RU84381U1 - DEVICE FOR AUTOMATED ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS - Google Patents
DEVICE FOR AUTOMATED ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS Download PDFInfo
- Publication number
- RU84381U1 RU84381U1 RU2009105294/22U RU2009105294U RU84381U1 RU 84381 U1 RU84381 U1 RU 84381U1 RU 2009105294/22 U RU2009105294/22 U RU 2009105294/22U RU 2009105294 U RU2009105294 U RU 2009105294U RU 84381 U1 RU84381 U1 RU 84381U1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cartridge
- reservoirs
- nucleic acids
- lysis
- reagents
- Prior art date
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
1. Устройство для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, состоящее из (а) картриджа, содержащего резервуары с реагентами для лизиса клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистки и элюции нуклеиновых кислот, каналы, микроколонки и клапаны, и (б) управляющей установки-контроллера, осуществляющей подачу давления, нагрев, перемешивание реагентов в индивидуальных резервуарах картриджа и перемещение реакционных смесей и растворов в резервуарах картриджа, характеризующееся тем, что картридж содержит приемную камеру для ввода биологического образца, резервуары с сухими реакционными смесями буферов для лизиса и буфера для промывки, микроколонку с твердофазным сорбентом для связывания нуклеиновых кислот, резервуары для этанола, смеси вода-этанол и воды для растворения сухих компонентов промывочного буфера, промывки микроколонки и элюции нуклеиновых кислот, связавшихся с твердофазным сорбентом в микроколонке, выходной порт, совместимый со стандартной микропробиркой, резервуар для сбора отходов реакций, а управляющая установка-контроллер содержит блок соленоидов для управления клапанами картриджа, блок нагревателей, блок электромагнитных мешалок, компрессор и блок электронного управления. ! 2. Устройство по п.1, характеризующееся тем, что картридж помещают в управляющую установку-контроллер, обеспечивающую заданные скорости перемещения реакционных смесей и реагентов в резервуарах картриджа, температурно-временные режимы инкубации и перемешивания реакционных смесей в отдельных резервуарах картриджа. ! 3. Устройство по п.1, характеризующееся тем, что картридж содержи1. Device for the automated extraction of nucleic acids from biological samples, consisting of (a) a cartridge containing reservoirs with reagents for lysis of cells, microorganisms and viral particles, purification and elution of nucleic acids, channels, microcolumns and valves, and (b) control unit - a controller supplying pressure, heating, mixing reagents in individual reservoirs of the cartridge and moving reaction mixtures and solutions in the reservoirs of the cartridge, characterized in that the cartridge contains Receiving chamber for introducing a biological sample, reservoirs with dry reaction mixtures of lysis buffers and washing buffer, microcolumn with solid-phase sorbent for binding nucleic acids, reservoirs for ethanol, a mixture of water-ethanol and water for dissolving the dry components of the washing buffer, washing the microcolumn and elution nucleic acids bound to a solid-phase sorbent in a microcolumn, an output port compatible with a standard microtube, a reservoir for collecting reaction waste, and a control unit Weller comprises a unit for controlling the solenoid valves of the cartridge unit heaters, electromagnetic stirrer unit, a compressor and an electronic control unit. ! 2. The device according to claim 1, characterized in that the cartridge is placed in a control unit-controller, providing the specified speed of movement of the reaction mixtures and reagents in the reservoirs of the cartridge, temperature-time modes of incubation and mixing of the reaction mixtures in separate reservoirs of the cartridge. ! 3. The device according to claim 1, characterized in that the cartridge contains
Description
Полезная модель относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, микробиологии и медицине и касается устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот (НК), в котором осуществляются все стадии выделения и очистки НК из биологических образцов. Процедура выделения и очистки НК выполняется внутри картриджа, изолированного от внешней среды, что сводит к минимуму риск заражения персонала. Полученную очищенную ДНК можно непосредственно использовать для проведения ПЦР.The utility model relates to the field of molecular biology, biotechnology, microbiology and medicine and relates to a device for the automated isolation of nucleic acids (NK), in which all stages of the selection and purification of NK from biological samples are carried out. The procedure for the separation and purification of ND is performed inside the cartridge, isolated from the external environment, which minimizes the risk of infection of personnel. The resulting purified DNA can be directly used for PCR.
Выделение и очистка нуклеиновых кислот (НК) из биологического материала (животные и растительные клетки, ткани, физиологические жидкости (кровь, слюна и др.)), а также из образцов почв, пищевых продуктов, воды и др. является необходимой стадией при проведении широкого круга исследований в разных областях науки, включая молекулярно-генетические исследования, а также в клинической диагностике, фармакологии, медицине, биотехнологии, охране окружающей среды и др. Современные требования к лабораторным методам выделения НК включают быстроту и эффективность проведения всех этапов выделения и безопасность выполнения процедуры для персонала, универсальность протокола для получения очищенной ДНК и РНК из различных биологических образцов. Возрастают требования к чистоте получаемых препаратов и воспроизводимости процедуры выделения.Isolation and purification of nucleic acids (NK) from biological material (animal and plant cells, tissues, physiological fluids (blood, saliva, etc.)), as well as from soil samples, food products, water, etc. is a necessary stage during a wide range of studies in various fields of science, including molecular genetic research, as well as in clinical diagnostics, pharmacology, medicine, biotechnology, environmental protection, etc. Modern requirements for laboratory methods for the isolation of NK include speed and efficiency the efficiency of all stages of isolation and the safety of the procedure for staff, the universality of the protocol for obtaining purified DNA and RNA from various biological samples. There are increasing requirements for the purity of the preparations obtained and the reproducibility of the isolation procedure.
Выделение и очистка НК в биохимических лабораториях и медицинских центрах в настоящее время производится, в основном, в ручном режиме. Первым этапом выделения является разрушение клеточных стенок или вирусного капсида (лизис), после которого необходимо проводить отделение белков и нерастворимых частиц. Большинство методик выделения НК включает несколько стадий центрифугирования, что является одной из наиболее трудоемких процедур, которые приводят также к уменьшению выхода НК за счет больших потерь при отборе супернатанта после центрифугирования. В некоторых методах выделения и очистки НК используются токсичные органические растворители, такие, как фенол, хлороформ и др., что требует дополнительных мер защиты персонала лабораторий. Кроме того, при работе с патогенными микроорганизмами и вирусами существует риск заражения персонала.Isolation and purification of NK in biochemical laboratories and medical centers is currently carried out mainly in manual mode. The first stage of isolation is the destruction of cell walls or a viral capsid (lysis), after which it is necessary to separate proteins and insoluble particles. Most of the techniques for the extraction of NK include several stages of centrifugation, which is one of the most laborious procedures, which also lead to a decrease in the yield of NK due to the large losses during the selection of the supernatant after centrifugation. Some methods for the separation and purification of nanocrystals use toxic organic solvents, such as phenol, chloroform, etc., which requires additional protective measures for laboratory personnel. In addition, when working with pathogenic microorganisms and viruses, there is a risk of infection of personnel.
Таким образом, недостатками ручных процедур являются трудоемкость, недостаточно высокий выход НК, частое использование токсичных органических растворителей, риск заражения персонала при работе с патогенными микроорганизмами. Поэтому, в данной области существует острая потребность в разработке устройства для автоматизированного выделения НК, которое позволяло бы быстро получать высокоочищенные НК с высоким выходом и исключило или свело к минимуму контакт персонала с патогенным или инфекционным материалом.Thus, the disadvantages of manual procedures are the complexity, insufficient yield of NK, the frequent use of toxic organic solvents, the risk of infection of personnel when working with pathogenic microorganisms. Therefore, in this area there is an urgent need to develop a device for automated ND extraction, which would allow one to quickly obtain highly purified ND with a high yield and eliminated or minimized personnel contact with pathogenic or infectious material.
