[go: up one dir, main page]

RU2836835C2 - Gene therapy of neurodegenerative disorders - Google Patents

Gene therapy of neurodegenerative disorders Download PDF

Info

Publication number
RU2836835C2
RU2836835C2 RU2021102985A RU2021102985A RU2836835C2 RU 2836835 C2 RU2836835 C2 RU 2836835C2 RU 2021102985 A RU2021102985 A RU 2021102985A RU 2021102985 A RU2021102985 A RU 2021102985A RU 2836835 C2 RU2836835 C2 RU 2836835C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
aav
mice
cells
vector
gene
Prior art date
Application number
RU2021102985A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2021102985A (en
Inventor
Марко А. ПАССИНИ
Лэмайа Шихабуддин
Сэн Х. ЧЭН
Original Assignee
Джензим Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Джензим Корпорейшн filed Critical Джензим Корпорейшн
Publication of RU2021102985A publication Critical patent/RU2021102985A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2836835C2 publication Critical patent/RU2836835C2/en

Links

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, in particular to a method of treating spinal muscular atrophy (SMA), comprising administering to a subject in need thereof, a therapeutically effective amount of recombinant virions of adeno-associated virus (rAAV), containing a self-complementary adeno-associated viral (scAAV) vector containing a heterologous nucleic acid construct.
EFFECT: invention provides effective treatment of spinal muscular atrophy (SMA).
6 cl, 10 dwg, 4 ex

Description

Перекрестная ссылка на связанные заявкиCross reference to related applications

По данной заявке испрашивается приоритет на основании 35 USC §119(e)(1) по предварительным заявкам США №№ 61/174/982, поданной 2 мая 2009 года, и 61/268059, поданной 8 июня 2009 года, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.This application claims priority under 35 U.S.C. §119(e)(1) to U.S. Provisional Application Nos. 61/174/982, filed May 2, 2009, and 61/268,059, filed June 8, 2009, which are incorporated herein by reference in their entireties.

Область техникиField of technology

Настоящее изобретение главным образом относится к способам доставки генов. В частности, изобретение относится к композициям и способам для лечения нарушений, влияющих на двигательную функцию, такую как двигательная функция, затронутая заболеванием или повреждением головного и/или спинного мозга.The present invention relates primarily to methods of gene delivery. In particular, the invention relates to compositions and methods for treating disorders affecting motor function, such as motor function affected by disease or injury to the brain and/or spinal cord.

Описание изобретенияDescription of the invention

Генная терапия представляет собой перспективный способ лечения нарушений, которые влияют на центральную нервную систему (ЦНС). Генную терапию ЦНС облегчает разработка вирусных векторов, которые способны эффективно инфицировать постмитотические нейроны. Центральная нервная система состоит из спинного мозга и головного мозга. Спинной мозг проводит сенсорную информацию от периферической нервной системы к головному мозгу и проводит двигательную информацию от головного мозга к различным эффекторам. Обзор вирусных векторов для доставки генов в центральную нервную систему можно найти в публикации Davidson et al., Nature Rev. (2003) 4:353-364.Gene therapy is a promising treatment for disorders that affect the central nervous system (CNS). Gene therapy of the CNS has been facilitated by the development of viral vectors that can efficiently infect postmitotic neurons. The central nervous system consists of the spinal cord and the brain. The spinal cord conducts sensory information from the peripheral nervous system to the brain and conducts motor information from the brain to various effectors. A review of viral vectors for gene delivery to the central nervous system can be found in Davidson et al., Nature Rev . (2003) 4 :353–364.

Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы считаются эффективными для генной терапии ЦНС, поскольку они обладают подходящим профилем токсичности и иммуногенности, их можно использовать в трансдукции нервных клеток, и они способны опосредовать длительную экспрессию в ЦНС (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Bartlett et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9:1181-1186; и Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446).Adeno-associated viral (AAV) vectors are considered effective for CNS gene therapy because they have a favorable toxicity and immunogenicity profile, can be used in neural cell transduction, and are able to mediate long-term expression in the CNS (Kaplitt et al., Nat. Genet . (1994) 8 :148–154; Bartlett et al., Hum. Gene Ther . (1998) 9 :1181–1186; and Passini et al., J. Neurosci . (2002) 22 :6437–6446).

Одно полезное свойство векторов AAV заключается в способности некоторых векторов AAV подвергаться ретроградному и/или антероградному транспорту в нервных клетках. Нейроны в одной области головного мозга соединены аксонами с дистальными областями головного мозга, тем самым предоставляя транспортную систему для доставки вектора. Например, вектор AAV можно вводить в терминали аксонов нейронов или рядом с ними. Нейроны интернализируют вектор AAV и транспортируют его ретроградным способом по аксону в тело клетки. У аденовируса, HSV, и вируса псевдобешенства показаны схожие свойства в отношении доставки генов в дистальные структуры головного мозга (Soudas et al., FASEB J. (2001) 15:2283-2285; Breakefield et al., New Biol. (1991) 3:203-218; и deFalco et al., Science (2001) 291:2608-2613).One useful property of AAV vectors is the ability of some AAV vectors to undergo retrograde and/or anterograde transport in neuronal cells. Neurons in one region of the brain are connected by axons to distal regions of the brain, thereby providing a transport system for vector delivery. For example, an AAV vector can be injected into or near the axon terminals of neurons. Neurons internalize the AAV vector and transport it retrogradely along the axon to the cell body. Adenovirus, HSV, and pseudorabies virus have been shown to have similar gene delivery properties to distal brain structures (Soudas et al., FASEB J . (2001) 15 :2283–2285; Breakefield et al., New Biol . (1991) 3 :203–218; and deFalco et al., Science (2001) 291 :2608–2613).

Некоторые исследователи сообщали о том, что трансдукция головного мозга с использованием серотипа AAV 2 (AAV2) ограничена внутричерепным местом инъекции (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446; и Chamberlin et al., Brain Res. (1998) 793:169-175). Также существует доказательство того, что ретроградный аксональный транспорт нейротропных вирусных векторов, включая векторы AAV и лентивирусные векторы, также может происходить в выбранных цепях головного мозга нормальной крысы (Kaspar et al., Mol. Ther. (2002) 5:50-56; Kasper et al., Science (2003) 301: 839-842 и Azzouz et al., Nature (2004) 429:413-417. Roaul et al., Nat. Med. (2005) 11(4):423-428 и Ralph et al., Nat. Med. (2005) 11(4):429-433 сообщают, что внутримышечная инъекция лентивируса, экспрессирующего интерферирующую РНК для подавления экспрессии Cu/Zn-супероксиддисмутазы (SOD1) человека, задерживала начало заболевания боковым амиотрофическим склерозом (ALS) в терапевтически уместной модели ALS на грызунах.Several investigators have reported that brain transduction using AAV serotype 2 (AAV2) is limited to the intracranial injection site (Kaplitt et al., Nat. Genet . (1994) 8 :148–154; Passini et al., J. Neurosci . (2002) 22 :6437–6446; and Chamberlin et al., Brain Res . (1998) 793 :169–175). There is also evidence that retrograde axonal transport of neurotropic viral vectors, including AAV vectors and lentiviral vectors, can also occur in selected circuits of the normal rat brain (Kaspar et al., Mol. Ther . (2002) 5 :50–56; Kasper et al., Science (2003) 301 : 839–842; and Azzouz et al., Nature (2004) 429 :413–417. Roaul et al., Nat. Med . (2005) 11 (4):423–428; and Ralph et al., Nat. Med . (2005) 11 (4):429–433 report that intramuscular injection of lentivirus expressing interfering RNA to suppress the expression of Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) in humans delayed the onset of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) disease in a therapeutically relevant rodent model of ALS.

Клетки, трансдуцированные векторами AAV, могут экспрессировать продукт терапевтического трансгена, такой как фермент или нейротрофический фактор, чтобы опосредовать положительное воздействие внутриклеточно. Эти клетки также могут секретировать продукт терапевтического трансгена, который впоследствии может быть захвачен дистальными клетками, где он может опосредовать свое положительное воздействие. Этот процесс описан как кросс-коррекция (Νeufeld et al., Science (1970) 169:141-146).Cells transduced with AAV vectors can express a therapeutic transgene product, such as an enzyme or neurotrophic factor, to mediate beneficial effects intracellularly. These cells can also secrete a therapeutic transgene product that can subsequently be taken up by distal cells where it can mediate its beneficial effects. This process is described as cross-correction (Νeufeld et al., Science (1970) 169 :141–146).

Свойство описанных выше рекомбинантных векторов AAV заключается в том, что перед экспрессией кодируемого трансгена нужно конвертировать одноцепочечную ДНК (оцДНК) генома AAV в двухцепочечную ДНК (дцДНК). Эту стадию можно обойти посредством самокомплементарных векторов, в которых упакован геном с инвертированными повторами, который уложен в дцДНК, не требуя синтеза ДНК или спаривания оснований нескольких векторных геномов, тем самым повышая эффективность опосредованного AAV переноса генов. Обзор самокомплементарных векторов AAV см., например, в публикации McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656.A property of the recombinant AAV vectors described above is that the single-stranded DNA (ssDNA) of the AAV genome must be converted to double-stranded DNA (dsDNA) before expression of the encoded transgene. This step can be bypassed by self-complementary vectors that package an inverted repeat genome folded into dsDNA, eliminating the need for DNA synthesis or base pairing of multiple vector genomes, thereby increasing the efficiency of AAV-mediated gene transfer. For a review of self-complementary AAV vectors, see, e.g., McCarty, DM Molec. Ther . (2008) 16 :1648–1656.

Спинальная мышечная атрофия (SMA) представляет собой аутосомное рецессивное нервно-мышечное нарушение, вызванное мутациями в гене выживаемости двигательных нейронов 1 (SMΝ1) и утратой кодируемого SMΝ белка (Lefebvre et al., Cell (1995) 80:155-165). Отсутствие SMΝ ведет к дегенерации двигательных нейронов в брюшном (переднем) роге спинного мозга, что ведет к слабости проксимальных мышц, отвечающих за ползание, ходьбу, движение шеи и глотание, и непроизвольно сокращающихся мышц, которые управляют дыханием и кашлем (Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245). Таким образом, пациенты с SMA предрасположены к пневмониям и другим пульмональным проблемам, таким как рестриктивное легочное заболевание. Начало заболевания и степень тяжести отчасти определяет фенотипический ген-модификатор SMN2, который способен обеспечить образование малого количества SMN (Monani et al., Hum. Mol. Genet. (1999) 8:1177-1183; Lorson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:6307-6311). Таким образом, пациенты с высоким числом копий SMN2 (3-4 копии) переносят менее тяжелую форму заболевания (именуемую II или III типом), тогда как 1-2 копии SMN2 обычно ведут к более тяжелому заболеванию I типа (Campbell et al., Am. J. Hum. Genet. (1997) 61:40-50; Lefebvre et al., Nat. Genet. (1997) 16:265-269). В настоящее время не существует эффективного лечения SMA.Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive neuromuscular disorder caused by mutations in the survival motor neuron 1 (SMN1) gene and loss of the SMN-encoded protein (Lefebvre et al., Cell (1995) 80 :155–165). The absence of SMN leads to degeneration of motor neurons in the ventral (anterior) horn of the spinal cord, resulting in weakness of the proximal muscles responsible for crawling, walking, neck movement, and swallowing, and of the involuntary muscles that control breathing and coughing (Sumner CJ, NeuroRx (2006) 3 :235–245). Patients with SMA are thus predisposed to pneumonia and other pulmonary problems such as restrictive lung disease. The onset and severity of the disease are determined in part by the phenotypic modifier gene SMN2, which is capable of producing small amounts of SMN (Monani et al., Hum. Mol. Genet . (1999) 8 :1177–1183; Lorson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96 :6307–6311). Thus, patients with high SMN2 copy numbers (3–4 copies) have a less severe form of the disease (called type II or III), whereas 1–2 SMN2 copies typically lead to the more severe type I disease (Campbell et al., Am. J. Hum. Genet . (1997) 61 :40–50; Lefebvre et al., Nat. Genet . (1997) 16 :265–269). There is currently no effective treatment for SMA.

Фундаментальная стратегия лечения данного моногенного нарушения состоит в повышении уровней SMN у пациентов с SMA. Один подход для достижения этого состоит в модуляции эндогенного гена SMN2 с использованием низкомолекулярных соединений, которые активируют промотор SMN2 или корректируют паттерн сплайсинга предшественника мРНК SMN2. Изменение сплайсинга SMN2 также можно реализовать с использованием антисмысловых олигонуклеотидов и транс-сплайсинга РНК. Однако несмотря на то, что модуляция SMN2 повышала уровень SMN in vitro и восстанавливала ядерные кристаллические структуры в клеточных линиях с SMA, исследования эффективности с использованием низкомолекулярных лекарственных средств не перешли в поддающиеся измерению улучшения в клинике (Oskoui et al., Neurotherapeutics (2008) 5:499-506).The fundamental strategy for treating this monogenic disorder is to increase SMN levels in patients with SMA. One approach to achieve this is to modulate the endogenous SMN2 gene using small molecules that activate the SMN2 promoter or correct the splicing pattern of the SMN2 precursor mRNA. Alteration of SMN2 splicing can also be accomplished using antisense oligonucleotides and trans-RNA splicing. However, although SMN2 modulation has been shown to increase SMN levels in vitro and restore nuclear crystal structures in SMA cell lines, efficacy studies using small molecules have not translated into measurable improvements in the clinic (Oskoui et al., Neurotherapeutics (2008) 5 :499–506).

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение основано на открытии того, что как стандартные рекомбинантные вирионы AAV (rAAV), так и рекомбинантные самокомплементарные векторы AAV (scAAV) способны доставлять гены в ЦНС при успешной экспрессии в ЦНС и лечении нейродегенеративного заболевания. Этот терапевтический подход для доставки генов, кодирующих терапевтические молекулы, которая ведет по меньшей мере к частичной коррекции неврологических патологий, предоставляет крайне желательный способ лечения различных нейродегенеративных нарушений, включая SMA.The present invention is based on the discovery that both standard recombinant AAV virions (rAAV) and recombinant self-complementary AAV vectors (scAAV) are capable of delivering genes to the CNS with successful expression in the CNS and treatment of a neurodegenerative disease. This therapeutic approach for delivering genes encoding therapeutic molecules that leads to at least partial correction of neurological pathologies provides a highly desirable method for treating various neurodegenerative disorders, including SMA.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к самокомплементарному аденоассоциированному вирусному (scAAV) вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий белок, который модулирует двигательную функцию у субъекта с нарушением двигательных нейронов. В определенных вариантах осуществления нарушение двигательных нейронов выбирают из спинальной мышечной атрофии (SMA), бокового амиотрофического склероза (ALS), спинобульбарной мышечной атрофии, спиноцеребеллярной атаксии, первичного латерального склероза (PLS) или травматического повреждения спинного мозга.Thus, in one embodiment, the invention relates to a self-complementary adeno-associated viral (scAAV) vector comprising a polynucleotide encoding a protein that modulates motor function in a subject with a motor neuron disorder. In certain embodiments, the motor neuron disorder is selected from spinal muscular atrophy (SMA), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), spinobulbar muscular atrophy, spinocerebellar ataxia, primary lateral sclerosis (PLS), or traumatic spinal cord injury.

В дополнительных вариантах осуществления полинуклеотид, присутствующий в векторе scAAV, кодирует белок выживаемости двигательных нейронов (SMN). В определенных вариантах осуществления белок SMN представляет собой SMN-1 человека. В дополнительных вариантах осуществления SMN-1 содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью, изображенной на фиг.9B. В дополнительных вариантах осуществления SMN-1 содержит аминокислотную последовательность, как изображено на фиг.9B.In additional embodiments, the polynucleotide present in the scAAV vector encodes a survival motor neuron (SMN) protein. In certain embodiments, the SMN protein is human SMN-1. In additional embodiments, SMN-1 comprises an amino acid sequence that has at least 90% sequence identity to the sequence depicted in Fig. 9B. In additional embodiments, SMN-1 comprises an amino acid sequence as depicted in Fig. 9B.

В других вариантах осуществления изобретение относится к рекомбинантному вириону AAV, содержащему вектор scAAV, как описано выше.In other embodiments, the invention relates to a recombinant AAV virion comprising an scAAV vector as described above.

В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантный вирион AAV, как указано выше, и фармацевтически приемлемый эксципиент.In further embodiments, the invention relates to a composition comprising a recombinant AAV virion as defined above and a pharmaceutically acceptable excipient.

В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к способу модуляции двигательной функции у субъекта с нарушением двигательных нейронов, включающему введение терапевтически эффективного количества указанной выше композиции в клетки субъекта. В определенных вариантах осуществления композицию вводят в клетки in vitro для того, чтобы трансдуцировать клетки, и трансдуцированные клетки вводят субъекту. В альтернативных вариантах осуществления композиции вводят в клетки in vivo.In additional embodiments, the invention relates to a method of modulating motor function in a subject with a motor neuron disorder, comprising administering a therapeutically effective amount of the above composition to the cells of the subject. In certain embodiments, the composition is administered to the cells in vitro to transduce the cells, and the transduced cells are administered to the subject. In alternative embodiments, the compositions are administered to the cells in vivo .

В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к способу обеспечения белка SMN у субъекта со спинальной мышечной атрофией (SMA), включающему введение рекомбинантного вириона AAV, содержащего вектор AAV, как описано выше, в клетки субъекта, нуждающегося в этом. В определенных вариантах осуществления композицию вводят в клетки in vitro для того, чтобы трансдуцировать клетки, и трансдуцированные клетки вводят субъекту. В альтернативных вариантах осуществления композиции вводят в клетки in vivo.In additional embodiments, the invention relates to a method of providing SMN protein to a subject with spinal muscular atrophy (SMA), comprising administering a recombinant AAV virion comprising an AAV vector as described above to cells of the subject in need thereof. In certain embodiments, the composition is administered to the cells in vitro to transduce the cells, and the transduced cells are administered to the subject. In alternative embodiments, the compositions are administered to the cells in vivo .

В каждом указанном выше способе композицию можно вводить непосредственной инъекцией в спинной мозг. В других вариантах осуществления композицию вводят интрацеребровентрикулярной инъекцией. В дополнительных вариантах осуществления композицию вводят в боковой желудочек головного мозга. В определенных вариантах осуществления композицию вводят в оба боковых желудочка головного мозга. В других вариантах осуществления композицию вводят как интрацеребровентрикулярной инъекцией, так и прямой инъекцией в спинной мозг. В дополнительных вариантах осуществления композицию вводят посредством интратекальной инъекции.In each of the above methods, the composition can be administered by direct injection into the spinal cord. In other embodiments, the composition is administered by intracerebroventricular injection. In additional embodiments, the composition is administered into the lateral ventricle of the brain. In certain embodiments, the composition is administered into both lateral ventricles of the brain. In other embodiments, the composition is administered both by intracerebroventricular injection and by direct injection into the spinal cord. In additional embodiments, the composition is administered by intrathecal injection.

Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения легко решат специалисты в данной области с учетом описания, приведенного в настоящем документе.These and other embodiments of the present invention will be readily apparent to those skilled in the art given the description provided herein.

Краткое описание рисунковBrief description of the drawings

На фиг.1 показана выживаемость мышей, которых лечили с использованием AAVhSMN1, в сравнении с мышами с SMA, которые не получали лечения. Лечение с использованием AAVhSMN1 повышало выживаемость мышей с SMA. Мыши с SMA, не получавшие лечение (n=34, светлые круги), имели среднее значение продолжительности жизни 15 суток. Мыши с SMA, которых лечили при P0 с использованием AAVhSMN1 (n=24, темные круги), имели среднее значение продолжительности жизни 50 суток (p<0,0001), что составило увеличение срока жизни на 233%.Figure 1 shows the survival of mice treated with AAVhSMN1 compared to untreated SMA mice. Treatment with AAVhSMN1 increased the survival of SMA mice. Untreated SMA mice (n=34, open circles) had a median survival of 15 days. SMA mice treated at P0 with AAVhSMN1 (n=24, closed circles) had a median survival of 50 days (p<0.0001), representing a 233% increase in survival.

