RU2837898C1 - Method for indication of cereulide and diarrheal enterotoxins of bacillus cereus complex using real-time pcr - Google Patents
Method for indication of cereulide and diarrheal enterotoxins of bacillus cereus complex using real-time pcr Download PDFInfo
- Publication number
- RU2837898C1 RU2837898C1 RU2024121111A RU2024121111A RU2837898C1 RU 2837898 C1 RU2837898 C1 RU 2837898C1 RU 2024121111 A RU2024121111 A RU 2024121111A RU 2024121111 A RU2024121111 A RU 2024121111A RU 2837898 C1 RU2837898 C1 RU 2837898C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- pcr
- seq
- Prior art date
Links
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 title claims abstract description 53
- JWWAHGUHYLWQCQ-UHFFFAOYSA-N cereulide Chemical compound CC(C)CC1OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C)NC1=O JWWAHGUHYLWQCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108010061320 cereulide Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title abstract description 6
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims abstract description 15
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims abstract description 15
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 19
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 10
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 2
- 101150042441 K gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract description 24
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 46
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 32
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 23
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 241000006378 Bacillus cereus group Species 0.000 description 6
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 5
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 5
- 101150102573 PCR1 gene Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002895 emetic Substances 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241000301512 Bacillus cereus ATCC 14579 Species 0.000 description 1
- 101100394356 Bacillus cereus hblA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000906059 Bacillus pseudomycoides Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 208000037041 Community-Acquired Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- -1 Mg2+ ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010019477 S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100000249 enterotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002242 enterotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 101150111558 hblA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012092 latex agglutination test Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 108010000785 non-ribosomal peptide synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000002126 nonhaemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010807 real-time PCR kit Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000721 toxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к индикации цереулида и диарейных энтеротоксинов Bacillus cereus complex с помощью ПЦР-РВ. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает высокой специфичностью - выявляются уникальные фрагменты ДНК B. cereus, кодирующие выработку токсинов. Экстремальная чувствительность реакции обеспечивает выявление клеток возбудителя даже при условии малой обсеменённости субстрата клетками B. cereus или при условии наличия сопутствующей микрофлоры, это позволяет использовать ПЦР в тех случаях, когда другие методы экспресс-диагностики не дают положительного результата. Проведение ПЦР в формате «реального времени» (ПЦР-РВ) позволяет ускорить получение результата, что имеет большое значение в проведении массового микробиологического мониторинга [1].The invention relates to the field of biotechnology, namely to the indication of cereulide and diarrheal enterotoxins of Bacillus cereus complex using RT-PCR. The polymerase chain reaction (PCR) method has high specificity - unique fragments of B. cereus DNA encoding the production of toxins are detected. Extreme sensitivity of the reaction ensures the detection of pathogen cells even under the condition of low contamination of the substrate with B. cereus cells or in the presence of concomitant microflora, this allows the use of PCR in cases where other methods of express diagnostics do not give a positive result. Conducting PCR in the "real time" format (RT-PCR) allows to speed up the receipt of the result, which is of great importance in conducting mass microbiological monitoring [1].
Группа Bacillus cereus объединяет несколько близкородственных видов грамположительных палочковидных спорообразующих факультативно аэробных бактерий, широко распространенных в природе [2, 4, 10]. The Bacillus cereus group includes several closely related species of Gram-positive rod-shaped spore-forming facultative aerobic bacteria that are widespread in nature [2, 4, 10].
Основными заболеваниями, с которыми связывают B. cereus, являются пищевые отравления. Данные по распространенности в мире пищевых токсикоинфекций, вызванных B. cereus, на данный момент крайне неполны, но по разным оценкам в разных регионах B. cereus ответственен за 1,5-15% от общего числа таких заболеваний [11]. Болезнь обычно проявляется болями в животе, водянистой диареей, а иногда также тошнотой и рвотой. Время инкубации колеблется в пределах 8-16 часов, но в редких случаях наблюдается более длительное время инкубации. Продолжительность заболевания обычно составляет 12-24 часа, но сообщалось о случаях, продолжающихся несколько дней. [7]. Данную клиническую картину легко спутать с другими заболеванием алиментарного происхождения, вызываемыми иными спорообразующим бактериями.The main diseases associated with B. cereus are food poisoning. Data on the prevalence of foodborne illnesses caused by B. cereus worldwide are currently extremely incomplete, but estimates vary across regions that B. cereus is responsible for 1.5–15% of such illnesses [11]. The disease typically presents with abdominal pain, watery diarrhea, and sometimes nausea and vomiting. The incubation period ranges from 8–16 hours, but longer incubation periods are rare. The duration of the disease is usually 12–24 hours, but cases lasting several days have been reported [7]. This clinical picture can easily be confused with other foodborne illnesses caused by other spore-forming bacteria.
Этиологическими агентами пищевых токсикоинфекций B. cereus являются рвотный или диарейные токсины. Рвотный токсин цереулид представляет собой циклический додекадепсипептид кодируемой кластером генов цереулидсинтетазы (ces) размером 24 т.п.н., который расположен на мегаплазмиде pBCE4810 или pCER270 [4, 10].The etiologic agents of B. cereus food poisoning are emetic or diarrheal toxins. The emetic toxin cereulide is a 24-kb cyclic dodecadepsipeptide encoded by the cereulide synthetase (ces) gene cluster, which is located on the pBCE4810 or pCER270 megaplasmid [4, 10].
Механизм, посредством которого цереулид вызывает рвоту у людей, точно не определён. Небольшой размер цереулида крайне усложняет его обнаружение при проведении эпидрасследований.The mechanism by which cereulide causes vomiting in humans is not precisely defined. The small size of cereulide makes it extremely difficult to detect during epidemiological investigations.
Этиологическими агентами диарейных заболеваний пищевого происхождения, вызванных B. cereus, в настоящее время считаются три цитотоксина: гемолизин BL Hbl, негемолитический энтеротоксин Nhe и цитотоксин К CytK. Hbl и Nhe - это трехкомпонентные токсины.Etiologic agents of foodborne diarrheal diseases caused byB. cereus, Currently, three cytotoxins are considered: hemolysin BL Hbl, non-hemolytic enterotoxin Nhe and cytotoxin K CytK. Hbl and Nhe are three-component toxins.