В настоящее время существует ряд автоматизированных устройств для обработки биологических образцов и выделения НК. Роботизированные системы COBAS AmpliPrep компании Roche Diagnostics (США/Швейцария), Thermo′s KingFisher компании Thermo Electron (США), QIAsymphony SP и BioRobot MDx компании Qiagen (Германия), предназначенные для выделения и очистки ДНК и РНК из биологических жидкостей, таких как сыворотка и плазма крови, слюна, моча, основаны на применении технологии, использующей магнитные частицы. Все эти системы позволяют одновременно обрабатывать несколько биологических образцов, например, 24 образца физиологических жидкостей в устройстве Thermo′s KingFisher, 96 образцов для выделения вирусных НК или геномной ДНК из образцов крови в приборе QIAsymphony SP. Система QIAsymphony SP включает картриджи, заполненные необходимыми реагентами, дозированно подаваемые для обработки образца. Картриджи в процессе выделения открываются автоматически, что сводит к минимуму риск заражения или контаминации.Currently, there are a number of automated devices for processing biological samples and the selection of NK. Robotic systems COBAS AmpliPrep from Roche Diagnostics (USA / Switzerland), Thermo's KingFisher from Thermo Electron (USA), QIAsymphony SP and BioRobot MDx from Qiagen (Germany) designed to isolate and purify DNA and RNA from biological fluids such as serum and blood plasma, saliva, urine, are based on the use of technology using magnetic particles. All these systems allow the simultaneous processing of several biological samples, for example, 24 samples of physiological fluids in a Thermo's KingFisher device, 96 samples for isolation of viral NK or genomic DNA from blood samples in a QIAsymphony SP device. The QIAsymphony SP system includes cartridges filled with the necessary reagents, dispensed for sample processing. Cartridges are automatically opened during the selection process, which minimizes the risk of infection or contamination.
Известны также рабочие станции для автоматической экстракции и очистки НК, которые с использованием роботов воспроизводят ручные способы выделения НК, включающие последовательное перемещение пробирок, фильтрацию, дозирование реагентов. Например, компанией Bioneer Corp.заявлено устройство для автоматической очистки ДНК (Automatic DNA purification apparatus, патент WO/2001/025482), состоящее из многочисленных контейнеров для растворов, каналов для прохождения жидкостей, регулируемых клапанами, вакуумного блока, штативов, шприцов для точного количественного введения и отсасывания жидкостей.Workstations for automatic extraction and purification of NK are also known, which using robots reproduce manual methods for NK isolation, including sequential tube transfer, filtration, and dosing of reagents. For example, Bioneer Corp. announced a device for automatic DNA purification (Automatic DNA purification apparatus, patent WO / 2001/025482), consisting of numerous containers for solutions, channels for the passage of liquids, adjustable valves, a vacuum unit, racks, syringes for accurate quantitative introduction and suction of liquids.
Компанией Corbett Technologies (Австралия) разработана настольная рабочая станция "X-tractor GeneTM System" для экстракции НК из образцов объемом до 200 мкл, полностью воспроизводящая ручное выделение НК.Corbett Technologies (Australia) developed the X-tractor GeneTM System desktop workstation for extracting NK from samples up to 200 μl, fully reproducing manual NK extraction.
Компанией Isis Pharmaceuticals, США запатентована полностью автоматизированная система-робот для идентификации биологически-опасных агентов (Automatic identification of bioagents, патент WO/2005/009202). Система состоит из двух блоков, разделенных воздушным шлюзом, в первом из которых проводится выделение и очистка ДНК, а во втором - ПЦР для идентификации агента.Isis Pharmaceuticals, USA patented a fully automated robot system for identifying biohazard agents (Automatic identification of bioagents, patent WO / 2005/009202). The system consists of two units separated by an air lock, in the first of which DNA is extracted and purified, and in the second, PCR to identify the agent.
Все эти устройства являются сложными конструкциями, основанными на применении робототехники, недостатками которых является их громоздкость, высокая стоимость (более 70 тыс. долл. США), дороговизна проведения анализов и эксплуатации, что делает невозможным их использования в небольших лабораториях и центрах. Кроме того, они являются закрытыми системами, не допускающими вмешательство оператора в ход процесса. При эксплуатации таких систем необходимы постоянные закупки реагентов данной фирмы, которые предназначены для данного конкретного прибораAll these devices are complex designs based on the use of robotics, the disadvantages of which are their bulkiness, high cost (more than 70 thousand US dollars), the high cost of analysis and operation, which makes it impossible to use them in small laboratories and centers. In addition, they are closed systems that do not allow operator intervention in the process. When operating such systems, constant purchases of reagents from this company are required, which are designed for this particular device
Другой класс установок для автоматизированного выделения НК включает более простые и дешевые устройства, которые позволяют хотя бы частично автоматизировать процесс.Another class of installations for automated ND extraction includes simpler and cheaper devices that allow at least partially automating the process.
Фирмой Millipore Corporation (США) запатентовано устройство для выделения НК из клеток, вирусных частиц и микоплазмы, состоящее из системы фильтрующих элементов (пористых мембран), через которые последовательно пропускают образец (Filter device for the isolation of a nucleic acid, EP 183242 A2). На первой мембране осуществляется лизис клеток; полученный лизат поступает на стекловолоконный фильтр для последующей очистки и элюции НК. Фильтрующие мембраны соединены системой клапанов. Устройство может быть как одноразового, так и многоразового использования. Для одновременной обработки нескольких образцов несколько фильтрующих устройств могут быть собраны в кассету. Недостатками данного устройства являются необходимость ручного введения реагентов и наличие стадий центрифугирования.Millipore Corporation (USA) patented a device for separating NK from cells, viral particles, and mycoplasma, consisting of a system of filtering elements (porous membranes) through which a sample is passed sequentially (Filter device for the isolation of a nucleic acid, EP 183242 A2). Cell lysis is performed on the first membrane; the resulting lysate enters a glass fiber filter for subsequent purification and elution of the NK. The filtering membranes are connected by a valve system. The device can be either disposable or reusable. For the simultaneous processing of several samples, several filtering devices can be collected in a cassette. The disadvantages of this device are the need for manual introduction of reagents and the presence of centrifugation stages.
Запатентовано устройство для выделения НК (Nucleic acid isolation, WO/2005/012521, Invitrogen Corp., США), представляющее собой картридж, состоящий из пробирки, соединенной с фильтрующим элементом и далее с колонкой для очистки НК. Фильтрующий элемент содержит несколько слоев фильтров, колонка включает носитель, способный связывать НК, например носитель с переменным зарядом. Манипуляции с образцом осуществляются с помощью шприца или насоса. Недостатком данного устройства является необходимость предварительной ручной обработки образца перед введением его в картридж: проведение лизиса клеток, разбавление сыворотки крови и т.п.A device for separating NK (Nucleic acid isolation, WO / 2005/012521, Invitrogen Corp., USA) is patented, which is a cartridge consisting of a tube connected to a filter element and then to a column for cleaning NK. The filter element contains several layers of filters, the column includes a carrier capable of binding NK, for example a carrier with a variable charge. Sample manipulations are carried out using a syringe or pump. The disadvantage of this device is the need for preliminary manual processing of the sample before introducing it into the cartridge: cell lysis, dilution of blood serum, etc.
Описан ряд микрофлюидных устройств для получения очищенных нуклеиновых кислот, содержащих сеть микроканалов диаметром 100 мкм и менее, через которые пропускаются биологические образцы и растворы реагентов. В состав микрофлюидных систем входят также перемешивающие устройства, микродозаторы, микронасосы, фильтры и др.A number of microfluidic devices are described for producing purified nucleic acids containing a network of microchannels with a diameter of 100 μm or less, through which biological samples and reagent solutions are passed. Microfluidic systems also include mixing devices, microdosers, micropumps, filters, etc.
Запатентованы микрофлюидное устройство для очистки ДНК при взаимодействии образца с диатомитом (Purification and amplification of nucleic acids in a microfluidic device, WO/2008/002725, Bio-Rad, США), микрофлюидное устройство для выделение геномной ДНК из лейкоцитов человека, в котором ДНК из образца связывается с поверхностью канала, модифицированного ДНК-связывающим реагентом (DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces, WO/2006/081324); микрочип, в котором очистка ДНК происходит путем последовательного прохождения через серию хроматографических микроколонок, селективно сорбирующих примесные вещества, такие как белки, пептиды, липиды, лектины и др., а последняя колонка селективно связывает ДНК (DNA purification in a multi-stage, multi-phase microchip, WO/2008/058204). Недостатком таких устройств является низкий выход НК, а также необходимость ручного введения реагентов на разных стадиях выделения и очистки.A microfluidic device for DNA purification during the interaction of a sample with diatomite (Purification and amplification of nucleic acids in a microfluidic device, WO / 2008/002725, Bio-Rad, USA), a microfluidic device for the isolation of genomic DNA from human leukocytes, in which DNA is the sample binds to the channel surface modified with a DNA binding reagent (DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces, WO / 2006/081324); a microchip in which DNA purification occurs by sequentially passing through a series of chromatographic microcolumns selectively sorbing impurities such as proteins, peptides, lipids, lectins, etc., and the last column selectively binds DNA (DNA purification in a multi-stage, multi- phase microchip, WO / 2008/058204). The disadvantage of such devices is the low yield of NK, as well as the need for manual introduction of reagents at different stages of isolation and purification.