На фиг.2A-2C показано влияние генной терапии на уровни SMN в спинном мозге. Показаны уровни белка hSMN в инъецированных поясничном (фиг.2A), грудном (фиг.2B) и шейном (фиг.2C) отделах по сравнению с мышами с SMA, не получавшими лечение, и мышами дикого типа. Осуществляли вестерн-блоттинг для поясничного, грудного и шейного отделов спинного мозга через 16, 58-66 и 120-220 суток после инъекции. Посредством вестерн-блоттинга проводили количественное определение для трех отделов, а для контроля уровней белка нормализовали SMN к β-тубулину и наносили на график в виде процентной доли мышей дикого типа с совпадающим возрастом. Легенда (и значения n): SMA, с нокаутом, не получавшие лечение (n=5 на 16 сутки); AAV, мыши с SMA, которых лечили с использованием AAV8-hSMN (n=7 на 16 сутки, n=5 на 58-66 сутки); scAAV, мыши с SMA, которых лечили с использованием scAAV8-hSMN (n=5 в каждый момент времени). Значения представляют среднее значение ±SEM (стандартная ошибка среднего значения).Figures 2A–2C show the effect of gene therapy on SMN levels in the spinal cord. The hSMN protein levels in injected lumbar (Figure 2A), thoracic (Figure 2B), and cervical (Figure 2C) regions are shown compared to untreated and wild-type SMA mice. Western blots were performed on lumbar, thoracic, and cervical spinal cords at 16, 58–66, and 120–220 days post-injection. Western blots were used to quantify the three regions, and as a control for protein levels, SMN was normalized to β-tubulin and plotted as a percentage of age-matched wild-type mice. Legend (and n values): SMA, KO, untreated (n=5 at day 16); AAV, SMA mice treated with AAV8-hSMN (n=7 at day 16, n=5 at days 58-66); scAAV, SMA mice treated with scAAV8-hSMN (n=5 at each time point). Values represent mean ±SEM.

На фиг.3A-3J показано внутриклеточное распределение белка hSMN и экспрессия в двигательных нейронах спинного мозга у мышей с SMA, получавших и не получавших лечение. Белок hSMN в большом количестве обнаруживали в цитоплазме трансдуцированных клеток (фиг.3A и 3B). Кроме того, белок hSMN обнаруживали в ядре, как проиллюстрировано парой кристаллических структур (стрелка), увеличенных во врезке (фиг.3A). Белок hSMN также обнаруживали в дендритах (фиг.3B и 3C) и аксонах (фиг.3D) нейронов. Белок hSMN не поддавался обнаружению на срезах тканей мышей с SMA, не получавших лечение (фиг.3E). Совместная локализация белка hSMN (фиг.3F) и ChAT мыши (фиг.3G) показывала, что подмножество трансдуцированных клеток представляет собой двигательные нейроны (фиг.3H и 3I). Процентную долю ChAT-клеток, иммуноположительных по белку hSMN, определяли на 16 (белые столбцы) и 58-66 (черные столбцы) сутки (фиг.3J). Значения представляют среднее значение ±SEM.Figures 3A–3J show the subcellular distribution of hSMN protein and expression in spinal cord motor neurons from treated and untreated SMA mice. hSMN protein was abundant in the cytoplasm of transduced cells (Figures 3A and 3B). In addition, hSMN protein was detected in the nucleus, as illustrated by the pair of crystal structures (arrow) magnified in the inset (Figure 3A). hSMN protein was also detected in the dendrites (Figures 3B and 3C) and axons (Figure 3D) of neurons. hSMN protein was undetectable in tissue sections from untreated SMA mice (Figure 3E). Co-localization of hSMN protein (Figure 3F) and mouse ChAT (Figure 3G) indicated that a subset of transduced cells were motor neurons (Figures 3H and 3I). The percentage of ChAT cells immunopositive for hSMN protein was determined at days 16 (white bars) and 58–66 (black bars) (Fig. 3J). Values represent mean ±SEM.

На фиг.4 показано количество двигательных нейронов в спинном мозге у мышей с SMA, получавших и не получавших лечение. Для каждой группы показано среднее число ChAT иммуноположительных нейронов, которое считали на 10 мкм тканевых срезах. Число отражает количество в каждом десятом срезе с различных уровней шейного, грудного, поясничного и крестцового отделов. Значения представляют среднее значение ±SEM. Легенда: *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.Figure 4 shows the number of motor neurons in the spinal cord of treated and untreated SMA mice. The mean number of ChAT immunopositive neurons counted in 10 μm tissue sections is shown for each group. The number represents the number in every tenth section from different levels of the cervical, thoracic, lumbar, and sacral spine. Values represent the mean ±SEM. Legend: *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

На фиг.5A-5C показана площадь поперечного сечения мышечного волокна из мышечных групп у мышей с SMA, получавших и не получавших лечение. Площадь поперечного сечения мышечного волокна из нескольких мышечных групп возрастала при лечении с использованием AAVhSMN1. Составные диаграммы для квадрицепсов, икроножных и межреберных мышц на 16 (фиг.5A) и 58-66 (фиг.5B) сутки показывают, что распределение размеров мышечных волокон схожи у мышей с SMA, получавших лечение, и у мышей дикого типа. Общее среднее значение на 16 сутки показывает, что при лечении площадь поперечного сечения мышечного волокна значительно выше (фиг.5C). Кроме того, на 58-66 сутки средняя площадь статистически сходна у мышей с SMA, получавших лечение, и у мышей дикого типа с совпадающим возрастом в икроножных и межреберных мышцах (фиг.5C). Значения представляют среднее значение ±SEM. Легенда: WT, мыши дикого типа, не получавшие лечение; HET, гетерозиготы, не получавшие лечение; SMA, с нокаутом, не получавшие лечение; AAV, мыши с SMA, получавшие лечение с использованием AAVhSMN1; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.Figures 5A-5C show the muscle fiber cross-sectional area of muscle groups in treated and untreated SMA mice. The muscle fiber cross-sectional area of several muscle groups was increased by treatment with AAVhSMN1. Composite plots for the quadriceps, gastrocnemius, and intercostal muscles at days 16 (Figure 5A) and 58-66 (Figure 5B) show that the muscle fiber size distributions are similar in treated and wild-type SMA mice. The overall mean at day 16 shows that the muscle fiber cross-sectional area is significantly higher with treatment (Figure 5C). Additionally, at days 58-66, the mean area is statistically similar between treated and age-matched wild-type SMA mice in the gastrocnemius and intercostal muscles (Figure 5C). Values represent the mean ± SEM. Legend: WT, wild-type mice, untreated; HET, heterozygous, untreated; SMA, knockout, untreated; AAV, SMA mice treated with AAVhSMN1; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

На фиг.6A-6F показана структура нервно-мышечного соединения (NMJ) в мышцах у мышей с SMA, получавших и не получавших лечение. Структуру в квадрицепсе, икроножной и межреберной мышцах улучшали при использовании генной терапии. Показаны нервно-мышечные соединения(NMJ) из квадрицепсов мышей с SMA, не получавших лечение (фиг.6A), мышей с SMA, получавших лечение (фиг.6B), и мышей дикого типа, не получавших лечение (фиг.6C), на 16 сутки, и мышей с SMA, получавших лечение (фиг.6D), и мышей дикого типа, не получавших лечение (фиг.6E), на 58-66 сутки. Пре- и постсинаптическое NMJ метили антителом к нейрофиламенту (зеленый) и окрашивали α-бунгаротоксином (красный), соответственно. Стрелка в основной части указывает на NMJ, которое выделено во врезках ниже. У каждого животного в каждой мышце случайно оценивали по меньшей мере 100 NMJ. Нормальное NMJ определяли как имеющее пресинаптическую терминаль, в которой не наблюдали аномального накопления белка нейрофиламента, показанного на фиг.6A. Значения на фиг.6F представляют среднее значение ±SEM. Легенда: WT, мыши дикого типа, не получавшие лечение; HET, гетерозиготы, не получавшие лечение; SMA, мыши с нокаутом, не получавшие лечение; AAV, мыши с SMA, получавшие лечение с использованием AAVhSMN1; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001. Масштабная метка: 20 мкм.Figures 6A-6F show the neuromuscular junction (NMJ) structure in muscles from treated and untreated SMA mice. The structure in the quadriceps, gastrocnemius, and intercostal muscles was improved by gene therapy. Shown are neuromuscular junctions (NMJs) from quadriceps of untreated SMA mice (Figure 6A), treated SMA mice (Figure 6B), and untreated wild-type mice (Figure 6C) at day 16, and treated SMA mice (Figure 6D) and untreated wild-type mice (Figure 6E) at days 58-66. The pre- and postsynaptic NMJ were labeled with anti-neurofilament antibody (green) and stained with α-bungarotoxin (red), respectively. The arrow in the main body points to the NMJ, which is highlighted in the insets below. At least 100 NMJs were randomly assessed in each animal in each muscle. A normal NMJ was defined as having a presynaptic terminal that did not show abnormal accumulation of neurofilament protein as shown in Fig. 6A. Values in Fig. 6F represent the mean ± SEM. Legend: WT, untreated wild-type mice; HET, untreated heterozygotes; SMA, untreated knockout mice; AAV, SMA mice treated with AAVhSMN1; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. Scale bar: 20 μm.

На фиг.7A-7F показаны результаты поведенческих тестов у мышей с SMA, получавших и не получавших лечение. В поведенческих тестах мыши с SMA, получавшие лечение, показывали значительные улучшения. Мыши с SMA, получавшие лечение (звездочка), и мыши дикого типа (WT), не получавшие лечение, по существу более приспособлены, чем мыши с SMA, не получавшие лечение (отмечены «x»), на 16 сутки (фиг.7A). Мыши с SMA, получавшие лечение, также значительно тяжелее контрольных мышей с SMA, не получавших лечение, с 11 суток и далее (фиг.7B). Мыши с SMA, получавшие лечение, значительно лучше выполняли тесты на выпрямительный рефлекс (фиг.7C), отрицательный геотаксис (фиг.7D), силу хватания (фиг.7E) и разведение задних конечностей (фиг.7F), чем мыши с SMA, не получавшие лечение. Мыши с SMA, получавшие лечение, статистически идентичны мышам дикого типа и гетерозиготам в тестах на выпрямительный рефлекс и отрицательный геотаксис на 12-16 сутки (фиг.7C и 7D). Значения представляют среднее значение ±SEM. Легенда: мыши WT, не получавшие лечение (светлый круг), гетерозиготы, не получавшие лечение (светлый треугольник); мыши с SMA, не получавшие лечение (светлый квадрат); мыши с SMA, получавшие лечение с использованием AAVhSMN1 (темный квадрат); *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.Figures 7A-7F show the behavioral test results in treated and untreated SMA mice. In the behavioral tests, treated SMA mice showed significant improvements. Treated SMA mice (asterisk) and untreated wild-type (WT) mice were significantly fitter than untreated SMA mice (marked with “x”) at day 16 (Figure 7A). Treated SMA mice were also significantly heavier than untreated control SMA mice from day 11 onward (Figure 7B). Treated SMA mice performed significantly better in the righting reflex (Figure 7C), negative geotaxis (Figure 7D), grasp strength (Figure 7E), and hindlimb extension (Figure 7F) tests than untreated SMA mice. Treated SMA mice were statistically identical to WT and heterozygotes in the righting reflex and negative geotaxis tests at days 12–16 (Figs. 7C and 7D). Values represent mean ± SEM. Legend: Untreated WT mice (open circle), untreated heterozygotes (open triangle); untreated SMA mice (open square); AAVhSMN1-treated SMA mice (closed square); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

На фиг.8 показана выживаемость мышей, получавших лечение с использованием scAAVhSMN1 и не получавших лечение. Лечение с использованием scAAVhSMN1 повышало выживаемость у мышей с SMA. Мыши с SMA, получавшие лечение при P0 с использованием scAAVhSMN1 (n=17, темные треугольники), имели среднее значение продолжительности жизни 157 суток (p<0,0001) по сравнению с 16 сутками у мышей с SMA, не получавшими лечение (n=47, светлые круги).Figure 8 shows the survival of mice treated with scAAVhSMN1 and untreated mice. Treatment with scAAVhSMN1 increased survival in SMA mice. SMA mice treated at P0 with scAAVhSMN1 (n=17, closed triangles) had a median survival of 157 days (p<0.0001) compared to 16 days in untreated SMA mice (n=47, open circles).

На фиг.9A-9B (SEQ ID NO:1 и 2) показана кодирующая последовательность ДНК (фиг.9A) и соответствующая аминокислотная последовательность (фиг.9B) характерного гена выживаемости двигательных нейронов (SMN1) человека.Figures 9A-9B (SEQ ID NOs:1 and 2) show the coding DNA sequence (Figure 9A) and the corresponding amino acid sequence (Figure 9B) of the human survival motor neuron gene (SMN1).

На фиг.10A-10F показано, что экспрессия scAAV8-hSMN увеличивает количество двигательных нейронов и улучшает NMJ у мышей с SMA. На фиг.10A показана процентная доля mChAT иммуноположительных клеток, которые локализованы совместно с экспрессией hSMN в пояснично-грудном отделе на 16 сутки после инъекции. На фиг.10B-10F показаны средние количества mChAT иммуноположительных клеток в поясничном (фиг.10B), грудном (фиг.10C) и шейном (фиг.10D) отделах и средние процентные доли поврежденных NMJ в квадрицепсе (фиг.10E) и межреберных мышцах (фиг.10F) на 16, 58-66 и 214-269 сутки. Точкой отсчета для фиг.10E и 10F служит 75-90% NMJ в квадрицепсе и межреберных мышцах мышей с SMA, не получавших лечение, которые содержали неправильную поврежденную структуру на 16 сутки (см. фиг.6F). Легенда и значения n: SMA, мыши с нокаутом, не получавшие лечение (светлые столбцы, n=8 на 16 сутки), AAV, AAV8-hSMN (заштрихованные столбцы, n=8 на 16 сутки, n=5 на 58-66 сутки); scAAV, scAAV8-hSMN (темные столбцы, n=5 в каждый момент времени); WT, мыши WT, не получавшие лечение (столбцы в клетку, n=8 на 16 сутки, n=5 на 58-66 и 216-269 сутки). Значения представляют среднее значение ±SEM. Статистические сравнения осуществляли, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и апостериорный критерий Бонферрони для множественных сравнений на 16 сутки (фиг.10B-10F). С помощью непарного двустороннего критерия Стьюдента сравнивали 1) два вектора друг с другом на 16 сутки (фиг.10A) и 58-66 сутки (фиг.10B-10D); 2) относительное число ChAT-клеток в группах 58-66d и 214-269d при лечении с использованием scAAV8-hSMN (фиг.10B-10D); 3) относительное число аномальных NMJ между мышами WT с совпадающим возрастом, не получавшими лечение, и мышами с SMA, получавшими лечение с использованием scAAV8-hSMN, на 214-269 сутки (E, F); *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.Figures 10A-10F show that scAAV8-hSMN expression increases motor neuron numbers and improves NMJs in mice with SMA. Figure 10A shows the percentage of mChAT immunopositive cells that co-localize with hSMN expression in the thoracolumbar region at day 16 post-injection. Figures 10B-10F show the mean numbers of mChAT immunopositive cells in the lumbar (Figure 10B), thoracic (Figure 10C), and cervical (Figure 10D) regions and the mean percentages of damaged NMJs in the quadriceps (Figure 10E) and intercostal muscles (Figure 10F) at days 16, 58-66, and 214-269. The cutoff point for Figs. 10E and 10F is 75–90% of the NMJ in the quadriceps and intercostal muscles of untreated SMA mice, which contained the abnormal lesional structure at day 16 (see Fig. 6F). Legend and n values: SMA, untreated KO mice (open bars, n=8 at day 16), AAV, AAV8-hSMN (hatched bars, n=8 at day 16, n=5 at days 58-66); scAAV, scAAV8-hSMN (dark bars, n=5 at each time point); WT, untreated WT mice (checkered bars, n=8 at day 16, n=5 at days 58-66 and 216-269). Values represent mean ± SEM. Statistical comparisons were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni's post hoc test for multiple comparisons at day 16 (Figs. 10B-10F). Unpaired two-tailed Student's t-test was used to compare 1) the two vectors against each other at day 16 (Fig. 10A) and days 58-66 (Figs. 10B-10D); 2) the relative numbers of ChAT cells in the 58-66d and 214-269d groups with scAAV8-hSMN treatment (Figs. 10B-10D); 3) the relative numbers of abnormal NMJs between age-matched untreated WT mice and scAAV8-hSMN-treated SMA mice at days 214-269 (E, F); *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

При практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если не указано иначе, стандартные способы химии, биохимии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, известные специалистам в данной области. Такие способы полностью описаны в литературе. См., например, Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, standard techniques of chemistry, biochemistry, recombinant DNA, and immunology within the skill of the art. Such techniques are fully described in the literature. See, for example, Fundamental Virology , 2nd Edition, vols. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology , Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T. E. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем документе, как выше, так и ниже, настоящим включены посредством ссылки в полном объеме.All publications, patents and patent applications cited in this document, both supra and infra, are hereby incorporated by reference in their entirety.

1. Определения1. Definitions

В описании настоящего изобретения использованы следующие термины, которые следует использовать в значении, указанном ниже.In the description of the present invention, the following terms are used, which should be used with the meaning specified below.

Следует отметить, что используемые в данном описании и приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, упоминание о «рецепторе интерлейкина» включает смесь двух или более таких рецепторов и т.п.It should be noted that the singular forms used in this description and the appended claims include plural forms unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to an "interleukin receptor" includes a mixture of two or more such receptors, etc.

Термины «полипептид» и «белок», используемые взаимозаменяемо в настоящем документе, или кодирующая их нуклеотидная последовательность, относятся к белку или нуклеотидной последовательности, соответственно, которые представляют или нативную последовательность, ее вариант или ее фрагмент. Полноразмерные белки, с сигнальной последовательностью или без нее, и их фрагменты, а также белки с модификациями, такими как делеции, вставки и замены (или консервативные или неконсервативные по природе), в нативной последовательности предназначены для использования в настоящем документе при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, введенными посредством сайт-специфического мутагенеза, или могут быть случайными, например, введенными посредством мутаций организма-хозяина, который продуцирует белки, или посредством ошибок ПЦР амплификации. Таким образом, в настоящем документе предполагается использовать активные белки, по существу гомологичные родительской последовательности, например, белки с 70…80…85…90…95…98…99% и т.д. идентичностью, которые сохраняют желаемую активность нативной молекулы.The terms "polypeptide" and "protein" used interchangeably herein, or the nucleotide sequence encoding them, refer to a protein or nucleotide sequence, respectively, that is either a native sequence, a variant thereof, or a fragment thereof. Full-length proteins, with or without a signal sequence, and fragments thereof, as well as proteins with modifications such as deletions, insertions, and substitutions (whether conservative or non-conservative in nature) in the native sequence are intended for use herein, provided that the protein retains the desired activity. These modifications may be intentional, such as those introduced by site-directed mutagenesis, or may be accidental, such as those introduced by mutations in the host organism that produces the proteins, or by PCR amplification errors. Thus, in this document it is intended to use active proteins that are substantially homologous to the parent sequence, for example proteins with 70…80…85…90…95…98…99%, etc. identity, which retain the desired activity of the native molecule.

«Нативный» полипептид, такой как полипептид выживаемости двигательных нейронов (SMN), относится к полипептиду, который имеет такую же аминокислотную последовательность, как и соответствующая молекула, полученная из природы. Такие нативные последовательности можно выделить из природы или можно получить рекомбинантными или синтетическими средствами. Термин «нативная» последовательность, в частности, охватывает природные усеченные или секретируемые формы конкретной молекулы (например, последовательность внеклеточного домена), природные формы вариантов (например, формы, возникшие в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты полипептида. В различных вариантах осуществления изобретения нативные молекулы, описанные в настоящем документе, представляют собой зрелые или полноразмерные нативные последовательности, содержащие полноразмерные аминокислотные последовательности, представленные на сопроводительных фигурах. Однако несмотря на то, что некоторые молекулы, показанные на сопроводительных фигурах, начинаются с остатков метионина, обозначенных в качестве аминокислотного положения 1 на этой фигуре, другие остатки метионина, расположенные или ближе к 5’-концу, или ближе к 3’-концу относительно аминокислотного положения 1 на этой фигуре, можно использовать в качестве начального аминокислотного остатка для конкретной молекулы. Альтернативно, в зависимости от используемой экспрессирующей системы, у молекул, описанных в настоящем документе, может отсутствовать N-концевой метионин.A "native" polypeptide, such as a survival motor neuron (SMN) polypeptide, refers to a polypeptide that has the same amino acid sequence as the corresponding molecule obtained from nature. Such native sequences may be isolated from nature or may be produced by recombinant or synthetic means. The term "native" sequence specifically encompasses naturally occurring truncated or secreted forms of a particular molecule (e.g., an extracellular domain sequence), naturally occurring variant forms (e.g., forms resulting from alternative splicing), and naturally occurring allelic variants of a polypeptide. In various embodiments, the native molecules described herein are mature or full-length native sequences comprising the full-length amino acid sequences shown in the accompanying figures. However, although some of the molecules shown in the accompanying figures begin with the methionine residues designated as amino acid position 1 in the figure, other methionine residues located either closer to the 5' end or closer to the 3' end relative to amino acid position 1 in the figure can be used as the starting amino acid residue for a particular molecule. Alternatively, depending on the expression system used, the molecules described herein may lack an N-terminal methionine.

