SE444174B - Kiselsyraheteropolykondensat som berare for antigener, antikroppar, hormoner, enzymer etc, jemte forfarande for framstellning av sadana berarbundna preparat och anvendningen av dem vid immunkemiska forfaranden - Google Patents

Description

i -rff »ga-q vxl-valg; i 7813017-6 l0 15 20 25 30 2 haptener och hormoner, särskilt albuminer, globuliner, aminosyror, lämpligt substituerade steroider etc., alldeles särskilt immunglobuliner, antikroppar och hormoner.

Ett föremål för uppfinningen är således på en bärare anbringade, stabiliserade, olösliggjorda biokemiska preparat, som kännetedcnas av att biokemiska material, som t.ex. antigener, antikroppar, hormoner, aminosyror, haptener, proteiner, enzymer, etc. är kovalent bundna till ett kiselsyrahetero- polykondensatskikt av ett sampolymerisat av a) minst en substituerad silan med den allmänna formeln (I) siknlvckm) (i) där R betecknar väte, halogen, alkoxi eller -NR'2 (R' = väte och/eller alkyl), R” betedcnar alkyl, alkenyl, aryl eller aralkyl och n är ett heltal från l till 3, b) minst en funktionell silan med den allmänna formeln (ll) SiRn(R"'Y)(_.¿_“) (ll) där R har den ovan angivna betydelsen, R"' betecknar alkylen, fenylen, alkylfenylen eller alkylenfenylen, Y betecknar halogen eller en even- tuellt substituerad amino-, eventuellt substituerad anilino-, aldehyd-, ketof, karboxi-, hydroxi-, merkapto-, cyano-, hydroxifenyh, diazo-, karbonsyraalkylesten, sulfonsyra- (-SO3H) eller fosforsyragrupp (-PO3H2)od1 n är ett heltal från l till 3, liksom c) eventuellt mirst ett hydrolyserbart kiselsyraderivat med den allmänna formeln (Ill) SlRq (lll) där R har den ovan angivna betydelsen, varvid dock inte alla grupper R är väte,- som i sin tur är anbringat på ett mekaniskt bärkraftigt underlag.

Ett ytterligare föremål för uppfinningen är ett förfarande för fram- ställning av sådana biokemiska preparat, vilket kännetecknas av att man framställer ett kiselsyraheteropolykondensat, genom att kondensera a) minst en substituerad silan med den allmänna formeln (l) _ SiRnRïtn) (l) där R betecknar väte, halogen, alkoxi eller -NR'2 (R' .-. äte och/eller alkyl), R" betecknar alkyl, alkenyl, aryl eller aralkyl och n är ett heltal från l till 3, 10 l5 20 25 30 35 7813017-6 3 b) minst' en funktionell silan med den allmänna formeln (ll) sinnmwlukn) (n) där R har den evan angivna betydelsen, R* betecknar aikyien, renyiefi, alkylfenylen eller alkylenfenylen, Y betecknar halogen eller en even- tuellt substituerad amino-, eventuellt substituerad anilino-, aldehyd-, keto-, karboxi-, hydroxí-, merkapto-, cyano-, hydroxifenyk, diazo-, karbonsyraalkylesten, sulforisyra- (-SO3H) eller fosforsyragrupp l-POBHZ) och r. är ett heltal från l till 3, liksom c) eventuellt .minst ett hydrolyserbart kiselsyraderivat med den allmänna formeln (m) Sillh (lll) där R har den ovan angivna betydelsen, varvid dock inte alla grupper R är väte, eventuellt lösta i ett organiskt lösningsmedel, som t.ex. alkoholer, ketoner, etrar, amider eller blandningar därav, vid temperaturer från -20 till +l30°C, före- trädesvis O till 65° C, eventuellt i närvaro av katalysatorer som avspjälkar protoner eller hydroxyljoner och eventuellt i närvaro av vatten, i ett eller flera steg, företrädesvis i ett eller två steg, påför detta på ett bärkraftigt underlag, och eventuellt efter en efterbehandling kopplar det biokemiska materialet.

Ett ytterligare föremål är slutligen användningen av dessa stabiliserade biokemiska preparat som medel, företrädesvis separermedel eller adsorbens, vid immunkemiska förfaranden, som t.ex. radioimmunoanalyser eller affinitets- kromatografi. _ Uppfinningen har de utomordentliga fördelarna att särskilt enkelt vara tekniskt realiserbar och i stort sett vara oberoende av slaget och samman- sättningen hos det använda underlaget. _ Enligt uppfinningen kommer således kiselsyraheteropolykorwdensatskikt för påförande på underlaget ifråga, vilka erhållits av de ovan nämnda komponenter- na a) och b) eller a), b) och c).

Föredragna är polykondensat, som fås genom kondensation av följande tre komponenter: a) minst en substituerad silan med den allmänna formeln SiRnlFïLn), där R betecknar klor, lägre alkoxi, särskilt etoxi eller metoxi, eller dimetyl- amino, R" står för alkyl, särskilt metyl eller etyl, aryl, särskilt fenyl eller aralkyl, särskilt bensyl eller tolyl, och n är ett heltal från l till 3, b) minst en funktionell silan med den allmänna formeln SiRn(R"'Y)(g_n). där eí 1-5 10 15 20 25 30 35 7813017-6 ll R står för klor, lägrealkoxi, särskilt etoxi eller metoxi, eller dimetyl- R"' står för lägrealkylen, Y står för eventuellt substituerad amino eller anilino, karbonyl, karboxi, diazo eller halogen och n är ett heltal från l till 3, särskilt l, och amino, eventuellt minst ett hydrolyserbart kiselsyraderivat med den allmänna formeln SiRu, där R står för klor, lägrealkoxi, särskilt etoxi eller metoxi, c) eller dimetylamino.