Hbl состоит из трех белков L2, L1 и B, кодируемых генами hblC, hblD и hblA соответственно, которые котранскрибируются, входя в один оперона [6,8].Hbl consists of three proteins L2, L1 and B, encoded by the genes hblC , hblD and hblA , respectively, which are co-transcribed and included in one operon [6,8].
Токсин Nhe также состоит из белков NheA, NheB и NheC, кодируемых опероном nheABC [5].The Nhe toxin also consists of the proteins NheA, NheB and NheC, encoded by the nheABC operon [5].
CytK - это мономерный β-порин, один из двух основных β-поринов B. cereus [9].CytK is a monomeric β-porin, one of the two major β-porins in B. cereus [9].
Энтеротоксин FM (EntFM) - еще один фактор вирулентности B. cereus. Он не имеет существенного сходства с другими энтеротоксинами, и сам по себе EntFM не является цитотоксичным. Тем не менее, токсин участвует в обеспечении подвижности бактериальных клеток, формировании биопленок и адгезии к эпителиальным клеткам, которые важны для прогрессирования инфекционного процесса. Enterotoxin FM (EntFM) is another virulence factor of B. cereus . It does not have significant similarities with other enterotoxins, and EntFM itself is not cytotoxic. However, the toxin is involved in ensuring bacterial cell motility, biofilm formation, and adhesion to epithelial cells, which are important for the progression of the infectious process.
В настоящее время отечественных наборов для индикации и идентификации токсинов возбудителя пищевых токсико-инфекций, вызванных бактериями группы B. cereus complex методом ПЦР, нет. Currently, there are no domestic kits for the indication and identification of toxins of the causative agent of food toxic infections caused by bacteria of the B. cereus complex group using the PCR method.
Доступен набор реактивов для обнаружения ДНК Bacillus Cereus P608H. Производитель: TIANLONG (Китай). Набор предназначен для выявления ДНК условно-патогенных бактерий классов Bacilli, вызывающих нозокомиальные и внебольничные инфекции, полученных из биологического материала человека и бактериальных культур из этого биоматериала (мокрота, моча, мазки/соскобы из дыхательных путей, желудочно-кишечного и урогенитального тракта, фекалии, аспираты, экссудаты) методом ПЦР в режиме реального времени. A reagent kit for detection of Bacillus Cereus DNA P608H is available. Manufacturer: TIANLONG (China). The kit is designed to detect DNA of opportunistic bacteria of the Bacilli class that cause nosocomial and community-acquired infections, obtained from human biological material and bacterial cultures from this biological material (sputum, urine, smears/scrapings from the respiratory tract, gastrointestinal and urogenital tract, feces, aspirates, exudates) using real-time PCR.
Недостатком данного набора является то, что исследователь может идентифицировать микроорганизм, но не может выявить гены, кодирующие токсины и оценить патогенный потенциал выделенной культуры.The disadvantage of this kit is that the researcher can identify the microorganism, but cannot identify the genes encoding the toxins and assess the pathogenic potential of the isolated culture.
Другой доступный набор SureFast® Bacillus cereus group PLUS представляет собой набор для ПЦР в реальном времени для прямого качественного обнаружения специфических последовательностей ДНК группы Bacillus cereus (Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus cytoxis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus thuringiensis и Bacillus weihenstephanensis). Производитель: R-Biopharm AG (Германия).Another available kit is SureFast® Bacillus cereus group PLUS, a real-time PCR kit for the direct qualitative detection of specific DNA sequences of the Bacillus cereus group ( Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus cytoxis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus thuringiensis and Bacillus weihenstephanensis ). Manufacturer: R-Biopharm AG (Germany).
Данный набор способен дифференцировать между собой различных представителей группы Bacillus cereus complex, но не способен определить токсический профиль каждого представителя.This kit is able to differentiate between different representatives of the Bacillus cereus complex group, but is not able to determine the toxic profile of each representative.
Иные зарубежные аналоги коммерчески не доступны для приобретения на территории РФ.Other foreign analogues are not commercially available for purchase in the Russian Federation.
Известны классические микробиологические методы отбора проб, культивирование, микросопирование и диагностирования B. cereus complex, но они не охарактеризовывают патологический потенциал штаммов, а способствуют только определению таксономии возбудителя. Classical microbiological methods of sampling, culturing, microscopy and diagnosing B. cereus complex are known, but they do not characterize the pathological potential of strains and only help to determine the taxonomy of the pathogen.
Индикация факторов патогенности возможна при использовании MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry), или матрично-активированной лазерной деcорбционно/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии, для обнаружения цереулида, CytK и NheA в мазках, взятых из культивированных чистых культур B. cereus. Также существует набор для тестирования обратной пассивной латексной аглютинации BCET-RPLA на фрагмент L2 Hbl производитель (Thermo Scientific), а также тест Duopath Cereus на энтеротоксины NheB и фрагмент L2 Hbl производитель (Merck). Описан метод идентификации токсинов NheA и Hbl при использовании ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay) - метода определения с помощью иммуносорбентов, связанных с ферментами, который в настоящий момент в России также коммерчески недоступен. Альтернативный способ идентификации генов, кодирующих токсины - это секвенирование всего генома штамма возбудителя пищевой токсикоинфекции. Также для оценки токсического потенциала штаммов чистых культур B. cereus возможно использование перевиваемых клеточных линий. Например, клеточная линия Hep2 подходит для проверки штаммов на наличие церулида, а клеточные линии Vero и Сасо-2 обычно используются для проверки штаммов на энтеротоксический потенциал [3, 4].Pathogenicity factors can be identified using MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry) to detect cereulide, CytK and NheA in smears taken from cultured pure cultures of B. cereus . There is also a BCET-RPLA reverse passive latex agglutination test kit for the L2 Hbl fragment (Thermo Scientific) and a Duopath Cereus test for enterotoxins NheB and the L2 Hbl fragment (Merck). The article describes a method for identifying NheA and Hbl toxins using ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay), a method for determining using immunosorbents associated with enzymes, which is also currently not commercially available in Russia. An alternative method for identifying genes encoding toxins is sequencing the entire genome of the food poisoning pathogen strain. It is also possible to use continuous cell lines to assess the toxic potential of pure B. cereus culture strains. For example, the Hep2 cell line is suitable for testing strains for the presence of cerulide, and the Vero and Caco-2 cell lines are commonly used to test strains for enterotoxic potential [3, 4].
