SE441548B - Forfaringssett for kvantitativ bestemning av malondialdehyd i blodplettar - Google Patents

Description

“'7908794-6 10 30 \~.\, dialys, och malondialdehyden uppLuges i en motdiulys- bubbelström, att det knlorimv1rihkn rongunsvL lill- hättes till denna motdíalys~hubbeJsLröm ovh bubbel- strömmen därefter bringas till en temperatur po omkring SQOC och hålles där samman med det kolorlmutrifika reagenset till en fullständig omsättning av malnu- dialdehyden med det kolorímetriska reagensct innan den kolorímetríska bestämningen av mulondinldehydvn skur. l en utföringsform användes som kolori- metrískt reagens 2-tiobarbitursyra.

Företrädesvis hålls bubbelströmmen vid den förhöjda temperaturen av 820C ungefär 10 minuter.

V Utfällningen av proteinet sker lämpligen genom tillsats av ungefärligen 10-procentig pozklor- svra.

Blodplättarna har förmågan att producera xä- sentlíga mängder endoperoxider ur arkídonsyru. Omvand- lingen sker tack vare enzymsystemet vid cyklooxigenasvr.

Endoperoxiderna övergår i sin tur till olika metaboliter, däribland malondialdehyd (MDA). Det är känt att en enda oral dos av acetylsalicylsyra (aspirin) irre- versibelt förändrar blodplättarnas cyklooxigenas-syetvm, och sålunda hindær produktionen av endoperoxíder ur blod- plättarnal Produktionen av MDA, endopèroxidernas metabolis- ka derivat, förhindras också irreversíbelt. Således utgör kvantifieringen av MDA i blodplättar Före och efter en enkel oral dos av acetylsalicylsyra en möjlighet ari ut- värdera åccrbiianing av bimipizittar. ' Blodplättarna, som in vívo utsuLL< För uvvtyl- salícylsyror, har visserligen irrevvrsihelt Förlorat nur- mal förmåga att producera MDA. Ä andra sidan skor ingvL inhiberíngsfenomen i de blodplättar som sätts i cirkula- tion efter att aspirinet har mist sin verkan, vilket vun- ligen sker mycket snabbt. Således kan man, om MDA-halten 10 15 20 25 30 35 7908794-6 jämförs med halten före acetylsalicylsyredosen, genom upp- ritande av lämpliga diagram bestämma återbildningstiden för bióapiättar. ' Föreliggande teknik kan således i_motsats till 51cr-metoden sägas vara en mätning av produktionshastig- -heten av blodplättar i benmärgen snarare än en mätning av destruktionshastigheten för blodplättarna.

I det följande kommer en utförandeform av uppfinningen att beskrivas, vilken emellertid inte ska ses som begränsande för uppfinningen.

Utförandeformen avser en halvautomatisk kvan- tifiering av malondialdehyd i blodplättar.

Metoden omfattar ett manuellt steg för iord- ningställande av prover innehållande malondialdehyd och ett automatiskt steg för den egentliga bestämningen av malondialdehydinnehållet i dessa prover. För att erhålla etthelt automatiskt förfarande kan även det första steget automatiseras.

Manuellt steg En mängd av 9 ml venblod från människa upp- samlas och koagulering motverkas med 1 ml 0,129 M tri- natriumcitratlösning. Blodplättsrik plasma (PRP) fram- ställs genom eentrifugering av blodet vid 200 xg under 10 min (2200). Räkning av blodplättarna genomförs på varje prov med en THROMBO-räknare (Coulter Electronics). Knapp- formade prov av blodplättar framställs genom centrifuge- ring (zooo xg; 30 min; 21°c) av 2 mi PRP. Knapparna åter- förs i suspension i 2 ml fosfatbuffert med pH 7,h (naznrou, 1,36 % vikt/voi; Neon 0,33 % vikt/voi) och in- kuberas under 15 min vid 37°C i närvaro av N-etylmaleimid (1 mN; NEM) eller arkidonsyra (o,6h mn; AA). Dessa medel stimulerar produktionen av blodplätt-MDA. Efter inkuba- tionsperioden utsätts proven för ultraljud under 15 min.

Avfallssubstans avlägsnas genom filtrering med SERACLEAR-filter. 7908794-6 10 15 20 25 30 Automatiskt steg Ett flödesschema för automatiskt bestämning av maldndialdehyd ur blodplättar framgår av bifogade ritning. Följande TECHNICO§:)moduler används vid kvanti- fieringen. En provdistribueringsapparat av typ ll med en kapacitet av #0 prover i timmen (förhållandet mellan provtagning och rengörning 2:1), en peristalisk doserings- pump med multirör av typ II, en dialysapparat försedd med ett cuprophane membrane, vilket hålls vid en temperatur av 3700, ett termoreglerat oljebad, vars temperatur hålls vid 82°C, en kolorimeter försedd med en rörformig tank med 15 mm optisk passage och ett 530 nm filter, en skrivare med Ä ggr skalförstorníng samt en spännlngstrans- formator och stabilisator.