Описано микрофлюидное устройство и метод концентрирования и очистки НК из биологических образцов (Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step, WO/2005/068627, 3M Innovative Properties company, США), включающее резервуар для загрузки образца и камеры для обработки и перемешивания, соединенные каналами и клапанами. Образец после загрузки подвергается действию лизирующего раствора, переходит далее в камеру для обработки, где проходит несколько стадий концентрирования и разбавления, а также дополнительный лизис и удаление раствора, содержащего ингибиторы, которые мешают проведению ПНР с полученной ДНК. Недостатком данной системы является возможность лишь частичной очистки НК, в основном, от ингибиторов ПЦР.A microfluidic device and a method for concentrating and purifying NK from biological samples are described (Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step, WO / 2005/068627, 3M Innovative Properties company, USA), including a reservoir for loading a sample and a chamber for processing and mixing, connected by channels and valves. After loading, the sample is subjected to the action of a lysing solution, then passes to the processing chamber, where several stages of concentration and dilution take place, as well as additional lysis and removal of the solution containing inhibitors that interfere with the PNR with the obtained DNA. The disadvantage of this system is the possibility of only partial purification of NK, mainly from PCR inhibitors.
Предложено монолитное микрофлюидное устройство для экстракции ДНК и РНК, в основном, из образцов крови (Nucleic acid purification chip, WO/2005/066343, Сингапур), состоящее из субстрата на основе кремния, входных и выходных отверстий для введения и выведения образца крови, а также буферов для обработки образца в объеме нескольких микролитров, микромешалки, камеры для лизиса, камеры, содержащей ДНК-связывающий материал и систему клапанов. Устройство позволяет выделять НК только из образца определенного типа (кровь).A monolithic microfluidic device for extracting DNA and RNA, mainly from blood samples (Nucleic acid purification chip, WO / 2005/066343, Singapore), consisting of a silicon-based substrate, inlet and outlet openings for introducing and removing a blood sample, and buffers for processing a sample in the amount of several microliters, a micromixer, a lysis chamber, a chamber containing DNA-binding material and a valve system. The device allows you to select NK only from a sample of a certain type (blood).
Примером более сложной микрофлюидной системы является система, представляющая собой совокупность модулей, в первом из которых происходит связывание и очистка целевого продукта (НК), а второй модуль является собственно микрофлюидным устройством, осуществляющим детекцию и анализ полученного продукта (Microfluidic devices, WO/2008/030631, Microchip biotechnologies, США). Лизис клеток осуществляется обработкой ультразвуком в проточном режиме. Очистка ДНК осуществляется путем взаимодействия с магнитными частицами, содержащими аффинный носитель. Магнитное поле создается вращающимся магнитным блоком.An example of a more complex microfluidic system is a system consisting of a set of modules, in the first of which binding and purification of the target product (ND) takes place, and the second module is the microfluidic device proper, which detects and analyzes the resulting product (Microfluidic devices, WO / 2008/030631 , Microchip biotechnologies, USA). Cell lysis is carried out by ultrasonic treatment in a flow mode. DNA purification is carried out by interaction with magnetic particles containing an affinity carrier. A magnetic field is created by a rotating magnetic block.
Фирмой Siemens (Германия) предложен плоский картридж (карта) для автоматического анализа ДНК или белков, содержащий систему микроканалов и микрополостей, формирующих емкости для содержащихся в них сухих реагентов, а также способ его изготовления методом литья под давлением (Arrangement for integrated and automated DNA or protein analysis in a single-use cartridge, method for producing such a cartridge and operating method for DNA or protein analysis using such a cartridge, WO/2006/042838). Сухие реагенты вносятся в открытые каналы, которые после этого заклеиваются пленкой. Картридж является одноразовым устройством. Образец вносится в готовый к анализу картридж, и результаты получают в полностью автоматическом режиме при помещении картриджа в считывающее устройство.Siemens (Germany) proposed a flat cartridge (card) for automatic analysis of DNA or proteins, containing a system of microchannels and microcavities that form containers for the dry reagents contained in them, as well as a method for its manufacture by injection molding (Arrangement for integrated and automated DNA or protein analysis in a single-use cartridge, method for producing such a cartridge and operating method for DNA or protein analysis using such a cartridge, WO / 2006/042838). Dry reagents are introduced into open channels, which are then sealed with a film. The cartridge is a disposable device. The sample is entered into a cartridge ready for analysis, and the results are obtained in a fully automatic mode when the cartridge is placed in a reader.
Описан также ряд микрофлюидных аппаратов, в которых одновременно производится выделение ДНК и ее ПЦР-амплификация, а в ряде устройств и последующая детекция. Примером такой системы может служить устройство для выделения и амплификации ДНК из биологических жидкостей фирмы Micronics (США) (Method and system for microfluidic manipulation, amplification and analysis of fluids, for example, bacteria assays and antiglobulin testing, WO/2004/065010, патент США 7,416,892). Устройство представляет собой одноразовую микрофлюидную карту и предназначено для анализа бактерий в биологических жидкостях и диагностики некоторых заболеваний. Карта имеет встроенную фильтрующую мембрану, на которой задерживаются клетки, которые далее подвергаются лизису. Через мембрану последовательно пропускают серию растворов: растворы для отмывки, растворы, содержащие ферменты, растворы для амплификации и детекции. Проводится ПЦР-амплификация полученной ДНК в соответствующем температурном режиме, а далее ПЦР-продукт смывается с мембраны и передается на детектирующий элемент.A number of microfluidic devices are also described, in which DNA is extracted and its PCR amplification is simultaneously performed, and in a number of devices it is subsequently detected. An example of such a system is a device for the isolation and amplification of DNA from biological fluids (Micronics, USA) (Method and system for microfluidic manipulation, amplification and analysis of fluids, for example, bacteria assays and antiglobulin testing, WO / 2004/065010, U.S. patent 7,416,892). The device is a disposable microfluidic map and is intended for the analysis of bacteria in biological fluids and the diagnosis of certain diseases. The card has a built-in filtering membrane on which cells are retained, which are then lysed. A series of solutions is passed through the membrane sequentially: washing solutions, solutions containing enzymes, solutions for amplification and detection. PCR amplification of the obtained DNA is carried out in the appropriate temperature regime, and then the PCR product is washed off the membrane and transferred to the detecting element.
Описана микрофлюидная система («лаборатория-на-чипе») для детекции некоторых возбудителей инфекционных заболеваний (Университет Пенсильвании, США), состоящая из коллектора образца (слюны), одноразовой пластиковой кассеты (микрофлюидный чип) для обработки образца, включающей систему для проведения лизиса, экстракции НК, ПЦР, мечения ПЦР-продукта, и управляющей платформы-контроллера для управления подачей реагентов, температурой, клапанами, а также лазерного сканера для считывания результатов (Z. Chen, M.G. Mauk, J. Wang, W.R. Abrams, P.L. Corstjens, R.S. Niedbala, D. Malamud, H.H. Bau, A microfluidic system for saliva-based detection of infectious diseases. Ann. NY Acad. Sci., 2007, v. 1098, p.429-436).A microfluidic system (lab-on-a-chip) is described for the detection of certain infectious pathogens (University of Pennsylvania, USA), consisting of a sample collector (saliva), a disposable plastic cartridge (microfluidic chip) for processing a sample, including a lysis system, NK extraction, PCR, labeling of the PCR product, and the control platform controller for controlling the flow of reagents, temperature, valves, as well as a laser scanner for reading results (Z. Chen, MG Mauk, J. Wang, WR Abrams, PL Corstjens, RS Niedbala, D. Malamu d, H. H. Bau, A microfluidic system for saliva-based detection of infectious diseases. Ann. NY Acad. Sci., 2007, v. 1098, p. 429-436).