Все описанные методы диагностики являются дорогостоящими и требуют специализированное оборудование и высококвалифицированных специалистов для проведения исследований. Таким образом, существует явная потребность в разработке способа экспресс-идентификации. All the described diagnostic methods are expensive and require specialized equipment and highly qualified specialists to conduct the research. Thus, there is a clear need to develop a method for express identification.
Технической задачей настоящего технического решения является разработка набора для быстрой идентификации ДНК генов, кодирующих токсины, синтезируемые бактериями группы B. cereus complex. The technical objective of this technical solution is to develop a kit for rapid identification of DNA genes encoding toxins synthesized by bacteria of the B. cereus complex group.
Техническим результатом заявленного технического решения является расширение арсенала технических средств, что позволяет без использования дополнительных методов выявлять цереулид и диарейные энтеротоксины B. cereus complex в исследуемых образцах, повысить эффективность определения токсинов и исключить ложноположительные и ложноотрицательные результаты идентификации. The technical result of the declared technical solution is the expansion of the arsenal of technical means, which allows, without the use of additional methods, to detect cereulide and diarrheal enterotoxins of B. cereus complex in the studied samples, to increase the efficiency of toxin determination and to eliminate false positive and false negative identification results.
Указанный технический результат достигается тем, что предложен способ индикации, использующий набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации ДНК B. cereus complex методом гибридизационно-флуоресцентно полимеразной цепной реакции, который включает олигодезоксирибонуклеотиды, обладающие специфической активностью прямого и обратного праймеров, и флуоресцентно-меченный зонд, имеющие следующую структуру:The specified technical result is achieved by the fact that a method of indication is proposed, using a set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for identifying DNA of the B. cereus complex by the hybridization-fluorescent polymerase chain reaction method, which includes oligodeoxyribonucleotides possessing the specific activity of forward and reverse primers, and a fluorescently labeled probe, having the following structure:
Используемые для расчета праймеров и зонда последовательности геномов были получены из международной базы данных GenBank. Для построения элайнментов, анализа и расчетов праймеров и зондов, изучения их специфичности использовали семейство компьютерных программ Vector NTI 9.0.0 (Informax, США) и онлайн-интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI).The genome sequences used to calculate the primers and probe were obtained from the international GenBank database. The Vector NTI 9.0.0 family of computer programs (Informax, USA) and the online Internet resources of the US National Center for Biotechnology Information (Blast NCBI) database were used to construct alignments, analyze and calculate the primers and probes, and study their specificity.
Оценка специфичности праймеров проводилась на рабочей коллекции из 40 штаммов B. cereus, депонированных в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск». Наличие генов, кодирующих синтез токсинов в исследуемых штаммах B. cereus, определяли по скринингу данных полногеномного секвенирования, используя программу UGEN 50.0 (Унипро, Россия). Была исследована рабочая коллекция из 40 штаммов B. Cereus. Эффективность определения наличия токсинов предлагаемым/разрабатываемым прототипом тест-системы составила 100%. Ложноположительных и ложноотрицательных результатов выявлено не было. The evaluation of primer specificity was carried out on a working collection of 40 strains.B. cereus, deposited in the State Collection of Pathogenic Microorganisms and Cell Cultures "GKPM - Obolensk". The presence of genes encoding the synthesis of toxins in the studied strainsB. cereus, were determined by screening whole genome sequencing data using the UGEN 50.0 program (Unipro, Russia). A working collection of 40 strains was examinedB. Cereus.The efficiency of determining the presence of toxins by the proposed/developed prototype test system was 100%. No false positive or false negative results were detected.
Положительные контрольные образцы были получены in vitro методом ПЦР. Использовали метод наработки фрагмента локуса, кодирующего ген токсинообразования с ДНК матрицы штамма продуцента токсина B. cereus. Positive control samples were obtained in vitro by PCR. The method used was to develop a fragment of the locus encoding the toxin-forming gene from the DNA matrix of the toxin-producing strain B. cereus.
Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния (Mg2+), концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров. С использованием полученной плазмидной конструкции были подобраны оптимальные концентрации ионов Mg2+ (2.5 мМ MgCl2), прямого и обратного праймеров (300 нМ), флуоресцентного ДНК-зонда (100 нМ). Важно отметить, что все этапы оптимизации проведения ПЦР были осуществлены с использованием коммерческих реагентов и приборов для амплификации, являясь коммерчески доступными, они предназначены для массового применения в диагностических лабораториях России. Это позволяет широко применять данное изобретение в лабораторной практике. The amplification conditions were optimized for the concentration of magnesium ions (Mg2+), the concentration of primers and probes in the reaction mixture, and the annealing temperature of the primers. Using the resulting plasmid construct, the optimal concentrations of Mg2+ ions (2.5 mM MgCl2), forward and reverse primers (300 nM), and fluorescent DNA probe (100 nM) were selected. It is important to note that all stages of PCR optimization were carried out using commercial reagents and amplification devices. Being commercially available, they are intended for mass use in diagnostic laboratories in Russia. This allows this invention to be widely used in laboratory practice.
Для определения аналитической чувствительности метода были приготовлены последовательные 10-кратные разведения наработанной ДНК. Концентрацию ДНК определяли при помощи замера на Спектрофотометр NanoDrop One, 190-850 нм, от 1 мкл, (Thermo Scientific, США)Аналитическая чувствительность разработанного метода с использованием праймеров составила 102 геномных эквивалентов (ГЭ).To determine the analytical sensitivity of the method, successive 10-fold dilutions of the prepared DNA were prepared. The DNA concentration was determined using a NanoDrop One spectrophotometer, 190-850 nm, from 1 μl, (Thermo Scientific, USA). The analytical sensitivity of the developed method using primers was 10 2 genomic equivalents (GE).
Предлагаемое техническое решение даёт возможность разделения постановки реакции для индикации рвотного токсина и цитотоксина К отдельно от других диарейных токсинов. Это позволяет сократить стоимость проведения одного анализа. The proposed technical solution makes it possible to separate the reaction for the indication of emetic toxin and cytotoxin K separately from other diarrheal toxins. This allows to reduce the cost of conducting one analysis.
