SE452251B - Testremsa avsedd att anvendas vid ocklusiv epikutantest for att pavisa kontaktallergi - Google Patents

Description

452 251 i g _ 2 _ Epicon Oy, Finland respektive Square-test från Chemotechnique Diagnostic AB, Malmö, Sverige) eller små filtrerpappersförsedda skivor av aluminium (Al-test från Holister Stier, USA). Alldeles innan testet skall utföras, appliceras lämpligt formulerad testsubstans på "lappen", varefter den direkt appliceras ocklusivt mot normal hud. Är vehikeln vatten, kan man av praktiska skäl låta den formulerade testsubstansen sugas upp i en tyg- eller papperslapp som är placerad i den aktuella skålen- Vanligen är ett flertal "lappar" uppsatta på en självhäftande remsa och täckta med en avrivbar skyddsfolie, vilken avlägsnas strax innan testsubstanserna skall sättas till lapparna.

Den nya tekniken för epikutantestning som presenteras i WO-A-8601994 och Br J Dermatol 112 (1985) s. 63-68 anses av många dermatologer betyda en revolution inom epikutan- testning. Den innebär, att man använder en lapp, pà vilken testsubstansen är preformulerad i en polymer film, som 3 sväller till en gel när lappen är.applicerad ocklusivt mot huden. Metoden har gett mycket reproducerbara testresultat med betydligt lägre mängder testsubstans (jämfört med den allmänt accepterade metoden som utnyttjar Finn Cambersw).

I samband med produktutvecklingen hos sökanden har det dock visat sig, att vid lángtidsförvaring av testmaterial kan problem uppkomma för vissa testsubstanser. Testsubstanserna ifråga är redan tidigare kända för att vara problematiska, på grund av att de är instabila och/eller har ett relativt högt àngtryck. Som exempel kan nämnas formaldehyd, luktämnen i parfymer, smakämnen o s v.

Epikutantestning med lappar har som redan antytts använts i snart ett sekel. Orsaken, till att man i klinisk rutinverk- samhet hållit fast vid att dispensera testsubstansen på lapparna först vid testtillfället, har varit att bra lappar med predispenserad testsubstans ej funnits kommersiellt tillgängliga. Kvaliteten har varit klart otillfredsställande.

Det har varit svårigheter med att framställa lappar som _under en längre tids förvaring innehåller en likvärdig mängd 452 251 testsubstans. Flera av de ovan angivna publikationerna tar upp problemet, men det enda som säges i dem är att lappar med predispenserad testsubstans skall förvaras i tätslutande förpackning. Läckage såväl inifrån som utifrån skall däri- genom förhindras. êxšæee Ett syfte med uppfinningen är att erbjuda lappar och test- remsor som innehåller stabiliserade formuleringar av test- substanser som är avsedda för epikutantestning. Ett andra syfte är att stabilisera testsubstanser som på ett eller annat sätt är instabila när de är formulerade för epikutan- testning på en lapp. Bland mera specifika syften, kan nämnas medel och metoder att användas vid testning på kontakt- allergi mot formaldehyd, komponenter i parfymer, kryddor, lanolin, fettsyror och dylikt.

Uppfínningen De tidigare nämnda svårigheterna kan i betydande grad övervinnas med uppfinningen. Samtidigt kan syftena ovan till" stor del uppfyllas. En aspekt av uppfinningen är en test- remsa avsedd för ocklusiv epikutantestning. Remsan har minst en lapp med testsubstans. Som kännetecknande drag har remsan att minst en av dess testsubstanser är formulerad som ett inneslutningskomplex mellan substansen ifråga och en cyklo- dextrin med förmåga att bilda sådant komplex. Cyklodextrin- komplex är för fackmannen välkända och kallas på engelska för "inclusion complex" eller "host-guest compound". De cyklodextriner som är aktuella skall vara fysiologiskt acceptabla (främst icke-allergena och icke-irrítatíva) och farmacevtiskt acceptabla (d v s vara möjliga att formulera på avsett sätt för epikutantestning). De är uppbyggda av lämpliga monosackaridenheter, som via glykosidbindningar bildar cykliserade polysackaridkedjor. Man känner till att »fas 452 251 _ 4 _ de kan ha från 6 upp till 12 monosackaridenheter, och deras förmåga att bilda inneslutningskomplex har varit känd sedan lång tid tillbaka, men industriellt har detta först ut- nyttjats under det senaste decenniet. De vanligaste an- vändningsomrádena har varit att stabilisera lättoxiderbara ämnen och ämnen som relativt lätt föràngas. Detta har skett inom livsmedels-, parfym- och läkemedelsindustri. Av ekono- miska skäl har det varit föredraget att använda cyklodextriner som är uppbyggda av 6 - 8 stycken alfa-l,4-D-glukopyranos- enheter (kallade alfa-, beta- respektive gamma-cyklodextriner).