Den här använda beteckningen "lägre" skall beteckna grupper med l till 6, företrädesvis l till Il, kolatomer.

Lämpliga utgångsföreningar är t.ex. (Et0),¿Si, SiClu, (MeOlgSi, SKNI-lzlu, (cflyzsiclz, (cflalzsilømelz, (ci-iyzsflofizlz, (csngzsiciz, (Erogsitci-izgwuz.

(EtO)3Si(CH2)3CN etc., som kan framställas enligt uppgifterna av W. Noll, Chemie und Technologie der Silikone, Verlag Chemie, 1968.

För framställning av kondensatet blandar man enligt uppfinningen de enskilda komponenterna under fuktighetsuteslutning. Föredragna lösningsmedel är lägre alkoholer med l till 4 C-atomer, företrädesvis MeOl-l och EtOH, alkylketoner, företrädesvis aceton, alkyletrar, företrädesvis dietyleter, dimetyl- formamid, och blandningar därav. Samtidigt eller anslutningsvis tillsätts den eventuellt använda katalysatorn som kan avspjälka protoner eller hydroxyljoner.

Vid kondensation i ett steg tillsätts den nödvändiga vattenmängden och eventuellt en katalysator till reaktionsblandningen redan i början. Vid kondensa- tion i två steg utförs först en förkonderisation. Efter tillsats av den erforderliga vattenmängden till förkondensatet sker sedan slutkondensationen. Slutkondensa- tionen kan utföras efter det att förkondensatet påförts på underlaget.

Kondensationen sker särskilt vid rumstemperatur, och kondensationens varaktighet uppgår till l minut till 2f4 timmar. Varaktigheten för kondensationen resp. förkondensationen påverkar de' mekaniska egenskaperna hos de erhållna skikten. i ' _ Förkondensatet resp. den genomkondenserade produkten kan påföras på underlaget och förbindas därmed i reaktionsmediet. Det kan emellertid även isoleras genom avdunstning av lösningsmedlet (eventuellt i vakuum) och påföras på underlaget vid en senare tidpunkt antingen som sådant eller löst i ett organiskt lösningsmedel. Eventuellt tillsätts den stökiometriskt erforderliga vattenmängden.

Som katalysatorer kommer vid kondensationen syror, särskilt flyktiga syror, företrädesvis saltsyra eller ättiksyra, vatten, baser, särskilt alkalihydroxider eller aminer, företrädesvis natronlut, och lägre alkylaminer ifråga. Katalysator- mängden uppgår företrädesvis till 3%. Vid sura katalysator-er föredras kortare kondensationstider.

Under förkondensationen äger dels en omalkoxylering av silanerna rum och 10 l5 20 25 30 35 7813017-6 5 dels en genom de valda reaktionsbetingelserna styrd oligomerisering under samtidig eteravspjälkning. i Såiedes påförs t.ex. vid en utföringsform av förfarandet enligt uppfin- ningen, sedan den fastställda förkondensationstiden förlupit, det i lösning befintliga kiselsyraheteropolykondensatet på 'det stabila underlaget som sådant eller med hjälp av stökiometriska mängder vatten vid förhöjd temperatur. Vid avdunstninger. av lösningsmedlet knyts sedan kovalenta bindningar mellan Si0H-grupperna i kiselsyraheteropo!ykondensatet och reaktiva grupper i underlaget. De påförrla skikten efterbehandlas eventuellt med vatten och/eller inbränns. Till de funktio- nella grupperna i detta sålunda påförda skikt kan nu biokemiskt intressanta material kopplas enligt i och för sig kända metoder inom organisk kemi och biokemi. g ' Förhållandet mellan de enskilda komponenterna liksom kondensationsbe- tingelserna bestämmer egenskaperna hos de erhållna skikten. Andelen hydrolyser- bara kiselsyraderivat bestämmer beskaffenheten hos skiktets yta, t.ex. den specifika ytan, andelen substituerade silaner (jfr komponent a) adhesionsegen- skaperna och andelen funktionella silaner (jfr komponent b) antalet kopplingsställen på ytan. Kiselsyraheteropolykondensaten innehåller, räknat på oxider, 60 till 90 viktprocent, företrädesvis 65 till 85 viktprocent, särskilt 75 till 80 viktprocent av komponent a), l till 15 viktprocent, företrädesvis 2 till l0 viktprocent, särskilt ü till 8 viktprocent av komponent b) och 0 till 30 viktpmcent, särskilt 5 till 20 viktprocent, alldeles särskilt 8 till 15 viktprocent, t.ex. 9 till l2 viktprocent av komponent c).

De organiska lösningarna av kondensatet är 5 till IiO-procentiga, särskilt l0 till 35-procentiga, företrädesvis 25 till BO-procentiga. Som katalysator används med fördel upp till 396 vatten eller syra.

Som mekaniskt bärkraftiga underlag kommer alla fasta kroppar av lämplig stabilitet ifråga, särskilt glas, mineraler, t.ex. hydroxiapatit, kvarts, etc., keramik, t.ex. porslin, stengods, etc., keramiska material, t.ex. chamotte etc., metalloxider, t.ex. aluminiumoxid, järnoxid etc., metaller, t.ex. aluminium, järn etc., trä, papper, kol, syntetmaterial, t.ex. PVC, polyeten, etc., organiska högpolymerer, t.ex. cellulosa, polysackarider etc., och liknande, företrädesvis glas, t.ex. objektbärare, cylindriska småflaskor av borosilikatglas (t.ex. med 5 ml volym), små smältglas (t.ex. 8 x 70 mm) etc.. keramik, metalloxider, metaller och syntetmaterial, t.ex. polypropen, sampolymerisat av akrylsyra och eten etc.