Техническое решение, обусловленное использованием идентичных каналов обнаружения FAM для индикации гемолизина BL и цереулида, было вызвано невозможностью амплификаторов проводить четкую идентификацию световых спектров при использовании более 4 флюорофоров. При использовании в реакционной смеси праймеров, содержащих более 4 зондов, происходит засвечивание при считывании светового канала и в результате наложение графиков кривых. Что в свою очередь приводит к образованию ложноположительных результатов. Поэтому мы предлагаем использовать одномоментную постановку сочетания из комбинации реакционных смесей 1 и 2 (Табл. 1).The technical solution, based on the use of identical FAM detection channels for the indication of BL hemolysin and cereulide, was caused by the inability of amplifiers to perform clear identification of light spectra when using more than 4 fluorophores. When using primers containing more than 4 probes in the reaction mixture, there is overexposure when reading the light channel and, as a result, the curve graphs overlap. This in turn leads to the formation of false positive results. Therefore, we propose to use a single-stage setting of a combination of reaction mixtures 1 and 2 (Table 1).
Таблица 1. Состав реакционных смесей для ПЦР-анализа в формате двух независимых мультиплексных реакцийTable 1. Composition of reaction mixtures for PCR analysis in the format of two independent multiplex reactions
Таким образом, на основании вышеизложенного получаем комплект, включающий:Thus, based on the above, we obtain a set that includes:
При этом, ПЦР смесь 1 включает праймеры и флуоресцентно меченные зонды для идентификации: цитотоксина К, цереулида и внутреннего положительного контроля. ПЦР смесь 2 включает праймеры и флуоресцентно меченные зонды для идентификации: гемолизина BL, негемолитического энтеротоксина А, энтеротоксина FM и внутреннего положительного контроля. Внутренние положительные контроли смесей идентичны и включают любые обычно используемые для постановки ПЦР-РВ положительные контроли.In this case, PCR mixture 1 includes primers and fluorescently labeled probes for identification of: cytotoxin K, cereulide and internal positive control. PCR mixture 2 includes primers and fluorescently labeled probes for identification of: hemolysin BL, non-hemolytic enterotoxin A, enterotoxin FM and internal positive control. Internal positive controls of the mixtures are identical and include any positive controls commonly used for RT-PCR.
В основном исполнении изобретение имеет следующий вид:In its basic form, the invention has the following appearance:
Способ детекции цереулида и диарейных энтеротоксинов (цитотоксина К, гемолизина BL, негемолитического энтеротоксина А, энтеротоксина FM) Bacillus cereus complex с помощью ПЦР-РВ, включающий: A method for detecting cereulide and diarrheal enterotoxins (cytotoxin K, hemolysin BL, non-hemolytic enterotoxin A, enterotoxin FM) of Bacillus cereus complex using RT-PCR, including:
а) экстракцию ДНК из материала, подозрительного на заражение (содержание) Bacillus cereus complex, a) DNA extraction from material suspected of being contaminated (containing) Bacillus cereus complex ,
b) проведение ПЦР-РВ с ДНК, полученной на стадии а), с помощью набора, содержащего ПЦР смесь 1 и ПЦР смесь 2, b) performing RT-PCR with the DNA obtained in step a) using a kit containing PCR mix 1 and PCR mix 2,
где ПЦР смесь 1 содержит:where PCR mixture 1 contains:
набор праймеров для детекции цитотоксина К, состоящий из последовательностей SEQ ID No.1 (F), SEQ ID No.2 (R) и SEQ ID No.3 (Z);a set of primers for detecting cytotoxin K, consisting of the sequences SEQ ID No. 1 (F), SEQ ID No. 2 (R) and SEQ ID No. 3 (Z);
набор праймеров для детекции цереулида, состоящий из последовательностей SEQ ID No.13 (F), SEQ ID No.14 (R) и SEQ ID No.15 (Z);a set of primers for detecting cereulide, consisting of the sequences SEQ ID No.13 (F), SEQ ID No.14 (R) and SEQ ID No.15 (Z);
где ПЦР смесь 2 содержит:where PCR mixture 2 contains:
набор праймеров для детекции гемолизин BL, состоящий из последовательностей SEQ ID No.7 (F), SEQ ID No.8 (R) и SEQ ID No.9 (Z);a set of primers for detecting hemolysin BL, consisting of the sequences SEQ ID No.7 (F), SEQ ID No.8 (R) and SEQ ID No.9 (Z);
набор праймеров для детекции негемолитического энтеротоксина А, состоящий из последовательностей SEQ ID No.4 (F), SEQ ID No.5 (R) и SEQ ID No.6 (Z);a set of primers for detecting non-hemolytic enterotoxin A, consisting of the sequences SEQ ID No.4 (F), SEQ ID No.5 (R) and SEQ ID No.6 (Z);
набор праймеров для детекции энтеротоксина FM, состоящий из последовательностей SEQ ID No.10 (F), SEQ ID No.11 (R) и SEQ ID No.12 (Z);a set of primers for detecting enterotoxin FM, consisting of the sequences SEQ ID No.10 (F), SEQ ID No.11 (R) and SEQ ID No.12 (Z);
где F - прямой праймер, R - обратный праймер и Z - флуоресцентно-меченный ДНК-зонд,where F is the forward primer, R is the reverse primer and Z is the fluorescently labeled DNA probe,
где ДНК-зонды, состоящие из последовательностей SEQ ID No.3, SEQ ID No.6, SEQ ID No.9, SEQ ID No.12 и SEQ ID No.15 детектируются по каналам ROX, ROX, FAM, RG6 и FAM соответственно;where DNA probes consisting of the sequences SEQ ID No.3, SEQ ID No.6, SEQ ID No.9, SEQ ID No.12 and SEQ ID No.15 are detected by the ROX, ROX, FAM, RG6 and FAM channels, respectively;
где ПЦР смесь 1 и ПЦР смесь 2 дополнительно содержит ДНК-полимеразу, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, ПЦР-буфер (Mgwhere PCR mixture 1 and PCR mixture 2 additionally contain DNA polymerase, a mixture of deoxynucleoside triphosphates, PCR buffer (Mg 2+2+ ) и деионизированную воду, обычно применяемые для постановки ПЦР;) and deionized water, commonly used for PCR;
где проведение ПЦР-РВ включает использование положительного и отрицательного контролей, обычно используемых для постановки ПЦР-РВ, и детектируемых по каналу Cy5 и всем каналам (ROX, FAM, RG6) соответственно;where the implementation of RT-PCR includes the use of positive and negative controls, usually used for setting up RT-PCR, and detected by the Cy5 channel and all channels (ROX, FAM, RG6), respectively;
с) учет результатов проведения ПЦР-РВ по наличию флуоресценции по каналам ROX, FAM, HEX и Cy5. c) taking into account the results of RT-PCR for the presence of fluorescence in the ROX, FAM, HEX and Cy5 channels.
