SE447628B - Medicinskt material med antikoagulerande aktivitet vilket utgores av berarmaterial varpa heparin och antitrombin iii er samimmobiliserade - Google Patents

Description

TO fis 25 30 40 447 628 blodkoagulering och trombusbildning har det visat sig att en yt- terst hög antikoagulerande aktivitet kan erhållas när heparin och antitrombin III immobiliseras tillsammans på ett bärarmate- rial. I jämförelse med immobilisering av enbart heparin ger sam- immobiliseringen av dessa substanser en ytterst överlägsen anti- koagulerande aktivitet. Det är fördelaktigt att en tillräckligt antikoagulerande aktivitet kan iakttagas till och med med små mängder av de antikoagulerande substanserna och en anmärknings- värd antikoagulerande aktivitet kan till och med förlänas ett bärarmaterial uppvisande få funktionella grupper. t Samverkan av heparin och antitrombin III för utövande av antikoagulerande aktivitet är välkänd. Eftersom antitrombin III väsentligen ingår i blod har man allmänt antagit att antitrombin -III som är nödvändig för samverkan med heparin för utövande av antikoagulerande aktivitet kan tillföras naturligt från blodet i sig. Följaktligen har immobilisering av heparin föreslagits _och i själva verket genomförts men dess samtidiga immobilisering med antitrombin III har aldrig föreslagits. Upptäckten att sam- immobiliserad heparin och antitrombin III ger upphov till en av- sevärt högre antikoagulerande aktivitet än heparin som immobili- serats för sig är följaktligen helt oväntad och överraskande.

Nyligen genomförda studier har avslöjat att koaguleringen av blodet sker genom verkan av den aktiverade X-faktorn (dvs Xa- faktorn). Denna bildar nämligen trombin, varigenom fibrin separe- ras och blodkoagulering äger rum. Baserad på denna mekanism är det vid förhindrande blodkoagulering betydelsefullt att Xa-fak- torn inaktiveras av vilken faktor en enhet kan ge upphov till ca 50 NIH-enheter trombin. Det har visat sig att samimmobilise- ring av heparin och antitrombin III är helt effektivt med av- seende på inaktivering av Xa-faktorn. Fastän antitrombin III isig kan inaktivera Xa-faktorn gör samexistensen av heparin det möj- ligt att en sådan inaktiveringseffekt utövas ögonblickligen.

Enligt uppfinningen erhålles ett artificiellt medicinskt material uppvisande antikoagulerande aktivitet som innefattar ett bärarmaterial, samt heparin och antitrombin III samimmobili- serade därpå.

Föreliggande uppfinning kännetecknas därav att heparin och antitrombin III immobíliseras i det tillstånd, varvid de existe- rar samtidigt. Själva immobiliseringsförfarandet är ej karaktä- ristiskt för uppfinningen och immobiliseringen av de aktiva subs- 21-/ 10 15 25 30 35 40 3 447 628 tanserna kan åstadkommas genom vilken som helst konventionell teknik anpassad för immobilisering av enzymer lfimf. Ichiro Chibata et a1.: "Koteika Koso (Immobilized Enzymes)", publicerad av Kodansha (l975); "Seikagaku Jikken Koza (Series of Experiments in Biochemistry)", Vol. 5, Method for Investigation of Enzymes, del VI, Immobilized Enzymes, p 642-666 (1975); "Shin Jikken Kagaku Koza (Series of New Experimental Chemistry)", Vol. 20, Biological Chemistry I, Chapter I, Article 5, Immobilized Enzymes, p 363-409 (1978); O.R. Zaborsky, "Immobilized Enzymes", Chemical Rubber Co., Press (1973); samt i dessa texter citerade referenserj.

Vid framställning av föreliggande artificiella medicinska material kan vilket som helst lämpligt förfarande utväljas av olika konventionella metoder för immobilisering av enzymer, så- som bärarbindningsmetoden [kovalent bindningsmetod, jonbindnings- metod, fysikalisk adsorptionsmetod), förnätningsmetoden och inne- slutningsmetoden. När exempelvis bärarbindningsmetoden användes är vilket som helst konventionellt bärarmaterial, såsom ett vat- -tenolösligt polymermaterial (exempelvis cellulosa, dextran, aga- ros, polyakrylamid, polyvinylalkohol, polyhydroxietylmetakrylat) eller användningsformen för det artificella medicinska materialet kan vilket som helst lämp- användbart. Beroende på påförings- ligt bärarmaterial uppvisande lämpliga fysikaliska egenskaper ut- väljas. Genom immobilisering av heparin och antitrombin III i samexísterande tillstånd kan en tillräcklig antikoagulerande aktivitet uppnås till och med med relativt små mängder av de ak- tiva substanserna; därför är till och med ett bärarmaterial upp- visande få funktionella grupper ändock användbart.