Av samma skäl är dessa cyklodextriner föredragna i uppfinningen.

Det är känt att cyklodextriner kan derivatiseras med bibehål- lande av komplexbindande egenskaper. Det finns således partiellt metylerat cyklodextrin samt cyklodextrin som är tvärbundet i.analogi med adsorbenter baserade på dextran (Sephadex® är en sådan adsorbent /Pharmacia AB, Sverige/).

Uppfinningen avser även användningen av komplexbindande cyklodextrinderivat vid epikutantestning. För en översikt av al... olika inneslutningskomplex, med speciell inriktning på “ cyklodextrin och dess användning, hänvisas till Starch/die Stärke 34 (1982) s. 379-85 och die Stärke 29 (1977) s. 26-33.

Ytterligare aspekter av uppfinningen framgår nedan i såväl beskrivning som bifogade patentkrav. - Testsubstanser När en testsubstans får bilda inneslutningskomplex innebär det att den stabiliseras gentemot avdunstning och/eller oxidations- och/eller reduktionsreaktioner. Vissa test- substanser har stora krav på att de måste stabiliseras.

Detta gäller speciellt för sådana vars àngtryck är sådant att signifikanta mängder avdunstar när de är formulerade enligt gängse teknik för epikutantestning. De flesta prob- lematiska testsubstanser återfinns bland de vars àngtryck vid rumstemperatur är högre än 0,01 mm Hg. Andra substanser som kan behöva stabiliseras enligt uppfinningen är de som 452 251 lätt undergâr oxidations- och/eller reduktionsreaktioner.

Många problematiska substanser uppvisar som regel minst en funktionell grupp vald bland olefiniska dubbelbindningar, primära alkoholgrupper, aldehydgrupper och amingrupper.

Testsubstanserna som kan stabiliseras enligt uppfinningen kan uppvisa hydrofob eller hydrofil karaktär, men de största fördelarna uppnås för de som är amfifila. Starkt hydrofila testsubstanser kan vara reversibelt derivatiserade till ett derivat som uppvisar för stabilisering enligt uppfinningen lämplig karaktär. De flesta testsubstanserna man känner till uppvisar såväl hydrofoba som kemiskt reaktiva grupper.

Troligen är en allergen och/eller irritativ egenskap kopplad till förekomsten av just dessa grupper.

Testsubstanserna som användes vid epikutantestning är ofta blandningar av olika kemiska föreningar som förekommer i ett visst sammanhang, t ex i parfymer. Blandningarnas kompo- nenter kan vara klart olika ur kemisk synvinkel, men upp- finningen har visats fungera även för sådana blandningar.

Sålunda är uppfinningen potentiellt användbar för Carba-mix, Kolofonium, PPD-mix (= svartgummi-mix), lanolin, merkapto- mix, Kain-mix, Peru-balsam, Oak moss (abs mousse de Chene), Thiuram-mix, Parabener, Kinolin-mix, parfym-mix etc.

Bland testsubstanser som är distinkta kemiska föreningar och pà vilka uppfinningens sätt att stabilisera är applicerbar kan nämnas: isoeugenol, engenol, geraniol, alfa-amyl kanel- aldehyd, alfa-hexyl kanelaldehyd, kanelalkohol, Kathon (blandning av 5-klor-2-metyl-4-isotiazolin-3-on och 2-metyl- -4-isotiazolin-3-on), p-fenylendiamin och hydroxycitronellal.