В одном из исполнений изобретения, оптимальная температура отжига праймеров составляет 57°С.In one embodiment of the invention, the optimal annealing temperature of the primers is 57°C.
В одном из исполнений изобретения, в качестве внутреннего положительного контроля реакции используется плазмида E.coli pUC19, детектируемая по каналу Cy5.In one embodiment of the invention, the E. coli pUC19 plasmid, detected via the Cy5 channel, is used as an internal positive control for the reaction.
В одном из исполнений изобретения, вместо детекции по каналу RG6 осуществляется детекция по каналу HEX.In one embodiment of the invention, instead of detection via the RG6 channel, detection via the HEX channel is performed.
В одном из исполнений изобретения, способ дополнительно содержит стадию обратной транскрипции образца с получением кДНК и проведением ПЦР-РВ с кДНК.In one embodiment of the invention, the method further comprises the step of reverse transcription of the sample to obtain cDNA and performing RT-PCR with the cDNA.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.The invention is illustrated by the following graphic materials.
Фиг. 1. Общий вид итогового протокола при условии просмотра всех флюорофорных каналов и всех исследуемых образцов. Fig. 1. General view of the final protocol, provided that all fluorophore channels and all samples under study are viewed.
Фиг. 2. Идентификация цитотоксина К: 1 - положительный контроль; 2 - тестируемая ДНК; 3 - отрицательный контроль. Канал считывания флюорофора ROX.Fig. 2. Identification of cytotoxin K: 1 - positive control; 2 - test DNA; 3 - negative control. ROX fluorophore reading channel.
Фиг. 3. Идентификация цереулида: 1 - положительный контроль; 2 - тестируемая ДНК; 3 - отрицательный контроль. Канал считывания флюорофора FAM. Fig. 3. Identification of cereulide: 1 - positive control; 2 - test DNA; 3 - negative control. FAM fluorophore reading channel.
Фиг. 4. Идентификация гемолизина BL: 1 - положительный контроль; 2 - тестируемая ДНК; 3 - отрицательный контроль. Канал считывания флюорофора FAM.Fig. 4. Identification of hemolysin BL: 1 - positive control; 2 - test DNA; 3 - negative control. FAM fluorophore reading channel.
Фиг. 5. Идентификация негемолитического энтеротоксина А: 1 - положительный контроль; 2 - тестируемая ДНК; 3 - отрицательный контроль. Канал считывания флюорофора ROX.Fig. 5. Identification of non-hemolytic enterotoxin A: 1 - positive control; 2 - test DNA; 3 - negative control. ROX fluorophore reading channel.
Фиг. 6. Идентификация энтеротоксина FM: 1 - положительный контроль; 2 - тестируемая ДНК; 3 - отрицательный контроль. Канал считывания флюорофора RG6, данные калибровки амплификатора попадают под световой диапазон HEX. Fig. 6. Identification of enterotoxin FM: 1 - positive control; 2 - test DNA; 3 - negative control. Fluorophore reading channel RG6, calibration data of the amplifier fall under the HEX light range.
Фиг. 7. Контроль работы внутреннего положительного контроля тест-системы: 1 - положительный контроль (ПЦР смесь 1); 2 - положительный контроль (ПЦР смесь 2); 3 - отрицательный контроль. Канал считывания флюорофора Cy5.Fig. 7. Control of the internal positive control of the test system: 1 - positive control (PCR mixture 1); 2 - positive control (PCR mixture 2); 3 - negative control. Reading channel of the Cy5 fluorophore.
ПРИМЕРEXAMPLE
С целью раскрытия сущности заявленного технического решения для осуществления его специалистом в данной области техники приводится нижеследующий пример.In order to disclose the essence of the claimed technical solution for its implementation by a specialist in this field of technology, the following example is given.
Для индикации цереулида и диарейных энтеротоксинов Bacillus cereus complex с помощью ПЦР-РВ были подготовлены штаммы B. cereus из рабочей коллекции, как это принято в микробиологической практике, и осуществлена экстракция ДНК с помощью коммерческих тест-наборов для экстракции ДНК из исследуемого материала.To detect cereulide and diarrheal enterotoxins of Bacillus cereus complex using RT-PCR, B. cereus strains from the working collection were prepared, as is customary in microbiological practice, and DNA extraction was performed using commercial test kits for DNA extraction from the test material.
Затем была подготовлена реакционная смесь 1 и реакционная смесь 2 для постановки ПЦР-РВ. ПЦР смесь 1 включает праймеры и флуоресцентно меченные зонды для идентификации: цитотоксин К, цереулида и внутреннего положительного контроля. ПЦР смесь 2 включает праймеры и флуоресцентно меченные зонды для идентификации: гемолизина BL, негемолитического энтеротоксина А, энтеротоксина FM и внутреннего положительного контроля. Внутренние положительные контроли смесей идентичны и в данном случае представляют нуклеотидные последовательност 5'-3': tgtactgagagtgcaccatatgcg (PUC-F), 5'-3' aatttcacacaggaaacagctatgacc (PUC-R) и 5'-3'gatgtgcaaggcgattaagt (PUC-Z). Вместе с тем, в качестве положительных контролей могут использоваться любые контроли, обычно используемые на практике для постановки ПЦР-РВ, поэтому используемые в настоящем примере контроли не следует использовать как основание для ограничения объема исспрашиваемых прав по настоящей заявке. Then reaction mixture 1 and reaction mixture 2 were prepared for RT-PCR. PCR mixture 1 included primers and fluorescently labeled probes for identification of: cytotoxin K, cereulide and internal positive control. PCR mixture 2 included primers and fluorescently labeled probes for identification of: hemolysin BL, non-hemolytic enterotoxin A, enterotoxin FM and internal positive control. Internal positive controls of the mixtures are identical and in this case represent nucleotide sequences 5'-3': tgtactgagagtgcaccatatgcg (PUC-F), 5'-3' aatttcacacaggaaacagctatgacc (PUC-R) and 5'-3'gatgtgcaaggcgattaagt (PUC-Z). However, any controls commonly used in practice for performing RT-PCR may be used as positive controls, and therefore the controls used in this example should not be used as a basis for limiting the scope of the rights sought under this application.