Фирмой Canon U.S. Life Sciences, США предложено устройство для анализа геномной ДНК, состоящее из картриджа, в котором проводится выделение ДНК, инжектора, с помощью которого ДНК передается на микрофлюидный чип, включающий зону для ПЦР-амплификации, зону для детекции и зону для анализа ДНК (Method and molecular diagnostic device for detection, analysis and identification of genomic DNA, WO 2007028084). Выделение ДНК происходит в реакционной камере с использованием магнитных частиц или материалов, меняющих свойства под действием электрического заряда.Canon U.S. Life Sciences, USA proposes a device for analyzing genomic DNA, consisting of a cartridge in which DNA is extracted, an injector, with which DNA is transferred to a microfluidic chip, including a PCR amplification zone, a detection zone and a DNA analysis zone (Method and molecular diagnostic device for detection, analysis and identification of genomic DNA, WO 2007028084). DNA is isolated in the reaction chamber using magnetic particles or materials that change properties under the influence of an electric charge.
Предложен полностью автоматизированный портативный микрофлюидный чип для обнаружения патогенных микроорганизмов методом ПЦР с детекцией в реальном времени (Real-time PCR detection of microorganisms using an integrated microfluidic platform, WO/2006/085948, Cornell Research Foundation, США). Микрочип включает модуль для лизиса очистки ДНК, который с помощью микроканалов соединен с модулем для ПЦР-детекции. Детекция осуществляется методом ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного красителя. Устройство можно использовать как в лабораториях, так и в полевых условиях.A fully automated portable microfluidic chip for detecting pathogenic microorganisms by real-time PCR (Real-time PCR detection of microorganisms using an integrated microfluidic platform, WO / 2006/085948, Cornell Research Foundation, USA) is proposed. The microchip includes a module for lysis of DNA purification, which is connected via microchannels to a module for PCR detection. Detection is carried out by real-time PCR using a fluorescent dye. The device can be used both in laboratories and in the field.
Таким образом, в настоящее время разработан ряд устройств для автоматического выделения и очистки НК, включающий сложные роботизированные системы, в том числе устройства для одновременно выделения ДНК и ее ПЦР-амплификации, и более простые и дешевые аппараты. Автоматические роботизированные системы дороги, громоздки и сложны в использовании, а более простые системы либо требуют дополнительной ручной обработки образца, либо осуществляют неполную очистку НК, либо выход НК недостаточен, либо они предназначены для выделения ДНК из образца определенного типа, например, только из крови, слюны и др., либо проводят анализ образца на наличие одного конкретного заболевания. Не существует универсального устройства, которое позволяет быстро, воспроизводимо и с высоким выходом выделять НК из биологических образцов в полностью автоматическом режиме.Thus, a number of devices for the automatic extraction and purification of NK have been developed, including complex robotic systems, including devices for simultaneously isolating DNA and its PCR amplification, and simpler and cheaper devices. Automatic robotic systems are expensive, cumbersome and difficult to use, and simpler systems either require additional manual processing of the sample, or they perform incomplete purification of the NK, or the NK yield is insufficient, or they are designed to isolate DNA from a certain type of sample, for example, only from blood, saliva, etc., or analyze the sample for the presence of one specific disease. There is no universal device that allows you to quickly, reproducibly and with high yield to extract NK from biological samples in a fully automatic mode.
В данной области существует острая потребность в разработке устройства для автоматизированного выделения НК, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высоким выходом НК и невысокой стоимостью. Чрезвычайно важно проведение всех операций выделения и очистке в автоматическом режиме, чтобы полностью исключить контакт персонала с патогенными и инфицированными образцами.In this area, there is an urgent need to develop a device for automated ND extraction, which would be favorably distinguished from the prior art solutions by the simplicity of analysis, high ND yield and low cost. It is extremely important to carry out all the operations of isolation and purification in automatic mode, in order to completely exclude personnel contact with pathogenic and infected samples.
Предлагаемая полезная модель позволяет проводить в автоматическом режиме все стадии выделения и очистки НК, включая лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистку и элюцию НК. Полностью исключен контакт персонала с биологическим образцом. Процедура выделения и очистки НК происходит быстро (около 40 мин) и с высоким выходом (более 90%). Полученную ДНК можно использовать для проведения ПЦР.The proposed utility model makes it possible to carry out automatically all stages of NK isolation and purification, including lysis of cells, microorganisms and viral particles, NK purification and elution. The contact of personnel with a biological sample is completely excluded. The procedure for the isolation and purification of ND occurs quickly (about 40 min) and with a high yield (more than 90%). The resulting DNA can be used for PCR.
На Фиг.1 представлена фотография полезной модели-устройства для автоматизированного выделения НК из биологических образцов. Картридж (1) помещают в управляющую установку-контроллер (2). Процедура выделения и очистки НК с использованием устройства управляется компьютером (3).Figure 1 presents a photograph of a useful model device for automated extraction of NK from biological samples. The cartridge (1) is placed in a control unit-controller (2). The procedure for extracting and purifying NK using the device is controlled by a computer (3).
На Фиг.2 представлена принципиальная схема картриджа для автоматизированного выделения НК с обозначением резервуаров с необходимыми реагентами.Figure 2 presents a schematic diagram of a cartridge for automated selection of NK with the designation of tanks with the necessary reagents.
1 - приемная камера для образца;1 - a receiving chamber for a sample;
2 - резервуар для лизирующего буфера, содержащего лизоцим. Раствор в резервуаре нагревается при использовании нагревательного элемента и перемешивается электромагнитной мешалкой;2 - reservoir for lyse buffer containing lysozyme. The solution in the tank is heated using a heating element and mixed with an electromagnetic stirrer;
3 - резервуар для лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент. Раствор в резервуаре нагревается при использовании нагревательного элемента и перемешивается электромагнитной мешалкой;3 - reservoir for lysis buffer containing a chaotropic agent, proteinase K, detergent. The solution in the tank is heated using a heating element and mixed with an electromagnetic stirrer;
4 - резервуар, содержащий этанол;4 - a tank containing ethanol;
5 - резервуар для промывочного буфера, содержащего хаотропный агент. Раствор в резервуаре нагревается при использовании нагревательного элемента и перемешивается электромагнитной мешалкой;5 - reservoir for washing buffer containing a chaotropic agent. The solution in the tank is heated using a heating element and mixed with an electromagnetic stirrer;
6 - резервуар, содержащий растворитель для промывочного буфера (смесь этанол-вода);6 - a reservoir containing a solvent for washing buffer (ethanol-water mixture);
7 - резервуар, содержащий этанол;7 - a tank containing ethanol;
8 - микроколонка с твердофазным сорбентом для связывания нуклеиновых кислот;8 - microcolumn with solid-phase sorbent for nucleic acid binding;
9 - резервуар для раствора для элюции НК с микроколонки (вода);9 - a reservoir for a solution for elution of NK from a microcolumn (water);
10 - резервуар для сбора очищенной НК;10 - a reservoir for collecting purified NK;
11 - резервуар для сбора отходов;11 - a tank for collecting waste;
а-m - клапаны, регулирующие перемещение реакционных смесей и реагентов в каналах и резервуарах картриджа. Управляются установкой-контроллером.a-m - valves that regulate the movement of reaction mixtures and reagents in the channels and reservoirs of the cartridge. They are controlled by the installation controller.
Фиг.3 представляет конструктивные элементы картриджа.Figure 3 represents the structural elements of the cartridge.
А - верхняя панель (крышка), оргстекло, 2 мм. На верхней панели расположены:A - top panel (cover), plexiglass, 2 mm. On the top panel are located:
1 - отверстия для поршней (16 шт.);1 - holes for pistons (16 pcs.);
2 - отверстие для приемной камеры образца;2 - hole for the receiving chamber of the sample;
3 - отверстия для фиксирующих винтов (4 шт.);3 - holes for fixing screws (4 pcs.);
П1 - прокладка, силикон, 2 мм;P1 - gasket, silicone, 2 mm;
П2 - прокладка, полиэтилен, пленка, 50 мкм;P2 - gasket, polyethylene, film, 50 microns;
Б - основная рабочая платформа, оргстекло, 8 мм;B - the main working platform, plexiglass, 8 mm;
П3 - прокладка, полиэтилен, пленка, 50 мкм;P3 - gasket, polyethylene, film, 50 microns;
П4 - прокладка, силикон, 2 мм;P4 - gasket, silicone, 2 mm;
В - нижняя панель (крышка), оргстекло, 2 мм.B - bottom panel (cover), plexiglass, 2 mm.