Två lösningar av perklorsyra (PGA) med kon- centrationen 2 respektive 10% (v/v) iordningställs. Brij- 35 med konsentrationen 0,05% (V/v) tillsätts till vardera lösningen för att kontrdflera bubblingen i flödet.

En O,8%-ig (w/v) 2-tiobarbitursyrelösning iordningställes enligt en teknik beskriven i "The New England Journal of Medecine", juni 19,1975, s. 1310-1313, Marie J.Stuart, M.B., B.S.,Scott Murphy, M.D. och Frank A.Oski M.D. :"A simple non radioisotope technic for the determination of Platelet Life-Span".

Den 1o%-iga PGA-lösningen blandas med flödet av prover, vilka först sönderdelats med luft eller någon annan gas. De frigjorda proteinerna avskiljs genom dialys vid 37°c, varvid MDA :ae upp med en; meiriktat bubbel- flöde av 2% PGA. 2-tiobarbitydsyrelösning tillsätts till metflödet. En _inkubering under 10 min vid s2°c medger att MDA och 2-tiobarbitursyra bildar ett rosafärgat komplex. Nämnda färg kan avläsas vid 530 nm efter kyl- ning av blandningen till rumstemperatur med en värme- växlare (SINNED-kylare).

. *I 10 15 2o_ 25 30 35 7908794-6 En 10 mM MDA-lösning iordningsställs genom hydrolys av malondialdehydtetrartylacetal med 0,5 N salt- syra. Kalibreringskurvor ritas med MDA-lösningar, vars koncentrationer varierar mellan 0,25 och 3 nmol/ml. Dessa lösningar framställs ur modervätskan genom spädning med destillerat vatten.

Kompatíbilitetsvillkor för automatisk MDA-kvuntificríng a) Provdistribneringsapparatens kapacitet kan variera från 20 till 70 prover per timma. Förhållandet mellan _provtagning och rengöring kan vara 2:3 P 2:1. b) Pumpmotorns varvtal kan väljas efter behov.

Q) Dialystiden kan exempelvis variera mellan 1 och 10 min och är företrädesvis 3 min, om temperaturen hålls mellan 20 och 5000, företrädesvis mellan 35 och HOOC.

Det bör påpekas att angivna förhållanden i ovan be- skrivna exempel är de optimala. Motflödet i dialysen kan bestå av en vattenhaltig syrelösning av låg styrka.

Valet av syra har förhållandevis lite betydelse, men dess koncentration bör inte överstiga 5%. Förutan perklorsyran (PGA) kan t ex H3POh, CHSCOOH och CCL3 d) Den syrakoncentration som används för att frigöra COOH användas, proteinerna är inte kritisk.

Vad beträffar t ex PCA kan en koncentration av 5_- 12% användas. Emellertid medför hög koncen- tration korrosionsproblem, speciellt i dialyssystemet.

I detta steg kan PCA utbytas mot någon av ovan- nämnda syror, som inte behöver vara identisk med i dialysens motströmsflöde använd syra. e) En sänkning av 2-tiobarbitursyrakoncentrationen leder till minskad färgning. En ökning däremot innebär inte ökad känslighet. f) Tiden i oljebadet och dess temperatur är kritiska i det ovan behandlade systemet. En temperaturökning förhindrar god kontroll av flödet och en temperatur- minskning leder till minskad känslighet. 790-8794- 6 10 15 20 25 BO 35 Den nämnda färgningstiden (10 min) är tiil- räcklig för att fullborda reaktionen mellan MDA och _» 2-tiobarbitursyran. Tiden kan ökas men inte minskas.

Ovan beskrivna villkor för automatisk kvanti- t fiering av blodplätts-MA är optimala. En ändring i flödesschemat, som är visat på bifogade ritning, kan leda = till förlorad känslighet. Förlusten kan dock kompenseras genom förstärkning av utsignalen från kolorimetern.

En anordning för genomförande av det automatiska steget kommer i det följande att detaljerat beskrivas med hänvisning till bifogade ritning.

Anordningen omfattar i tur och ordning en provdistribueringsapparat 1, och en dialysapparat 2, ett oljebad 3, en kolorimeter H och en skrivare 5.