Beorende på det använda immobiliseringsförfarandet kan akti- vering av bärarmaterialet ibland fordras före användningen därav.

Också en sådan aktivering åstadkommas genom vilket som helst lämp- ligt förfarande som utväljes av konventionella sådana, exempel- vis genom behandling med bromcyanid. Det finns inga speciella be- gränsningar med avseende på mängderna av heparin och antitrombin III som skall immobiliseras på bärarmaterialet. Vanligen användes 1-50 mg heparin och l-50 mg antitrombin III per 1 g av bärarma- terialet för erhållande av ett artificiellt medicinskt material uppvisande god antikoagulerande aktivitet. Förhållandet av mängden av heparin och antitrombin III som skall immobiliseras är ej heller speciellt begränsat men är vanligen 1:1 till 10:1 (viktförhållande). Fastän heparin och antitrombin III kan immo- 10 15 20 25 30 35 40 4 4-47 628 biliseras separat i successiva steg är símultan immohilisering fördelaktigare med avseende på enkelheten av operationen. 0 Det artificiella medicinska materialet enligt uppfinningen kan framställas i vilken som helst lämplig form, såsom pulver, plattor eller rör beroende på bärarmaterialets fysikaliska egen- skaper; När blod kommer i kontakt med detta medicinska material infångas trombin och andra element lätt därigenom och blodkoagu- Q lering förhindras följaktligen. 1 Trombinet som infångas med det artificiella medicinska g materialet kan lätt frigöras därifrån, exempelvis genom tvättning med en vattenhaltig lösning av ättiksyra sålunda att det artificiella medicinska materialets förmåga att infånga trombin återfås.

Föreliggande uppfinning förklaras närmare i följande exem- pel och referensexempel.

Exempel 1 t c (A) Agaros (Sepharos 4B, 40 ml, torrvikt ca 1 g) uppslammas i vatten (100 ml) och en vattenhaltig 5-10 N NaOH-lösning sättes därtill under omröring för åstadkommande av ett pH-värde av 11-12.

Till denna supension sättes en BrCN-lösning (4-24 g/80-480 ml) under det att pH-värdet av 11-12 upprätthålles genom tillsats av den vattenhaltiga NaOH-lösningen tills en sänkning av pH-värdet ej iakttages. Under reaktionen hålles temperaturen av reaktions- lösningen vid ca ZOOC genom tillsats av is. Reaktionen är full- bordad inom 8-12 minuter. Efter fullbordande av reaktionen filt- reras reaktionsblandningen omedelbart genom ett glasfilter och filtratet tvättas med kallt vatten (1 liter) för eliminering av överskott av BrCN, varigenom aktiverad agaros erhålles. 1 (B) Aktiverad agaros (500 mg) uppslammas i en vattenhaltig 0,1-M NaHCO3-lösning (5 ml) och en lösning av heparin (100 mg) och antitrombin III (12,5 mg) i en vattenhaltig 0,1-M NaHCO3- _lösning'(10 ml) sättes därtill. Brhållen blandning omröres vid 4°C över natten. För blockering av överskott av aktiva grupper i aktiverad agaros tillsättes en vattenhaltig 1-M etanolaminlös- ning (pH 8,0, 10 ml) och efter omröring vid 40C under en timme tvättas reaktionsblandningen med en vattenhaltig 2-M NaC1-lös- ning och en vattenhaltig 0,15-M NaCl-lösning i följd för er- hållande av ett heparin-antitrombin-III-immobiliserat material (betecknas hädanefter "I-ATIII-HEP") vari 20 mg heparin och 5 mg “ antitrombin III immobiliseras per 200 mg aktiverad agaros. I ' Pâ samma sätt som ovan erhålles ett heparinimmobiliserat s 10 15 20 30 5 447 628 material (betecknas hädanefter "T%EP") vari 20 mg heparin immo- lfiliserats per 200 mg aktiverad agaros och _ antitrombin III- immobiliserat material (betecknas hädanefter "I-ATIII") vari 5 mg antitrombin III immobiliserats per 200 mg aktiverad agaros.