Det har inte visat sig vara nödvändigt att förbehandla resp. kemiskt rena de underlag som skall beskiktas, vilket innebär en ytterligare förenkling gentemot sedvanliga metoder. Den. lösning som innehåller kondensatet påtörs på underlaget som sådan eller under tillsats av stökiornetriska mängder vatten. Vid fähöjd -_-_..._.-.-.-.-....t wïzm i \ w »w i , pn-wn mlqvnæ-fiç., l0 15 20 25 30 35 7813017-6 e iempmmf, med famn 15 :in 1so° , 'aerfsoesvis ioo :m izo° . :mmm lösningsmedlet och förnätas silikonskiktet och binds kovalent till underlaget inom loppet av l5 till 45 minuter, företrädesvis 20 till 00 minuter.

Som allmänt användbara beskiktningsförfaranden kan man exempelvis använda: a) i indränkning 'av det underlag som skall beskiktas i kiselsyraheteropoly- kondensatlösningen resp. i förkondensatet-och avdunstning av lösnings- medlet (se ovan), b) sprayning av de kiselsyraheteropolykondensathaltiga lösningarna på de underlag som skall beskiktas och avdunstning av lösningsmedlet (se ovan), c) fyllning av behållarformiga underlag med kiselsyraheteropolykondensat- haltiga lösningar och avdunstning av lösningsmedlet, och liknande..

Företrädesvis efterbehandlas de med kiselsyraheteropolykondensatskiktet försedda underlagen med vatten eller vattenånga för fullständig förnätning av kiselsyraheteropolykondensatet. Vattnet resp. ångan kan ha temperaturer från 0 till l50°C, varvid skiktets stabilitet ökar med temperaturen. Efterbehandlingstiden kan uppgå till 2 till 30 minuter. En efterbehandling på 10 till 20 minuter med kokande vatten har visat sig vara fördelaktig. Skiktet kan sedan fixeras 5 till 30 minuter vid temperaturer på 100 till l50°C, företrädesvis l5 till 25 minuter vid ll0 till UOOC.

Skiktens tjocklek har ingen inverkan på deras funktionsduglighet.

Till det med funktionella grupper försedda kiselsyraheteropolykondensat- skiktet kan nu biokemiska material 'kopplas kovalent genom kända metoder inom organisk kemi biokemi, som kan hämtas från facklitteraturen. Lämpliga metoder beskrivs t.ex. i US-PS 3.652.761. Alltef ~ -eaktiviteten hos de funktionel- la grupperna hos de biokemiska material resp. kiselsyraheteropolykondensatskikt som skall kopplas måste de funktionella grupperna i kiselsyraheteropolykondensat- skiktet modifieras ytterligare enligt metoderna inom den organiska kemin. l allmänhet är det nödvändigt att först derivatisera kiselsyraheteropolykondensat- skiktet och sedan tillkoppla det önskade materialet. Som derivatiseringsmedel kommer exempelvis aminer, karbonsyror, syraklorider, tiokarbamater. tiokarbamin- syraklorid, diazoföreningar, estrar, sulfider etc. ifråga.

Modifieringsvalet beror därvid på de nödvändiga betingelserna för den efterföljande kopplingsreaktionen, eftersom man härvid måste arbeta vid tempera- tur-, pH-områden och medier, vid vilka en irreversibel denaturering eller en aktivitetsförlust hos de biokemiska materialen är i stort sett utesluten resp. vid vilka dessa materials önskade karakteristika inte förändras väsentligt. l regel kopplas därför biokemiska material vid rumstemperatur i vattenhaltigt medium i pH-områden från pH 3 till pH ll. Å andra sidan skall man se till att “i . R f MÉ f, H.

'V7 v' "*!"'f 1"IÉ'NÜ!|i'-iHr-vø\i l0 l5 20 25 30 35 7813017-6 1 kopplingsreaktionen förlöper med tillräcklig hastighet för att de biokemiska materialen inte skall utsättas för länge för icke-fysiologiska betingelser.

Vidare måste man ta hänsyn till att defixerade biokemiska materialens aktivitet ofta beror på längden hos den ”spacer” via vilken materialet är bundet till ytan.

Under beaktande av de ovan nämnda synpunkterna kan kiselsyrahetero- polykondensatskikt framställas resp. modifieras, som efter beskiktning med biokemiskt material ger optimala resultat; En modifiering av ett skikt innehållande gamma-aminopropylgrupper kan exempelvis ske genom att skiktet behandlas med en vattenhaltig, ca 2,5 %-ig glutaraldehydlösning vid rumstemperatur i 30 till 60 minuter. Diazoderivatet av det ovannämnda skiktet kan framställas t.ex. genom omsättning med p-nitrobensoylklorid, reduktion av nitrogruppen till amin och diazotering med salpetersyrlighet. Om kiselsyraheteropolykondensatskiktet på grund av användning av lämpliga funktionella silaner som utgângsförening redan innehåller anilinogrupper, kan man direkt diazotera med salpetersyrlighet. Genom omsättning av aminogrupper i kiselsyraheteropolykondensatskiktet med tiofosgen får man isotiocyanoderivatet.