В лунки микропланшета были внесены ПЦР смеси 1 и 2 по 10 мкл каждая. Затем были добавлены ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов и ПЦР-буфер (Mg2+) по 5 мкл, а также деионизированная вода по 9 мкл. В качестве указанных компонентов могут использоваться коммерческие наборы. Затем в соответствующие лунки были добавлены контроли (в том числе соответствующие токсины для проверки правильности работы праймеров, которые не входят в набор и не используются в постановке) по 1 мкл и исследуемые образцы (ДНК, полученная на этапе экстракции) по 1 мкл. Таким образом, объем реакционного раствора составляет 25 мкл, а одна постановка включает:PCR mixtures 1 and 2 were added to the wells of the microplate at 10 μl each. Then DNA polymerase, a mixture of deoxynucleoside triphosphates and PCR buffer (Mg 2+ ) were added at 5 μl each, as well as deionized water at 9 μl. Commercial kits can be used as the specified components. Then controls (including the corresponding toxins to check the correct operation of the primers that are not included in the kit and are not used in the setup) at 1 μl each and the test samples (DNA obtained at the extraction stage) at 1 μl each were added to the corresponding wells. Thus, the volume of the reaction solution is 25 μl, and one setup includes:
ПКPCR1
PC
ОPCR1
ABOUT
ТPCR1
T
ОКОPCR1
EYE
ПКPCR2
PC
ОPCR2
ABOUT
ТPCR2
T
ОКОPCR2
EYE
где ПК - положительный контроль, ОКО - отрицательный контроль, ПЦР1 - ПЦР смесь 1 (включая ДНК-полимеразу, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, ПЦР-буфер (Mg2+) и деионизированную воду), ПЦР2 - ПЦР смесь 2 (включая ДНК-полимеразу, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, ПЦР-буфер (Mg2+) и деионизированную воду), О - образец, Т - смесь токсинов.where PC is the positive control, NCC is the negative control, PCR1 is the PCR mixture 1 (including DNA polymerase, a mixture of deoxynucleoside triphosphates, PCR buffer (Mg2 + ) and deionized water), PCR2 is the PCR mixture 2 (including DNA polymerase, a mixture of deoxynucleoside triphosphates, PCR buffer (Mg2 + ) and deionized water), S is the sample, T is the toxin mixture.
Для проведения амплификации использовали амплификатор CFX96, однако возможно использование любого амплификатора, обычно используемого на практике для постановки ПЦР-РВ, поэтому используемый в настоящем примере амплификатор не следует использовать как основание для ограничения объема исспрашиваемых прав по настоящей заявке. The CFX96 amplifier was used to carry out the amplification, however, it is possible to use any amplifier commonly used in practice for setting up RT-PCR, therefore, the amplifier used in this example should not be used as a basis for limiting the scope of the rights sought under this application.
Амплификацию проводили по следующей программе термоциклирования:Amplification was carried out according to the following thermal cycling program:
* считывание свечения * glow reading
Полученные результаты (Фиг.1) интерпретировали по каналам детекции FAM, HEX, ROX и Cy5.The obtained results (Fig. 1) were interpreted using the FAM, HEX, ROX and Cy5 detection channels.
ПЦР смесь 1:PCR mixture 1:
цитотоксин К идентифицируется на основании характерного свечения, выраженного экспоненциальным графиком (Фиг.2) по каналу ROX.Cytotoxin K is identified based on the characteristic luminescence expressed by an exponential graph (Fig. 2) along the ROX channel.
целеулид идентифицируется на основании характерного свечения, выраженного экспоненциальным графиком (Фиг.3) по каналу FAM.The celeulide is identified based on the characteristic luminescence expressed by an exponential graph (Fig. 3) in the FAM channel.
ПЦР смесь 2:PCR mix 2:
гемолизин BL идентифицируется на основании характерного свечения, выраженного экспоненциальным графиком (Фиг.4) по каналу FAM.Hemolysin BL is identified based on the characteristic glow expressed by an exponential graph (Fig. 4) in the FAM channel.
негемолитический энтеротоксин А идентифицируется на основании характерного свечения, выраженного экспоненциальным графиком (Фиг.5) по каналу ROX.Non-hemolytic enterotoxin A is identified based on the characteristic luminescence expressed by an exponential graph (Fig. 5) in the ROX channel.
энтеротоксин FM идентифицируется на основании характерного свечения, выраженного экспоненциальным графиком (Фиг.6) по каналу HEX.Enterotoxin FM is identified based on the characteristic glow expressed as an exponential graph (Fig. 6) in the HEX channel.
Положительные контроли идентифицируются на основании характерного свечения, выраженного экспоненциальным графиком (Фиг.7) по каналу Cy5. Отрицательный контроль идентифицируется на основании отсутствия свечения по любому из каналов (Фиг. 2 - Фиг. 7).Positive controls are identified based on the characteristic luminescence expressed by an exponential graph (Fig. 7) in the Cy5 channel. Negative controls are identified based on the absence of luminescence in any of the channels (Fig. 2 - Fig. 7).
Список используемых источниковList of sources used
1. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов; под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова; предисл. Л.А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е.Д. Свердлова; 2-е изд., испр. и доп. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, - 2009. - C. 233.1. Rebrikov, D.V. Real-time PCR / D.V. Rebrikov, G.A. Samatov, D.Yu. Trofimov; edited by D.Sc. (Biology); foreword by L.A. Osterman and Academician of the Russian Academy of Sciences and Russian Academy of Agricultural Sciences E.D. Sverdlov; 2nd ed., corrected and enlarged. - Moscow: BINOM. Knowledge Laboratory, - 2009. - P. 233.
2. Rasko, D.A. Genomics of the Bacillus cereus group of organisms / D.A. Rasko, M.R. Altherr, C.S. Han, J. Ravel // FEMS Microbiol Rev. - 2005. - Vol. 29, N 2. - P. 303-329.2. Rasko, D.A. Genomics of the Bacillus cereus group of organisms / D.A. Rasko, M.R. Altherr, C.S. Han, J. Ravel // FEMS Microbiol Rev. - 2005. - Vol. 29, N 2. - P. 303-329.