Фиг.4 представляет фотографию управляющей установки-контроллера (без картриджа).Figure 4 is a photograph of a control unit-controller (without cartridge).
1 - блок соленоидов для управления клапанами картриджа;1 - block of solenoids for controlling cartridge valves;
2 - блок поршней;2 - piston block;
3 - блок галогенных ламп нагревателя;3 - block halogen heater lamps;
4 - направляющие салазки для помещения картриджа в управляющую установку-контроллер;4 - guide rails for placing the cartridge in the control unit controller;
5 - блок электромагнитных мешалок;5 - block electromagnetic stirrers;
6 - компрессор;6 - compressor;
7 - блок электронного управления.7 - electronic control unit.
На Фиг.5 представлена схематическая диаграмма устройства клапана.Figure 5 presents a schematic diagram of a valve device.
1 - соленоид постоянного тока;1 - direct current solenoid;
2 - поршень;2 - the piston;
3 - запорная головка клапана;3 - locking valve head;
А - верхняя панель картриджа (см. Фиг.3);A - the upper panel of the cartridge (see Figure 3);
П1 - прокладка между верхней панелью и основной рабочей платформой картриджа, силикон (см. Фиг.3);P1 - gasket between the upper panel and the main working platform of the cartridge, silicone (see Figure 3);
П2 - прокладка между верхней панелью и основной рабочей платформой картриджа, полиэтилен (см. Фиг.3);P2 - laying between the top panel and the main working platform of the cartridge, polyethylene (see Figure 3);
Б - основная рабочая платформа картриджа (см. Фиг.3);B - the main working platform of the cartridge (see Figure 3);
IN - входной канал;IN - input channel;
OUT - выходной канал.OUT is the output channel.
Фиг.6 представляет результаты выделения НК из бактериальных клеток.6 represents the results of the selection of NK from bacterial cells.
А. Грам-положительные бактериальные клетки Bacillus thuringiensis (10s клеток/мл).A. Gram-positive bacterial cells of Bacillus thuringiensis (10 s cells / ml).
Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:Electrophoresis in 1% agarose gel. Tracks:
1 - ДНК Bacillus thuringiensis;1 - DNA of Bacillus thuringiensis;
2 - ДНК, выделенная из клеток Bacillus thuringiensis, ручным методом;2 - DNA isolated from Bacillus thuringiensis cells by manual method;
3 - ДНК, выделенная из клеток Bacillus thuringiensis, с использованием устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот;3 - DNA isolated from Bacillus thuringiensis cells using an automated nucleic acid isolation device;
4 - маркер λ/Hind III.4 - marker λ / Hind III.
Б. Грам-отрицательные бактериальные клетки Escherichia coli. Выделение НК из ночной культуры клеток. Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:B. Gram-negative bacterial cells of Escherichia coli. Isolation of NK from overnight cell culture. Electrophoresis in 1% agarose gel. Tracks:
1 - маркер λ/Hind III;1 - marker λ / Hind III;
2 - НК, выделенные из клеток E.coli, ручным методом;2 - NK isolated from E. coli cells, by manual method;
3, 4 - НК, выделенные из клеток E.coli, с использованием устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот.3, 4 - NK isolated from E. coli cells using a device for the automated selection of nucleic acids.
Фиг.7 представляет результаты проведения ОТ-ПЦР с РНК бактериофага MS2 с использованием РНК, выделенной различными методами. ПЦР проводили с праймерами, комплементарными участку последовательности Coat протеина.Fig.7 represents the results of RT-PCR with RNA of the bacteriophage MS2 using RNA isolated by various methods. PCR was performed with primers complementary to the portion of the Coat protein sequence.
1 - РНК бактериофага MS2, выделенная ручным методом;1 - RNA of bacteriophage MS2, isolated by manual method;
2, 3 - РНК бактериофага MS2, выделенная с использованием устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот;2, 3 — RNA of the bacteriophage MS2 isolated using a device for the automated isolation of nucleic acids;
4 - положительный контроль реакции;4 - positive reaction control;
5 - отрицательный контроль реакции;5 - negative reaction control;
6 - маркер λ/Hind III.6 - marker λ / Hind III.
Устройство для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов состоит из картриджа, содержащего резервуары с реагентами для лизиса клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистки и элюции нуклеиновых кислот, каналы, микроколонки и клапаны, и управляющей установки-контроллера, осуществляющей подачу давления, нагрев, перемешивание реагентов в индивидуальных резервуарах картриджа, а также перемещение реакционных смесей и растворов (Фиг.1).A device for the automated extraction of nucleic acids from biological samples consists of a cartridge containing tanks with reagents for the lysis of cells, microorganisms and viral particles, purification and elution of nucleic acids, channels, microcolumns and valves, and a control unit-controller that delivers pressure, heating, mixing reagents in individual reservoirs of the cartridge, as well as moving the reaction mixtures and solutions (Figure 1).
Картридж содержит приемную камеру для ввода биологического образца, резервуары с сухими реакционными смесями буферов для лизиса и буфера для промывки, микроколонку с твердофазным сорбентом для связывания нуклеиновых кислот, резервуары для этанола, смеси вода-этанол и воды для растворения сухих компонентов промывочного буфера, промывки микроколонки и элюции нуклеиновых кислот, связавшихся с твердофазным сорбентом в микроколонке, выходной порт, совместимый со стандартной микропробиркой, резервуар для сбора отходов реакций (Фиг.2). В процессе изготовления в резервуар 2 объемом 1,5 мл помещают сухую смесь реагентов для лизирующего буфера, содержащую лизоцим, в резервуар 3 объемом 1,5 мл - сухую смесь реагентов для лизирующего буфера, содержащую хаотропный агент, протеиназу К и детергент, в резервуар 5 объемом 1,0 мл - сухую смесь реагентов для промывочного буфера, содержащую хаотропный агент; микроколонку 8 заполняют твердофазным сорбентом для связывания нуклеиновых кислот, резервуар 4 объемом 0,5 мл и резервуар 7 объемом 1,0 мл - этанолом, резервуар 6 объемом 0,5 мл - смесью этанол-вода, резервуар 9 объемом 0,2 мл - водой. Объем резервуара для сбора отходов реакций составляет 5,0 мл.The cartridge contains a receiving chamber for introducing a biological sample, reservoirs with dry reaction mixtures of lysis buffers and washing buffer, a microcolumn with a solid-phase sorbent for binding nucleic acids, ethanol reservoirs, a mixture of water-ethanol and water for dissolving the dry components of the washing buffer, washing the microcolumn and elution of nucleic acids bound to a solid-phase sorbent in a microcolumn, an output port compatible with a standard microtube, a reservoir for collecting reaction waste (Figure 2). During the manufacturing process, a dry mixture of lyse buffer reagents containing lysozyme is placed in a 1.5 ml tank 2; a dry mixture of lyse buffer reagents containing a chaotropic agent, proteinase K and detergent is placed in a tank 5 in a 1.5 ml tank volume of 1.0 ml - a dry mixture of reagents for washing buffer containing a chaotropic agent; microcolumn 8 is filled with a solid-phase adsorbent for nucleic acid binding, reservoir 0.5 ml in volume 4 and 1.0 ml reservoir 7 in ethanol, reservoir 0.5 ml in volume 6 with ethanol-water mixture, reservoir 9 in volume of 0.2 ml with water . The volume of the reaction waste collection tank is 5.0 ml.