De omsorgsfullt tvättade, på stabila underlag befintliga, derivatiserade kiselsyraheteropolykondensaten inkuberas sedan med det biokemiska materialet i lämpliga buffertsystem, t.ex. acetat (pH 0,0), fosfat (pH 7,0), bikarbonat (pH 9,5), boratbuffert (pH 8,0) etc. Härvid kopplas kovalenta bindningar mellan kiselsyra- heteropolykondensatderivaten och de biokemiska materialen. Inkubationstiderna uppgår i allmänhet till l till 72 timmar vid rumstemperatur. Efter eliminering av överskottet av biokemiskt material torkas de sålunda erhållna stabiliserade biokemiska materialen antingen i luft eller i vakuum eller behandlas först med ca 0,5 till 2 96-iga lösningar av polyvinylalkohol och torkas därefter. De torra preparaten kan lagras vid temperaturer upp till 50°C.

Uppfinningen belyses ytterligare med hjälp av följande exempel, där alla temperaturer är angivna i Celsius-grader.

Exempel 1 7,5 ml aceton p.a., 7,5 ml etanol p.a. och 0,6 ml tetraetoxisilan p.a. blandades med varandra» och förvarades under uteslutning av luft (lösning A).

Likaså blandades 7,5 ml aceton, 7,5 ml etanol och 0,35 ml gamma-aminopropyltri- etoxisilan och förvarades under uteslutning av luft (lösning B). Lösning C erhölls genom blandning av 2,5 ml aceton, 2,5-ml etanol och l0 ml dimetyldietoxisilan och förvarades likaledes under uteslutning av luft.

För förkondensationen blandades volymekvivalenta mängder av lösningar- , »l n: 1 . s ma: 5:1 «. 7813017-6 10 15 20 25 30 35 na A, B och C (lösning M) och omsattes vid rumstemperatur i 2.5 timmar under uteslutning av luft.

Därefter fylldes vardera 0,2 ml av förkondensatet i smä glasflaskor ("Fiolax" klarglas 00 x 15 mm) och försattes med 15 pl destillerat vatten. Flaskorna roterades vid l20° på en rotationsanordning i 30 minuter (5 varv/sekund). Därefter spolades de sålunda beskiktade flaskorna 15 minuter med kokande vatten och torkades vid 150°. l de beskiktade smâglasen fylldes 2 ml av en 2,5 96-ig vattenhaltig glutaraldehydlösning' och fick stå l2 timmar vid rumstemperatur. Man tvättade sedan med vatten. Därefter ifylldes antiserum mot trijodtyronin (T3) från harar, framställt enligt anvisningarna av R.-D. Hesch och M. Hübner i Acta biol. med germ. 28, 861 (1972), i fosfatbuffert (pl-l 7,7) (utspädning 1 : 50000) och man inkuberade äter 12~timmar vid rumstemperatur. Lösningen avsögs, ersattes med normalt harserum i fosfatbuffert (pH 7,7) (utspädning 1 : 25000) och man inkuberade sedan _1 timme vid rumstemperatur. Lösningen avlägsnades och man tvättade med vatten.

De med trijodtyroninantikroppar beskiktade småglasen insattes i en radioimmunoanalys. Därvid ifylldes i de enskilda småglasen vardera 100 pl serum- standard, innehållande 0, 50, 100, 200, #00 och 800 ng/ 100 ml trijodtyronin, samt l ml 125 J-trijodtyronim Efter 2 timmars förvaring vid rumstemperatur avsögs lösningen, och restaktiviteten i de enskilda smâglasen mättes. Därvid erhölls en bindning av 125 J-trijodtyronin i glaset med 0 ng/ 100 ml triiodtyronin på Bo/T = 34,296. Restaktiviteten i de glas som innehöll standardlösningarna, räknat på restaktiviteten i O-standarden, gav Bo/B för 50 ng/ 100 ml 74,7%, 100 ng/100 ml 68,596, 200 ng/ 100 ml 52,7%, 400 ng/ 100 ml 37,096 och 800 ng/ 100 ml 26,095. Éíemæl 2 Framställningen av lösningarna A, B, C och M skedde som i Exempel 1. 5 ml av lösning M försattes dock med 0,1 ml 0,lN HC! och förkondenserades vid rumstemperatur 7 minuter. För beskiktning sattes vardera 0,2 ml till små glasflaskor ("Fiolax" klarglas) och försattes med l5pl vatten. Anbringandet av skiktet skedde som i Exempel 1.

De sålunda behandlade smâglasen behandlades i l timme med 2,5 9â-ig glutaraldehydlösning i 0,lM acetatbuffert (pH 14,0), sedan 12 timmar med T3- antiserum (utspädning 1 : 50000) i 0,lM acetatbuffert (pH 4,0) och slutligen med harserum (utspädning 1 : 25000) i acetatbuffert (pH lø,0). Funktionstest motsvarande Exempel l gav en bindning ßo/T = 27%. š..\.....b.l.il._... : u: 10 15 20 25 30 35 7813017-6 Exemæl 3 Man framställde följande utgångslösningar genom blandning av de enskilda komponenterna och förvarade dem under uteslutning av luft: Lösning D: 7,5 ml aceton, 7,5 ml etanol och 1,2 ml tetraetoxisilan Lösning E: 7,5 ml aceton, 7,5 ml etanol och 0,7 ml gamma-aminopropyltri- etoxisilan Lösning C: 2,5 ml aceton, 2,5 ml etanol och 10 ml dimetyldietoxisilan.

Lika stora volymmängder av lösningarna C, D och E blandades (lösning N) och förkondenserades 2 timmar vid rumstemperatur. Vardera 0,2 ml av förkon- densatet sattes till små smältglas (8 x 70 mm) från Fa. Schott år Gen.. Därefter gick man tillväga analogt med Exempel 1.