Förutom testsubstansen stabiliserad enligt ovan kan test- remsan enligt uppfinningen även innehålla testsubstanser som är formulerade enligt alternativ teknik, exempelvis tidigare känd sådan. 452 251 Enligt uppfinningen kan en testremsa, pà en av sina lappar som testsubstans, innehålla formaldehyd i form av para- formaldehydsinklusionskomplex, speciellt cyklodextrin- paraformaldehydkomplex.

Bildning av inneslutningskomplex Framställning av inneslutningskomplex kan ske som en enkel uppslutning i närvaro av ett lämpligt lösningsmedel (vatten).

I en föredragen utföringsform sker det hela genom att testsubstans och cyklodextrin blandas upp och bearbetas mekaniskt, men det kan även ske genom gängse sätt för att bilda komplexen, t ex genom att låta komplexen precipitera i vattenhaltiga medier.

Genom att variera det molära förhållandet mellan test- substans och cyklodextrin kan den förra mer eller mindre starkt bindas som komplex. Det molära förhållandet styr ga alltså mängden testsubstans som skall kunna avges vid epikutantestning, och det skall därför väljas så att under testning en korrekt mängd kan avges. Det optimala förhål- landet varierar mellan testsubstanser, vehiklar och test- metodik. våra studier i samband med uppfinningen har visat - att generellt är det mest föredraget att testsubstansen, d v s det som avses penetrera huden, och cyklodextrin skall föreligga i ungefärligen ekvimolära mängder (1 25 %) eller med överskott testsubstans.

Det erhållna komplexet kan sedan formuleras i lämplig vehikel, t ex i filmbildande polymerer eller i vaselin, och användas enligt gängse teknik. Se t ex de inledningsvis nämnda teknikerna. Ett mycket fördelaktigt sätt är det som beskrivas i WO-A-8601994. Det innebär att, komplexet inkorporeras i en vehikel som föreligger som en polymer film vilken är svällbar när den appliceras under ocklusion mot hud. Med film avses därvid ett tunt skikt som är mindre än 452 251 0,25 mm tjockt. Metoden i WO-A-8601994 redovisar att filmtjocklekar som är mindre än 0,1 mm såsom mindre än 0,05 mm kan användas. Enligt metoden är filmen applicerad som en lapp på en testremsa.

Vehikeln De mest föredragna vehiklarna är de som vid användningen kan föreligga som en film såsom beskrivits i WO-A-8601994.

Vehikeln kan alltså vara vald bland de ämnen som har film- bildande egenskaper. Vanligtvis är den en polymer som tillsammans med en flyktig vätska, t ex vatten, ger en gel eller koalescerbar emulsion i vilken komplexet ifråga kan fördelas homogent antingen i löst, kristalliserad, mikroni- serad eller dispergerad form; varvid polymeren i den mest praktiska utföringsformen skall vara vald så att gelen eller emulsionen kan torka in till en sammanhängande film när den är utstruken. Vehikeln bör uppvisa hydrofila egenskaper så att fukt vid användningen kan absorberas i den.

Olika egenskaper som återspeglar en polymer vehikels hydro- fila egenskaper är åtkomliga i handböcker och från till- verkare, se t ex (Encyclopedia of Polymer Science and Technology; Plastics, Rubbers, Resins, Fibers; John Wiley & samerna; v01 6 s. 778-779 (1967). Aktuella fiimbiiaanae polymerer väljas företrädesvis bland sådana som innehåller en mångfald polära strukturer, t ex karboxyl- och/eller estergrupper, etergrupper, såsom fullständigt eller parti- ellt alkylerade polysackarider (t ex hydroxypropylerad, karboxymetylerad och metylerad cellulosa) m m), alkohol- grupper (såsom polysackarider (t ex stärkelse) eventuellt i derivatiserade former som de tidigare mämnda alkylerade formerna). Graden av hydrofilicitet bestäms av hur stort inslaget av polära grupper är i en speciell polymer. Film- 452 251 ' _ ".".""I'f'f3¶".ff bildande polymerer baserade på i naturen förekommande polymerer (biopolymerer) uppvisar som regel tillräcklig hydrofilicitet.