Картридж содержит только резервуары с реагентами и клапаны для коммутации газожидкостных потоков, в то время как все необходимые электромагнитные компоненты, осуществляющие подачу давления, перемещение реакционных смесей и реагентов в резервуарах картриджа, нагрев и перемешивание в индивидуальных резервуарах картриджа, размещены в управляющей установке-контроллере. Управляющая установка-контроллер обеспечивает заданные скорости перемещения реакционных смесей и реагентов в резервуарах картриджа, температурно-временные режимы инкубации и перемешивания реакционных смесей в отдельных резервуарах картриджа.The cartridge contains only tanks with reagents and valves for switching gas-liquid flows, while all the necessary electromagnetic components that supply pressure, move the reaction mixtures and reagents in the tanks of the cartridge, heat and mix in the individual tanks of the cartridge, are located in the control unit-controller. The control unit-controller provides the specified speed of movement of the reaction mixtures and reagents in the reservoirs of the cartridge, temperature-time modes of incubation and mixing of the reaction mixtures in the individual reservoirs of the cartridge.
Готовый к работе картридж помещают в управляющую установку-контроллер. Ввод картриджа происходит вдоль верхних и нижних направляющих салазок (см. Фиг.4), которые обеспечивают его точное позиционирование.Ready-to-work cartridge is placed in the control unit-controller. The cartridge is introduced along the upper and lower guide rails (see Figure 4), which ensure its accurate positioning.
Биологический образец помещают в приемную камеру картриджа, и далее все стадии лизиса клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистки и элюции нуклеиновых кислот осуществляются последовательно в резервуарах картриджа, изолированных от внешней среды. Процедура выделения и очистки НК с использованием данного устройства управляется компьютером.The biological sample is placed in the receiving chamber of the cartridge, and then all the stages of lysis of cells, microorganisms and viral particles, purification and elution of nucleic acids are carried out sequentially in the reservoirs of the cartridge isolated from the external environment. The procedure for the allocation and purification of NK using this device is controlled by a computer.
После введения биологического образца в приемную камеру картриджа осуществляются последовательные стадии его обработки. Процедура выделения и очистки НК состоит из следующих стадий (Фиг.2):After the introduction of the biological sample into the receiving chamber of the cartridge, successive stages of its processing are carried out. The procedure for the allocation and purification of NK consists of the following stages (Figure 2):
а) лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием лизирующего буфера, содержащего лизоцим.a) lysis of cells, microorganisms and viral particles using a lysis buffer containing lysozyme.
Биологический образец (100-500 мл) помещают в приемную камеру 1 с помощью пипетки или любого дозирующего устройства. Открывается клапан а, и образец поступает в резервуар 2. Клапан b и остальные клапаны закрыты. В резервуаре 2 происходит растворение сухой реакционной смеси для лизирующего буфера, содержащего лизоцим, причем растворителем является жидкий биологический образец. Растворение сухой реакционной смеси буфера для лизиса, содержащего лизоцим, и разрушение компонентов клеточной стенки микроорганизмов и вирусного капсида после поступления биологического образца из приемной камеры в резервуар 2 происходят одновременно при интенсивном перемешивании и нагревании до температуры 37°С в течение 10 мин.A biological sample (100-500 ml) is placed in the receiving chamber 1 using a pipette or any dosing device. Valve a opens and the sample enters reservoir 2. Valve b and the rest of the valves are closed. In the reservoir 2, the dry reaction mixture dissolves for the lyse buffer containing lysozyme, the solvent being a liquid biological sample. The dissolution of the dry reaction mixture of the lysis buffer containing lysozyme and the destruction of the components of the cell wall of microorganisms and the viral capsid after the biological sample arrives from the receiving chamber in the reservoir 2 occur simultaneously with vigorous stirring and heating to a temperature of 37 ° C for 10 min.
Перемешивание осуществляется блоком электромагнитных мешалок, а нагревание - блоком галогенных ламп нагревателя, входящих в состав управляющей установки-контроллера.Mixing is carried out by a block of electromagnetic mixers, and heating is carried out by a block of halogen lamps of the heater, which are part of the control unit-controller.
В качестве лизирующего буфера, содержащего лизоцим, используют, например, 10 мМ трис-НС1 буфер, содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 50 мг/мл лизоцима, рН 8,0.As a lyse buffer containing lysozyme, for example, 10 mM Tris-HCl buffer containing 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 50 mg / ml lysozyme, pH 8.0, is used.
б) лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент.b) lysis of cells, microorganisms and viral particles using a lysis buffer containing a chaotropic agent, proteinase K, detergent.
Через открытый клапан b (остальные клапаны закрыты) реакционная смесь поступает в резервуар 3. В резервуаре 3 происходит растворение сухой реакционной смеси для лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент, причем растворителем является жидкий биологический образец, поступивший из резервуара 2 и обработанный буфером для лизиса, содержащего лизоцим. Растворение сухой реакционной смеси буфера для лизиса, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент, и окончательное разрушение клеток, микроорганизмов и вирусов с высвобождением нуклеиновых кислот происходят одновременно при интенсивном перемешивании и нагревании до температуры 55°С в течение 10 мин.Through the open valve b (the remaining valves are closed), the reaction mixture enters the reservoir 3. In the reservoir 3, the dry reaction mixture dissolves for the lysis buffer containing a chaotropic agent, proteinase K, detergent, and the solvent is a liquid biological sample received from reservoir 2 and processed lysozyme-containing lysis buffer. Dissolution of the dry reaction mixture of the lysis buffer containing a chaotropic agent, proteinase K, detergent, and the final destruction of cells, microorganisms, and viruses with the release of nucleic acids occur simultaneously with vigorous stirring and heating to 55 ° C for 10 min.
Во время осуществления процедуры лизиса в резервуаре 3 растворитель для промывочного буфера (смесь этанол-вода) из резервуара 6 поступает в резервуар 5, содержащий сухую реакционную смесь промывочного буфера, в состав которой входит хаотропный агент (клапан е открыт, клапан f закрыт). Растворение сухой реакционной смеси буфера для промывки происходит в резервуаре 5 при перемешивании и нагревании до температуры 55°С.During the lysis procedure in tank 3, the solvent for the wash buffer (ethanol-water mixture) from the tank 6 enters the tank 5 containing the dry reaction mixture of the wash buffer, which contains a chaotropic agent (valve e open, valve f closed). The dissolution of the dry reaction mixture of the washing buffer occurs in the tank 5 with stirring and heating to a temperature of 55 ° C.
Перемешивание осуществляется блоком электромагнитных мешалок, а нагревание - блоком галогенных ламп нагревателя, входящих в состав управляющей установки-контроллера.Mixing is carried out by a block of electromagnetic mixers, and heating is carried out by a block of halogen lamps of the heater, which are part of the control unit-controller.
В качестве хаотропного агента, входящего в состав одного из буферов для лизиса и буфера для промывки, используют гуанидинтиоцианат или гуанидингидрохлорид, в качестве детергента - Тритон Х-100 или N-лаурилсаркозил.Guanidine thiocyanate or guanidine hydrochloride is used as a chaotropic agent, which is part of one of the lysis buffers and washing buffer, and Triton X-100 or N-lauryl sarcosyl as a detergent.
В качестве лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент, используют, например, 10 мМ трис-НС1 буфер, содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 4,5 М гуанидингидрохлорида, 1 мг/мл протеиназы К, 0,5% Тритон Х-100, рН 8,0.As a lysis buffer containing a chaotropic agent, proteinase K, a detergent, for example, 10 mM Tris-HCl buffer containing 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 4.5 M guanidine hydrochloride, 1 mg / ml proteinase K, 0.5% Triton X -100, pH 8.0.
в) добавление этанола к полученному лизату биологического образца.c) adding ethanol to the obtained lysate of the biological sample.
С целью создания оптимальных условий связывания нуклеиновых кислот с твердофазным сорбентом к лизату биологического образца, полученному после обработки вторым лизирующим буфером, в резервуар 3 добавляют этанол из резервуара 4 (клапан с открыт, остальные клапаны закрыты).In order to create optimal conditions for the binding of nucleic acids to a solid-phase sorbent, ethanol from tank 4 is added to reservoir 3 to the lysate of the biological sample obtained after treatment with the second lysis buffer (valve is open, other valves are closed).
г) связывание нуклеиновых кислот на микроколонке, содержащей твердофазный сорбент.d) nucleic acid binding on a microcolumn containing a solid-phase sorbent.