Småglasen behandlades därefter l timme med 2,5 %-ig vattenhaltig glutaraldehydlösning, tvättades, inkuberades 12 timmar vid rumstemperatur med TB-antiserum (utspädning 1 : 50000) i 0,lM fosfatbuffert (pH 7,14), tvättades, behandlades 0,5 timmar med 196 kreatursserumalbumin (RSA) i 0,lM fosfatbuffert (pH 7,0), tvättades och testades ienlighet med Exempel 1 med 125 J-TB. Därvid fick man en bindning av Bo/T = 29,596.

Exempel 4 0,2 ml av förkondensatet från Exempel 3 sattes till små smältglas (8 x 70 mm) och försattes med 20 pl vatten. Beskiktningen anbringades som i Exempel l.

Småglasen inkuberades 0,5 timme vid rumstemperatur med 2,5 %-ig glutaraldehyd- lösning, tvättades, behandlades ll timmar vid rumstemperatur med TB-antiserum (utspädning 1 : 50000) i 0,lM fosfatbuffert (pH 7,14), tvättades, fick stå 0,5 timme med 196 RSAÅ 0,lM fosfatbuffert (pH 7,4), tvättades och insattes vid radioimmuno- analys i enlighet med Exempel l. Därvid konstaterades en bindning av Bo/T = 2196.

Exemæl 5 5 ml av lösningen N (Exempel 3) försattes med 0,1 ml 0,lN saltsyra och förkondenserades 7 minuter vid rumstemperatur under uteslutning av luft. 0,2 ml av förkondensatet sattes till små glasflaskor ("Fiolax“ klarglas 140 x 15 mm).

Beskiktningen anbringades i enlighet med Exempel 1.

Småglasen behandlades 1 timme vid rumstemperatur med 2,5 %-ig vatten- haltig glutaraldehyd, tvättades, inkuberades 12 timmar vid rumstemperatur med TB-antiserum (utspädning 1 : 50000) i 0,lM fosfatbuffert (PH 73), tvättades, behandlades 0,5 timme med 0,01% RSA (Behringwerke) i 0,lM fosfatbuffert (pH 7,0), tvättades och torkades i luft. Beskiktningen testades i enlighet med Exempel 10 15 20 25 30 71813017-6 io 1. Härvid fick man en bindning av ßo/T = 31%.

Exemæl 6 Småglas från Exempel 5 inkuberades 2 timmar vid 60° med en vardera 10 96-ig lösning av tributylamin och p-nitrobertsoylklorid i kloroform, tvättades med kloroform, kokades l fmme med 5 %-ig vattenhaltig natriumditionitlösning, andlades 10 minuter med ! 96-ig natriumnitritlösning i IaN ättades grundligt med iskallt vatten. Till de sålunda tvättades med vatten, saltsyra vid 0° och framställda diazogru rna i kiselsyraheteropolykondensatskiktet kopplades T)- antiserum (utspädning l : 50000) genom 12 timmars inkubering vid rumstemperatur i 0,05M natriumbikarbonatbuffert-(pH (9,6). Därefter behandlade man 0,5 timme med 0,01% RSA i 0,lM fosfatbuffert (pH 7,4). Småglasen testades vid radioimmuno- analys analogt med Exempel 1. Härvid visade sig en bindning av Bo/T = 073%. De enskilda standardlösningarna hade värden b/Bo på 50 ng/100 ml T. 79,0%, 100 ng/ 100 ml å' 60,3%, 200 rig/l00 ml 'I 37,5%. #00 ng/100 ml 'å 227%, 800 ng/100 ml 'å lß,1%.

Exemæl 7 Småglas från Exempel 5 behandlades med en l96-ig vattenhaltig tereftal- aldehydlösning 2 timmar i vattenbad vid 60 till 80°, tvättades med vatten, inkube- rades 12 timmar vid rumstemperatur med TB-antiserum (utspädning 1 : 50000) i fosfatbuffert (pH 6,14), tvättades, behandlades 0,5 timme med 0,01% RSA i 0,lM fosfatbuffert (pH 6,4), sköljdes med 0,0lM fosfatbuffert (pH 7,11), innehållande 0,01% natriumazid och 1% polyvinylalkohol (PVA), och torkades i vakuum vid rumstemperatur. Vid funktionstest i enlighet med Exempel 1 fann man en bindning av BO/T = 319%.

Exemæl 8 Småglas från Exempel 5 behandlades I: timmar med en 2,5%-ig vattenlös- ning av glutaraldehyd vid rumstemperatur, tvättades, inkuberades 12 timmar med immunglobuliner mot hTSH (utspädning 1 : 10000), framställda enligt anvisningarna av J.L. Vaitukaitis et al. i J. Clin. Endocr. Metab. 33, 10149 (1971), anrikade enligt metoden enligt 21.5. Baumstark et al., Arch. Biochem. Biophys. 108, 510 (1960), i 0,lM fosfatbuffert (pl-l 7,14), tvättades, behandlades 0,5 timme med 0,01% RSA i 0,lM flosfatbuffert (pH 7,4), sköljdes med 0,01% natriumazid och 1% PVA i 0,0lM fosfatbuffert (pH 7,4) och torkades.

De med TSl-l-antikroppar beskiktade småglasen testades vid radioimmuno- analys med hjälp av 125 J-TSH. Härvid fick man en bindning av Bo/T = 565%. ~ š 10 l5 20 25 30 35 7813017-6 ll Exemæl 9 Enligt Exempel 5 diazoterade smâglas inkuberades l2 timmar med immunglobuliner mot TSH (utspädning l : 10000) i 0,lM natriumkarbonatbuffert (pH 8,14), tvättades, behandlades 0,5 timme med 0,01% RSA i fosfatbuffert (pH 7,14), sköljdes med 0,0l% natriumazid och 1% PVA i 0,0lM fosfatbuffert (pH 7,14) och torkades. Funktionstest i enlighet med Exempel 8 gav en bindning av Bo/T = 6h,1i%.

