningsförhållandet (%) av 1251-märkt peptid och antikropp vid varje koncentra- tion. Bindningsförhållandet vid varje koncentration infördes i ett diagram med bindningsförhållandet såsom ordinata och den initiella utspädningen av antikropp såsom abskissa. Den grad av antikroppsutspädning vid vilken bindningsförhällandet (%) var 50 % var såsom följer: Antikropp Aktivitet Antikropp I 20.000 Antikropp II 25.000 Antikropp III 25.000 Antikropp IV 10.000 Antikropp V 5.000 Bestämning av tarmglukagonspecificitet.

Pankreatiskt glukagon, peptidsekvensen 80-100 i svinglicentin och tarmglukagon (topp I beskriven i Kenny J., J. Clin.

Endocr., 15, 865 (1955)) användes vid olika koncentrationer såsom testprov. Såsom standarddiluent användes en 0,05 M fosfat/fysiologisk saltlösning (pH 7,5) innehållande 0,25 % BSA, 0,01 M EDTA, "Trasylol" (500 KIV/ml) och 0,01 % NaN3, 400.ul av standarddiluenten, l00,ul av varje testprov, 100 ml Antikropp I framställd enligt exempel 10 (aktivitet 20.000) och 100¿ul 1251-märkt peptid (framställd genom utspädning av den enligt ovan erhållna märkta peptiden till en grad av 454 301 30 - ungefär 10.000 cpm) infördes i ett provrör och inkuberades vid 4°C i 66 timmar. Till blandningen sattes 1 ml av en dis- persion av 0,25 % aktiverat kol belagt med 0,025 % dextran âtföljt av inkubering vid 4°C i 30 minuter. Den så behand- l25I-märkt standardpeptid och icke-reagerad (eller fri) märkt standard- lade blandningen separerades i antikroppsbunden peptid genom centrifugering vid en hastighet av 3000 varv per minut vid 4°C. Radioaktiviteten för varje peptid bestämdes.

Binaningsförhåiianaet (s) för 1251-märkt pepfia och varje prov vid varje koncentration och utspädning bestämdes med bindningsförhållande (Bo) motsvarande aktiviteten för använd antikropp såsom 100 %. De så erhållna resultaten anges i fig. 1. I fig. l representerar ordinatan bindningsförhål- landet (%) (B/Bo x 100) och abskissan representerar koncent- rationen av testprovet (pankreatiskt glukagon och peptid- sekvensen 80-100 i svinglicentin) och graden av utspädning av tarmglukagon (topp I). I fig. 1 betecknar bokstaven (a) pankreatiskt glukagon, bokstaven (b) betecknar peptidsekvensen 80-100 i svinglicentin och bokstaven (c) betecknar tarm- glukagon. Av fig. l framgår att Antikropp I ger en kurva som representerar reaktivitet med pankreatiskt glukagon, som klart kan skiljas från den kurva som representerar reak- tivitet med tarmglukagon. Därav följer att antikroppen enligt uppfinningen inte tvärreagerar med pankreatiskt gluka- gon och har utmärkt specificitet.

Med Antikropparna III, IV och V bestämdes tarmglukagonspeci- ficiteten på samma sätt som beskrivits ovan och de så er- hållna resultaten anges i fig. 2, 3 och 4.

Fig. 2 är en kurva som visar specificiteten för Antikropp III, varvid ordinatan representerar bindningsförhållandet (%) (B/Bo x 100) och abskissan representerar koncentrationen av testprovet (pankreatiskt glukagon och peptidsekvensen 74-100 i svinglicentin) och graden av utspädning av tarmglukagon (topp I). I fig. 2 betecknar bokstaven (a) pankreatiskt glukagon, bokstaven (c) betecknar tarmglukagon och bokstaven (d) betecknar peptidsekvensen 74-l00 i svinglicentin. 454 301 31 ' Fig. 3 är en kurva som visar specificiteten för Antigen IV, vari ordinatan betecknar bindningsförhållandet (%) (B/Bo x 100) och abskissan betecknar koncentrationen av test- provet (pankreatiskt glukagon och peptidsekvensen 89-100 i svinglicentin) och graden av utspädning av tarmglukagon (topp I). I fig. 3 betecknar bokstaven (a) pankreatiskt glukagon, bokstaven (c) betecknar tarmglukagon och bokstaven (e) betecknar peptidsekvensen 89-100 i svinglicentin.

Fig. 4 är en kurva som visar specificiteten för Antikropp V, vari ordinatan betecknar bindningsförhâllandet (%) (B/Bo x 100) och abskissan betecknar koncentrationen av test- provet (pankreatiskt glukagon och peptidsekvensen 93-100 i svinglicentin) och graden av utspädning av tarmglukagon (topp I). I fig. 4 betecknar bokstaven (a) pankreatiskt glukagon, bokstaven (c) betecknar tarmglukagon och bokstaven (f) betecknar peptidsekvensen 93-100 i svinglicentin.

Av fig. 2-4 framgår att alla Antikropparna III, IV och V uppvisar kurvor, som representerar reaktivitet med pankrea- tiskt glukagon, som är klart skiljaktiga från de kurvor som representerar reaktiviteten med tarmglukagon. Därav följer att antikropparna enligt uppfinningen inte tvärreagerar med pankreatiskt glukagon och har utmärkt specificitet till tarm- glukagon.

Claims (2)

454 301 32 ' PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett tarmglukagon- antigen bestående av ett peptidbärarkomplex, k ä n n e - t e c k n a t därav, att man såsom hapten använder en peptid, som representeras av följande allmänna formel: R-Lys-Arg-Asn-Lys~Asn-Asn-Ile-Ala-OH vari R betecknar en väteatom, en aminosyragrupp eller en peptid innehållande 2-20 aminosyragrupper, och bringar densamma att reagera med en bärare i närvaro av ett binde- medel för bindning av haptenen och bäraren till varandra.

2. Förfarande för framställning av en tarmglukagon- antikropp, k ä n n e t e c k n a t därav, att man tillför däggdjur det antigen, som beskrives i patentkravet 1, och tillvaratar den så bildade antikroppen.