Реакционная смесь из резервуара 3 после лизиса и добавления этанола, содержащая нуклеиновые кислоты и белки, поступает на микроколонку 8 с твердофазным сорбентом. Нуклеиновые кислоты сорбируются на сорбенте, а вещества, не связавшиеся с носителем проходят в резервуар для сбора отходов 11 (клапаны d, h, k и m открыты, клапаны l, g, f, i и j закрыты).The reaction mixture from tank 3 after lysis and addition of ethanol, containing nucleic acids and proteins, enters the microcolumn 8 with a solid phase sorbent. Nucleic acids are adsorbed on the sorbent, and substances that do not contact the carrier pass into the waste collection tank 11 (valves d, h, k and m are open, valves l, g, f, i and j are closed).
Твердофазный сорбент выбирают из группы сорбентов, включающей силикагели, стекловолоконные фильтры, химически модифицированное стекло.The solid-phase sorbent is selected from the group of sorbents, including silica gels, glass fiber filters, chemically modified glass.
д) отмывка нуклеиновых кислот от белков и кристаллов соли на микроколонке, содержащей твердофазный сорбент, с использованием промывочного буфера и этанола;d) washing the nucleic acids from proteins and salt crystals on a microcolumn containing a solid-phase sorbent using a wash buffer and ethanol;
Для отмывки твердофазного сорбента от белков на микроколонку подается промывочный буфер из резервуара 5; промывочный раствор проходит в резервуар для сбора отходов 11 (клапаны f, h, k и m открыты, клапаны l, g, d, i и j закрыты).To wash the solid-phase sorbent from proteins, a washing buffer from reservoir 5 is supplied to the microcolumn; the flushing solution passes to the waste collection tank 11 (valves f, h, k and m are open, valves l, g, d, i and j are closed).
Для отмывки твердофазного сорбента от кристаллов соли на микроколонку подается этанол из резервуара 7; промывочный раствор проходит в резервуар для сбора отходов 11 (клапаны g, h, k и m открыты, клапаны l, f, d, i и j закрыты).To wash the solid-phase sorbent from salt crystals, ethanol is supplied to the microcolumn from reservoir 7; the flushing solution passes to the waste collection tank 11 (valves g, h, k and m are open, valves l, f, d, i and j are closed).
е) элюция нуклеиновых кислот с микроколонки.e) elution of nucleic acids from the microcolumn.
После промывки носителя нуклеиновые кислоты элюируют пропусканием через микроколонку раствора для элюции НК (вода) из резервуара 9 (клапаны i, h, j открыты, клапаны l, g, f, d, k и m закрыты). НК поступают в резервуар для сбора очищенной НК 10.After washing the carrier, nucleic acids are eluted by passing through a microcolumn a solution for elution of NK (water) from reservoir 9 (valves i, h, j are open, valves l, g, f, d, k and m are closed). NK enter the reservoir for collecting purified NK 10.
Выходной порт картриджа совместим со стандартной микропробиркой объемом 0,2 мл, которую можно использовать для проведения ПЦР.The output port of the cartridge is compatible with a standard 0.2 ml microtube that can be used for PCR.
Растворение сухих реакционных смесей обоих буферов для лизиса и буфера для промывки происходит при нагревании и перемешивании с помощью устройств, входящих в состав управляющей установки-контроллера. Все клапаны, регулирующие перемещение реакционных смесей и реагентов в каналах и резервуарах картриджа (клапаны а-m на Фиг.2) управляются установкой-контроллером.The dissolution of dry reaction mixtures of both lysis buffers and washing buffer occurs during heating and stirring using devices that are part of the control unit controller. All valves regulating the movement of reaction mixtures and reagents in the channels and reservoirs of the cartridge (valves a-m in FIG. 2) are controlled by a controller.
Картридж состоит из нескольких конструктивных элементов: основная рабочая платформа, содержащая резервуары с реагентами, каналы, микроколонку и резервуар для сбора отходов реакций, верхняя и нижняя панели (крышки), эластичные прокладки (Фиг.3). Материал основной рабочей платформы и верхней и нижней панелей картриджа выбирают из группы полимеров, не сорбирующих нуклеиновые кислоты, включающей оргстекло, полипропилен, поликарбонат. Материал прокладок картриджа выбирают из группы эластичных материалов, не сорбирующих НК, включающей силикон, полиэтилен.The cartridge consists of several structural elements: the main working platform, containing tanks with reagents, channels, a microcolumn and a tank for collecting reaction waste, upper and lower panels (covers), elastic gaskets (Figure 3). The material of the main working platform and the upper and lower panels of the cartridge are selected from the group of polymers that do not adsorb nucleic acids, including plexiglass, polypropylene, polycarbonate. The material of the cartridge gaskets is selected from the group of elastic materials that do not sorb NK, including silicone, polyethylene.
Например, в одном из воплощений основная рабочая платформа и верхняя и нижняя панели картриджа сделаны из оргстекла (Акрима 72), толщина 8 мм и 2 мм соответственно, эластичные прокладки - из силикона Силастик Т4, толщина 2 мм, и полиэтиленовой пленки универсальной, сорт Н, толщина 50 мкм.For example, in one embodiment, the main working platform and the upper and lower panels of the cartridge are made of Plexiglas (Akrim 72), thickness 8 mm and 2 mm, respectively, elastic gaskets made of silicone Silastic T4, thickness 2 mm, and a universal plastic film, grade H , thickness 50 microns.
Элементы картриджа скреплены между собой 4 фиксирующими винтами, расположенными по краям панелей. На верхней панели расположены 16 отверстий для поршней клапанов, отверстие для приемной камеры образца, 4 отверстия для фиксирующих винтов (см. Фиг 3). Линейные размеры картриджа (длина×ширина×высота) составляют 94×64×40 мм.The cartridge elements are fastened together by 4 fixing screws located at the edges of the panels. On the upper panel there are 16 holes for valve pistons, a hole for the sample receiving chamber, 4 holes for fixing screws (see Fig. 3). The linear dimensions of the cartridge (length × width × height) are 94 × 64 × 40 mm.
Управляющая установка-контроллер содержит блок соленоидов для управления клапанами картриджа, блок поршней, блок нагревателей, блок электромагнитных мешалок, компрессор и блок электронного управления (Фиг.4). Коммутация воздушных и жидкостных потоков в картридже осуществляется 16 клапанами с электрическим управлением. После помещения картриджа в блок управления и срабатывания запорного механизма картридж занимает положение, при котором штоки всех 16 соленоидов оказываются точно над соответствующими запорными головками клапанов картриджа.The control unit-controller contains a block of solenoids for controlling the valves of the cartridge, a block of pistons, a block of heaters, a block of electromagnetic mixers, a compressor and an electronic control unit (Figure 4). The switching of air and liquid flows in the cartridge is carried out by 16 electrically controlled valves. After placing the cartridge in the control unit and actuating the locking mechanism, the cartridge occupies a position in which the rods of all 16 solenoids are exactly above the corresponding locking heads of the cartridge valves.
Перемещение реакционных смесей и реагентов в резервуарах картриджа осуществляется подачей давления в соответствующие резервуары с помощью компрессора по системе каналов, причем перераспределение давления по резервуарам и потоки жидкостей по каналам организованы системой клапанов, выполненных с использованием эластичной прокладки картриджа. Компрессор представляет собой мембранный либо плунжерный насос, способный создавать избыточное давление воздуха до 2 атм.The movement of reaction mixtures and reagents in the reservoirs of the cartridge is carried out by applying pressure to the respective reservoirs using a compressor through a channel system, and the pressure redistribution through the tanks and the fluid flows through the channels are organized by a valve system made using an elastic cartridge gasket. The compressor is a diaphragm or plunger pump capable of creating excess air pressure up to 2 atm.
Диаграмма устройства клапана приведена на Фиг.5. Клапан состоит из соленоида, поршня и запорной головки. Поршень обеспечивает необходимое давление на запорную головку клапана, удерживая клапан в закрытом положении. При подаче напряжения на обмотку соленоида поршень поднимается, освобождая запорную головку клапана, и клапан открывается. Клапан вмонтирован в основную рабочую платформу картриджа (Б), в которой проделаны два отверстия 0,8 мм в диаметре для входа и выхода (IN и OUT). Между основной рабочей платформой (Б) и верхней панелью (А) находятся эластичные прокладки П1 и П2, которые обеспечивают открытие и закрытие клапана и, соответственно, возможность перетекания жидкости из резервуаров картриджа.The valve device diagram is shown in FIG. 5. The valve consists of a solenoid, a piston and a shut-off head. The piston provides the necessary pressure on the valve shut-off head by holding the valve in the closed position. When voltage is applied to the solenoid winding, the piston rises, releasing the valve shut-off head, and the valve opens. The valve is mounted in the main working platform of the cartridge (B), in which two holes 0.8 mm in diameter were made for inlet and outlet (IN and OUT). Between the main working platform (B) and the upper panel (A) there are elastic gaskets P1 and P2, which provide the opening and closing of the valve and, accordingly, the possibility of fluid flow from the cartridge reservoirs.