Exempel l0 l,5 ml difenyldiklorsilan blandades med 3,5 ml etanol (lösning F). Lika stora volymmängder av lösningarna D, E (se Exempel 3) och F blandades (lösning G) och förkondenserades 2 timmar vid rumstemperatur under uteslutning av luft. 0,2 ml av förkondensatet sattes till småglasflaskor ("Fiolax" klarglas) och försattes med 15 pl vatten. Beskiktningen anbringades analogt med Exempel l.

De enligt Exempel 6 diazoterade smâglasen inkuberades 12 timmar med TB-antiserum (utspädning l : 50000) i 0,lM natriumkarbonatbuffert (pH 8,14), tvättades, behandlades 0,5 timme med 0,01% RSA i fosfatbuffert (pH 7,10), sköljdes med 0,01% natriumazid och 196 PVA i 0,0lM fosfatbuffert (pH 7,14) och torkades.

Funkiidnsiesi i enlighet med Exempel 1 visade en bindning av ße/r = 210%. i Exemæl ll Lika stora volymmängder av lösningarna D, E och F blandades och lörkondenserades vid rumstemperatur Zh timmar under uteslutning av luft.

Därefter gick man tillväga som i Exempel l0. Funktionstestet visade en bindning av Bo/ T = 21i,l96.

-Exempgl 12 5 ml av lösning G försattes med l ml vatten och förkondenserades 2 timmar. Därefter avfiltrerade man utfallna högpolymerer, avdrev lösningsmedlet i högvakuum och förvarade det kvarvarande vita pulvret under uteslutning av luft. 0,l g av polymeren löstes i 50 ml aceton, och 0,l ml av denna acetonlösning sattes till' små glasflaskor ("Fiolax" klarglas, 140 x l5 mm).

Beskiktningen anbringades som i Exempel Lfillsmàglasens yta kopplades T3- antiserum som i Exempel l0. Vid funktionstest i enlighet med Exempel uppriåddes en bindning av Bo/T = 30%.

Exemæl 13 l ml av acetonlösningen av polymeren från Exempel l2 överfördes till plastkärl av ett sampolymerisat av polyeten och akrylsyra 92 : 8, volym l ml. Efter 20 sekunder hälldes lösningen åter ur och kärlen torkades.

Därefter inkuberade man med liß-ig glutaraldehydi 0,l M loslatbufiert (pH 7813017-6 l2 7,14) i 30 minuter, tvättade, behandlade 2 timmar med T3-antiserum (utspädning l : 100000) i 0,lM fosfatbuffeft (PH 7,0), sköljde 0,5 timme med 0,111» RSÅ i 0,lM íosfatbulfert (pH 7,14) och torkade. Vid funktionstest enligt Exempel l fick man en bindning av Bo/T = 27%. 5 ' - Exernæl 114 ~ l ml av acetonlösningen från Exempel l2 sattes till smâglasflaskor ("Fiolax" klarglas, 140 x l5 mm). Lösningen urhälldes efter 20 sekunder och det vid glasväggen vidhäftande skiktet inbrändes 15 minuter vid l50°. Funktionstest enligt Exempel l visade en bindning av Bo/T = 30%. lÛ ExemEl l5 l stället för lösning C i Exempel 3 användes en 0,0lM lösning av (CH3O)3Si-CH2CH2Cl-l2-NH-CO-(C6HQNH2 i etanol/aceton. Analogt med för- farandestegen i Exempel 3 beskiktade man små glasflaskor ("Fiolax" klarglas, 140 x 15 mm). 15 Småglasen behandlades med l% natriumnitrit i 14N saltsyra i 10 minuter vid OO, tvättades väl och inkuberades sedan l2 timmar med T3-antiserum (utspäd- ning l : 50000) i 0,lM natriumbikarbonatbuffert (pH 8,14), tvättades, fick stå 0,5 timme med 0,01% RSA i 0,lM fosfatbuffert (pH 7,14), sköljdes med 0,01% azid och l% PVA i 0,0lM fosfatbuffert (pH 7,14) och torkades. Vid funktionstest analogt med 20 Exempel l fick man en bindning av Bo/T = 214,8%.

Exempel l6 Småglas från Exempel 6 behandlades I timme med 2,5%-ig vattenhaltig glutaraldehyd och tvättades två gånger med vatten. Därefter inkuberade man med 6,5 ng mJ-:rijedtyfenin (sßesßso cpm, spec. aktivare: 1.113 mci/mgn 1 m1 0,lM 25 fosfatbuffert (pH 7,14). Efter 2 timmar var 76%, efter 3 timmar 79%, efter 14 timmar 81%, och efter l2 timmar 97% av T3 bundet. Genom 30 minuters tvättning med 0,lM glycinbuffert (pH 2,3) avlägsnades adsorptivt bundet hormon. 814% av hormonet motsvarande 5,5 ng TB var kovalent bundet till smâglasen. _ Exemæl l7 so Enligt Exempel 16 inkuberade man med s ng mJ-:yfexin (Tu) (saizaoo cpm, spec. aktivitet 927 mCi/mg). Bindningen efter 2 timmar uppgick till 55%, efter 14 timmar till 60% och efter l2 timmar till 69%. Efter tvättning kvarstod 3.l58.14l0 cpm eller 56% av T14 (motsvarande 14,5 ng) kovalent bundet till småglasen.