Antitrombin III uppvisar ej en antikoagulerande aktivitet om det ej immobiliseras under skyddsverkan av heparin; följaktligen ínneslutes vid framställningen av det senare materialet acety- lerad heparin i en 8-faldig mängd i förhållande till antítrombin III i reaktionssystemet så att aktiviteten av antitrombin III skyddas och det ímmobiliseras ensamt på aktiverad agaros.

För framställning av ett kontrollprov behandlas aktiverad agaros på samma sätt som ovan men utan användning av heparin eller antitrombin III.

(C) Cítrathaltig plasma (0,2 ml, en övervätska som erhållits genom centrifugering av en blandning av blod och en vattenhaltig 3,8-procentig natriumcitratlösning, (9:1 baserat på volym) vid 3000 rpm under 15 minuter) infördes i ett av glas framställt litet provrör och värmdes vid 37°C och en lämplig mängd av ett immobiliserat material sattes därtill. Omedelbart därefter till- sattes en vattenhaltig 1/40-M kalciumkloridlösning (0,2 ml) och provröret skakades försiktigt i en inkuberingsanordning vid 37°C.

Erforderlig tid för koagulering av plasmat bestämdes. Resultaten anges i tabell 1.

Tabell 1 Immobiliserat Koaguleringstid (sek.) materlal Mängd använt immo- Mängd använt immo- biliserat material biliserat material (1 mg) (2,5 mg) Kontroll 190 120 I-HE? _ 205 370 I~ATIII 225 550 I-ATIII-HEP 1200 24 h eller mer Av denna tabell är det uppenbart att I-ATIII-HEP förlänger tiden för blodkoagulering avsevärt i jämförelse med I-HEP eller I-ATIII.

Exempel Z (A) Polyhydroxietylmetakrylat (betecknas hädanefter "Poly- HEMA", 100 mg) tvättades med vatten och neddoppades i en 0,1-M vattenhaltig NaZCO3-lösning (pH 11,0) över natten. Den sålunda 10 15 20 50 40' 6 447 623 svällda substansen uppslammades i Na2C03-lösningen och pH-värdet justerades till 11,5-12,0 genom tillsats av en 1-N vattenhaltig -NaOH-lösning, varvid den totala volymen av blandningen justerades till 20 ml. Under omröring tillsattes en BICN-lösning (20-1000 mg/20 ml, justerad till pH 11,5-12,0 med en vattenhaltig I-N NAOH- lösning) och reaktionen genomfördes vid ca 10°C under 30 minu- ter vid ett pH-värde av 11,5-12,0. Efter fullbordande av reak- tionen filtrerades reaktionsblandningen medelst ett glasfilter och tvättades därefter med en 0,1-M vattenhaltig NaHC03-lösning upprepade gånger för erhållande av aktiverad Poly-HEMA.

(B) Aktiverad Poly-HEMA (100 mg) uppslammades i en vatten- haltig 0,1-M NaHCO3-lösning (2 ml) och en lösning av heparin (20 mg) och antitrombin III (2 mg) i en vattenhaltig 0,1-M NaHC03-lösning (3 ml) sattes därtfll. Erhållen blandning om- rördes vid 4°C över natten. För blockering av överskott av aktiva grupper i aktiverad Poly-HEMA tillsattes en vattenhaltig 1-M etanolamínlösning (pH 8,0, 1 ml) och efter omröring vid 4°C under 1 timme tvättades reaktionsblandningen med en vattenhaltig Z-M NaCl-lösning och en vattenhaltig 0,15-M NaCl-lösning i följd för erhållande av ett immobiliserat heparin-antitrombin-III- material (betecknas hädanefter "I'-ATIII-HEP“).

På samma sätt som ovan framställdes ett heparinimmobili- serat material vari Z mg heparin immobiliserats per 100 mg ak- tiverad Poly-HEMA (betecknas hädanefter "I'-HBP") och ett anti- trombin-III-immobiliserat material vari Z mg antitrombin III 'immobiliserats per 100 mg aktiverat Poly-HEMA (betecknas hädan- ' efter "1'-ArxII"). Antitrombin 111 uppvisar ej någon .' antikcagulerande aktivitet om den ej immobiliserats under skydds- verkan av heparin; vid framställning av det senare materialet inneslutes följaktligen acetylerad heparin i en 8-faldig mängd till antitrombin III i reaktionssystemet för skyddande av akti- viteten av antitrombin III och för immobilisering av enbart denna på aktiverad Poly-HEMA.