Для формирования рабочих поверхностей клапанов используют, например, полиэтилен и тефлон.For the formation of the working surfaces of the valves, for example, polyethylene and teflon are used.
Представленная полезная модель позволяет проводить выделение и очистку НК из биологического образца (кровь, плазма, слюна, культуральные жидкости), содержащего 104 или более клеток, бактерий и/или вирусных частиц. Результаты выделения НК из бактериальных клеток и вирусных частиц представлены на Фиг.6 и 7. Полезная модель позволяет проводить выделение НК клеток микроорганизмов и/или вирусов в автоматическом режиме с низкими потерями, низкой себестоимостью, малым временем, необходимым для получения результата. Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Полученный препарат НК может быть использован без дополнительной очистки непосредственно в амплификации (Фиг.7) или гибридизации НК с целью непосредственной идентификации инфекционного агента в исследуемом образце или для проведения дальнейшего молекулярно-генетического анализа.The presented utility model allows the isolation and purification of NK from a biological sample (blood, plasma, saliva, culture fluids) containing 10 4 or more cells, bacteria and / or viral particles. The results of the selection of NK from bacterial cells and viral particles are presented in Figs. 6 and 7. The utility model allows the selection of NK cells of microorganisms and / or viruses in an automatic mode with low losses, low cost, and short time required to obtain a result. The method does not require expensive equipment and highly qualified personnel. The resulting NK preparation can be used without additional purification directly in amplification (Fig. 7) or NK hybridization in order to directly identify the infectious agent in the test sample or to conduct further molecular genetic analysis.
Claims (18)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009105294/22U RU84381U1 (en) | 2009-02-17 | 2009-02-17 | DEVICE FOR AUTOMATED ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009105294/22U RU84381U1 (en) | 2009-02-17 | 2009-02-17 | DEVICE FOR AUTOMATED ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU84381U1 true RU84381U1 (en) | 2009-07-10 |
Family
ID=41046204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009105294/22U RU84381U1 (en) | 2009-02-17 | 2009-02-17 | DEVICE FOR AUTOMATED ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU84381U1 (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2484139C1 (en) * | 2012-05-17 | 2013-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Производственное Объединение ДНК-Технология" | Device to extract nucleic acids |
| RU2545404C2 (en) * | 2010-04-30 | 2015-03-27 | Байонир Корпорейшн | Device for automatic purification of biological specimens provided with magnetic field applicator, method of extraction of target matter from biological specimen and protein extraction and purification |
| RU2595374C2 (en) * | 2014-04-09 | 2016-08-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method for automated extraction with simultaneous purification of nucleic acids from several biological samples |
| RU2630642C1 (en) * | 2016-11-15 | 2017-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно Производственное Объединение ДНК-Технология" | Device for allocation of nucleic acids |
| RU2645088C2 (en) * | 2012-06-25 | 2018-02-15 | Инпеко Холдинг Лтд. | Device with multiple tripods for placement of containers with biological product removed from storage to store these containers, associated with laboratory automation system |
| RU2681914C2 (en) * | 2013-10-15 | 2019-03-13 | Байо Молекьюлар Системс Пти Лтд | Improved thermocycler |
| RU2768005C1 (en) * | 2021-09-02 | 2022-03-22 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Тробио" | Disposable cartridge for isolation of nucleic acids and their subsequent amplification (oprions) |
| RU2784821C2 (en) * | 2020-10-26 | 2022-11-29 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации | Automated device for isolation, purification and analysis of nucleic acids by rt-pcr method |
-
2009
- 2009-02-17 RU RU2009105294/22U patent/RU84381U1/en active IP Right Revival
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2545404C2 (en) * | 2010-04-30 | 2015-03-27 | Байонир Корпорейшн | Device for automatic purification of biological specimens provided with magnetic field applicator, method of extraction of target matter from biological specimen and protein extraction and purification |
| RU2484139C1 (en) * | 2012-05-17 | 2013-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Производственное Объединение ДНК-Технология" | Device to extract nucleic acids |
| RU2645088C2 (en) * | 2012-06-25 | 2018-02-15 | Инпеко Холдинг Лтд. | Device with multiple tripods for placement of containers with biological product removed from storage to store these containers, associated with laboratory automation system |
| RU2681914C2 (en) * | 2013-10-15 | 2019-03-13 | Байо Молекьюлар Системс Пти Лтд | Improved thermocycler |
| RU2595374C2 (en) * | 2014-04-09 | 2016-08-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method for automated extraction with simultaneous purification of nucleic acids from several biological samples |
| RU2630642C1 (en) * | 2016-11-15 | 2017-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно Производственное Объединение ДНК-Технология" | Device for allocation of nucleic acids |
| RU2784821C2 (en) * | 2020-10-26 | 2022-11-29 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации | Automated device for isolation, purification and analysis of nucleic acids by rt-pcr method |
| RU2768005C1 (en) * | 2021-09-02 | 2022-03-22 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Тробио" | Disposable cartridge for isolation of nucleic acids and their subsequent amplification (oprions) |
| RU2790849C1 (en) * | 2022-08-27 | 2023-02-28 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Тробио" | Disposable cartridge for nucleic acids isolation and their subsequent amplification |
| RU221186U1 (en) * | 2023-04-20 | 2023-10-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Биодайв" | CARTRIDGE FOR MOLECULE DETECTION |
| RU2828813C1 (en) * | 2023-06-26 | 2024-10-21 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Method of purifying and recovering high-molecular nucleic acids, gel and device for implementation thereof |
| RU2828813C9 (en) * | 2023-06-26 | 2024-12-10 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Method of purifying and recovering high-molecular nucleic acids, gel and device for implementation thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2380418C1 (en) | Replaceable microfluid module for automated recovery and purification of nucleic acids from biological samples and method for recovery and purification nucleic acids with using thereof | |
| US10464065B2 (en) | Nucleic acid purification | |
| US9028777B2 (en) | Automated cellular material preparation | |
| RU84381U1 (en) | DEVICE FOR AUTOMATED ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS | |
| US9506847B2 (en) | Method and system for selective isolation of target biological molecules in a general purpose system | |
| US20080153078A1 (en) | System for isolating biomolecules from a sample | |
| US20100240882A1 (en) | Apparatus, System and Method for Purifying Nucleic Acids | |
| WO2021254519A1 (en) | Sample processing and detection apparatus and application thereof | |
| JP2006508343A (en) | Apparatus for processing fluid samples | |
| RU110746U1 (en) | DEVICE FOR SIMULTANEOUS AUTOMATED ISOLATION AND PURIFICATION OF NUCLEIC ACIDS FROM SEVERAL BIOLOGICAL SAMPLES | |
| US20240353439A1 (en) | Fluidic bridge device and sample processing methods | |
| AU2017235971B2 (en) | Nucleic Acid Purification | |
| WO2007122819A1 (en) | Device for reactions with liquid media | |
| EP3887048A1 (en) | Systems and methods for on-chip analysis of nucleic acids and for multiplexed analysis of cells | |
| RU2595374C2 (en) | Method for automated extraction with simultaneous purification of nucleic acids from several biological samples | |
| WO2004048564A1 (en) | Device for pretreating specimen | |
| RU134929U1 (en) | DEVICE FOR EXTRACTION AND CLEANING OF NUCLEIC ACIDS (MICRONK) | |
| Gärtner et al. | A microfluidic toolbox approach to CBRNE sensing | |
| AU2013205155A1 (en) | Nucleic acid purification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Utility model has become invalid (non-payment of fees) |
Effective date: 20120218 |
|
| NF1K | Reinstatement of utility model |
Effective date: 20140110 |