Exemæl 18 35 Enligt Exempel l6 inkuberade man med l7 ng lÜJ-hTSH (l.9fl3.l ll cpm, 10 15 20 25 7813017-6 13 spec. aktivitet 117 mCi/mg). Bindningen efter 3 timmar uppgick till 10%, (efter ü timmar till 11% och efter 12 timmar till 111%. Efter tvättning med glycinbuffert kvarstod 13% eller 2 ng hTSH kovalent bundet.

. Exemæl 19 Enligt Exempel 16 inkuberade man med 29 ng (acc) (sso.ooo epm, spee. elrnvirer za mcl/mg). ßlndnlngen elrer 2 rlmmer uppgick till 5% och efter 12 timmar till 6%. Efter tvättning med glycinbuffert var 14,596 motsvarande 1,3 ng RGG kovalent bundet. 125 J-kreatursgammaglobulin _ Exempel 20 Enligt Exempel 6 diazoterade smâglas inkuberades med 6,5 ng 125 J-T3 från Exempel 16 i 0,1M bikarbonatbuffert (PH 8,0). Bindningen efter 2 timmar uppgick till 36%, efter 14 timmar till 1l1% och efter 12 timmar till 78%. Efter tvättning med glycinbuffert kvarstod 61% motsvarande 14 ng av haptenen kovalent bundet. i Exemæl 21 Enligt Exempel 20 lnkubereae men med s ng mJ-ru fran Exempel n.

Bindningen efter 2 timmar uppgick till 145% och efter 12 timmar till 149%. Efter tvättning med glycinbuffert var 142% motsvarande 3,3 ng av aminosyran Th kovalent bundet.

Exemæl 22 I enlighet med Exempel 20 inkuberade man med 17 ng 1253- tyreotropin (hTSH) från Exempel 18. Bindningen uppgick efter 2 timmar till 13% och efter 12 timmar till 214%. Efter tvättning med glycin kvarstod 17% motsvarande 2,8 ng av proteohormonet kovalent bundet till smàglas.

Exemæl 23 ' Enligt Exempel 2o lnlruperede men med 29 ng ”SJ-acc fran Exempel 19.

Bindningen uppgick efter 2 timmar till 114%, efter 3 timmar till 16% och efter 12 timmar till 20%. Efter tvättning med glycin var 19% motsvarande 5 ng av proteinet kovalent bundet till småglasen.

Claims (1)

1. l0 15 20 25 7813017-6 li PATENTKRAV l. På en bärare anbringade, stabiliserade, olösliggjorda biokemiska prepa- rat, k ä n n e t e c k n a d e av att biokemiska material, som t.ex. antigener, antikroppar, hormoner, aminosyror, haptener, proteiner, enzymer etc. är kova- lent bundna till ett kiselsyraheteropolykondensatskikt av ett sampolymerisat av a) l nfinst en substitueradsilan med den allmänna formeln (l) SiRnRwbn) (l) där R betecknar väte, halogen, alkoxi eller -NR'2 (R' = väte och/eller alkyl), R" betecknar alkyl, alkenyl, aryl eller aralkyl och n är ett heltal fran 1 fm 3, b) minst en funktionell silan med den allmänna formeln (ll) sannuzwlukn, . m) där R har den ovan, angivna betydelsen, R" betecknar alkylen, fenylen, alkylfenylen eller alkylenfenylen, Y betecknar halogen eller en eventuellt substituerad amino-, eventuellt substituerad anilino-, aldehyd-, keto-, karboxi-, hydroxi-, rnerkaptæ, cyano-', hydroxifenyb, diazo-, karbonsyra- alkylester-, sulfonsyra- (-SO3H) eller íoslorsyragrupp l-POJHZ) och n är ett heltal från l till 3, liksom c) eventuellt :ninst ett hydrolyserbart kiselsyraderivat med den allmänna formeln (lll) Siku (lll) där R har den ovan angivna betydelsen, varvid dock inte alla grupper R är väte, som i sin tur är anbringat på ett mekaniskt bärkraftigt underlag.

   2. Preparat enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att kiselsyraheteropolykondensatrkiktet är kovalent koppiat till det mekaniskt bärkraftiga underlaget. I

   3. Preparat enligt patentkravet l eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att det bärkraftiga underlaget är glas, ett kiselhaltigt material, metalloxid, metall, keramiskt material, mineral, papper, material innehållande hydroxylgrupper, syntetmaterial och liknande. ~ ., :wa , =Ö-< f* Ä-fffi -« äflwïrf 1 t ._.,.¿,'. l0 l5 20 25 30 7813017-6 is ll. Förfarande för framställning av på en bärare anbringade, stabiliserade, olösliggjorda biokemiska preparat, k ä n n e t e c k n a t av att man framställer ett kiselsyraheteropolykondensat, genom att man kondenserar a) minst en substituerad silan med den allmänna formeln (I) sin" "MW (i) där R betecknar väte, halogen, alkoxi eller -NR'2 (R' = väte och/eller alkyl), R" betecknar alkyl, alkenyl, aryl eller aralkyl och n är ett heltal från l till 3, b) minst en funktionell silan med den allmänna formeln (ll) (ll) där R har den ovan angivna betydelsen, R'" betecknar alkylen, fenylen, alkylfenylen eller alkylenfenylen, Y betecknar halogen eller en eventuellt smnuvnnubn) substituerad amino-, eventuellt substituerad anilino-, aldehyd-, keto-, karboxi-, hydroxi-, merkapto-, cyano-, hydroxifenyb, diazo-, karbonsyra- alkylesten, sulfonsyra- (-SO3H) eller fosforsyragrupp (-P03H2) och n är ett heltal från l till 3, liksom c) eventuellt minst ett hydrolyserbart kiselsyraderivat med den allmänna formeln (lll) sm” (m) där R har den ovan angivna betydelsen, varvid dock inte alla grupper R är väte, eventuellt lösta i ett organiskt lösningsmedel, som t.ex. alkoholer, ketoner, et- rar, amider eller blandningar därav, vid temperaturer från -20 till +l30°C, före- trädesvis 0 till 65°C, eventuellt i närvaro av katalysatorer som avspjälkar protoner eller hydroxyljoner och eventuellt i närvaro av vatten, i ett eller flera steg, företrädesvis i ett eller två steg, påför detta på ett bärkraftigt underlag, 1 och eventuellt efter en efterbehandling kopplar det biokemiska materialet.