3. Ehling-Schulz, M. Identification and partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus / M. Ehling-Schulz, N. Vukov, A. Schulz, R. Shaheen, M. Andersson, E. Märtlbauer, S. Scherer // Appl Environ Microbiol. - 2005. - Vol. 71, - Р. 105-113.3. Ehling-Schulz, M. Identification and partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus / M. Ehling-Schulz, N. Vukov, A. Schulz, R. Shaheen, M. Andersson, E. Märtlbauer, S. Scherer // Appl Environ Microbiol. - 2005. - Vol. 71, - R. 105-113.
Ehling-Schulz, M. The Bacillus cereus Group: Bacillus species with pathogenic potential / M. Ehling-Schulz, D. Lereclus, T.M. Koehler // Microbiol Spect. - 2019. - Vol. 7, N. 3. - P. e. 1128.Ehling-Schulz, M. The Bacillus cereus Group: Bacillus species with pathogenic potential / M. Ehling-Schulz, D. Lereclus, T.M. Koehler // Microbiol Spect. - 2019. - Vol. 7, N. 3. - P. e. 1128.
4. Granum, P.E. The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from Bacillus cereus / P.E. Granum, K. O'Sullivan, T. Lund // FEMS Microbiol Lett. - 1999. - Vol. 177 - Р. 225-229.4. Granum, P.E. The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from Bacillus cereus / P.E. Granum, K. O'Sullivan, T. Lund // FEMS Microbiol Lett. - 1999. - Vol. 177 - R. 225-229.
5. Heinrichs, J.H. Molecular cloning and characterization of the hblA gene encoding the B component of hemolysin BL from Bacillus cereus / J.H. Heinrichs, D.J. Beecher, J.D. MacMillan, B.A. Zilinskas // J Bacteriol. - 1993. - Vol. 175. - Р. 6760-6766.5. Heinrichs, J.H. Molecular cloning and characterization of the hblA gene encoding the B component of hemolysin BL from Bacillus cereus / J.H. Heinrichs, D.J. Beecher, J.D. MacMillan, B.A. Zilinskas // J Bacteriol. - 1993. - Vol. 175. - R. 6760-6766.
6. Kramer, J.M. Bacillus cereus and other Bacillus species / J.M. Kramer, R.J. Gilbert // Foodborne Bacterial Pathogens. - 1989. - Р. 21-70.6. Kramer, J.M. Bacillus cereus and other Bacillus species / J.M. Kramer, R.J. Gilbert // Foodborne Bacterial Pathogens. - 1989. - R. 21-70.
7. Lindbäck, T. Insertional inactivation of hblC encoding the L2 component of Bacillus cereus ATCC 14579 haemolysin BL strongly reduces enterotoxigenic activity, but not the haemolytic activity against human erythrocytes / T. Lindbäck, O.A. Okstad, A.L. Rishovd, A.B. Kolstø // Microbiology - 1999. - Vol. 145. - Р. 3139-3146.7. Lindbäck, T. Insertional inactivation of hblC encoding the L2 component of Bacillus cereus ATCC 14579 haemolysin BL strongly reduces enterotoxigenic activity, but not the haemolytic activity against human erythrocytes / T. Lindbäck, O.A. Okstad, A. L. Rishovd, A.B. Kolstø // Microbiology - 1999. - Vol. 145. - R. 3139-3146.
8. Lund, T.D. A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis / T.D. Lund, M.L. Buyser, P.E. Granum // Mol Microbiol. - 2000. - Vol. 38. - Р. 254-261.8. Lund, T.D. A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis / T.D. Lund, M. L. Buyser, P.E. Granum // Mol Microbiol. - 2000. - Vol. 38. - R. 254-261.
9. Rasko, D.A. Complete sequence analysis of novel plasmids from emetic and periodontal Bacillus cereus isolates reveals a common evolutionary history among the B. cereus-group plasmids, including Bacillus anthracis pXO1 / D.A. Rasko, M.J. Rosovitz, O.A. Okstad, D.E. Fouts, L. Jiang, R.Z. Cer, A.B. Kolsto, S.R. Gill, J. Ravel // J Bacteriol. - 2007.- Vol. 189. - Р. 52-64.9. Rasko, D.A. Complete sequence analysis of novel plasmids from emetic and periodontal Bacillus cereus isolates reveals a common evolutionary history among the B. cereus-group plasmids, including Bacillus anthracis pXO1 / D.A. Rasko, M.J. Rosovitz, O.A. Okstad, D.E. Fouts, L. Jiang, R. Z. Cer, A.B. Kolsto, S.R. Gill, J. Ravel // J Bacteriol. - 2007.- Vol. 189. - R. 52-64.