Под «вариантом» понимают активный полипептид, как определено в настоящем документе, который обладает по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности с соответствующей полноразмерной нативной последовательностью, полипептид, у которого отсутствует сигнальный пептид, внеклеточный домен полипептида, с сигнальным пептидом или без него, или любой другой фрагмент последовательности полноразмерного полипептида, как описано в настоящем документе. Такие варианты полипептида включают, например, полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавлены или удалены на N- и/или C-конце полноразмерной нативной аминокислотной последовательности. Как правило, вариант обладает по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 82% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 83% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 84% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 86% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 87% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 88% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 89% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью аминокислотной последовательности и альтернативно по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью аминокислотной последовательности с соответствующей полноразмерной нативной последовательностью. Как правило, полипептиды вариантов составляют по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот в длину, например, по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот в длину, например, по меньшей мере приблизительно 30 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 40 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 60 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 70 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 80 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 90 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 150 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 200 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 300 аминокислот в длину или более.By "variant" is meant an active polypeptide as defined herein that has at least about 80% amino acid sequence identity with the corresponding full-length native sequence, a polypeptide that lacks a signal peptide, an extracellular domain of the polypeptide, with or without a signal peptide, or any other fragment of the sequence of a full-length polypeptide as described herein. Such polypeptide variants include, for example, polypeptides in which one or more amino acid residues are added or deleted at the N- and/or C-terminus of the full-length native amino acid sequence. Typically, a variant has at least about 80% amino acid sequence identity, alternatively at least about 81% amino acid sequence identity, alternatively at least about 82% amino acid sequence identity, alternatively at least about 83% amino acid sequence identity, alternatively at least about 84% amino acid sequence identity, alternatively at least about 85% amino acid sequence identity, alternatively at least about 86% amino acid sequence identity, alternatively at least about 87% amino acid sequence identity, alternatively at least about 88% amino acid sequence identity, alternatively at least about 89% amino acid sequence identity, alternatively at least about 90% amino acid sequence identity, alternatively at least about 91% amino acid sequence identity, alternatively at least about 92% amino acid sequence identity, alternatively at least about 93% amino acid sequence identity, alternatively at least about 94% amino acid sequence identity, alternatively at least about 95% amino acid sequence identity, alternatively at least about 96% amino acid sequence identity, alternatively at least about 97% amino acid sequence identity, alternatively at least about 98% amino acid sequence identity, and alternatively at least about 99% amino acid sequence identity to the corresponding full-length native sequence. Typically, the variant polypeptides are at least about 10 amino acids in length, such as at least about 20 amino acids in length, such as at least about 30 amino acids in length, alternatively at least about 40 amino acids in length, alternatively at least about 50 amino acids in length, alternatively at least about 60 amino acids in length, alternatively at least about 70 amino acids in length, alternatively at least about 80 amino acids in length, alternatively at least about 90 amino acids in length, alternatively at least about 100 amino acids in length, alternatively at least about 150 amino acids in length, alternatively at least about 200 amino acids in length, alternatively at least about 300 amino acids in length or more.

Особенно предпочтительные варианты включают замены, которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые объединены по их боковым цепям. В частности, аминокислоты обычно делят на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, достаточно обосновано предсказание о том, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или схожая консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет важного влияния на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может включать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или даже вплоть до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое число от 5 до 50 при условии, что желаемая функция молекулы остается незатронутой.Particularly preferred variants include substitutions that are conservative in nature, i.e., those substitutions that occur within a family of amino acids that are grouped together by their side chains. In particular, amino acids are usually divided into four families: (1) acidic - aspartate and glutamate; (2) basic - lysine, arginine, histidine; (3) nonpolar - alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4) uncharged polar - glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine. Phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids. For example, it is reasonably predictable that a selected substitution of leucine for isoleucine or valine, aspartate for glutamate, threonine for serine, or a similar conservative substitution of an amino acid for a structurally related amino acid will not have an important effect on biological activity. For example, a polypeptide of interest may include up to about 5-10 conservative or non-conservative amino acid substitutions, or even up to about 15-25 or 50 conservative or non-conservative amino acid substitutions, or any number from 5 to 50, so long as the desired function of the molecule remains intact.

«Гомология» относится к проценту идентичности двух полинуклеотидных или двух полипептидных фрагментов. Две последовательности ДНК или две полипептидные последовательности являются «по существу гомологичными» друг другу, когда последовательности обладают по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%-85%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%-98% идентичностью последовательностей на протяжении молекул определенной длины. Как используется в настоящем документе, термин по существу гомологичная также относится к последовательности, которая обладает полной идентичностью с точно определенной последовательностью ДНК или полипептида."Homology" refers to the percentage identity of two polynucleotide fragments or two polypeptide fragments. Two DNA sequences or two polypeptide sequences are "substantially homologous" to each other when the sequences have at least about 50%, preferably at least about 75%, more preferably at least about 80%-85%, preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95%-98% sequence identity over a given molecule length. As used herein, the term substantially homologous also refers to a sequence that has complete identity to a specified DNA or polypeptide sequence.

Как правило, «идентичность» относится к точному соответствию нуклеотид-в-нуклеотид или аминокислота-в-аминокислоту двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, соответственно. Процент идентичности можно определить прямым сравнением информации о последовательности для двух молекул посредством выравнивания последовательностей, подсчета точного числа совпадений между двумя выровненными последовательностями, деления на длину более короткой последовательности и умножения результата на 100. Для облегчения этого анализа можно использовать легко доступные компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, в которой адаптирован алгоритм локальной гомологии Smith and Waterаman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 для пептидного анализа. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (доступен в Genetics Computer Group, Madison, WI), например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также основаны на алгоритме Смита-Ватермана. Эти программы легко использовать с параметрами по умолчанию, которые рекомендованы производителем и описаны в Wisconsin Sequence Analysis Package, который указан выше. Например, процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности относительно эталонной последовательности можно определить с помощью алгоритма гомологии Смита-Ватермана, в котором используют по умолчанию матрицу замен и штраф за пропуск шести положений нуклеотидов.Generally, "identity" refers to the exact nucleotide-to-nucleotide or amino acid-to-amino acid correspondence of two polynucleotide or polypeptide sequences, respectively. Percent identity can be determined by directly comparing the sequence information for two molecules by aligning the sequences, counting the exact number of matches between the two aligned sequences, dividing by the length of the shorter sequence, and multiplying the result by 100. Readily available computer programs such as ALIGN, Dayhoff, MO in Atlas of Protein Sequence and Structure MO Dayhoff ed., 5 Suppl. 3 :353–358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, which adapts the local homology algorithm of Smith and Waterаman Advances in Appl. Math . 2 :482–489, 1981 for peptide analysis, can be used to facilitate this analysis. Programs for determining nucleotide sequence identity are available in the Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (available from Genetics Computer Group, Madison, WI), such as BESTFIT, FASTA, and GAP, which are also based on the Smith-Waterman algorithm. These programs are easy to use with the default parameters recommended by the manufacturer and described in the Wisconsin Sequence Analysis Package listed above. For example, the percent identity of a particular nucleotide sequence to a reference sequence can be determined using the Smith-Waterman homology algorithm, which uses a default substitution matrix and a penalty for missing six nucleotide positions.

Другой способ определения процента идентичности в контексте настоящего изобретения заключается в использовании пакета программ MPSRCH, права на который принадлежат University of Edinburgh, разработанного John F. Collins и Shane S. Sturrok и распространяемого компанией IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Из этого набора пакетов можно использовать алгоритм Смита-Ватермана с параметрами по умолчанию для матрицы замен (например, штраф за открытие пропуска 12, штраф за продолжение пропуска один и пропуск шесть). В генерируемых данных значение «Match» отражает «идентичность последовательностей». Другие подходящие программы для вычисления процента идентичности или сходства между последовательностями в целом известны в данной области, например, другой программой выравнивания является BLAST, который используют с параметрами по умолчанию. Например, можно использовать BLASTN и BLASTP со следующими параметрами по умолчанию: генетический код = стандартный; фильтр = нет; нить = обе; порог = 60; ожидаемое = 10; матрица = BLOSUM62; описания = 50 последовательностей; сортировка по = наивысшей оценке; базы данных = не избыточные, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + трансляция GenBank CDS + Swiss protein + Spupdate + PIR. Подробности об этих программах хорошо известны в данной области.Another method for determining percent identity in the context of the present invention is to use the MPSRCH software package, copyrighted by the University of Edinburgh, developed by John F. Collins and Shane S. Sturrok, and distributed by IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). From this set of packages, the Smith-Waterman algorithm can be used with default parameters for the substitution matrix (e.g., a gap opening penalty of 12, a gap extension penalty of one, and a gap of six). In the generated data, the "Match" value reflects "sequence identity". Other suitable programs for calculating percent identity or similarity between sequences are generally known in the art, for example, another alignment program is BLAST, which is used with default parameters. For example, BLASTN and BLASTP can be used with the following default parameters: genetic code = standard; filter = none; strand = both; threshold = 60; expected = 10; matrix = BLOSUM62; descriptions = 50 sequences; sort by = highest score; databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translation + Swiss protein + Spupdate + PIR. Details of these programs are well known in the field.

Альтернативно, гомологию можно определить гибридизацией полинуклеотидов в условиях, допускающих образование стабильных дуплексов между гомологичными областями, с последующим расщеплением нуклеазой(ами) со специфичностью к одноцепочечной нуклеиновой кислоте, и определением размеров расщепленных фрагментов. По существу гомологичные последовательности ДНК можно идентифицировать в гибридизации по Саузерну, например, в строгих условиях, как определено для этой конкретной системы. Определение соответствующих условий гибридизации известно специалистам в данной области. См., например, Sambrook et al., выше; DNA Cloning, выше; Nucleic Acids Hybridization, выше.Alternatively, homology can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions that permit the formation of stable duplexes between homologous regions, followed by digestion with nuclease(s) with specificity for single-stranded nucleic acid, and determination of the sizes of the digested fragments. Substantially homologous DNA sequences can be identified by Southern hybridization, for example, under stringent conditions as defined for that particular system. Determination of appropriate hybridization conditions is known to those skilled in the art. See, for example, Sambrook et al., supra; DNA Cloning , supra; Nucleic Acids Hybridization , supra.

Под термином «вырожденный вариант» понимают полинуклеотид, содержащий изменения в своей последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый тем полинуклеотидом, из которого вырожденный вариант получен.The term "degenerate variant" refers to a polynucleotide containing changes in its nucleic acid sequence that encodes a polypeptide having the same amino acid sequence as the polypeptide encoded by the polynucleotide from which the degenerate variant is obtained.

«Кодирующая последовательность» или последовательность, которая «кодирует» выбранный полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, транскрипция (в случае ДНК) и трансляция (в случае мРНК) которой ведет к образованию полипептида in vivo, когда она находится под управлением соответствующих последовательностей регуляции. Границы кодирующей последовательности определены инициирующим кодоном на 5’-конце (N-конце) и терминирующим трансляцию кодоном на 3’-конце (C-конце). Последовательность терминации транскрипции может быть расположена ближе 3’-концу относительно кодирующей последовательности.The "coding sequence" or sequence that "encodes" the selected polypeptide is a nucleic acid molecule whose transcription (in the case of DNA) and translation (in the case of mRNA) leads to the formation of the polypeptide in vivo when under the control of appropriate regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are defined by an initiation codon at the 5' end (N-terminus) and a translation termination codon at the 3' end (C-terminus). A transcription termination sequence may be located 3' relative to the coding sequence.

Под «вектором» понимают любой генетический элемент, такой как плазмида, фаг, транспозон, космида, хромосома, вирус, вирион и т.д., который способен к репликации, если он связан с подходящими управляющими элементами, и который может переносить последовательности генов в клетки. Таким образом, термин включает клонирующие и экспрессирующие носители, а также вирусные векторы.By "vector" is meant any genetic element, such as a plasmid, phage, transposon, cosmid, chromosome, virus, virion, etc., which is capable of replication when linked to suitable control elements and which can transfer gene sequences into cells. The term thus includes cloning and expression vehicles as well as viral vectors.

Под «рекомбинантным вектором» понимают вектор, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, которая способна к экспрессии in vivo.A "recombinant vector" is a vector that contains a heterologous nucleic acid sequence that is capable of expression in vivo .

Под «рекомбинантным вирусом» понимают вирус, который генетически изменен, например, вставкой или инсерцией гетерологичной конструкции нуклеиновой кислоты в частицу.A "recombinant virus" is a virus that has been genetically altered, such as by inserting or inserting a heterologous nucleic acid construct into the particle.

Термин «трансген» относится к полинуклеотиду, который вводят в клетку и который способен к транскрипции в РНК и, необязательно, трансляции и/или экспрессии в соответствующих условиях. В одном из аспектов он придает желаемое свойство той клетке, в которую его ввели, или иным образом ведет к желаемому терапевтическому или диагностическому исходу.The term "transgene" refers to a polynucleotide that is introduced into a cell and that is capable of being transcribed into RNA and, optionally, translated and/or expressed under appropriate conditions. In one aspect, it confers a desired property on the cell into which it is introduced or otherwise leads to a desired therapeutic or diagnostic outcome.

Термины «геномные частицы (гч)» или «эквиваленты генома», как используется в отношении вирусного титра, относятся к числу вирионов, содержащих геномную ДНК рекомбинантного AAV, независимо от инфекционности или функциональности. Число геномных частиц в конкретном препарате вектора можно измерить посредством процедур, таких как описано в настоящем документе в примерах или, например, в публикациях Clark et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1031-1039; и Veldwijk et al., Mol. Ther. (2002) 6:272-278.The terms "genomic particles (gp)" or "genome equivalents" as used in reference to viral titer refer to the number of virions containing recombinant AAV genomic DNA, regardless of infectivity or functionality. The number of genomic particles in a particular vector preparation can be measured by procedures such as those described in the Examples herein or, for example, in Clark et al., Hum. Gene Ther . (1999) 10 :1031-1039; and Veldwijk et al., Mol. Ther . (2002) 6 :272-278.

Термины «инфекционная единица» (ие), «инфекционная частица» или «репликационная единица», как используется в отношении вирусного титра, относятся к числу инфекционных частиц рекомбинантного вектора AAV, которое измеряют посредством анализа инфекционных центров, также известного как анализ репликационных центров, описанный, например, в публикации McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62:1963-1973.The terms "infectious unit"(s), "infectious particle" or "replication unit" as used in reference to viral titer refer to the number of infectious particles of a recombinant AAV vector as measured by the infectious center assay, also known as the replication center assay, described, for example, in McLaughlin et al., J. Virol . (1988) 62 :1963-1973.

Термин «трансдуцирующая единица» (те), как используется в отношении вирусного титра, относится к числу инфекционных частиц рекомбинантного вектора AAV, которые ведут к образованию функционального продукта трансгена, как измеряется в функциональных анализах, таких как описано в примерах в настоящем документе или, например, в публикации Xiao et al., Exp. Neurobiol. (1997) 144:113-124; или в публикации Fisher et al., J. Virol. (1996) 70:520-532 (анализ LFU).The term "transducing unit" (te), as used in reference to viral titer, refers to the number of infectious particles of a recombinant AAV vector that result in the formation of a functional transgene product, as measured in functional assays such as those described in the examples herein or, for example, in Xiao et al., Exp. Neurobiol . (1997) 144 :113-124; or in Fisher et al., J. Virol . (1996) 70 :520-532 (LFU assay).

Термин «трансфекция» используют для обозначения захвата чужеродной ДНК клеткой, а клетку «трансфицируют», когда экзогенную ДНК вводят внутрь клеточной мембраны. В данной области в целом известно множество способов трансфекции. См., например, публикации Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, и Chu et al. (1981) Gene 13:197. Такие способы можно использовать для введения одного или нескольких фрагментов экзогенной ДНК в подходящие клетки-хозяева.The term "transfection" is used to refer to the uptake of foreign DNA into a cell, and a cell is "transfected" when exogenous DNA is introduced into the cell membrane. Many transfection techniques are known in the art as a whole. See, for example, Graham et al. (1973) Virology , 52 :456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology , Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13 :197. Such techniques can be used to introduce one or more fragments of exogenous DNA into suitable host cells.

Термин «гетерологичный», когда он относится к последовательностям нуклеиновых кислот, таким как кодирующие последовательности и последовательности регуляции, обозначает последовательности, которые обычно не соединены вместе и/или обычно не связаны с конкретной клеткой. Таким образом, «гетерологичная» область конструкции нуклеиновой кислоты или вектора представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, расположенный внутри или присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты, которая в природе не найдена совместно с другой молекулой. Например, гетерологичная область конструкции нуклеиновой кислоты может содержать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, которые в природе не найдены совместно с кодирующей последовательностью. Другой пример гетерологичной кодирующей последовательности представляет собой конструкцию, где сама кодирующая последовательность не найдена в природе (например, синтетические последовательности, которые содержат кодоны, отличные от нативного гена). Аналогичным образом, клетку, трансформированную конструкцией, которая обычно не присутствует в клетке, будут считать гетерологичной для целей данного изобретения. Аллельное разнообразие или природные мутационные события не являются источником гетерологичных ДНК, как используется в настоящем документе.The term "heterologous" when referring to nucleic acid sequences such as coding sequences and regulatory sequences refers to sequences that are not normally linked together and/or not normally associated with a particular cell. Thus, a "heterologous" region of a nucleic acid construct or vector is a nucleic acid fragment located within or attached to another nucleic acid molecule that is not naturally found in association with the other molecule. For example, a heterologous region of a nucleic acid construct may comprise a coding sequence flanked by sequences that are not naturally found in association with the coding sequence. Another example of a heterologous coding sequence is a construct where the coding sequence itself is not found in nature (e.g., synthetic sequences that contain codons different from the native gene). Likewise, a cell transformed with a construct that is not normally present in the cell will be considered heterologous for the purposes of this invention. Allelic diversity or natural mutational events are not the source of heterologous DNA as used herein.

Последовательность «нуклеиновой кислоты» относится к последовательности ДНК или РНК. Термин охватывает последовательности, которые содержат любые известные аналоги оснований ДНК и РНК, такие как, но без ограничения, 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметил-аминометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентиладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5’-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир -урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин.A "nucleic acid" sequence refers to a DNA or RNA sequence. The term encompasses sequences that contain any known DNA and RNA base analogs such as, but not limited to, 4-acetylcytosine, 8-hydroxy-N6-methyladenosine, aziridinylcytosine, pseudoisocytosine, 5-(carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethyl-aminomethyluracil, dihydrouracil, inosine, N6-isopentyl adenine, 1-methyladenine, 1-methylpseudouracil, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-methyladenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosin, 5'-methoxycarbonylmethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, methyl uracil-5-hydroxyacetic acid, uracil-5-hydroxyacetic acid, oxybutoxosin, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, methyl uracil-5-hydroxyacetic acid , uracil-5-hydroxyacetic acid, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosine and 2,6-diaminopurine.

Термин «последовательности регуляции» ДНК в совокупности относится к промоторным последовательностям, сигналам полиаденилирования, последовательностям терминации транскрипции, вышележащим регуляторным доменам, участкам начала репликации, внутренним участкам связывания рибосом («IRES»), энхансерам и т.п., которые в совокупности предоставлены для репликации, транскрипции и трансляции кодирующей последовательности в клетке-реципиенте. Не все эти последовательности регуляции должны всегда присутствовать, при условии, что выбранная кодирующая последовательность способна к репликации, транскрипции и трансляции в соответствующей клетке-хозяине.The term "regulatory sequences" of DNA collectively refers to promoter sequences, polyadenylation signals, transcription termination sequences, upstream regulatory domains, replication origins, internal ribosome entry sites ("IRES"), enhancers, etc., which collectively provide for the replication, transcription, and translation of the coding sequence in the recipient cell. Not all of these regulatory sequences need always be present, so long as the coding sequence selected is capable of replication, transcription, and translation in the appropriate host cell.

Термин «промотор» используют в настоящем документе в его обычном смысле для обозначения нуклеотидной области, содержащей регуляторную последовательность ДНК, где регуляторную последовательность получают из гена, который способен к связыванию РНК-полимеразы и инициации транскрипции нижележащей (в направлении 3’-конца) кодирующей последовательности. Транскрипционные промоторы могут включать «индуцибельные промоторы» (где экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируют с использованием анализируемого вещества, кофактора, регуляторного белка и т.д.), «репрессируемые промоторы» (где экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируют с использованием анализируемого вещества, кофактора, регуляторного белка и т.д.) и «конститутивные промоторы».The term "promoter" is used herein in its usual sense to refer to a nucleotide region containing a regulatory sequence of DNA, wherein the regulatory sequence is derived from a gene that is capable of binding RNA polymerase and initiating transcription of a downstream (3') coding sequence. Transcriptional promoters may include "inducible promoters" (wherein expression of a polynucleotide sequence operably linked to the promoter is induced using an analyte, cofactor, regulatory protein, etc.), "repressible promoters" (wherein expression of a polynucleotide sequence operably linked to the promoter is induced using an analyte, cofactor, regulatory protein, etc.), and "constitutive promoters".