   5. Förfarande enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a t av att man förkondenserar utgångskomponenterna a) till c) l minut till 20 timmar och sedan utkondenserar dem i närvaro av minst den för hydrolys stökiometriskt erforderliga vattenmängden.

   6. Förfarande enligt patentkravet b, k ä n n e t e c k n a t av att man genornkondenserar utgångskomponenterna a) till c) i närvaro av åtminstone den för hydrolys stökiometrislt erforderliga l0 15 20 25 30 7813017-6 i 16 vattenmängden i ett steg.

   7. F örfarande enligt något av patentkraven ß-G, k ä n n e t e c k n a t av att man 'förkondenserar utgångskomponenterna a) till c) och påför det erhållna kondensatet som, sådant eller löst i ett organiskt lösningsmedel, eventuellt efter tillsats av stökiometriska mängder av vatten, på det bärkraftiga underlaget och eventuellt behandlar det påförda skiktet med vatten och/eller inbrännerdet vid förhöjd temperatur.

   8. Förfarande enligt något av patentkraven 14-6, k ä n n e t e c k n a t av att man genomkondenserar utgångskomponenterna a) till c) och påför det erhållna kondensatet som sådant eller löst i ett organiskt lösningsmedel på det bärkraftiga underlaget och eventuellt behandlar det påförda skiktet med vatten och/eller inbränner det vid förhöjd temperatur.

   9. Förfarande enligt något av patentkraven 0-8, k ä n n e t e c k n a t av att man eventuellt efter tillsats av en stökiometrisk vattenmängd isolerar kiselsyraheteropolykondensatet ur den organiska fasen och om så erfordras efter upplösning i ett organiskt lösningsmedel påför det på det bärkraftiga underlaget och eventuellt behandlar det påförda skiktet med vatten och/eller inbränner det vid förhöjd temperatur. l0. _ Förfarande 'enligt något av patentkraven 14-9, k ä n n e t e c k n a t av att man väljer mängden av komponenterna a) till c) så att det bildade kiselsyraheteropolykondensatet, räknat på oxider, innehåller 60 till 90 viktprocent av komponent a), l till 15 viktprocent av komponent b) och 0 till 30 viktprocent av komponent c). ll. Förfarande enligt något av patentkraven li-IO, k ä n n e t e c k n a t av att man för kondensationen eventuellt tillsätter upp till 3% vatten, syra, bas eller amin som katalysator.

   12. Förfarande enligt något av patentkraven li-l l, k ä n n e t e c k' n a t av att man påför kiselsyraheteropolykondensatet som sådant eller löst i ettiorganiskt lösningsmedel på underlaget och förbinder det med underlaget genom l0 till 45 minuters upphettning till 75 till l50°C. l3. F örfarande enligt något' av patentkraven 14-12, k ä n n e t e c k n a t av att 'man efterbehandlar kiselsyraheteropolykondensat- skiktet med vatten' eller vattenånga av ß till l50°C i 2 till 30 minuter. l0 l5 20 25 lll. 7813017-6 17 F örfarande enligt något av patentkraven #43, k än n e t e c k n a t av att man inbränner kiseisyraheteropolykondensatskiktet vid temperaturer från l00 till l50°C i 5 till 30 minuter. ljfl Användning av stabiliserade, olösliggjorda biokemiska preparat i form av biokemiska material, som t.ex. antigener, antikroppar, hormoner, aminosyror, haptener, proteiner, enzymer etc., kovalent bundna till ett kiselsyraheteropoly- kondensatskikt bestående av ett sampolymerisat av a)' b) c) minst en substituerad silan med den allmänna formeln (l) SiRn "(a_n) (l) där R betecknar väte, halogen, alkoxi eller -NR'2 (R' = väte och/eller alkyl), R" betecknar alkyl, alkenyl, aryl eller aralkyl och n är ett heltal från l till 3, minst en funktionell silan med den allmänna formeln (ll) SiRn(R"'Y)(a_n) (ll) där R har den ovan angivna betydelsen, R"' betecknar alkylen, fenylen, alkylfenylen eller alkylenfenylen, Y betecknar halogen eller en eventuellt substituerad ámino-, eventuellt substituerad anilino-, aldehyd-, keto-, karboxi-, hydroxi-, merkapto-, cyano-, hydroxifenyh, diazo-, karbonsyra- fllkyleSter-w SUIfOH-Syra- (-SC_)3H) eller fosforsyragrupp (-PO3H2) och n är ett heltal från l till 3, liksom weíentuellt minst ett hydrolyserbart kiselsyraderivat med den allmänna formeln (lll) sina i y . (m) där R har denovan angivna betydelsen, varvid dock inte alla grupper R är väte, som i sin tur anbringat på ett mekaniskt bärkraftigt underlag ,som medel, före- trädesvis separationsmedel eller adsorbens, vid immunkemiska förfaranden, såsom radioimmunoanalys eller affinitetskromatografi. r , _ . _21; <-i__._-Ér,-,f¿.,;, i ~ »w-»fl- _ ,:~=.:-...:».;