10. Stenfors Arnesen, L.P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins / L.P. Stenfors Arnesen, A. Fagerlund, P.E. // Granum. FEMS Microbiol Rev. - 2008.- Vol. 32, N 4. - Р. 579-606.10. Stenfors Arnesen, L.P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins / L.P. Stenfors Arnesen, A. Fagerlund, P.E. //Granum. FEMS Microbiol Rev. - 2008.- Vol. 32, N 4. - R. 579-606.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Real-time PCR test <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Real-time PCR test
system for the detection of cereulide and diarrheal enterotoxins system for the detection of cereulide and diarrheal enterotoxins
Bacillus cereus.xml" softwareName="WIPO Sequence" Bacillus cereus.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-09-27">softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-09-27">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-05-08</FilingDate> <FilingDate>2024-05-08</FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Federal Budget Institution of <ApplicantName languageCode="en">Federal Budget Institution of
Science «STATE RESEARCH CENTER FOR APPLIED MICROBIOLOGY AND Science "STATE RESEARCH CENTER FOR APPLIED MICROBIOLOGY AND
BIOTECHNOLOGY»</ApplicantName>BIOTECHNOLOGY»</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal Budget Institution of Science STATE <ApplicantNameLatin>Federal Budget Institution of Science STATE
RESEARCH CENTER FOR APPLIED MICROBIOLOGY AND RESEARCH CENTER FOR APPLIED MICROBIOLOGY AND
BIOTECHNOLOGY</ApplicantNameLatin>BIOTECHNOLOGY</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Khlopova Kseniya</InventorName> <InventorName languageCode="ru">Khlopova Kseniya</InventorName>
<InventorNameLatin>Khlopova Kseniya</InventorNameLatin> <InventorNameLatin>Khlopova Kseniya</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">A set of oligodeoxyribonucleotide <InventionTitle languageCode="en">A set of oligodeoxyribonucleotide
primers and fluorescently labeled probes for the detection of primers and fluorescently labeled probes for the detection of
Bacillus cereus diarrheal and vomiting toxin DNA</InventionTitle>Bacillus cereus diarrheal and vomiting toxin DNA</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>15</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>15</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctcgcacatatctatatgaatctgatgc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tctcgcacatatctatatgaatctgatgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agttccaaatgtgtagcctggacg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>agttccaaatgtgtagcctggacg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"><INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtttctctcctggtatgatcgctgtt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggtttctctcctggtatgatcgctgtt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"><INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagggttattggttacagcagtatctacg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cagggttattggttacagcagtatctacg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"><INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caattagcttcggattatattcatcaatcc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>caattagcttcggattatattcatcaatcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"><INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttacgctaaggaggggcaaacggaagt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cttacgctaaggaggggcaaacggaagt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"><INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttcctcttcattacgaaaattaggtgc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ttcctcttcattacgaaaattaggtgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"><INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgtcatagccatttcttgaagtacttc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcgtcatagccattcttgaagtacttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>31</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>31</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18"><INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctaatcaaacaagatatgaaggaatggtca</INSDSeq_sequence <INSDSeq_sequence>cctaatcaaacaagatatgaaggaatggtca</INSDSeq_sequence
>>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"> <SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20"><INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caaactggtggttcttatgttgttaacact</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>caaactggtggttcttatgttgttaacact</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"> <SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22"><INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttacaaacttaacgaagtctgcacttacgt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ttacaaacttaacgaagtctgcacttacgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12"> <SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24"><INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agctacatacaacgctgtaatcggtgg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>agctacatacaacgctgtaatcggtgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13"> <SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26"><INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgctctggtaaatggctaatcgga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgctctggtaaatggctaatcgga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14"> <SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28"><INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtcatagtatgggtgctttggcag</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggtcatagtatgggtgctttggcag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15"> <SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30"><INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus cereus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgatatcgcggtgcttctcttcca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cgatatcgcggtgcttctcttcca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (17)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2837898C1 true RU2837898C1 (en) | 2025-04-07 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130059756A1 (en) * | 2010-04-14 | 2013-03-07 | Takaaki Yamasaki | Primer set for pcr, peaction liquid for pcr, and method for detecting food poisoning bacteria |
| CN107236812A (en) * | 2017-07-07 | 2017-10-10 | 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Detection kit, detection method and application for bacillus cereus |
| RU2785435C1 (en) * | 2022-05-24 | 2022-12-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Method for real-time pcr detection of toxigenic pasteurella multocida |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130059756A1 (en) * | 2010-04-14 | 2013-03-07 | Takaaki Yamasaki | Primer set for pcr, peaction liquid for pcr, and method for detecting food poisoning bacteria |
| CN107236812A (en) * | 2017-07-07 | 2017-10-10 | 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Detection kit, detection method and application for bacillus cereus |
| RU2785435C1 (en) * | 2022-05-24 | 2022-12-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Method for real-time pcr detection of toxigenic pasteurella multocida |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RAMARAO, N. et al. Advanced Methods for Detection of Bacillus cereus and Its Pathogenic Factors, Sensors, 2020, 20, N 9: 2667, pp. 1-23. DIETRICH, R. et al. The Food Poisoning Toxins of Bacillus cereus, Toxins, 2021, 13(2), 98, pp. 1-48, см. реферат. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klouche et al. | Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections. | |
| Dunbar et al. | Quantitative, multiplexed detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the Luminex LabMAP™ system | |
| US20100255474A1 (en) | Method for Detecting Bacteria and Fungi | |
| JPH10504973A (en) | Specific and universal probes and amplification primers for rapid detection and identification of common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnostics in microbiological laboratories | |
| EP1895015B1 (en) | Method and kit for the detection of bacterial species by means of dna analysis | |
| US7989170B2 (en) | Method for the detection of bacterial species of the genera anaplasma/ehrlichia and bartonella | |
| Eigner et al. | Evaluation of a rapid direct assay for identification of bacteria and the mecA and van genes from positive-testing blood cultures | |
| Si et al. | A LAMP-based system for rapid detection of eight common pathogens causing lower respiratory tract infections | |
| RU2837898C1 (en) | Method for indication of cereulide and diarrheal enterotoxins of bacillus cereus complex using real-time pcr | |
| CA2775273A1 (en) | Composition, method and kit for detecting bacteria by means of sequencing | |
| RU2839150C1 (en) | Use of set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-labelled probes for indication of cereulide and diarrheal enterotoxins bacillus cereus complex using real-time pcr | |
| RU2839472C1 (en) | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-labelled probes for indicating cereulide and diarrheal enterotoxins bacillus cereus complex using real-time pcr | |
| EP1881068A1 (en) | Primer and probe for use in detection of mycobacterium kansasii and method for detection of mycobacterium kansasii using the same | |
| US20240191312A1 (en) | Compositions and kits for detecting the presence of a hypervirulent clostridium difficile strain | |
| CN114196767B (en) | Specific molecular targets and methods for detecting Staphylococcus aureus ST type | |
| KR102467600B1 (en) | Primer sets for detecting toxin agents, and method for detecting toxin agents using the same | |
| EP1795614B1 (en) | Diagnostic method and products useful therein | |
| Hu et al. | Simultaneous analysis of foodborne pathogenic bacteria by an oligonucleotide microarray assay | |
| de Souza | Methods for the identification, characterization, and tracking the spread of Staphylococcus aureus | |
| CN119842946B (en) | A CRISPR/Cas12b-based method for detecting Neisseria gonorrhoeae | |
| JP2006333785A (en) | Clostridium difficile toxin B gene detection method using LAMP method and primer set used in this method | |
| Thompson | Molecular testing for diseases associated with bacterial infections | |
| CN120099202A (en) | Specific molecular markers, primer sets and applications for screening Staphylococcus xylosus | |
| CN120442826A (en) | A digital PCR platform-based infective endocarditis pathogen detection kit, use, and detection method | |
| van Belkum | Molecular diagnostics and comparative genomics in clinical microbiology |