«Функционально связанный» относится к расположению элементов, где описанные таким образом компоненты выполнены с возможностью осуществления своей обычной функции. Таким образом, последовательности регуляции, функционально связанные с кодирующей последовательностью, способны осуществлять экспрессию кодирующей последовательности. Последовательности регуляции не обязательно прилегают к кодирующей последовательности при условии, что их функция состоит в управлении ее экспрессией. Таким образом, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут присутствовать, например, промежуточные не транслируемые, но транскрибируемые последовательности, и промоторную последовательность все еще можно считать «функционально связанной» с кодирующей последовательностью."Operably linked" refers to an arrangement of elements where the components so described are capable of performing their usual function. Thus, regulatory sequences operably linked to a coding sequence are capable of effecting the expression of the coding sequence. The regulatory sequences are not necessarily adjacent to the coding sequence, provided that their function is to control its expression. Thus, between the promoter sequence and the coding sequence, for example, there may be intervening untranslated but transcribed sequences, and the promoter sequence may still be considered "operably linked" to the coding sequence.

Термин «нервная система» включает как центральную нервную систему, так и периферическую нервную систему. Термин «центральная нервная система» или «ЦНС» включает все клетки и ткани головного мозга и спинного мозга позвоночных. Термин «периферическая нервная система» относится ко всем клеткам и тканям части нервной системы за пределами головного мозга и спинного мозга. Таким образом, термин «нервная система» включает, но не ограничивается ими, нервные клетки, глиальные клетки, астроциты, клетки в спинномозговой жидкости (CSF), клетки в интерстициальном пространстве, клетки в защитных оболочках спинного мозга, эпидуральные клетки (т.е. клетки за пределами твердой мозговой оболочки), клетки не из нервной ткани, прилегающие к или находящиеся в контакте с или иннервируемые нервной тканью, клетки в эпиневрии, периневрии, эндоневрии, канатики, пучки и т.п.The term "nervous system" includes both the central nervous system and the peripheral nervous system. The term "central nervous system" or "CNS" includes all of the cells and tissues of the brain and spinal cord of vertebrates. The term "peripheral nervous system" refers to all of the cells and tissues of the portion of the nervous system outside of the brain and spinal cord. Thus, the term "nervous system" includes, but is not limited to, nerve cells, glial cells, astrocytes, cells in the cerebrospinal fluid (CSF), cells in the interstitial space, cells in the protective membranes of the spinal cord, epidural cells (i.e., cells outside the dura mater), non-nervous tissue cells adjacent to, in contact with, or innervated by nervous tissue, cells in the epineurium, perineurium, endoneurium, funiculi, fasciculi, etc.

«Активный» или «активность» для целей настоящего изобретения относится к формам терапевтического белка, которые сохраняют биологическую активность соответствующего нативного или природного полипептида. Активность может быть выше, равна или ниже, чем наблюдаемая у соответствующего нативного или природного полипептида."Active" or "activity" for the purposes of the present invention refers to forms of a therapeutic protein that retain the biological activity of the corresponding native or naturally occurring polypeptide. The activity may be greater than, equal to, or lower than that observed in the corresponding native or naturally occurring polypeptide.

Под «выделенной», когда говорят о нуклеотидной последовательности, понимают, что указанная молекула присутствует по существу без других биологических макромолекул того же типа. Таким образом, «выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный полипептид», относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая по существу свободна от других молекул нуклеиновой кислоты, которые не кодируют рассматриваемый полипептид; однако молекула может содержать некоторые дополнительные основания или фрагменты, которые не оказывают вредного воздействия на основную характеристику композиции.By "isolated" when speaking of a nucleotide sequence is meant that the molecule in question is present substantially free of other biological macromolecules of the same type. Thus, an "isolated nucleic acid molecule that encodes a particular polypeptide" refers to a nucleic acid molecule that is substantially free of other nucleic acid molecules that do not encode the polypeptide in question; however, the molecule may contain some additional bases or moieties that do not adversely affect the essential characteristic of the composition.

С целью описания относительного положения нуклеотидных последовательностей в конкретной молекуле нуклеиновой кислоты на всем протяжении настоящей заявки, например, если конкретную нуклеотидную последовательность описывают как расположенную «выше», «ниже», «3-штрих (3’)» или «5-штрих (5’)» относительно другой последовательности, то следует понимать, что это означает положение последовательностей в «смысловой» или «кодирующей» цепи молекулы ДНК, что является стандартом в данной области.For the purpose of describing the relative positions of nucleotide sequences in a particular nucleic acid molecule throughout this application, for example, if a particular nucleotide sequence is described as being located "upstream," "downstream," "3-prime (3')," or "5-prime (5')" relative to another sequence, this is to be understood to mean the position of the sequences in the "sense" or "coding" strand of the DNA molecule, which is standard in the art.

Под термином «приблизительно», в частности, в отношении заданной величины, понимают, что он включает отклонение в ±5%.The term "approximately", particularly with respect to a given quantity, is understood to include a deviation of ±5%.

Термины «субъект», «индивидуум» или «пациент» используют взаимозаменяемо в настоящем документе и относят к позвоночному, предпочтительно, к млекопитающему. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, мышиных, грызунов, обезьян, человека, сельскохозяйственных животных, спортивных и домашних животных.The terms "subject," "individual," or "patient" are used interchangeably herein and refer to a vertebrate, preferably a mammal. Mammals include, but are not limited to, mice, rodents, monkeys, humans, farm animals, sport animals, and pets.

Термин «модулировать» в настоящем документе обозначает изменение количества или интенсивности эффекта или исхода, например, усиление, увеличение, ослабление, уменьшение или устранение.The term "modulate" as used herein means changing the amount or intensity of an effect or outcome, such as enhancing, increasing, weakening, decreasing, or eliminating.

В настоящем документе термин «уменьшить интенсивность» является синонимом «облегчать» и обозначает уменьшение или смягчение. Например, можно уменьшить интенсивность симптомов заболевания или нарушения, сделав заболевание или симптомы заболевания менее тяжелыми.In this document, the term "ameliorate" is synonymous with "alleviate" and means to reduce or alleviate. For example, one may reduce the intensity of the symptoms of a disease or disorder by making the disease or symptoms of the disease less severe.

Термины «терапевтическая», «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» композиции или средства в настоящем документе относятся к достаточному количеству композиции или агента, чтобы обеспечить желаемый ответ, такой как предупреждение, задержку начала или уменьшение интенсивности симптомов у субъекта, или достижение желаемого биологического исхода, такого как коррекция неврологической патологии, например, клеточной патологии, связанной с заболеванием двигательных нейронов, таким как спинальная мышечная атрофия (SMA). Термин «терапевтическая коррекция» относится к той степени коррекции, которая ведет к предупреждению или задержке начала или уменьшению интенсивности симптомов у субъекта. Точное необходимое количество будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести состояния, подлежащего лечению, и конкретной макромолекулы, представляющей интерес, способа введения и т.п. Соответствующее «эффективное» количество в каждом отдельном случае может определить специалист в данной области, используя повседневные эксперименты.The terms "therapeutic", "effective amount" or "therapeutically effective amount" of a composition or agent as used herein refer to a sufficient amount of the composition or agent to provide a desired response, such as preventing, delaying the onset of, or reducing the intensity of symptoms in a subject, or to achieve a desired biological outcome, such as correcting a neurological pathology, for example, a cellular pathology associated with a motor neuron disease such as spinal muscular atrophy (SMA). The term "therapeutic correction" refers to the degree of correction that leads to preventing or delaying the onset of, or reducing the intensity of symptoms in a subject. The exact amount required will vary from subject to subject, depending on the species, age, and general condition of the subject, the severity of the condition being treated, and the particular macromolecule of interest, the route of administration, etc. The appropriate "effective" amount in each individual case can be determined by one of skill in the art using routine experimentation.

«Лечение» конкретного заболевания включает: (1) предупреждение заболевания, т.е. предупреждение развития заболевания или снижение интенсивности заболевания у субъекта, который может быть подвержен или предрасположен к заболеванию, но пока не испытывает или не проявляет симптомов заболевания, (2) подавление заболевания, т.е. купирование развития или обращение состояния заболевания, или (3) облегчение симптомов заболевания, т.е. снижение числа симптомов, испытываемых субъектом, а также изменение клеточной патологии, связанной с заболеванием."Treating" a particular disease includes: (1) preventing the disease, i.e., preventing the development of the disease or reducing the intensity of the disease in a subject who may be susceptible or predisposed to the disease but does not yet experience or exhibit symptoms of the disease, (2) suppressing the disease, i.e., arresting the progression or reversing the condition of the disease, or (3) alleviating the symptoms of the disease, i.e., reducing the number of symptoms experienced by the subject as well as reversing the cellular pathology associated with the disease.

2. Способы осуществления изобретения2. Methods for implementing the invention

Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понять, что данное изобретение не ограничено конкретными составами или параметрами процесса, поскольку их, конечно, можно менять. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология служит только цели описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения.Before describing the present invention in detail, it should be understood that the present invention is not limited to specific compositions or process parameters, as these can, of course, be varied. It should also be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments of the invention only and is not intended to be limiting.

Несмотря на то, что можно использовать множество способов и веществ, схожих с теми, что описаны в настоящем документе, или эквивалентных им, в настоящем документе описаны вещества и способы, предпочтительные для осуществления настоящего изобретения на практике.Although many methods and materials similar to or equivalent to those described herein can be used, the materials and methods described herein are preferred for practicing the present invention.

Центральным для настоящего изобретения является открытие того, что доставка вирионов rAAV, содержащих кДНК гена выживаемости двигательных нейронов 1 человека (hSMN1), в ЦНС в агрессивной модели спинальной мышечной атрофии (SMA) на мышах, вызывала экспрессию SMN1 на всем протяжении спинного мозга. Мыши с SMA, получавшие лечение, содержали большее число двигательных нейронов по сравнению с мутантами с совпадающим возрастом, не получавшими лечение. Кроме того, оценка размера мышечных волокон показывала, что размер отдельных мышечных волокон в различных мышечных группах у мышей с SMA, получавших лечение, приближался к наблюдаемому у мышей дикого типа. Кроме того, структура нервно-мышечного соединения (NMJ) у мышей с SMA, получавших лечение, схожа с мышами дикого типа, что отличалось от мышей с SMA, не получавших лечение, которые демонстрировали аномальное накопление белка нейрофиламента в пресинаптических терминалях. Мыши с SMA, получавшие лечение, также проявляли значительные улучшения в комплексе поведенческих тестов, что указывает на функциональность NMJ. Важно, что мыши, которых лечили рекомбинантным AAV, обладали значительно увеличенной продолжительностью жизни по сравнению с их двойниками, не получавшими лечение. Мыши с SMA, которых лечили с использованием самокомплементарного вектора rAAV, также проявляли заметное улучшение среднего значения выживаемости, даже по сравнению с лечением путем использования стандартных не самокомплементарных векторов rAAV.Central to the present invention is the discovery that delivery of rAAV virions containing the human survival motor neuron 1 (hSMN1) gene cDNA to the CNS in an aggressive mouse model of spinal muscular atrophy (SMA) induced SMN1 expression throughout the spinal cord. Treated SMA mice contained a greater number of motor neurons compared to age-matched untreated mutants. Furthermore, assessment of muscle fiber size showed that the size of individual muscle fibers in different muscle groups in treated SMA mice approached that observed in wild-type mice. Furthermore, the neuromuscular junction (NMJ) structure in treated SMA mice was similar to that of wild-type mice, which differed from untreated SMA mice, which exhibited abnormal accumulation of neurofilament protein at presynaptic terminals. Treated SMA mice also showed significant improvements in a battery of behavioral tests, indicating NMJ functionality. Importantly, mice treated with recombinant AAV had significantly increased lifespan compared to their untreated counterparts. SMA mice treated with the self-complementary rAAV vector also showed a marked improvement in median survival, even compared to treatment with standard, non-self-complementary rAAV vectors.

Эти результаты демонстрируют, что направленное на ЦНС, опосредованное AAV усиление гена SMN1 является высокоэффективным в отношении как нейрональных, так и мышечных патологий SMA и свидетельствуют о полезности вирусной генной терапии в качестве терапевтической стратегии для лечения и предотвращения нейрональных и мышечных патологий, таких как SMA, а также других заболеваний, которые влияют на двигательную функцию. Описанные в настоящем документе способы генной терапии можно использовать отдельно или в сочетании с традиционными лекарственными средствами.These results demonstrate that CNS-targeted AAV-mediated SMN1 gene enhancement is highly effective against both neuronal and muscle pathologies of SMA and suggest the utility of viral gene therapy as a therapeutic strategy for the treatment and prevention of neuronal and muscle pathologies such as SMA, as well as other diseases that affect motor function. The gene therapy methods described herein can be used alone or in combination with traditional therapeutics.

Для того чтобы более глубоко понять изобретение, ниже приведено более подробное обсуждение, касающееся патологий двигательных нейронов и терапевтических молекул, а также различных способов доставки генов для использования с настоящим изобретением.In order to more fully understand the invention, a more detailed discussion is provided below regarding motor neuron pathologies and therapeutic molecules, as well as various gene delivery methods for use with the present invention.

Патологии двигательных нейронов и терапевтические молекулыMotor neuron pathologies and therapeutic molecules

Рассматриваемое изобретение предусматривает композиции и способы для модуляции, коррекции или усиления двигательной функции у субъекта, пораженного нарушением двигательных нейронов или расстройством двигательных нейронов. Только с иллюстративной целью, субъект может страдать одним или несколькими из спинальной мышечной атрофии (SMA), бокового амиотрофического склероза (ALS), спинобульбарной мышечной атрофии, спиноцеребеллярной атаксии, первичного латерального склероза (PLS) или травматического повреждения спинного мозга. Не ограничиваясь конкретной теорией, патология, связанная с повреждением двигательных нейронов, может включать дегенерацию двигательных нейронов, глиоз, аномалии нейрофиламентов, потерю миелинизированных волокон в корково-спинномозговых путях и передних корешках. Например, выявлено два типа начала - бульбарное начало, которое поражает верхние двигательные нейроны (двигательные нейроны коры и ствола головного мозга), поражает мимические мышцы, речь и глотание; и начало в конечностях, поражающее расположенные ниже двигательные нейроны (двигательные нейроны спинного мозга), которое отражено в спазмах, общей слабости, мышечной атрофии, параличе и дыхательной недостаточности. При ALS у субъектов бывает как бульбарное начало, так и начало в конечностях. При PLS у субъектов бывает только бульбарное начало.The subject invention provides compositions and methods for modulating, correcting or enhancing motor function in a subject affected by a motor neuron disorder or a motor neuron disorder. For illustrative purposes only, the subject may suffer from one or more of spinal muscular atrophy (SMA), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), spinobulbar muscular atrophy, spinocerebellar ataxia, primary lateral sclerosis (PLS) or traumatic spinal cord injury. Without being limited by a particular theory, the pathology associated with motor neuron injury may include motor neuron degeneration, gliosis, neurofilament abnormalities, loss of myelinated fibers in the corticospinal tracts and anterior roots. For example, two types of onset have been identified - bulbar onset, which affects upper motor neurons (motor neurons of the cortex and brainstem), affecting facial muscles, speech, and swallowing; and limb onset, which affects lower motor neurons (motor neurons of the spinal cord), which is reflected in spasms, general weakness, muscle atrophy, paralysis, and respiratory failure. In ALS, subjects have both bulbar onset and limb onset. In PLS, subjects have only bulbar onset.

Таким образом, в определенных вариантах осуществления субъекту предоставляют конструкции rAAV, которые кодируют биологически активную молекулу, экспрессия которой в ЦНС ведет по меньшей мере к частичной коррекции неврологической патологии и/или к стабилизации развития заболевания, такой как предупреждение, задержка начала или уменьшение интенсивности симптомов у субъекта или достижение желаемого биологического исхода, включая, например, изменение клеточной патологии, связанной с описанным выше заболеванием двигательных нейронов.Thus, in certain embodiments, a subject is provided with rAAV constructs that encode a biologically active molecule, the expression of which in the CNS leads to at least partial correction of neurological pathology and/or stabilization of disease progression, such as prevention, delay in the onset or reduction in the intensity of symptoms in the subject or achievement of a desired biological outcome, including, for example, reversal of cellular pathology associated with the motor neuron disease described above.

В качестве примера, трансген, присутствующий в конструкции rAAV, может представлять собой, но ими не ограничиваясь, белок выживаемости двигательных нейронов (посредством гена SMN1 или гена SMN2), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), кальбиндин D28, парвальбумин, HIF1-α, SIRT-2, VEGF, такой как VEGF165, CNTF (цилиарный нейротрофический фактор), соник хеджхога (shh), эритропоэтин (EPO), лизилоксидазу (LOX), програнулин, пролактин, грелин, нейросерпин, ангиогенин и лактоген плаценты.As an example, a transgene present in the rAAV construct may be, but is not limited to, motor neuron survival protein (via the SMN1 gene or the SMN2 gene), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), calbindin D28, parvalbumin, HIF1-α, SIRT-2, VEGF such as VEGF165, CNTF (ciliary neurotrophic factor), sonic hedgehog (shh), erythropoietin (EPO), lysyl oxidase (LOX), progranulin, prolactin, ghrelin, neuroserpin, angiogenin, and placental lactogen.

Молекулярная основа SMA, аутосомного рецессивного нервно-мышечного нарушения, заключается в гомозиготной потере гена выживаемости двигательных нейронов 1 (SMN1), который также может быть известен как теломерный SMN. Почти идентичная копия гена SMN1, названная SMN2, которая также может быть известна как центромерный SMN, найдена у человека и модулирует тяжесть заболевания. Экспрессия нормального гена SMN1 ведет только к экспрессии белка выживаемости двигательных нейронов (SMN). Экспрессия гена SMN2 ведет к образованию приблизительно 10-20% белка SMN и 80-90% нестабильного/нефункционального белка SMNdelta7. Только 10% транскриптов SMN2 кодируют функциональный полноразмерный белок, идентичный SMN1. Это функциональное различие между генами происходит из трансляционно молчащей мутации, которая, однако, разрушает экзонный энхансер сплайсинга, что обуславливает пропуск экзона 7 в большинстве транскриптов SMN2. Белок SMN играет точно установленную роль в сборке сплайсосомы, а также может опосредовать транспорт мРНК в аксоны и нервные окончания нейронов.The molecular basis of SMA, an autosomal recessive neuromuscular disorder, is the homozygous loss of the survival motor neuron 1 (SMN1) gene, which may also be known as telomeric SMN. A nearly identical copy of the SMN1 gene, called SMN2, which may also be known as centromeric SMN, is found in humans and modulates the severity of the disease. Expression of the normal SMN1 gene results in expression of survival motor neuron (SMN) protein only. Expression of the SMN2 gene results in approximately 10-20% SMN protein and 80-90% unstable/nonfunctional SMNdelta7 protein. Only 10% of SMN2 transcripts encode a functional full-length protein identical to SMN1. This functional difference between the genes results from a translationally silent mutation that, however, disrupts an exonic splicing enhancer, resulting in skipping of exon 7 in most SMN2 transcripts. SMN protein plays a well-defined role in spliceosome assembly and may also mediate mRNA transport into axons and nerve terminals of neurons.

Известны нуклеотидные и аминокислотные последовательности различных молекул SMN1 и белков SMN. См., например, фиг.9A-9B; NCBI номер доступа NM_000344 (человек), NP_000335 (человек), NM_011420 (мышь), EU 791616 (свинья), NM_001131470 (орангутан), NM_131191 (данио), BC062404 (крыса), NM_001009328 (кошка), NM_001003226 (собака), NM_175701 (корова). Также известны различные последовательности SMN2. См., например, NCBI номер доступа NM_022876, NM_022877, NM_017411, NG_008728, BC_000908, BC070242, DQ185039 (все относятся к человеку).The nucleotide and amino acid sequences of various SMN1 molecules and SMN proteins are known. See, for example, Figs. 9A-9B; NCBI accession number NM_000344 (human), NP_000335 (human), NM_011420 (mouse), EU 791616 (pig), NM_001131470 (orangutan), NM_131191 (zebrafish), BC062404 (rat), NM_001009328 (cat), NM_001003226 (dog), NM_175701 (cow). Various SMN2 sequences are also known. See, for example, NCBI accession numbers NM_022876, NM_022877, NM_017411, NG_008728, BC_000908, BC070242, DQ185039 (all refer to humans).

Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) представляет собой терапевтический белок для лечения нейродегенеративных нарушений, включая нарушения двигательных нейронов, благодаря его множественному действию на различных уровнях осевой части центральной нервной системы (см. Dore et al., Trends Neurosci (1997) 20:326-331). Например, полагают, что в головном мозге он снижает апоптоз нейронов и клеток глии, защищает нейроны от токсического действия, вызванного железом, колхицином, кальциевыми дестабилизаторами, пероксидами и цитокинами. По-видимому, он также модулирует высвобождение нейромедиаторов ацетилхолина и глутамата и индуцирует экспрессию нейрофиламента, тубулина и основного белка миелина. Полагают, что в спинном мозге IGF-1 модулирует активность ChAT и снижает потерю холинергического фенотипа, усиливает спрутинг двигательных нейронов, усиливает миелинизацию, ингибирует демиелинизацию, стимулирует пролиферацию и дифференциацию двигательных нейронов из клеток-предшественников и ускоряет деление, созревание и рост Шванновских клеток. В мышце IGF-1, по-видимому, индуцирует образование кластеров рецептора ацетилхолина в нервно-мышечном соединении и повышает нервно-мышечную функцию и мышечную силу.Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) is a therapeutic protein for the treatment of neurodegenerative disorders, including motor neuron disorders, because of its multiple actions at different levels of the axial central nervous system (see Dore et al., Trends Neurosci (1997) 20 :326–331). For example, in the brain, it is thought to reduce neuronal and glial cell apoptosis and protect neurons from toxic effects induced by iron, colchicine, calcium destabilizers, peroxides, and cytokines. It also appears to modulate the release of the neurotransmitters acetylcholine and glutamate and to induce the expression of neurofilament, tubulin, and myelin basic protein. In the spinal cord, IGF-1 is thought to modulate ChAT activity and reduce the loss of the cholinergic phenotype, enhance motor neuron sprouting, enhance myelination, inhibit demyelination, stimulate motor neuron proliferation and differentiation from progenitor cells, and accelerate Schwann cell division, maturation, and growth. In muscle, IGF-1 appears to induce acetylcholine receptor clustering at the neuromuscular junction and enhance neuromuscular function and muscle strength.

Ген IGF-1 имеет сложную структуру, которая хорошо известна в данной области. Он имеет по меньшей мере два продукта альтернативного сплайсинга мРНК, образуемых из транскрипта гена. Это пептид из 153 аминокислот, известный под несколькими названиями, включая IGF-IA или IGF-IEa, и пептид из 195 аминокислот, известный под несколькими названиями, включая IGF-IB или IGF-IEb. У человека форма Eb также известна как Ec. Зрелая форма IGF-I представляет собой полипептид из 70 аминокислот. Как IGF-IEa, так и IGF-IEb содержат зрелый пептид из 70 аминокислот, но отличаются последовательностью и длиной их C-концевых удлинений. Белки IGF-1, а также пептидные последовательности IGF-IEa и IGF-IEb известны и описаны, например, в международной публикации № WO 2007/146046, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Геномные и функциональные кДНК IGF-I человека, а также дополнительную информацию относительно гена IGF-I и его продуктов можно получить по номеру доступа Unigene NM_000618.The IGF-1 gene has a complex structure that is well known in the art. It has at least two alternatively spliced mRNA products formed from the gene transcript. These are a 153-amino acid peptide known by several names, including IGF-IA or IGF-IEa, and a 195-amino acid peptide known by several names, including IGF-IB or IGF-IEb. In humans, the Eb form is also known as Ec. The mature form of IGF-I is a 70-amino acid polypeptide. Both IGF-IEa and IGF-IEb contain a 70-amino acid mature peptide, but differ in the sequence and length of their C-terminal extensions. IGF-1 proteins and the peptide sequences of IGF-IEa and IGF-IEb are known and described, for example, in International Publication No. WO 2007/146046, which is incorporated herein by reference in its entirety. Genomic and functional cDNAs of human IGF-I, as well as additional information regarding the IGF-I gene and its products, can be obtained from Unigene accession number NM_000618.

Кальбиндин D28K (также обозначаемый как кальбиндин D28) и парвальбумин представляют собой кальций-связывающие белки, которые предположительно участвуют в буферизации кальция. Не ограничиваясь конкретной теорией, по-видимому, у субъектов с нарушением двигательных нейронов (например, с ALS) изменяется гомеостаз кальция, и низкие уровни кальбиндина-D28K и/или парвальбумина могут повысить уязвимость двигательных нейронов путем снижения их способности справляться с повышенной кальциевой нагрузкой. Это снижение может вести к повреждению клеток и возможной гибели двигательных нейронов. Дополнительные факты подсказывают, что нейроны с высоким содержанием кальций-связывающих белков, таких как кальбиндин D28K и парвальбумин, устойчивы к дегенерации.Calbindin D28K (also referred to as calbindin D28) and parvalbumin are calcium-binding proteins that are thought to be involved in calcium buffering. Without being bound by a particular theory, it appears that calcium homeostasis is altered in subjects with motor neuron disorders (e.g., ALS), and low levels of calbindin D28K and/or parvalbumin may increase the vulnerability of motor neurons by reducing their ability to handle increased calcium loads. This reduction may lead to cell damage and eventual motor neuron death. Additional evidence suggests that neurons with high levels of calcium-binding proteins such as calbindin D28K and parvalbumin are resistant to degeneration.

HIF-I представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух субъединиц: (i) конститутивно экспрессируемой субъединицы β, также известной как ядерный транслокатор арилуглеводородного рецептора (ARNT) (который совместно используют другие родственные факторы транскрипции (например, диоксин/арилуглеводородный рецептор (DR/AhR)); и (ii) субъединицы α (см., например, международную публикацию № WO 96/39426, описание новой аффинной очистки и молекулярного клонирования HIF-Iα. Обе субъединицы являются членами семейства факторов транскрипции с основным мотивом спираль-петля-спираль (bHLH)-PAS. Эти домены регулируют связывание и димеризацию ДНК. Домен трансактивации расположен на C-конце белка. Основная область состоит приблизительно из 15 преимущественно основных аминокислот, отвечающих за непосредственное связывание ДНК. Эта область прилегает к двум амфипатическим α-спиралям, разделенным петлей переменной длины, которая формирует область контакта для первичной димеризации среди членов семейства (Moore, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 10436-10441). Домен PAS включает 200-300 аминокислот, содержащих две области с низкой консервативностью и высокой гидрофобностью приблизительно в 50 аминокислот, обозначенные PAS A и PAS B. Субъединица HIF-Iα не стабильна в условиях нормоксии, сверхэкспрессия этой субъединицы в культивируемых клетках при нормальных уровнях кислорода может индуцировать экспрессию генов, обычно индуцируемых гипоксией. Замена C-концевой области (или области трансактивации) белка индуцируемого гипоксией фактора на сильный домен трансактивации из белка транскрипционного активатора, такого как, например, VP16 вируса простого герпеса (HSV), NFκB или факторы транскрипции дрожжей GAL4 и GCN4, предназначена для того, чтобы стабилизировать белок в условиях нормоксии и обеспечить мощную конститутивную активацию транскрипции. См., например, описание и последовательность белка характерного стабилизированного индуцируемого гипоксией фактора, который представляет собой гибридный/химерный слитый белок, состоящий из ДНК-связывающего домена и домена димеризации из HIF-Iα и домена трансактивации из белка VP16 HSV, в международной публикации № WO 2008/042420, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Также см. описание конститутивно стабильного гибридного HIF-Iα в патентах США №№ 6432927 и 7053062, оба из которых в полном объеме включены в настоящий документ посредством ссылки.HIF-I is a heterodimeric protein composed of two subunits: (i) the constitutively expressed β subunit, also known as the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT) (which is shared with other related transcription factors (e.g., dioxin/aryl hydrocarbon receptor (DR/AhR)); and (ii) the α subunit (see, e.g., International Publication No. WO 96/39426, describing a novel affinity purification and molecular cloning of HIF-Iα). Both subunits are members of the basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS family of transcription factors. These domains regulate DNA binding and dimerization. The transactivation domain is located at the C-terminus of the protein. The core region consists of approximately 15 predominantly basic amino acids responsible for direct DNA binding. This region is adjacent to two amphipathic α-helices separated by a variable-length loop that forms a contact region for primary dimerization among family members (Moore, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97 : 10436–10441). The PAS domain is 200–300 amino acids long, containing two regions of low conservation and high hydrophobicity of approximately 50 amino acids, designated PAS A and PAS B. The HIF-Iα subunit is not stable under normoxic conditions; overexpression of this subunit in cultured cells at normal oxygen levels can induce the expression of genes normally induced by hypoxia. The replacement of the C-terminal region (or transactivation region) of the hypoxia-inducible factor protein with a strong transactivation domain from a transcriptional activator protein, such as, for example, herpes simplex virus (HSV) VP16, NFκB, or the yeast transcription factors GAL4 and GCN4, is intended to stabilize the protein under normoxic conditions and provide potent constitutive transcriptional activation. See, for example, the description and protein sequence of a representative stabilized hypoxia-inducible factor, which is a hybrid/chimeric fusion protein consisting of the DNA-binding domain and dimerization domain from HIF-Iα and the transactivation domain from the HSV VP16 protein, in International Publication No. WO 2008/042420, which is incorporated herein by reference in its entirety. See also the description of a constitutively stable hybrid HIF-Iα in U.S. Patent Nos. 6,432,927 and 7,053,062, both of which are incorporated herein by reference in their entireties.

Члены семейства фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) входят в число наиболее мощных модуляторов биологических процессов в сосудах. Они регулируют васкулогенез, ангиогенез и обновление сосудов. Описаны четыре различных молекулярных варианта VEGF. Вариант из 165 аминокислот является преобладающей молекулярной формой, найденной в нормальных клетках и тканях. Также известны менее обильная и более короткая форма с делецией 44 аминокислот между положениями 116 и 159 (VEGF121), более длинная форма с инсерцией из 24 основных остатков в положении 116 (VEGF189) и другая более длинная форма с инсерцией из 41 аминокислоты (VEGF206), которая включает инсерцию из 24 аминокислот, найденную в VEGF189. VEGF121 и VEGF165 представляют собой растворимые белки. VEGF189 и VEGF206, по-видимому, преимущественно связаны с клеткой. Все версии VEGF являются биологически активными. См., например, описание последовательности VEGF165 (также см. номер доступа GenBank AB021221), VEGF121 (также см. номер доступа GenBank AF214570) и VEGF189 в публикации Tischer et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:11947-11954.; и описание последовательности VEGF206 в публикации Houck et al., Mol. Endocrinol. (1991) 5:1806-1814.Members of the vascular endothelial growth factor (VEGF) family are among the most potent modulators of biological processes in blood vessels. They regulate vasculogenesis, angiogenesis, and vascular renewal. Four different molecular variants of VEGF have been described. The 165-amino acid variant is the predominant molecular form found in normal cells and tissues. Also known are a less abundant and shorter form with a deletion of 44 amino acids between positions 116 and 159 (VEGF 121 ), a longer form with an insertion of 24 basic residues at position 116 (VEGF 189 ), and another longer form with an insertion of 41 amino acids (VEGF 206 ), which includes the 24-amino acid insertion found in VEGF 189. VEGF 121 and VEGF 165 are soluble proteins. VEGF 189 and VEGF 206 appear to be predominantly cell associated. All versions of VEGF are biologically active. See, e.g., the sequence description of VEGF 165 (also see GenBank accession number AB021221), VEGF 121 (also see GenBank accession number AF214570), and VEGF 189 in Tischer et al., J. Biol. Chem . (1991) 266 :11947–11954; and the sequence description of VEGF 206 in Houck et al., Mol. Endocrinol . (1991) 5 :1806–1814.

CNTF (цилиарный нейротрофический фактор) представляет собой нейроцитокин, экспрессируемый глиальными клетками в периферических нервах и центральной нервной системе. Общеизвестно, что функция CNTF заключается в поддержании и выживаемости не нейрональных и нейрональных типов клеток. См., например, Vergara, C and Ramirez, B; Brain Res, Brain Res. Rev. (2004) 47: 161-73.CNTF (ciliary neurotrophic factor) is a neurocytokine expressed by glial cells in the peripheral nerves and central nervous system. It is well known that CNTF functions in the maintenance and survival of non-neuronal and neuronal cell types. See, for example, Vergara, C and Ramirez, B; Brain Res, Brain Res. Rev . (2004) 47 : 161–73.

Соник хеджхог (Shh) контролирует важные процессы, связанные с развитием, включая выживаемость нейрональных и глиальных клеток.Sonic hedgehog (Shh) controls important developmental processes including neuronal and glial cell survival.

Эритропоэтин (EPO) является главным регулятором эритроидных клеток-предшественников. Однако его функционально экспрессирует нервная система, и сообщалось, что он обладает нейропротективными эффектами. См., например, Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicology, 26:923-8. Гены, кодирующие EPO человека и других млекопитающих, клонировали, секвенировали и экспрессировали, и среди различных видов в кодирующей области они обладают высокой степенью гомологии последовательностей. Wen et al., Blood (1993) 82:1507-1516. Последовательность гена, кодирующего нативный EPO человека, а также способы его получения описаны, например, в патентах США №№ 4954437 и 4703008, включенных в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, а также в публикациях Jacobs et al. (1985) Nature 313:806-810; Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:7580; международной публикации № WO 85/02610; и публикации европейского патента № 232034 B1. Кроме того, последовательности генов, кодирующих нативные EPO кошки, собаки и свиньи, известны и легко доступны (№№ доступа GenBank: L10606; L13027 и L10607, соответственно), а также известна и доступна последовательность гена, кодирующая EPO обезьяны (Macaca mulatta) (номер доступа GenBank: L10609).Erythropoietin (EPO) is the master regulator of erythroid progenitor cells. However, it is functionally expressed by the nervous system and has been reported to have neuroprotective effects. See, e.g., Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicology, 26:923-8. The genes encoding human and other mammalian EPO have been cloned, sequenced, and expressed, and they share a high degree of sequence homology in the coding region among different species. Wen et al., Blood (1993) 82 :1507-1516. The sequence of the gene encoding native human EPO, as well as methods for producing it, are described, e.g., in U.S. Patent Nos. 4,954,437 and 4,703,008, incorporated herein by reference in their entireties, and in Jacobs et al. (1985) Nature 313 :806-810; Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 :7580; International Publication No. WO 85/02610; and European Patent Publication No. 232034 B1. In addition, the sequences of the genes encoding native cat, dog, and pig EPO are known and readily available (GenBank Accession Nos. L10606; L13027, and L10607, respectively), and the sequence of the gene encoding monkey ( Macaca mulatta ) EPO is also known and readily available (GenBank Accession No. L10609).

Лизилоксидаза (LOX) окисляет боковую цепь пептидил-лизина, тем самым превращая определенные остатки лизина в альфа-аминоадипиновый-дельта-полуальдегид. Это представляет собой посттрансляционное изменение, которое, например, делает возможным ковалентное сшивание составных цепей коллагена и эластина. Это стабилизирует фиброзные отложения указанных белков во внеклеточном матриксе. LOX также может окислять лизин в различных катионных белках, указывая на то, что ее функции шире, чем стабилизация или внеклеточный матрикс. LOX синтезируется в виде белка-предшественника; он выходит из клетки в виде proLOX и подвергается протеолитическому процессингу в активный фермент. См., например, Lucero, HA and Kagan, HM, Cell Mol. Life Sci (2006) 63:2304-2316.Lysyl oxidase (LOX) oxidizes the side chain of peptidyl lysine, thereby converting certain lysine residues to alpha-aminoadipic-delta-semialdehyde. This is a post-translational change that, for example, allows covalent cross-linking of the constituent chains of collagen and elastin. It stabilizes fibrous deposits of these proteins in the extracellular matrix. LOX can also oxidize lysine in a variety of cationic proteins, indicating that its functions extend beyond stabilization or the extracellular matrix. LOX is synthesized as a precursor protein; it is released from the cell as proLOX and is proteolytically processed to the active enzyme. See, for example, Lucero, HA and Kagan, HM, Cell Mol. Life Sci (2006) 63 :2304–2316.

Програнулин (PGRN) представляет собой плейотропный белок. Мутации в данном гене вызывают лобно-височную лобарную дегенерацию. Экспрессия PGRN в ЦНС происходит в микроглии и нейронах, и он играет роль в развитии головного мозга. PGRN также участвует в нескольких процессах «моделирования тканей», включая развитие, заживление ран и образование опухолей. Ферменты эластазы превращают PGRN в гранулин (GRN). Тогда как програнулин обладает трофическими свойствами, GRN более близки к медиаторам воспаления. Исследования экспрессии генов на моделях заболеваний ЦНС на животных показывают дифференциальное повышение PRGN в сочетании с активацией микроглии и воспалением. Повышение экспрессии PGRN может быть плотно связано с активацией микроглии и нейровоспалением. Кроме того, повышение экспрессии PGRN происходит в активированной микроглии при многих нейродегенеративных заболеваниях, включая заболевания двигательных нейронов и болезнь Альцгеймера. Исследования выявили мутации в PGRN в качестве причины нейродегенеративного заболевания и указывают на важность функции PGRN для нейрональной выживаемости.Progranulin (PGRN) is a pleiotropic protein. Mutations in this gene cause frontotemporal lobar degeneration. PGRN is expressed in microglia and neurons in the CNS and plays a role in brain development. PGRN is also involved in several “tissue modeling” processes including development, wound healing, and tumor formation. Elastase enzymes convert PGRN to granulin (GRN). While progranulin has trophic properties, GRN is more closely related to inflammatory mediators. Gene expression studies in animal models of CNS diseases show differential increases in PRGN in association with microglial activation and inflammation. Increased PGRN expression may be tightly linked to microglial activation and neuroinflammation. Furthermore, PGRN expression is increased in activated microglia in many neurodegenerative diseases including motor neuron diseases and Alzheimer's disease. Studies have identified mutations in PGRN as a cause of neurodegenerative disease and indicate the importance of PGRN function for neuronal survival.

На всем протяжении взрослого периода из клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) продолжается образование олигодендроцитов, миелинизирующих клеток ЦНС, которые необходимы для внутреннего восстановления повреждений миелина во взрослой ЦНС. В значительной степени известны физиологические события, которые модулируют пролиферацию OPC и образование новых миелинизирующих олигодендроцитов во взрослой ЦНС. Недавно поступило сообщение о том, что пациенты с рассеянным склерозом (MS), демиелинизирующим заболеванием, обладают сниженной частотой рецидивирования в третьем триместре беременности, что наводит на мысль о том, что гормоны влияют на образование олигодендроцитов. Ремиссия у пациентов с MS коррелирует со снижением числа и размера активных повреждений белого вещества. Беременность у мышей приводит к увеличению образования новых олигодендроцитов и числа миелинизированных аксонов в ЦНС матери (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823). Показано, что пролактин, гормон, уровень которого выравнивается на последней стадии беременности, регулирует пролиферацию OPC в течение беременности и способствует заживлению белого вещества у неоплодотворенных самок мышей (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823).Throughout adulthood, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) continue to produce oligodendrocytes, the myelinating cells of the CNS that are essential for intrinsic repair of myelin damage in the adult CNS. The physiological events that modulate OPC proliferation and the formation of new myelinating oligodendrocytes in the adult CNS are largely understood. It has recently been reported that patients with multiple sclerosis (MS), a demyelinating disease, have a reduced relapse rate in the third trimester of pregnancy, suggesting that hormones influence oligodendrocyte formation. Remission in patients with MS correlates with a reduction in the number and size of active white matter lesions. Pregnancy in mice results in increased formation of new oligodendrocytes and the number of myelinated axons in the maternal CNS (Gregg et al., J. Neurosci . (2007) 27 :1812–1823). Prolactin, a hormone whose levels level off in late pregnancy, has been shown to regulate OPC proliferation during pregnancy and promote white matter healing in unfertilized female mice (Gregg et al., J. Neurosci . (2007) 27 :1812–1823).