Det exakta valet av vehikel beror bl a på komplexet ifråga och det avsedda underlaget (underlaget kan vara av aluminium eller annat material som på testremsan ligger närmast vehikeln).

För metoden enligt WO-A-8601994 har det visat sig att det är väsentligt att välja en filmbildande polymer som tillsammans med ett polärt flyktigt lösningsmedel, företrädesvis vatten, etanol, metanol etc eller homogena blandningar därav, kan bilda en film. För cyklodextrinkomplex är lämpliga polymerer valda bland filmbildande polysackarider och deras derivat.

Speciellt gäller att de ovan givna alkylerade formerna av polysackarider, i synnerhet av cellulosa, har visat sig ha en mycket god balans mellan hydrofilicitet och hydrofobicitet tillsammans med att den har mycket goda filmbildande egenskaper och är icke-irriterande för human hud.

För metoden enligt WO-A-8601994 kan bäraren bestå av en blandning av olika polymerer. Med andra ord, vehikeln skall~ innehålla minst en av de aktuella polymererna. Ett krav är emellertid att blandningen skall vara kapabel att ge en film som sväller när den appliceras ocklusivt mot hud, t ex vid epikutantesning.

Viktiga punkter att tänka på vid val av vehikel är att den skall vara farmaceutiskt acceptabel, icke-irriterande för huden, inert gentemot filmbäraren samt inte väsentligen förändra de allergena och/eller de irritativa egenskaperna hos avsedd testsubstans. 452 251 Framställning av testlapp pà vilken testsubstansen är formulerad i en film.

I framställningen ingår två viktiga delsteg som är av betydelse för resultatet. Komplexet skall fördelas jämnt i det filmbildande materialet, och detta i sin tur skall strykas ut som en jämntjock film på lämpligt underlag (=filmbärare). För val av filmbärare, se de allmänna rikt- linjer som ges i WO-A-8601994.

I den för närvarande bäst kända metoden för att tillverka filmen, sättes komplexet till en filmbildande polymer (vehikel) vilken är upplöst eller gelad i en flyktig vätska.

Detta kan ske genom att man dispergerar eller emulgerar komplexet homogent i finfördelad form in i gelen. I princip är det även möjligt att tillverka komplexet in situ i den gelade polymeren genom att sätta testsubstans och cyklo- dextrin till gelen innan den strykes ut på sitt underlag.

Filmbäraren belägges sedan med ett jämntjockt gellager som får torka, och detta material kan sedan delas upp i lämpligt antal företrädesvis likformiga och till ytan lika stora lappar. Den torkade filmen kan fås med olika tjocklek beroende på den pàlagda mängden gel. Ytan av lapparna kan vara 0,2 - 4 cmz. Mängden per ytenhet av testsubstans i * filmen varierar beroende på allergen (testsubstans), cyklo- dextrin, molförhàllande mellan cyklodextrín och test- substans, vehikeln etc. Vissa allergen är mera potenta än andra så att fackmannen måste experimentera sig fram till lämplig effektiv mängd per ytenhet. Med effektiv mängd per ytenhet menas den mängd testsubstans som använd i testen framkallar en allergisk reaktion eller irritationsreaktion i flertalet sensibiliserade respektive normala individer.

Lapparna placeras sedan på självhäftande material, som erbjuder minst ca 1 cm överskjutande marginal runtom mot 452 251 ' ' '°"""T!"'.I1'.!I _ 10 _ varje lapp (filmsidan skall därvid vara vänd från mate- rialets självhäftande sida). Lappens geometriska form är ej kritisk för uppfinningen. I princip kan alltså remsor användas ekvivalent med andra former.