För framställning av ett kontrollprov behandlades aktive- rad Poly-HEMA på samma sätt som ovan men utan användning av heparin eller antitrombin III. ] (C) Citrat-innehållande plasma (0,2 ml, en övervätska.som erhållits genom centrifugering av en blandning av blod och en 3,8-procentig vattenhaltig natriumcitratlösning, 9:1 baserad på volymen, vid 3000 rpm under:15 minuter) infördes i ett av 10 15 20 25 7 443 628 glas framställt litet provrör och värmdes vid 37 C och det immo- biliserade materialet (1,25 mg) sattes därtill. Omedelbart där- efter tillsattes en 1/40-M kalchnmdoridüßning (0,2 ml) och prov- röret skakades försiktigt i en tank med konstant temperatur vid 37°C. Tiden som fordrades för koagulering av plasma bestämdes.

Resultaten anges i tabell 2.

Tabell 2 Immobiliserat material Koaguleringstid (sek.) Kontroll 120 I'~HEP 170 I'-ATIII 150 I'-ATIII-HEP 250 Av denna tabell är det uppenbart att I'-ATIII-HEP avsevärt förlänger tiden för blodkoagulering i jämförelse med I'-HEP el- ler I'-ATIII.

Exempel 3 Samma förfarande som i exempel 2 genomfördes men med an- vändning av polyvinylalkohol i stället för Poly-HEMA. Sålunda erhållen heparin-antitrombin-III-immobiliserad-polyvinylalkoho1 visades ha en väsentligt mer uttalad antikoagulerande aktivitet i jämförelse med en immobíliserad polyvinylalkohol vari enbart heparin eller antitrombin immobiliserats.

Exempel 4 Vart och ett av materialen I-ATIII-HEP, I-ATIII och I-HEP som erhållits i exempel l (vardera 10 mg) uppslammades i en vattenhaltig 0,15-M NaCl-lösning (0,2 ml). Till I-ATIII-HEP- suspensionen sattes en vattenhaltig 0,15-M NaCl-lösning (0,1 ml).

Till IrATIII-suspensionen sattes en heparinlösning (165 enheter/ ml, 0,1 ml) och till I-HEP-suspensionen sattes en antitrombin- III-lösning (1 mg/ml, 0,1 ml). En trombinlösníng (i systemet för mätning av koaguleringstiden uppvisar 0,1 ml av denna lösning en aktivitet av 10 sekunder med avseende på koaguleringstid; 0,2 ml) sattes ytterligare därtill och blandningen skakades un- der 30 minuter i en inkuberingsanordning vid 37°C för åstad- kommande av reaktionen. En portion (0,1 ml) av övervätskan som innehåller återstående trombin uttogs och sattes till en acacia- lösning (0,2 ml) värmd till ZBOC (en blandning av 15 % acacia- lösning, en 1-procentig kalciumkloridsaltlösning, en imidazol- _10 15 4-47 buffert och en saltlösning, 2:1:1:5 baserad på volymen). Efter omröring fick blanmfingen stå i stillhet i en tank för konstant temperatur vid Z8°C under 3 minuter. En standardfibrínogenlös- ning (0,1 ml, erhâllen genom upplösning av kommerciellt till- gänglig fibrinogen i en vattenhaltig 0,15~M NaCl-lösning och efter justering av pH-värdet till 7,2 med en vattenhaltíg 0,5- M Na2HP04-lösning utspädd" med en vattenhaltig 0,15-M NaCl-lös- ning för uppnående av en koncentration av 1 %) sattes därtill och koaguleringstiden uppmättes för bestämning av kvarvarande Ktrombinaktivitet i övervätskan. Separat uppslammades aktiverad agarossom ejtnsatts för immobilísering av heparin och antitrom- bin III, som användes såsom kontroll, i en vattenhaltig 0,1-M NaCl-lösning (0,2 ml) och en antibrombin-III-lösning (1 mg/ml, 0,1 ml) sattes därtill. Därefter genomfördes samma förfarande som ovan. Resultaten anges i tabell 3.