Лактоген плаценты человека (hPL), гормон, уровень которого также поднимается в течение третьего триместра беременности, может обладать аналогичным влиянием на генерацию олигодендроцита. hPL имеет несколько биологических активностей, которые качественно схожи с гормоном роста человека (hGH) и пролактином, и, по-видимому, является основным регулятором образования IGF-I. Показано, что как hGH, так и IGF-I являются стимуляторами миелинизации во взрослой ЦНС (Carson et al., Neuron (1993) 10:729-740; Peltwon et al., Neurology (1977) 27:282-288). Следовательно, лечение заболеваний ЦНС, в которые вовлечена демиелинизация, таких как MS, ALS, инсульт и повреждение спинного мозга, может выиграть от терапии на основе PRL или hPL, например, посредством внутрижелудочковой инъекции экспрессирующего rhPRL или hPL вирусного вектора.Human placental lactogen (hPL), a hormone whose levels also rise during the third trimester of pregnancy, may have a similar effect on oligodendrocyte generation. hPL has several biological activities that are qualitatively similar to human growth hormone (hGH) and prolactin, and appears to be a major regulator of IGF-I formation. Both hGH and IGF-I have been shown to stimulate myelination in the adult CNS (Carson et al., Neuron (1993) 10 :729–740; Peltwon et al., Neurology (1977) 27 :282–288). Therefore, treatment of CNS diseases involving demyelination, such as MS, ALS, stroke and spinal cord injury, may benefit from PRL or hPL-based therapy, such as via intraventricular injection of an rhPRL or hPL-expressing viral vector.

Грелин представляет собой гормон желудка, который является медиатором высвобождения гормона роста. См. например Wu, et al., Ann. Surg. (2004) 239:464. Ghrelin is a gastric hormone that mediates growth hormone release. See, for example, Wu, et al., Ann. Surg . (2004) 239 :464.

Нейросерпин является членом семейства ингибиторов протеазы серпинов. В определенных состояниях ЦНС нейросерпин может играть нейропротективную роль, возможно, посредством блокирования эффектов tPA. См., например, Galliciotti, G and Sonderegger, P, Front Biosci (2006) 11:33; Simonin, et al., (2006) 26:10614; Miranda, E and Lomas, DA, Cell Mol Life Sci (2006) 63:709.Neuroserpin is a member of the serpin family of protease inhibitors. In certain CNS conditions, neuroserpin may have a neuroprotective role, possibly by blocking the effects of tPA. See, for example, Galliciotti, G and Sonderegger, P, Front Biosci (2006) 11 :33; Simonin, et al., (2006) 26 :10614; Miranda, E and Lomas, DA, Cell Mol Life Sci (2006) 63 :709.

Ангиогенин является членом суперсемейства РНКаз. Он является нормальным компонентом кровообращения, но также в нарушениях двигательных нейронов участвует в качестве фактора риска.Angiogenin is a member of the RNase superfamily. It is a normal component of the circulation but has also been implicated as a risk factor in motor neuron disorders.

В определенных композициях и способах по изобретению можно доставлять более чем один трансген, кодирующий более чем одну описанную выше терапевтическую молекулу, где каждый трансген функционально связан с промотором для того, чтобы обеспечить возможность экспрессии трансгенов из одного вектора AAV. В дополнительных способах трансгены могут быть функционально связаны с одним промотором. Каждый трансген кодирует биологически активную молекулу, экспрессия которой в ЦНС ведет к по меньшей мере частичной коррекции неврологической патологии. Дополнительно, в тех случаях, когда доставляют более чем один трансген, трансгены можно доставлять посредством более чем одного вектора AAV, где каждый вектор AAV содержит трансген, функционально связанный с промотором.In certain compositions and methods of the invention, more than one transgene encoding more than one therapeutic molecule described above can be delivered, wherein each transgene is operably linked to a promoter to allow expression of the transgenes from a single AAV vector. In additional methods, the transgenes can be operably linked to a single promoter. Each transgene encodes a biologically active molecule, the expression of which in the CNS leads to at least partial correction of a neurological pathology. Additionally, in cases where more than one transgene is delivered, the transgenes can be delivered via more than one AAV vector, wherein each AAV vector comprises a transgene operably linked to a promoter.

Нативные молекулы, а также их активные фрагменты и аналоги, которые сохраняют желаемую биологическую активность, как измерено в любом из множества анализов и животных моделей, включая дополнительно описанные в настоящем документе, предназначены для использования с настоящим изобретением.Native molecules, as well as active fragments and analogs thereof, that retain the desired biological activity as measured in any of a variety of assays and animal models, including those further described herein, are intended for use with the present invention.

Полинуклеотиды, кодирующие желаемый белок, для использования с настоящим изобретением можно получить, используя стандартные способы молекулярной биологии. Например, полинуклеотидные последовательности, кодирующие описанные выше молекулы, можно получать, используя рекомбинантные способы, например, посредством скрининга библиотек кДНК и геномных библиотек из клеток, экспрессирующих ген, или посредством доставки гена из вектора, о котором известно, что он индуцирует это. Ген, представляющий интерес, также можно получить синтетическим путем, а не клонированием, на основе известных последовательностей. Молекулы можно конструировать с использованием соответствующих кодонов для конкретной последовательности. Затем полную последовательность собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами, и собирают в полную кодирующую последовательность. См., например, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; и Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.Polynucleotides encoding a desired protein for use with the present invention can be prepared using standard molecular biology techniques. For example, polynucleotide sequences encoding the molecules described above can be prepared using recombinant techniques, such as by screening cDNA and genomic libraries from cells expressing the gene, or by delivering the gene from a vector known to induce it. The gene of interest can also be prepared synthetically, rather than by cloning, based on known sequences. Molecules can be designed using the appropriate codons for a particular sequence. The complete sequence is then assembled from overlapping oligonucleotides prepared by standard techniques and assembled into the complete coding sequence. See, for example, Edge, Nature (1981) 292 :756; Nambair et al., Science (1984) 223 :1299; and Jay et al., J. Biol. Chem . (1984) 259 :6311.

Таким образом, конкретные нуклеотидные последовательности можно получить из векторов, содержащих желаемые последовательности, или синтезировать полностью или частично, используя различные способы синтеза олигонуклеотидов, известные в данной области, такие как способы сайт-специфического мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР), где это применимо. См., например, Sambrook, выше. Один способ получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих желаемые последовательности, заключается в ренатурации комплементарных наборов перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, получаемых в стандартном автоматизированном синтезаторе полинуклеотидов, с последующими лигированием с использованием соответствующей ДНК лигазы и амплификацией лигированной нуклеотидной последовательности посредством ПЦР. См., например, Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088. Дополнительно олигонуклеотид-направленный синтез (Jones et al., Nature (1986) 54:75-82), олигонуклеотид-направленный мутагенез предварительно существующих нуклеотидных областей (Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327 и Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536) и ферментативное заполнение пропущенных олигонуклеотидов с использованием ДНК полимеразы T4 (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029-10033) можно использовать для предоставления молекул для использования в рассматриваемых способах.Thus, specific nucleotide sequences can be obtained from vectors containing the desired sequences or synthesized in whole or in part using various oligonucleotide synthesis techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and polymerase chain reaction (PCR) techniques, where applicable. See, e.g., Sambrook, supra. One method for obtaining nucleotide sequences encoding the desired sequences is to anneal complementary sets of overlapping synthetic oligonucleotides produced in a standard automated polynucleotide synthesizer, followed by ligation using an appropriate DNA ligase and amplification of the ligated nucleotide sequence by PCR. See, e.g., Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88 :4084-4088. Additionally, oligonucleotide-directed synthesis (Jones et al., Nature (1986) 54 :75-82), oligonucleotide-directed mutagenesis of pre-existing nucleotide regions (Riechmann et al., Nature (1988) 332 :323-327 and Verhoeyen et al., Science (1988) 239 :1534-1536), and enzymatic filling of missing oligonucleotides using T4 DNA polymerase (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86 :10029-10033) can be used to provide molecules for use in the methods of this invention.

После получения конструкции доставляют, используя рекомбинантные вирусные векторы, как описано дополнительно ниже.Once produced, constructs are delivered using recombinant viral vectors as described further below.

Способы доставки генов AAVAAV Gene Delivery Methods

Описанные выше конструкции доставляют рассматриваемому субъекту с использованием любого из нескольких способов доставки генов rAAV. В данной области известно несколько AAV-опосредованных способов доставки генов. Как описано дополнительно ниже, гены можно доставлять или непосредственно субъекту или, альтернативно, доставлять ex vivo, в соответствующие клетки, такие как клетки, которые получают у субъекта, и клетки, которые повторно имплантируют субъекту.The constructs described above are delivered to the subject using any of several rAAV gene delivery methods. Several AAV-mediated gene delivery methods are known in the art. As described further below, the genes can be delivered either directly to the subject or, alternatively, delivered ex vivo , to appropriate cells, such as cells that are obtained from the subject and cells that are reimplanted into the subject.

Для доставки генов разработаны различные системы векторов AAV. Векторы AAV можно легко сконструировать, используя способы, хорошо известные в данной области. См., например, патенты США №№ 5173414 и 5139941; международные публикации №№ WO 92/01070 (опубликована 23 января 1992 года) и WO 93/03769 (опубликована 4 марта 1993 года); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, BJ. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; и Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875. Системы векторов AAV также описаны более подробно ниже.Various AAV vector systems have been developed for gene delivery. AAV vectors can be readily constructed using techniques well known in the art. See, e.g., U.S. Patent Nos. 5,173,414 and 5,139,941; International Publication Nos. WO 92/01070 (published January 23, 1992) and WO 93/03769 (published March 4, 1993); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol . (1988) 8 :3988–3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, BJ. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3 :533–539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol . and Immunol . (1992) 158 :97-129; Kotin, R. M. Human Gene Therapy (1994) 5 :793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1 :165-169; and Zhou et al., J. Exp. Med . (1994) 179 :1867-1875. AAV vector systems are also described in more detail below.

Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, содержащую приблизительно 4681 нуклеотид. Как правило, геном AAV содержит внутренний, неповторяющийся геном, фланкированный на каждом конце инвертированными концевыми повторами (ITR). ITR имеют длину приблизительно 145 пар нуклеотидов (п.н.). ITR имеют несколько функций, включая предоставление точек начала репликации ДНК, и упаковку сигналов для вирусного генома. Внутренняя неповторяющаяся часть генома содержит две большие открытые рамки считывания, известные как гены репликации (rep) и капсида (cap) AAV. Гены rep и cap кодируют вирусные белки, которые позволяют вирусу осуществлять репликацию и упаковку в вирион. В частности, из области rep AAV экспрессируют семейство по меньшей мере из четырех вирусных белков, Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40, которые названы согласно их кажущейся молекулярной массе. Область cap AAV кодирует по меньшей мере три белка, VP1, VP2 и VP3.The AAV genome is a linear, single-stranded DNA molecule containing approximately 4,681 nucleotides. Typically, the AAV genome contains an internal, non-repetitive genome flanked at each end by inverted terminal repeats (ITRs). ITRs are approximately 145 base pairs (bp) in length. ITRs have several functions, including providing origins of DNA replication and packaging signals for the viral genome. The internal, non-repetitive portion of the genome contains two large open reading frames known as the AAV replication ( rep ) and capsid ( cap ) genes. The rep and cap genes encode viral proteins that enable the virus to replicate and package into a virion. Specifically, a family of at least four viral proteins, Rep 78, Rep 68, Rep 52, and Rep 40, are expressed from the rep region of AAV, which are named according to their apparent molecular mass. The AAV cap region encodes at least three proteins, VP1, VP2, and VP3.

AAV сконструирован для доставки генов, представляющих интерес, путем удаления внутренней неповторяющейся части генома AAV (т.е. генов rep и cap) и вставки гетерологичного гена между ITR. Гетерологичный ген обычно функционально связан с гетерологичным промотором (конститутивным, специфичным для клетки или индуцибельным), способным управлять экспрессией гена в целевых клетках пациента в соответствующих условиях. Примеры промоторов каждого типа хорошо известны в данной области. Также могут быть включены сигналы терминации, такие как сайты полиаденилирования.AAV is engineered to deliver genes of interest by removing the internal non-repetitive portion of the AAV genome (i.e., the rep and cap genes) and inserting a heterologous gene between the ITRs. The heterologous gene is typically operably linked to a heterologous promoter (constitutive, cell-specific, or inducible) capable of driving gene expression in the patient's target cells under appropriate conditions. Examples of each type of promoter are well known in the art. Termination signals such as polyadenylation sites may also be included.

AAV представляет собой хелпер-зависимый вирус; иными словами, для образования вирионов AAV необходима совместная инфекция вирусом-хелпером (например, аденовирусом, вирусом герпеса или вирусом осповакцины). В отсутствие совместной инфекции вирусом-хелпером, AAV переходит в латентное состояние, в котором вирусный геном встраивается в хромосому клетки-хозяина, но образования инфекционных вирионов не происходит. Последующая инфекция вирусом-хелпером «спасает» интегрированный геном, предоставляя возможность репликации и упаковки этого генома в инфекционный вирион AAV. Несмотря на то, что AAV может инфицировать клетки различных видов, вирус-хелпер должен относиться к тому же виду, что и клетка-хозяин. Таким образом, например, AAV человека будет осуществлять репликацию в клетках собаки, которые совместно инфицированы аденовирусом собаки.AAV is a helper-dependent virus; that is, coinfection with a helper virus (e.g., adenovirus, herpes virus, or vaccinia virus) is required for AAV virions to form. In the absence of coinfection with a helper virus, AAV enters a latent state in which the viral genome is integrated into the host cell chromosome but infectious virions are not produced. Subsequent infection with a helper virus “rescues” the integrated genome, allowing the genome to replicate and package into an infectious AAV virion. Although AAV can infect cells of many different species, the helper virus must be of the same species as the host cell. Thus, for example, human AAV will replicate in dog cells that are coinfected with canine adenovirus.

Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие ген, представляющий интерес, можно получать, используя различные принятые в данной области способы, которые более полно описаны ниже. AAV и вирусы-хелперы дикого типа можно использовать для обеспечения необходимых репликативных функций с целью получения вирионов rAAV (см., например, патент США № 5139941, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Альтернативно, можно использовать плазмиду, содержащую гены, выполняющие функцию хелпера, в сочетании с инфицированием одним из хорошо известных вирусов-хелперов в качестве источника репликативных функций (см., например, патент США № 5622856 и патент США № 5139941, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Аналогичным образом, плазмиду, содержащую гены со вспомогательными функциями, можно использовать в сочетании с инфекцией AAV дикого типа, чтобы обеспечить необходимые репликативные функции. В случае использования в сочетании с вектором rAAV, существует три подхода, каждого из которых достаточно для получения вирионов rAAV. Специалист в данной области также может использовать другие подходы, хорошо известные в данной области, для получения вирионов rAAV.Recombinant AAV virions containing a gene of interest can be produced using a variety of art-recognized methods, which are described more fully below. Wild-type AAV and helper viruses can be used to provide the necessary replicative functions to produce rAAV virions (see, e.g., U.S. Patent No. 5,139,941, incorporated herein by reference in its entirety). Alternatively, a plasmid containing genes that perform helper function can be used in conjunction with infection with one of the well-known helper viruses as a source of replicative functions (see, e.g., U.S. Patent No. 5,622,856 and U.S. Patent No. 5,139,941, which are incorporated herein by reference in their entireties). Similarly, a plasmid containing genes with helper functions can be used in conjunction with infection with wild-type AAV to provide the necessary replicative functions. When used in combination with an rAAV vector, there are three approaches, each of which is sufficient to produce rAAV virions. One skilled in the art may also use other approaches well known in the art to produce rAAV virions.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ тройной трансфекции (подробно описан в патенте США № 6001650, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме), используют для получения вирионов rAAV, поскольку данный способ не требует использования инфекционного вируса-хелпера, позволяя получать вирионы rAAV без какого-либо поддающегося обнаружению присутствия вируса-хелпера. Это осуществляют, используя три вектора для получения вириона rAAV: вектор AAV с функцией хелпера, вектор со вспомогательной функцией и экспрессирующий вектор rAAV. Однако специалист в данной области примет во внимание, что последовательности нуклеиновой кислоты, кодируемые этими векторами, могут быть представлены в двух или более векторах в различных сочетаниях.In one embodiment of the present invention, a triple transfection method (described in detail in U.S. Patent No. 6,001,650, incorporated herein by reference in its entirety) is used to produce rAAV virions, since this method does not require the use of an infectious helper virus, allowing rAAV virions to be produced without any detectable presence of the helper virus. This is accomplished using three rAAV virion production vectors: an AAV helper function vector, a helper function vector, and an rAAV expression vector. However, one skilled in the art will appreciate that the nucleic acid sequences encoded by these vectors may be present in two or more vectors in various combinations.

Как объясняется в настоящем документе, вектор AAV с функцией хелпера кодирует последовательности «функции хелпера AAV» (т.е. rep и cap), эта функция in trans для производительной репликации и капсидирования AAV. Предпочтительно, вектор AAV с функцией хелпера поддерживает эффективное образование вектора AAV без образования каких-либо поддающихся определению вирионов AAV WT (т.е. вирионов AAV, содержащих функциональные гены rep и cap). Пример такого вектора, pHLP19, описан в патенте США № 6001650, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Гены rep и cap вектора AAV с функцией хелпера можно получить из AAV любого известного серотипа, как объясняется выше. Например, вектор AAV с функцией хелпера может иметь ген rep, полученный из AAV-2, и ген cap, полученный из AAV-6; специалист в данной области примет во внимание, что возможны другие сочетания генов rep и cap, а определяющим признаком является способность поддерживать образование вириона rAAV.As explained herein, an AAV helper function vector encodes "AAV helper function" sequences (i.e., rep and cap ), which function in trans for productive replication and encapsidation of AAV. Preferably, the AAV helper function vector supports efficient formation of the AAV vector without the formation of any detectable WT AAV virions (i.e., AAV virions containing functional rep and cap genes). An example of such a vector, pHLP19, is described in U.S. Patent No. 6,001,650, incorporated herein by reference in its entirety. The rep and cap genes of the AAV helper function vector can be derived from any known AAV serotype, as explained above. For example, an AAV helper function vector can have a rep gene derived from AAV-2 and a cap gene derived from AAV-6; A person skilled in the art will appreciate that other combinations of rep and cap genes are possible, and that the defining feature is the ability to support the formation of the rAAV virion.

Вектор со вспомогательной функцией кодирует нуклеотидные последовательности для вирусных и/или клеточных функций, которые получены не из AAV, от которых зависит репликация AAV (т.е. «вспомогательные функции»). Вспомогательные функции включают те функции, которые необходимы для репликации AAV, включая, без ограничения, те фрагменты, которые участвуют в активации транскрипции генов AAV, стадиеспецифического сплайсинга мРНК AAV, репликации ДНК AAV, синтезе продуктов экспрессии cap и сборке капсида AAV. Вирусные вспомогательные функции можно получать из любого хорошо известного вируса-хелпера, такого как аденовирус, вирус герпеса и вирус осповакцины. В одном из вариантов осуществления используют плазмиду со вспомогательной функцией pLadeno5 (подробности относительно pLadeno5 описаны в патенте США № 6004797, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Эта плазмида обеспечивает полный набор вспомогательных функций аденовируса для получения вектора AAV, но не содержит компоненты, необходимые для формирования репликативно-компетентного аденовируса.The helper function vector encodes nucleotide sequences for viral and/or cellular functions that are not derived from AAV on which AAV replication depends (i.e., "helper functions"). Helper functions include those functions that are necessary for AAV replication, including, but not limited to, those fragments that are involved in the activation of AAV gene transcription, stage-specific splicing of AAV mRNA, AAV DNA replication, synthesis of cap expression products, and AAV capsid assembly. The viral helper functions can be derived from any well-known helper virus, such as adenovirus, herpes virus, and vaccinia virus. In one embodiment, the helper function plasmid pLadeno5 is used (details regarding pLadeno5 are described in U.S. Patent No. 6,004,797, incorporated herein by reference in its entirety). This plasmid provides a complete set of adenovirus helper functions for producing an AAV vector, but does not contain the components required to form a replication-competent adenovirus.

Для более глубокого ознакомления с AAV ниже приведено более подробное обсуждение, которое касается рекомбинантных экспрессирующих векторов AAV и хелперных и вспомогательных функций AAV.For a more in-depth understanding of AAV, a more detailed discussion is provided below, which covers recombinant AAV expression vectors and AAV helper and accessory functions.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы AAVRecombinant AAV expression vectors

Рекомбинантные экспрессирующие векторы AAV (rAAV) конструируют с использованием известных способов для того, чтобы предоставить по меньшей мере в виде функционально связанных компонентов в направлении транскрипции управляющие элементы, которые включают область инициации транскрипции, полинуклеотид, представляющий интерес, и область терминации транскрипции. Управляющие элементы выбирают так, чтобы они функционировали в клетке, представляющей интерес, такой как клетка млекопитающего. Полученную конструкцию, которая содержит функционально связанные компоненты, связывают (5’ и 3’) с функциональными последовательностями ITR AAV.Recombinant AAV expression vectors (rAAV) are constructed using known methods to provide at least as operably linked components in the direction of transcription control elements that include a transcription initiation region, a polynucleotide of interest, and a transcription termination region. The control elements are selected to function in a cell of interest, such as a mammalian cell. The resulting construct, which contains operably linked components, is linked (5' and 3') to functional AAV ITR sequences.