För att underlätta testförfarandet kan flera lappar, med olika allergen och/eller med ett och samma allergen, men i olika mängd per ytenhet, i förväg placeras på samma bit av ett självhäftande material. Uppfinningens testremsa inne- häller minst en lapp med en testsubstans som är formulerad som ett cyklodextrinkomplex. Testremsor som innehåller flera lappar är avsedda för samtidig testning mot ett flertal allergener, respektive flera mängder per ytenhet av samma allergen pá en patient. Sådana remsor kan innehålla lappar svarande mot en standardpanel och varje remsa kan innehålla upp till 25 företrädesvis upp till 12 lappar.

Testförfarandet Detta sker på i och för sig känt sätt men med minst en testsubstans formulerad enligt uppfinningen, företrädesvis i form av en testremsa med minst en lapp. Man fäster således en eller flera lappar (testremsor) på patienten, så att vehíkeln (filmen) bringas i kontakt med huden inom testom- rådet, varefter remsan tätande trycks fast mot huden.

Uppfinningen skall nu áskádliggöras med ett antal icke- begränsande exempel. 452 251 _11..

Exempel 1 Framställning av testremsa som innehåller en lapp med parfymmix i form av cyklodextrinkomplex som testallergen 5,4 g av en parfymblandning (lika mängd i gram av geraniol, kanelaldehyd, hydroxycitronellal, kanelalkohol, eugenol, isoeugenol och alfa-amylkanelaldehyd adderades droppvis under omröring vid rumstemperatur till en blandning av beta-cyklodextrin (30 g) och destillerat vatten (30 g).

Omröringen fick fortgå tills dess att komplexet bildats (blandningens konsistens förändrades märkbart), varefter 5 g Klucelø GF (hydroxypropylcellulosa, Hercules Inc., USA) gelad i 100 g destillerat vatten enligt tillverkarens anvisningar, tillsattes och rördes om kraftigt tills dess att blandningen var homogen. Den gelartade blandningen lades och spreds ut som en jämntjock film (omkring 0,1 mm tjock) pà ett 0,03 mm tjockt polyesterark (Mylarø), som korona- behandlats. Efter torkningen erhölls en tunn smidig samman- ü% hängande film som var ca 0,01 mm tjock. Pâ liknande sätt men med utelämnande av cyklodextrin framställdes filmbelagda ark där testallergenet ej var komplexbundet (jfr WO-A-8601994).

De filmbelagda arken delades sedan upp i 1 cmz stora kvad- ratiska lappar som placerades på självhäftande remsor “_ (akrylathäfta (Lysaporø) från Cederroth, Sverige) med en överskjutande marginal pà minst 1 cm, varefter varje test- remsa förpackades ljus-, luft- och fukttätt i aluminiumfolie.

Det hela lagrades sedan i 1,5 månader vid +40 °C (komplex- bundet testallergen) eller 2 veckor vid samma temperatur (icke-komplexbundet allergen). Mängden testallergen/cmz bestämdes dels initialt och dels efter lagring enligt ovan.

Metoden som användes innebar att en lapp med känd area extraherades med etanol varefter det erhållna extraktet analyserades gaskromatografiskt på kapillärkolonn (Hewlett- Packard 5700) med flamjonisationsdetektor. Resultat se tabell 1. 452 251 _ 12 _ É맧lš_l A. Parfym + cyklodextrin Koncentration (mg/cmz) Initialt Lagring 1,5 månader vid +40 OC Geraniol 0,011 0,019 Kanelaldehyd 0,008 0,010 Hydroxycitronellal 0,008 0,012 Kanelalkohol 0,013 0,018 Eugenol _ W 0,009 0,008 Isoeugenol 0,004 0,003 -amylkanelaldehyd 0,010 0,007 B. Enbart parfym Initialt Lagring 2 veckor vid +40 °c Geraniol 0,013 < 0,0001 Kanelaldehyd 0,011 < 0,0001 Hydroxycitronellal 0,026 0,002 Kanelalkohol 0,36 < 0,0001 Eugenøl 0,024 < 0,0001 Isoeugenol 0,031 0,0001 ~amylkane1a1dehyd 0,045 0,0003 452 251 _13- '.'.'7"1fi|-V' Resultaten visar entydigt, att om testallergenet föreligger som cyklodextrinkomplex förstörs i princip inget under de angivna betingelserna. Det icke-komplexbundna däremot förstörs snabbt. Det torde sålunda vara svårt att utan stabilisering garantera mängden av en instabil testsnbstans i en lapp.