Provdistribueringsapparaten 1 är ansluten till dialysapparaten 2 medelst ett rör 6. Till röret är succesivt anslutna ett luftinlopp 7 för sönderdelning av de prover,som matas till dialysapparaten, i ekvidistanta delar med väsentlig konstant längd, samt en tillförsel- ledning 8 för 10% -ig perklorsyra, som ska blandas med proverna för att frigöra proteinerna. Nedströms det om- råde där syran tillföres proverna är en blandnings- spiral 9 insatt i röret, för att alstra ett väsentligen turbulent flöde som säkerställer en homogen blandning av syra och prover. De frigjorda proteinerna avskiljs vid 10.

En ledning 11, till vilken ytterligare ett luftinlopp 12, är anslutet ger upphov till det motriklade flödet av 2%-ig perklorsyra i dialvsen. 2-tiobarbitur- syralösningen tillsätts det flödet genom en ledning 13.

Omblandning sker i ytterligare en spiral 1h innan flödet får passera ett oljebad 3, där en temperatur av 82°C vidmakthålls.

När flödet passerat oljebadet matas det genom efter att ha kylts till "SINNED". ett rör 25 till kolorimetern H, rumstemperatur i en kylare av märket 10 15 20 25 BO 7908794-6 En del av varje prov passerar genom kolori- metern, för mätning av MDA-innehållet, under det att överskotter redan avletts genom en ledning 17 för att uppsamlas i 18. Mätprovet förs efter kolorimetern via en ledning 19 också till 18.

Ett tvättvattenflöde tillförs genom en ledning 20, dels för rengörning av distribueringsprov- tagningsnål samt dels för segmentering av proven och för blandning av proven med PCA. Vatten och rengörnings- produkter frånskiljs vid 21.

Flödesmängderna i de olika ledningarna, rören ooh tilloppen bestäms av en pump 22.

I det beskrivna exemplet matas proverna till dialysapparaten genom rör med en innerdiameter av 1,295 mm (0,051"), luften tillförs genom ett rör med innerdiametern 1,016 mm (0,0ü0") och den 10%-iga PCA:n tillförs genom ett rör med innerdiametern 0,889 mm (o,o35"). Den 296-iga PcAm till møtf1ödet.i dialysen tillförs genom en ledning med en innerdiameter av 1,L+22 mm (o,o56"), under det att luften tillförs sist- nämnda PCA-ström genom en ledning med en innerdiameter av 1,1l+3mm (o,ol+5") Tiobarbitursyran tillförs genom en ledning med innerdiametern 1,270 mm (0,05").

Innerdiametern på tvättvattenledningen är 1,851: mm (o,o73").

Det bör påpekas att de olika rörens inner- diametrar kan varieras inom vissa gränser. För att möj- liggöra optimal automatisk kvantifiering av MDA måste emellertid de olika rörens innerdiametrar väljas mycket noggrant, så att lämpliga flöden kan regleras av pumpen.

I allmänhet är samtliga rör, tuber och led- ningar i anordningen tillverkade av glas.

Claims (4)

10 15 20 25 30 "35 7908794-6 Patentkrav l. Förfaringssätt för kvantitativ bestämning av malon- n dialdehyd i blodplättar, varvid man ur en bestämd blod- mängd framställer en på blodplättar anrikad plasma, räk- nar de i plasmat ingående blodplättarna, sedimenterar blodplättarna och suspenderar dem på nytt vid pH 7,4 genom tillsats av en fosfatbuffert, tillsätter till suspensionen ett medel som befrämjar produktionen av gblodplättarnas malondialdehyd, därefter till det sålunda erhållna provet tillsätter ett kolorimetriskt reagens, upphettar provet och slutligen bestämmer dess halt av malondialdehyd genom kolorimetri, k ä n n e t e c k - n a t av, att för kontinuerlig behandling av det malondialdehyd-innehållande provet detta uppdelas i separata avsnitt medelst gasblåsor innan tillsatsen av *det kolorimetriska reagenset, att proteinet utfälles ur dessa separata avsnitt av provet genom syratillsats och avskiljes genom dialys, och malondialdehyden upptages i en motdialys-bubbelström, att det kolorimetriska rea- genset tillsättes till denna motdialys-bubbelström och bubbelströmmen därefter bringas till en temperatur på omkring 82° C och hâlles där samman med det kolorimet- riska reagenset till en fullständig omsättning av malon- dialdehyden med det kolorimetriska reagenset innan den kolorimetriska bestämningen av malondialdehyden sker.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av, att som kolorimetriskt reagens användes 2-tiobarbitursyra.

3. Sätt enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k n a t av, att bubbelströmmen hålles vid den förhöjda temperatu- ren av 820 C ungefär 10 minuter.

4. Sätt enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t av, att utfällningen av proteinet sker ge- Ä nom tillsats av ungefärligen 10-procentig perklorsyra. _ ...i-___