Нуклеотидные последовательности областей ITR AAV известны. Последовательность AAV-2 cм., например, в публикациях Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. “Parvoviridae and their Replication” в Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.). ITR AAV, используемые в векторах по изобретению, не обязаны содержать нуклеотидную последовательность дикого типа и могут быть изменены, например, инсерциями, делециями или заменами нуклеотидов. Дополнительно, ITR AAV можно получить из любого из нескольких серотипов AAV, включая без ограничения AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9 и т.д. Кроме того, 5’ и 3’ ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в экспрессирующем векторе AAV, не обязательно идентичны тому же серотипу или изоляту AAV или получены из него при условии, что их функции отвечают ожиданиям, т.е. позволяют вырезать и спасать последовательность, представляющую интерес, из генома клетки-хозяина или вектора, и позволяет интегрировать молекулу ДНК в геном клетки-реципиента, когда продукты гена Rep AAV присутствуют в клетке.The nucleotide sequences of the AAV ITR regions are known. For the AAV-2 sequence, see, for example, Kotin, RM (1994) Human Gene Therapy 5 :793-801; Berns, KI “Parvoviridae and their Replication” in Fundamental Virology , 2nd Edition, (BN Fields and DM Knipe, eds.). The AAV ITRs used in the vectors of the invention need not comprise the wild-type nucleotide sequence and may be altered, for example, by insertions, deletions, or nucleotide substitutions. Additionally, the AAV ITRs may be obtained from any of several AAV serotypes, including, but not limited to, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, etc. In addition, the 5' and 3' ITRs that flank the selected nucleotide sequence in the AAV expression vector are not necessarily identical to or derived from the same AAV serotype or isolate, as long as their functions are as expected, i.e., allow excision and rescue of the sequence of interest from the host cell or vector genome, and allow integration of the DNA molecule into the recipient cell genome when AAV Rep gene products are present in the cell.

Размер полинуклеотидных молекул, подходящих для использования в традиционных векторах AAV, составляет менее чем или приблизительно 5 тысяч нуклеотидов (т.п.н.). Выбранная полинуклеотидная последовательность функционально связана с управляющими элементами, которые управляют ее транскрипцией или экспрессией у субъекта in vivo. Такие управляющие элементы могут содержать последовательности регуляции, которые обычно связаны с выбранным геном. Альтернативно, можно использовать гетерологичные последовательности регуляции. Эффективные гетерологичные последовательности регуляции, как правило, включают те, что получены из последовательностей, кодирующих гены млекопитающих или вирусов. Неограничивающие примеры промоторов включают, но не ограничиваются ими, промотор цитомегаловируса (CMV) (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154), промотор β3-глобина CMV/человека (Mandel et al., J. Neurosci. (1998) 18:4271-4284), промотор GFAP (Xu et al., Gene Ther. (2001) 8:1323-1332), промотор нейронспецифической енолазы длиной 1,8 т.п.н. (NSE) (Klein et al., Exp. Neurol. (1998) 150:183-194), промотор β-актина курицы (CBA) (Miyazaki, Gene (1989) 79:269-277), промотор β-глюкуронидазы (GUSB) (Shipley et al., Genetics (1991) 10:1009-1018) и промоторы убиквитина, например, выделенные из убиквитина A человека, убиквитина B человека и убиквитина C человека, как описано в патенте США № 6667174, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Чтобы продлить экспрессию, другие регуляторные элементы дополнительно могут быть функционально связаны с трансгеном, такие как, например, пострегуляторный элемент вируса гепатита лесного сурка (WPRE) (Donello et al., J. Virol. (1998) 72:5085-5092) или сайт полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH). Кроме того, последовательности, получаемые из невирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также найдут применение в настоящем документе. Такие промоторные последовательности коммерчески доступны, например, от Stratagene (San Diego, CA).The size of polynucleotide molecules suitable for use in conventional AAV vectors is less than or approximately 5 kilonucleotides (kb). The selected polynucleotide sequence is operably linked to control elements that direct its transcription or expression in a subject in vivo . Such control elements may comprise regulatory sequences that are normally associated with the selected gene. Alternatively, heterologous regulatory sequences may be used. Effective heterologous regulatory sequences typically include those derived from sequences encoding mammalian or viral genes. Non-limiting examples of promoters include, but are not limited to, the cytomegalovirus (CMV) promoter (Kaplitt et al., Nat. Genet . (1994) 8 :148-154), the CMV/human β3-globin promoter (Mandel et al., J. Neurosci . (1998) 18 :4271-4284), the GFAP promoter (Xu et al., Gene Ther . (2001) 8 :1323-1332), the 1.8-kb neuron-specific enolase promoter (Hu et al., J. Neurosci . (2008) 8 :1501-1503), and the 1.8-kb neuron-specific enolase promoter (Hu et al., J. Neurosci . (2008) 8 :1511-1515). (NSE) (Klein et al., Exp. Neurol . (1998) 150 :183-194), the chicken β-actin (CBA) promoter (Miyazaki, Gene (1989) 79 :269-277), the β-glucuronidase (GUSB) promoter (Shipley et al., Genetics (1991) 10 :1009-1018), and ubiquitin promoters, such as those derived from human ubiquitin A, human ubiquitin B, and human ubiquitin C, as described in U.S. Patent No. 6,667,174, incorporated herein by reference in its entirety. In order to prolong expression, other regulatory elements can additionally be operably linked to the transgene, such as, for example, the woodchuck hepatitis virus postregulatory element (WPRE) (Donello et al., J. Virol . (1998) 72 :5085-5092) or the bovine growth hormone (BGH) polyadenylation site. In addition, sequences derived from non-viral genes, such as the mouse metallothionein gene, will also find use herein. Such promoter sequences are commercially available, for example, from Stratagene (San Diego, CA).

Для некоторых применений генной терапии ЦНС может потребоваться контроль активности транскрипции. С этой целью можно обеспечить фармакологическую регуляцию экспрессии гена с использованием вирусных векторов, включающих различные регуляторные элементы и промоторы, чувствительные к лекарственным средствам, как описано, например, в публикациях Habermaet al., Gene Ther. (1998) 5:1604-16011; и Ye et al., Science (1995) 283:88-91.Some CNS gene therapy applications may require control of transcriptional activity. For this purpose, pharmacological regulation of gene expression can be achieved using viral vectors incorporating various regulatory elements and drug-responsive promoters, as described, for example, by Haberma et al., Gene Ther . (1998) 5 :1604–16011; and Ye et al., Science (1995) 283 :88–91.

Экспрессирующий вектор AAV, который содержит полинуклеотидную молекулу, представляющую интерес, фланкированную ITR AAV, можно сконструировать путем непосредственной вставки выбранной последовательности(ей) в геном AAV, из которого вырезали основные открытые рамки считывания (“ORF”) AAV. Другие части генома AAV также можно удалить при условии, что оставляют достаточную часть ITR для того, чтобы сделать возможными функции репликации и упаковки. Такие конструкции можно конструировать, используя способы, хорошо известные в данной области. См., например, патенты США №№ 5173414 и 5139941; международные публикации №№ WO 92/01070 (опубликована 23 января 1992 года) и WO 93/03769 (опубликована 4 марта 1993 года); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; и Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.An AAV expression vector that contains a polynucleotide molecule of interest flanked by an AAV ITR can be constructed by directly inserting the selected sequence(s) into an AAV genome from which the major AAV open reading frames (“ORFs”) have been excised. Other portions of the AAV genome can also be removed, provided that sufficient of the ITR is left to allow replication and packaging functions. Such constructs can be constructed using methods well known in the art. See, e.g., U.S. Patent Nos. 5,173,414 and 5,139,941; International Publication Nos. WO 92/01070 (published January 23, 1992) and WO 93/03769 (published March 4, 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol . 8 :3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3 :533-539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol . 158 :97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5 :793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1 :165-169; and Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179 :1867-1875.

Альтернативно, ITR AAV можно вырезать из вирусного генома или из вектора AAV, содержащего такие же и слитые 5’ и 3’ выбранной конструкции нуклеиновой кислоты, которая присутствует в другом векторе, с использованием стандартных способов лигирования, таких как те, что описаны в Sambrook et al., выше. Например, лигирование можно осуществлять в 20 мМ Tris-Cl pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 33 мкг/мл BSA, 10 мМ-50 мМ NaCl и или 40 мкМ АТФ, 0,01-0,02 (Weiss) единиц ДНК лигазы T4 при 0°C (для лигирования «липких концов»), или 1 мМ АТФ, 0,3-0,6 (Weiss) единиц ДНК лигазы T4 при 14°C (для лигирования «тупых концов»). Межмолекулярное лигирование «липких концов» обычно осуществляют при общей концентрации ДНК 30-100 мкг/мл (5-100 нМ общая конечная концентрация). Векторы AAV, которые содержат ITR, описаны, например, в патенте США № 5139941. В частности, в настоящем документе описаны несколько векторов AAV, которые доступны из American Type Culture Collection («ATCC») под номерами доступа 53222, 53223, 53224, 53225 и 53226.Alternatively, the AAV ITR can be excised from the viral genome or from an AAV vector containing the same and fused 5' and 3' nucleic acid construct of choice as is present in another vector using standard ligation methods such as those described in Sambrook et al., supra. For example, ligation can be performed in 20 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, and either 40 μM ATP, 0.01-0.02 (Weiss) units T4 DNA ligase at 0°C (for sticky end ligation), or 1 mM ATP, 0.3-0.6 (Weiss) units T4 DNA ligase at 14°C (for blunt end ligation). Intermolecular sticky end ligation is typically performed at a total DNA concentration of 30-100 μg/ml (5-100 nM total final concentration). AAV vectors that contain ITRs are described, for example, in U.S. Patent No. 5,139,941. In particular, several AAV vectors are described herein, which are available from the American Type Culture Collection (“ATCC”) under accession numbers 53222, 53223, 53224, 53225, and 53226.

В определенных вариантах осуществления экспрессирующие векторы rAAV представлены в виде самокомплементарных конструкций rAAV. Обычно, ДНК rAAV упакована в вирусный капсид в виде одноцепочечной молекулы ДНК (оцДНК) длиной приблизительно 4600 нуклеотидов. После инфицирования клетки вирусом одноцепочечную ДНК конвертируют в форму двухцепочечной ДНК (дцДНК). Только дцДНК могут использовать белки клетки, которые транскрибируют содержащийся ген или гены в РНК. Таким образом, стандартная схема репликации AAV требует синтеза de novo комплементарной цепи ДНК. Эту стадию конвертирования оцДНК генома AAV в дцДНК перед экспрессией можно обойти использованием самокомплементарных (sc) векторов.In certain embodiments, rAAV expression vectors are provided as self-complementary rAAV constructs. Typically, rAAV DNA is packaged into a viral capsid as a single-stranded DNA (ssDNA) molecule approximately 4,600 nucleotides in length. Upon infection of a cell by the virus, the single-stranded DNA is converted to a double-stranded DNA (dsDNA) form. Only dsDNA can be utilized by the cellular proteins that transcribe the gene or genes contained therein into RNA. Thus, the standard AAV replication pathway requires de novo synthesis of a complementary DNA strand. This step of converting the ssDNA of the AAV genome to dsDNA prior to expression can be bypassed by using self-complementary (sc) vectors.

Самокомплементарные векторы получают спариванием оснований комплементарных цепей из двух инфицирующих вирусов, что не требует синтеза ДНК (см., например, Nakai et al., J. Virol. (2000) 74:9451-9463). Это спаривание оснований между цепями или ренатурация цепей (SA) возможны, поскольку AAV упаковывает или плюс- или минус-цепь ДНК с равной эффективностью (Berns, K.I., Microbiol. Rev. (1990) 54:316-329).Self-complementary vectors are produced by base pairing of complementary strands from two infecting viruses, which does not require DNA synthesis (see, e.g., Nakai et al., J. Virol . (2000) 74 :9451–9463). This interstrand base pairing, or strand annealing (SA), is possible because AAV packages either plus- or minus-strand DNA with equal efficiency (Berns, KI, Microbiol. Rev. (1990) 54 :316–329).

Таким образом, и без ограничения теорией, необходимость конвертирования дцДНК, или посредством SA или посредством синтеза ДНК, можно полностью обойти посредством упаковки обеих цепей в виде одной молекулы. Этого можно добиться, если использовать склонность AAV к образованию димерных геномов с инвертированными повторами в течение цикла репликации AAV. Если эти димеры достаточно малы, то они могут быть упакованы таким же образом, как и стандартные геномы AAV, и две половины молекулы оцДНК могут сложиться и спарить основания с образованием молекулы дцДНК в половину длины. Конвертирование дцДНК не зависит от синтеза ДНК клетки-хозяина и концентрации вектора (McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254).Thus, and without being limited by theory, the need for dsDNA conversion, either by SA or by DNA synthesis, can be completely circumvented by packaging both strands as a single molecule. This can be accomplished by exploiting the propensity of AAV to form dimeric inverted repeat genomes during the AAV replication cycle. If these dimers are small enough, they can be packaged in the same manner as standard AAV genomes, and the two halves of the ssDNA molecule can fold and base pair to form a half-length dsDNA molecule. dsDNA conversion is independent of host cell DNA synthesis and vector concentration (McCarty et al., Gene Ther . (2001) 8 :1248–1254).

Конструкции вирусов scAAV содержат приблизительно 4,6 т.п.н. и способны к упаковке в нормальный капсид AAV. Каждый известный серотип AAV способен к упаковке геномов scAAV с аналогичной эффективностью (см., например, Sipo et al., Gene Ther. (2007) 14:1319-1329). Таким образом, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вектор scAAV содержит белки капсида из серотипов, выбранных из серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 или AAV9. Однако вектор scAAV может содержать белки капсида из любых известных серотипов или модифицированные белки капсида, известные в данной области. Эти векторы scAAV также могут представлять собой псевдотипированные векторы, содержащие геном одного серотипа AAV в капсиде второго серотипа AAV. Такие векторы могут содержать, например, вектор AAV, который содержит капсид AAV2 и геном AAV1, или вектор AAV, который содержит капсид AAV5 и геном AAV2 (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81).The scAAV viral constructs are approximately 4.6 kb and are capable of packaging into a normal AAV capsid. Each known AAV serotype is capable of packaging scAAV genomes with similar efficiency (see, e.g., Sipo et al., Gene Ther . (2007) 14 :1319-1329). Thus, in certain embodiments of the present invention, the scAAV vector comprises capsid proteins from serotypes selected from serotypes AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, or AAV9. However, the scAAV vector may comprise capsid proteins from any known serotypes or modified capsid proteins known in the art. These scAAV vectors may also be pseudotyped vectors comprising the genome of one AAV serotype within the capsid of a second AAV serotype. Such vectors may comprise, for example, an AAV vector that contains the AAV2 capsid and the AAV1 genome, or an AAV vector that contains the AAV5 capsid and the AAV2 genome (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81).

Изначально предполагали, что последовательность трансгена в векторе scAAV может содержать только приблизительно 2,2 т.п.н. Однако, по-видимому, возможна бóльшая свобода в отношении упаковывающей емкости, чем предполагали ранее. Например, авторы Wu et al., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182 успешно упаковали конструкции scAAV-2, превышающие 3300 п.н., и продемонстрировали димерные геномы с инвертированными повторами, которые полностью устойчивы к ДНКазе. Эти векторы давали ожидаемое увеличение эффективности трансдукции относительно ssAAV при тестировании на культивируемых клетках.It was initially anticipated that the transgene sequence in the scAAV vector could only contain approximately 2.2 kb. However, it appears that greater latitude in packaging capacity is possible than previously thought. For example, Wu et al., Human Gene Ther . (2007) 18 :171–182 successfully packaged scAAV-2 constructs exceeding 3,300 bp and demonstrated dimeric inverted repeat genomes that were completely resistant to DNase. These vectors yielded the expected increase in transduction efficiency relative to ssAAV when tested in cultured cells.

Векторы scAAV можно получить либо путем создания векторных плазмид, которые составляют приблизительно половину стандартного размера генома, в сочетании с селективной очисткой инфекционной двухцепочечной формы, либо путем использования векторных плазмид размером приблизительно в половину генома с мутацией в одной из концевых последовательностей разрешения вируса AAV, которые обеспечивают синтез двухцепочечного вируса. Оба подхода создают плюс- и минус-цепи вирусных геномов, которые ковалентно связаны в одном концевом повторе.scAAV vectors can be produced either by constructing vector plasmids that are approximately half the standard genome size, combined with selective purification of the infectious double-stranded form, or by using vector plasmids that are approximately half the genome size with a mutation in one of the terminal resolution sequences of the AAV virus that allows for the synthesis of double-stranded virus. Both approaches create plus- and minus-strand viral genomes that are covalently linked at a single terminal repeat.

В частности, образование нормальных мономерных геномов AAV, в свою очередь, основано на эффективном разрешении двух ITR на каждом раунде синтеза ДНК. Эта реакция опосредована оцДНК-эндонуклеазной активностью двух увеличенных изоформ Rep AAV. За одноцепочечным разрывом ITR на концевом сайте разрешения следует элонгация ДНК от одноцепочечного разрыва с помощью ДНК полимеразы организма-хозяина. Образование димерных геномов происходит, когда Rep не может ввести одноцепочечный разрыв в концевой сайт разрешения до того, как его достигает репликационный комплекс, инициированный на другом конце.Specifically, the formation of normal monomeric AAV genomes in turn relies on the efficient resolution of two ITRs in each round of DNA synthesis. This reaction is mediated by the ssDNA endonuclease activity of the two expanded AAV Rep isoforms. A single-strand break in the ITR at the terminal resolution site is followed by DNA elongation from the single-strand break by the host DNA polymerase. The formation of dimeric genomes occurs when Rep fails to introduce a single-strand break at the terminal resolution site before it is reached by the replication complex initiated at the other end.

Образование димерных геномов при получении scAAV можно резко увеличить посредством ингибирования разрешения на одном концевом повторе. Это легко осуществить путем делеции последовательности концевого сайта разрешения из одного ITR так, чтобы белок Rep не мог создавать обязательный одноцепочечный разрыв оцДНК (см., например, McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118 и Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111). Затем репликационный комплекс, инициированный на другом ITR, осуществляет копирование через шпильку и обратно к инициирующему концу. Репликация продолжается до конца молекулы матрицы, оставляя инвертированный повтор дцДНК с ITR дикого типа на каждом конце и мутировавшим ITR в середине. Затем этот димерный инвертированный повтор может проходить нормальные раунды репликации с двух концов ITR дикого типа. Каждая вытесненная дочерняя цепь содержит инвертированный повтор оцДНК с полным ITR на каждом конце и мутировавшим ITR в середине. Упаковка в капсид AAV начинается с 3’-конца вытесненной цепи. Получение scAAV из конструкций с одним мутировавшим ITR обычно дает более чем 90% димерных геномов.The formation of dimeric genomes during scAAV production can be dramatically increased by inhibiting resolution at one terminal repeat. This is easily accomplished by deleting the terminal resolution site sequence from one ITR so that the Rep protein cannot create the obligatory ssDNA single-strand break (see, e.g., McCarty et al., Gene Ther . (2003) 10 :2112–2118 and Wang et al., Gene Ther . (2003) 10 :2105–2111). The replication complex, initiated at the other ITR, then copies through the hairpin loop and back to the initiating end. Replication continues to the end of the template molecule, leaving an inverted dsDNA repeat with a wild-type ITR at each end and a mutated ITR in the middle. This dimeric inverted repeat can then undergo normal rounds of replication from the two ends of the wild-type ITR. Each displaced daughter strand contains an inverted ssDNA repeat with a complete ITR at each end and a mutated ITR in the middle. Packaging into the AAV capsid begins at the 3' end of the displaced strand. Production of scAAV from constructs with a single mutated ITR typically yields >90% dimeric genomes.

Получение и очистка вектора scAAV из конструкций с мутировавшими ITR аналогичны случаю со стандартным ssAAV, как описано дополнительно ниже. Однако если используют дот-блоттинг или Саузерн-блоттинг, то вектор ДНК предпочтительно наносят на мембраны для гибридизации в щелочных условиях, чтобы предотвратить повторную ренатурацию комплементарных цепей. Дополнительно, возможно образование ненастоящего сайта одноцепочечного разрыва Rep достаточно близко к мутировавшему ITR, чтобы предоставить возможность терминального разрешения и образования мономерных геномов. Этого можно обычно избежать, поворачивая кассету трансгена относительно мутантных концевых повторов и концевых повторов дикого типа.The production and purification of scAAV vector from mutated ITR constructs is similar to that of standard ssAAV, as described further below. However, if dot or Southern blotting is used, the vector DNA is preferably applied to alkaline hybridization membranes to prevent re-annealing of the complementary strands. Additionally, it is possible for a false Rep single-strand break site to form close enough to the mutated ITR to allow terminal resolution and formation of monomeric genomes. This can usually be avoided by rotating the transgene cassette relative to the mutant and wild-type terminal repeats.