Tabell 3 Antikoaguleríngssystem Koaguleringstid (sek.) pKontroll + Antitrombin-III-lösning 170 I-HEP + Antitrombin-III-lösning 130 I-ATIII + Heparin-lösning 160 I-ATIII-HEP + 0,15-M NaCl-lösning 350 av denna tabell är det uppenbart att det immobiliserade systemet av heparin och antitrombin III uppvisar mycket starkare koagulerande aktivitet i jämförelse med systemet vari någon av dessa substanser immobiliserats för sig och den andra använts i lösníngstillstånd. g Därefter jämfördes de antikoagulerande aktiviteterna av de immobiliserade materialen utan användning av heparin-lösningen eller lösningen av antitrombin III i ovannämnda förfarande. Dvs en lämplig mängd av var och en av I-ATIII-HEP, I-ATIII och I-HEP sattes till en trombinlösning och efter det att blandningen ska- kats vid 37°C under en lämplig tid bestämdes kvarvarande trom- binakativitet i övervätskan genom koaguleringstiden. Genom jämförelse av resultaten framgår det att när kvarvarande-trombín- aktivitet i kontrollen betraktas såsom 100 % är kvarvarande trom- binaktivitet vid användning av I-ATIII 10-20 % och kvarvarande trombínaktivitet vid anwnñnfig av I-ATIII-HEP 0,2-0,7 % under sådana betingelser varvid kvarvarande trombinaktivitet vid an- 447 628 vünmfing av I-HEP är 20 %.

När I-ATIII-HEP lagras i en inkuberingsanordning vid 37°C under flera veckor iakttogs ingen minskning av antitrombinakti- viteten och en maximal effekt erhölls redan efter 30 sekunder 5 vid reaktionen med en trombinlösning.

Exempel 5 Vart och ett av I-ATIII-HEP, I-ATIII och I-HEP som erhållits i exempel 1 (vardera 25 mg) uppslammades i en buffert (50mM Tris- HCl, 100 mM NaCl, 10 mM CaC12; pH 7,5; 500 nl) och en lösning av 10 Xa-faktorn (120 ul) sattes därtill. Erhållen blandning fick stå vid 37°C under 3 eller 5 minuter och därefter avlägsnades I-ATIII- HEP, I-ATIII eller I-HEP därifrån. Erhållen lösning (100 pl) sat- *tes till en vattenhaltig 0,1-mM syntetisk substratlösning (1 ml) och fick stå vid 37°C under 20 minuter. Efter tillsats av en 15 17-procentig vattenhaltig acetatlösning (1,5 ml) uppmâttes kvar- varande procentuell mängd av Xa-faktoraktivitet med användning av en fluorofotometer. Erhållna resultat anges i tabell 4.

Tabell 4 Immobiliserat material Återstående procentuell mängd Xa-faktoraktivitet (%) Reagerad under Reagerad under 3 minuter 5 minuter Kontroll 100 100 I-HEP 100 100 I-ATIII 71 53 I-ATIII-HEP 15 11 Av denna tabell är det uppenbart att I-ATIII-HEP uppvisar en anmärkningsvärd inhiberande aktivitet gentemot Xa-faktorn 20 under det att I-HEP ej uppvisar någon inhiberande aktivitet.

Claims (9)

447 628, Patentkrav

1. Artificiellt, medicinskt material uppvisande anti- koagulerande aktivitet och innefattande ett bärarmaterial med heparin ímmobiliserat därpå, k ä n n e t e c k n a t därav, att det utgöres av bärarmaterialet, varpå heparin och antitrombín III är samímmobiliserade, vilken samimmobilisering är åstadkommen på i och för sig känt sätt.

2. Material enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att en vattenolöslig högpolymer användes såsom bärarmaterialet. i

3. hhterial enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenolösliga högpolymeren utgöres av agaros.

: 4. Material enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att denïvattanflösliga högpolymeren utgöres av polyvinylalkohol.

5. Material enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenolösliga högpolymeren utgöres av polyhydroxietyl- metakrylat.

6. Material enligt krav 1, k ä n n e't e c k n a t därav, att bärarmaterialet utsättes för aktiveríngsbehandling före immo- biliseringen.

7. Material enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att aktívering-sbehandlingen åstadkommes genom användning av bromcyanid.

8. Material enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att förhållandet av heparin och antitrombin III är 1:1-10:1 baserat på vikten.

9. Material enligt krav 1, k ä n n e t e c k n alt- därav, att heparin och antitrombin III immobiliserats på bärarmaterialet var och en i mängder av 1-50 mg/1 g bärarmaterial. - -<7à n