Testremsor innehållande lappar med parfym-cyklodextrin- komplex testades sedan kliniskt på 11 patienter med känd parfymallergi. Som jämförelsematerial användes motsvarande lappar utan cyklodextrin eller Finn Chambersø metodik med testallergen i vaselin. Remsorna placerades då under ock- lusion på respektive patients rygg, efter 48 timmar togs remsorna bort och efter ytterligare 24 timmar skedde av- läsning. Resultaten för uppfinningens lappar visade god överensstämmelse med Finn Chambersø metodik, men uppfinningens administreringsform saknar de nackdelar som är förbundna med Finn Chambers metodik.

Jämförelse mellan icke-komplexbunden och komplexbunden parfymkomponent (båda inkorperade i film av K1ucel®) visade att den komplexbundna formen var överlägsen. 452 251 _ 14 _ Exempel 2 Framställning av testlapp som innehåller formaldehyd i form av paraformaldehyd - cyclodextrinkomplex 0,5 g paraformaldehyd blandades homogent med 11,8 g beta- cyclodextrin, varefter 12 g gel av Klucelø G (Kluce1®: vatten = 1:6 (w/w)) tillsattes. Blandningen knàdades kraftigt tills dess att den var homogen, och därefter t trycktes den som en 0,1 mm tjock film på ark av Mylarø.

Tryckningen skedde på samma sätt som i exempel 1. Arken lagraaes tättslutanae aan mörk: vid -zo °c, +s °c och +40 °c under 25 dygn. Mängden paraformaldehyd bestämdes enligt Sawicki et al (Anal Chem 33(196l) s 93-) Éâ䧚l-š Lagringsbetingelser Initialt Efter 25 dagar i 2 2 varde mg/cm mg/cm -20 °c 0,07 0,07 +s °c 0,01 0,17 +40 °c o,o7 _ o,o7 " Separat framställda ark delades upp i l cmz stora kvadra- tiska lappar som placerades pà självhäftande remsor av plàstertyp (Cederroths akrylathäfta (Lysapor®)) och stu- derades kliniskt pà samma sätt som i exempel 1. De erhållna resultaten var i överensstämmelse med tidigare diagnos.

Claims (1)

1. 452 251 _15- Patentkrav Testrema med minst en lapp och avsedd att användas vid ocklusiv epikutantest för att påvisa kontaktallergi, k ä n n e t e c k n a d av att på minst en av lapparna föreligger testsubstansen som ett inneslutningskomplex med en cyklodextrin som har förmåga att bilda inne- slutningskomplex med testsubstansen och som är uppbyggd av 6 - 12 stycken alfa-1,4-glukopyranosenheter. . Testremsa enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att inneslutningskomplexet pà minst en av lapparna har formaldehyd i form av paraformaldehyd som testsubstans. Testremsa enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att på minst en av lapparna med inneslutningskomplex är testsubstansen en blandning av kemiska ämnen, såsom i karba-mix, lanolin, merkapto-mix, kolofonium, Peru-A balsam, oak moss, PPD-mix, Parfym-mix etc. Testremsa enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e - t e c k n a d av att på minst en av lapparna är testsubstansen, företrädesvis den som föreligger som ett inneslutningskomplex, formulerad i en polymer film" som sväller till gel när lappen appliceras under ocklusion mot hud. Testremsa enligt något av kraven 1 - 4, k ä n n e - t e c k n a d av att, i minst en av lapparna som uppvisar inneslutningskomplexet, är molförhållandet mellan testsubstansen och cyklodextrin större än 75 %. .._,,.. 'IF