Способы получения конструкций scAAV см., например, в публикациях McCarty, D.M., Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656; McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254; McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118; Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111; Wu et al., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182; публикации патентов США №№ 2007/0243168 и 2007/0253936, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме; а также примеры в настоящем документе.For methods of making scAAV constructs, see, e.g., McCarty, D. M., Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656; McCarty et al., Gene Ther . (2001) 8 :1248-1254; McCarty et al., Gene Ther . (2003) 10:2112-2118; Wang et al., Gene Ther . (2003) 10 :2105-2111; Wu et al., Human Gene Ther . (2007) 18 :171-182; U.S. Patent Publication Nos. 2007/0243168 and 2007/0253936, which are incorporated herein by reference in their entireties; and the Examples herein.

Для целей изобретения подходящие клетки-хозяева для получения вирионов rAAV из экспрессирующих векторов AAV (или стандартных или sc векторов) включают клетки микроорганизмов, дрожжей, насекомых и млекопитающих, которые можно использовать или которые были использованы в качестве реципиентов гетерологичной молекулы ДНК и которые способны расти, например, в суспензионной культуре, биореакторе или т.п. Термин включает потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Таким образом, «клетка-хозяин», как используется в настоящем описании, как правило, относится к клетке, которая была трансфицирована ДНК с экзогенной последовательностью. Клетки из подходящей клеточной линии человека 293 (легко доступны, например, в American Type Culture Collection под номером доступа ATCC CRL1573) предпочтительно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения. В частности, клеточная линия 293 человека представляет собой линию эмбриональных клеток почки человека, которая была трансформирована фрагментами ДНК аденовируса 5 типа (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), и которая экспрессирует аденовирусные гены E1a и E1b (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). Клеточная линия 293 легко трансфицируется и обеспечивает особенно удобную платформу для получения вирионов rAAV.For purposes of the invention, suitable host cells for producing rAAV virions from AAV expression vectors (or standard or sc vectors) include microbial, yeast, insect and mammalian cells that can be used or that have been used as recipients of a heterologous DNA molecule and that are capable of growing, for example, in suspension culture, a bioreactor or the like. The term includes progeny of the original cell that has been transfected. Thus, a "host cell" as used herein generally refers to a cell that has been transfected with DNA having an exogenous sequence. Cells from the appropriate human cell line 293 (readily available, for example, from the American Type Culture Collection under accession number ATCC CRL1573) are preferably used in the practice of the present invention. In particular, the human 293 cell line is a human embryonic kidney cell line that has been transformed with adenovirus type 5 DNA fragments (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol . 36:59 ) and that expresses the adenoviral E1a and E1b genes (Aiello et al. (1979) Virology 94 :460). The 293 cell line is readily transfected and provides a particularly convenient platform for the production of rAAV virions.

Функции хелпера AAVAAV Helper Functions

Клеткам-хозяевам, содержащим описанные выше экспрессирующие векторы AAV, необходимо придать способность обеспечивать функции хелпера AAV для того, чтобы реплицировать и капсидировать нуклеотидные последовательности, фланкированные ITR AAV, для получения вирионов rAAV. Функции хелпера AAV, как правило, представляют собой полученные из AAV кодирующие последовательности, которые могут быть экспрессированы для обеспечения продуктов генов AAV, которые, в свою очередь, функционируют в trans для продуктивной репликации AAV. Функции хелпера AAV используют в настоящем документе для восполнения необходимых функций AAV, которые отсутствуют у экспрессирующих векторов AAV. Таким образом, функции хелпера AAV включают одну или обе основные ORF AAV, а именно, кодирующие области rep и cap, или их функциональные гомологи.Host cells containing the AAV expression vectors described above must be conferred the ability to provide AAV helper functions in order to replicate and encapsidate nucleotide sequences flanked by AAV ITRs to produce rAAV virions. AAV helper functions are typically AAV-derived coding sequences that can be expressed to provide AAV gene products, which in turn function in trans to productively replicate AAV. AAV helper functions are used herein to supplement essential AAV functions that are missing from AAV expression vectors. Thus, AAV helper functions include one or both of the major AAV ORFs, namely the rep and cap coding regions, or functional homologs thereof.

Под «кодирующей областью rep AAV» понимают принятую в данной сфере область генома AAV, которая кодирует белки репликации Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40. Показано, что эти продукты экспрессии Rep обладают многими функциями, включая распознавание, связывание и внесение одноцепочечного разрыва в точку начала репликации ДНК AAV, активность ДНК-хеликазы и модулирование транскрипции с промоторов AAV (или других гетерологичных промоторов). Продукты экспрессии Rep в совокупности необходимы для репликации генома AAV. Описание кодирующей области rep AAV см., например, в публикациях Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; и Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Подходящие гомологи кодирующей области rep AAV включают ген rep вируса герпеса 6 человека (HHV-6), о котором также известно, что он опосредует репликацию ДНК AAV-2 (Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).The "AAV rep coding region" is the art-recognized region of the AAV genome that encodes the replication proteins Rep 78, Rep 68, Rep 52, and Rep 40. These Rep expression products have been shown to have multiple functions, including recognition, binding, and introduction of a single-strand break at the AAV DNA replication origin, DNA helicase activity, and modulation of transcription from the AAV (or other heterologous promoters) promoters. The Rep expression products are collectively required for replication of the AAV genome. For a description of the AAV rep coding region, see, e.g., Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol . 158 :97–129; and Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5 :793–801. Suitable homologues of the AAV rep coding region include the rep gene of human herpesvirus 6 (HHV-6), which is also known to mediate AAV-2 DNA replication (Thomson et al. (1994) Virology 204 :304-311).

Под «кодирующей областью cap AAV» понимают принятую в данной сфере область генома AAV, которая кодирует белки капсида VP1, VP2 и VP3, или их функциональные гомологи. Эти продукты экспрессии Cap обеспечивают функции упаковки, которые в совокупности необходимы для упаковывания вирусного генома. Описание кодирующей области cap AAV см., например, в публикациях Muzyczka, N. и Kotin, R.M. (выше).By "AAV cap coding region" is meant the art-recognized region of the AAV genome that encodes the capsid proteins VP1, VP2, and VP3, or their functional homologues. These Cap expression products provide packaging functions that collectively are required for packaging of the viral genome. For a description of the AAV cap coding region, see, for example, Muzyczka, N. and Kotin, RM (above).

Функции хелпера AAV вводят в клетку-хозяина посредством трансфицирования клетки-хозяина хелперной конструкцией AAV или до трансфекции экспрессирующим вектором AAV, или одновременно с ней. Таким образом, хелперные конструкции AAV используют для обеспечения по меньшей мере временной экспрессии генов rep и/или cap AAV для восполнения отсутствующих функций AAV, которые необходимы для продуктивной инфекции AAV. Хелперные конструкции AAV не содержат ITR AAV и не могут осуществлять ни репликацию, ни упаковку самих себя.The AAV helper functions are introduced into the host cell by transfecting the host cell with an AAV helper construct either prior to or concurrent with transfection with an AAV expression vector. Thus, the AAV helper constructs are used to provide at least transient expression of the AAV rep and/or cap genes to supplement the missing AAV functions that are required for productive AAV infection. The AAV helper constructs do not contain the AAV ITR and cannot replicate or package themselves.

Эти конструкции могут быть в форме плазмиды, фага, транспозона, космиды, вируса или вириона. Описано множество хелперных конструкций AAV, таких как общеупотребительные плазмиды pAAV/Ad и pIM29+45, которые кодируют продукты экспрессии Rep и Cap. См., например, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; и McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945. Описано множество других векторов, которые кодируют продукты экспрессии Rep и/или Cap. См., например, патент США № 5139941.These constructs may be in the form of a plasmid, phage, transposon, cosmid, virus, or virion. A variety of AAV helper constructs have been described, such as the commonly used plasmids pAAV/Ad and pIM29+45, which encode Rep and Cap expression products. See, e.g., Samulski et al. (1989) J. Virol . 63 :3822–3828; and McCarty et al. (1991) J. Virol . 65 :2936–2945. A variety of other vectors have been described that encode Rep and/or Cap expression products. See, e.g., U.S. Patent No. 5,139,941.

Вспомогательные функции AAVAAV Auxiliary Functions

Клетке-хозяину (или упаковывающей клетке) также необходимо придать способность обеспечивать полученные не от AAV функции, или «вспомогательные функции», чтобы получать вирионы rAAV. Вспомогательные функции представляют собой полученные не от AAV вирусные и/или клеточные функции, от которых зависит репликация AAV. Таким образом, вспомогательные функции включают по меньшей мере те белки и РНК не от AAV, которые необходимы для репликации AAV, включая те, которые участвуют в активации транскрипции генов AAV, стадиеспецифическом сплайсинге мРНК AAV, репликации ДНК AAV, синтезе продуктов экспрессии Cap и сборке капсида AAV. Вирусные вспомогательные функции можно получить от любого известного вируса-хелпера.The host cell (or packaging cell) must also be conferred the capacity to provide non-AAV-derived functions, or "helper functions," in order to produce rAAV virions. Helper functions are non-AAV-derived viral and/or cellular functions on which AAV replication depends. Thus, helper functions include at least those non-AAV proteins and RNAs that are required for AAV replication, including those involved in transcriptional activation of AAV genes, stage-specific splicing of AAV mRNA, AAV DNA replication, synthesis of Cap expression products, and AAV capsid assembly. Viral helper functions can be derived from any known helper virus.

В частности, вспомогательные функции можно вводить в клетки-хозяева, используя способы, известные специалистам в данной области, и затем экспрессировать в них. Обычно, вспомогательные функции обеспечивают посредством инфицирования клеток-хозяев неродственным вирусом-хелпером. Известно множество подходящих вирусов-хелперов, включая аденовирусы; вирусы герпеса, такие как вирус простого герпеса 1 и 2 типа; и вирусы осповакцины. Также в настоящем документе найдут применение невирусные вспомогательные функции, такие как те, которые обеспечены синхронизацией клеток с использованием различных известных средств. См., например, Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241-247; McPherson et al. (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117.In particular, helper functions can be introduced into host cells using methods known to those skilled in the art and then expressed therein. Typically, helper functions are provided by infecting host cells with an unrelated helper virus. A variety of suitable helper viruses are known, including adenoviruses; herpes viruses such as herpes simplex virus types 1 and 2; and vaccinia viruses. Also of use herein are non-viral helper functions, such as those provided by cell synchronization using various known means. See, e.g., Buller et al. (1981) J. Virol . 40 :241-247; McPherson et al. (1985) Virology 147 :217-222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152 :110-117.

Альтернативно, вспомогательные функции можно обеспечить, используя вектор со вспомогательной функцией, как определено выше. См., например, патент США № 6004797 и международную публикацию № WO 01/83797, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивающие вспомогательные функции, можно получить из природных источников, например, из генома аденовирусной частицы, или сконструировать, используя известные в данной области рекомбинантные или синтетические способы. Как объясняется выше, продемонстрировано, что все компоненты генов аденовирусов не являются обязательными для вспомогательных функций хелперов. В частности показано, что мутантные аденовирусы, неспособные к репликации ДНК и синтезу поздних генов, допускают репликацию AAV. Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317. Аналогичным образом показано, что мутации в областях E2B и E3 поддерживают репликацию AAV, что вероятно указывает на неучастие E2B и E3 областей в обеспечении вспомогательных функций. Carter et al., (1983) Virology 126:505. Однако аденовирусы с дефектами в области E1 или с удаленной областью E4 не способны поддерживать репликацию AAV. Таким образом, области E1A и E4 вероятно необходимы для репликации AAV, или напрямую или опосредованно. Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505. Другие описанные мутанты Ad включают: E1B (Laughlin et al. (1982), выше; Janik et al. (1981), выше; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), выше); и E4 (Carter et al.(1983), выше; Carter (1995)). Несмотря на то, что исследования вспомогательных функций, обеспечиваемых аденовирусами, содержащими мутации в кодирующей области E1B, дают противоречивые результаты, Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210, сообщали, что E1B55k необходим для получения вириона AAV, тогда как E1B19k нет. Кроме того, в международной публикации WO 97/17458 и у Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, описаны векторы со вспомогательными функциями, кодирующие различные гены Ad. Особенно предпочтительные векторы со вспомогательными функциями содержат кодирующую область VA РНК аденовируса, кодирующую область ORF6 E4 аденовируса, кодирующую область E2A 72 кДа аденовируса, кодирующую область E1A аденовируса и область E1B аденовируса, не содержащую интактную кодирующую область E1B55k. Такие векторы описаны в международной публикации № WO 01/83797.Alternatively, the helper functions can be provided using a helper function vector as defined above. See, for example, U.S. Patent No. 6,004,797 and International Publication No. WO 01/83797, which are each incorporated by reference in their entireties. The nucleic acid sequences providing the helper functions can be obtained from natural sources, such as from the genome of an adenovirus particle, or constructed using recombinant or synthetic techniques known in the art. As explained above, it has been demonstrated that not all components of the adenovirus genes are essential for the helper helper functions. In particular, mutant adenoviruses deficient in DNA replication and late gene synthesis have been shown to permit AAV replication. Ito et al., (1970) J. Gen. Virol . 9 :243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45 :317. Similarly, mutations in the E2B and E3 regions have been shown to support AAV replication, likely indicating that the E2B and E3 regions do not provide accessory functions. Carter et al., (1983) Virology 126 :505. However, adenoviruses with defects in the E1 region or with the E4 region deleted are unable to support AAV replication. Thus, the E1A and E4 regions are probably required for AAV replication, either directly or indirectly. Laughlin et al., (1982) J. Virol . 41 :868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :1925; Carter et al., (1983) Virology 126 :505. Other Ad mutants that have been described include: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104 :502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol . 29 :239; Strauss et al., (1976) J. Virol . 17 :140; Myers et al., (1980) J. Virol . 35 :665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem . 256 :567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), supra); and E4 (Carter et al. (1983), supra; Carter (1995)). Although studies of the helper functions conferred by adenoviruses containing mutations in the E1B coding region have yielded conflicting results, Samulski et al., (1988) J. Virol. 62 :206–210, reported that E1B55k is required for AAV virion production, whereas E1B19k is not. In addition, International Publication No. WO 97/17458 and Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5 :938-945, describe helper function vectors encoding various Ad genes. Particularly preferred helper function vectors comprise the adenovirus VA RNA coding region, the adenovirus E4 ORF6 coding region, the adenovirus E2A 72 kDa coding region, the adenovirus E1A coding region, and the adenovirus E1B region lacking the intact E1B55k coding region. Such vectors are described in International Publication No. WO 01/83797.

Вследствие инфекции клетки-хозяина вирусом-хелпером или трансфекции клетки-хозяина вектором со вспомогательной функцией, экспрессируют вспомогательные функции, которые трансактивируют хелперную конструкцию AAV для получения белков Rep и/или Cap AAV. Продукты экспрессии Rep вырезают рекомбинантную ДНК (включая ДНК, представляющую интерес) из экспрессирующего вектора AAV. Белки Rep также выполняют функцию удвоения генома AAV. Экспрессируемые белки Cap собираются в капсиды, а также происходит упаковка рекомбинантного генома AAV в капсиды. Таким образом, протекает продуктивная репликация AAV и упаковка ДНК в вирионы rAAV. «Рекомбинантный вирион AAV» или «вирион rAAV» определен в настоящем документе как инфекционный вирус с дефектом репликации, содержащий белковую оболочку AAV, которая образует капсид для гетерологичной нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, которую с обеих сторон фланкируют ITR AAV.Following infection of a host cell with a helper virus or transfection of a host cell with a vector containing a helper function, helper functions are expressed that transactivate the AAV helper construct to produce AAV Rep and/or Cap proteins. The Rep expression products excise recombinant DNA (including the DNA of interest) from the AAV expression vector. The Rep proteins also function to duplicate the AAV genome. The expressed Cap proteins are assembled into capsids, and packaging of the recombinant AAV genome into capsids occurs. In this manner, productive replication of AAV and packaging of DNA into rAAV virions occurs. A "recombinant AAV virion" or "rAAV virion" is defined herein as an infectious virus with a replication defect that contains an AAV protein coat that forms a capsid for a heterologous nucleotide sequence of interest that is flanked on both sides by AAV ITRs.

После репликации рекомбинантного AAV вирионы rAAV можно очистить от клеток-хозяев, используя различные стандартные способы очистки, такие как колоночная хроматография, градиенты CsCl и т.п. Например, можно использовать несколько стадий очистки на колонках, такие как очистка на анионообменной колонке, колонке для аффинной хроматографии и/или катионообменной колонке. См., например, международную публикацию № WO 02/12455. Кроме того, если инфекцию используют для экспрессии вспомогательных функции, то остаточный вирус-хелпер можно инактивировать с помощью известных способов. Например, аденовирус можно инактивировать нагреванием до температуры приблизительно 60°C, например, в течение 20 минут или более. Такое воздействие эффективно инактивирует только вирус-хелпер, поскольку AAV обладает чрезвычайной тепловой стабильностью, тогда как аденовирус-хелпер обладает тепловой лабильностью.Following replication of the recombinant AAV, the rAAV virions can be purified from the host cells using a variety of standard purification methods, such as column chromatography, CsCl gradients, etc. For example, multiple column purification steps can be used, such as purification on an anion exchange column, an affinity chromatography column, and/or a cation exchange column. See, for example, International Publication No. WO 02/12455. Furthermore, if the infection is used to express helper functions, the residual helper virus can be inactivated using known methods. For example, adenovirus can be inactivated by heating to a temperature of approximately 60°C, such as for 20 minutes or more. Such an exposure effectively inactivates only the helper virus, since AAV is extremely thermally stable, whereas adenovirus helper is thermally labile.

Затем получаемые вирионы rAAV, содержащие нуклеотидную последовательность, представляющую интерес, можно использовать для доставки генов с помощью описанных ниже способов.The resulting rAAV virions containing the nucleotide sequence of interest can then be used for gene delivery using the methods described below.

Композиции и доставкаCompositions and delivery

A. КомпозицииA. Compositions

После получения вирионы rAAV, кодирующие ген, представляющий интерес, вводят в композиции, подходящие для доставки. Композиции содержат достаточно генетического вещества для получения терапевтически эффективного количества гена, представляющего интерес, т.е. количества, достаточного для (1) предупреждения развития заболевания или снижения интенсивности заболевания у субъекта, который может быть подвержен или предрасположен к заболеванию, но пока не испытывает или не проявляет симптомов заболевания, (2) подавления заболевания, т.е. купирования развития или обращения состояния заболевания, или (3) облегчения симптомов заболевания, т.е. снижения числа симптомов, испытываемых субъектом, а также изменения клеточной патологии, связанной с заболеванием.Once produced, rAAV virions encoding a gene of interest are incorporated into compositions suitable for delivery. The compositions contain sufficient genetic material to provide a therapeutically effective amount of the gene of interest, i.e., an amount sufficient to (1) prevent the development of a disease or reduce the intensity of a disease in a subject that may be susceptible or predisposed to the disease but does not yet experience or exhibit symptoms of the disease, (2) suppress the disease, i.e., arrest the development or reverse the condition of the disease, or (3) alleviate the symptoms of the disease, i.e., reduce the number of symptoms experienced by the subject, as well as reverse the cellular pathology associated with the disease.

Соответствующие дозы, среди прочих факторов, также зависят от млекопитающего, подлежащего лечению (например, человек или примат, не являющийся человеком, или другое млекопитающее), возраста и общего состояния субъекта, подлежащего лечению, тяжести состояния, подлежащего лечению, способа введения. Специалист в данной области может легко определить соответствующее эффективное количество, а характерные количества предоставлены ниже.Appropriate doses also depend on, among other factors, the mammal being treated (e.g., human or non-human primate or other mammal), the age and general condition of the subject being treated, the severity of the condition being treated, and the route of administration. One skilled in the art can readily determine the appropriate effective amount, and representative amounts are provided below.

Композиции также содержат фармацевтически приемлемый эксципиент. Такие эксципиенты включают любые фармацевтические средства, которые самостоятельно не индуцируют образование антител, опасных для индивидуума, получающего композицию, и которые можно вводить без неоправданного токсического действия. Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, сорбит, любые из множества соединений TWEEN и жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. В них могут входить фармацевтически приемлемые соли, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Дополнительно в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие средства, вещества pH буферов и т.п. Доскональное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов доступно в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).The compositions also contain a pharmaceutically acceptable excipient. Such excipients include any pharmaceutical agents that do not themselves induce the formation of antibodies harmful to the individual receiving the composition and that can be administered without undue toxicity. Pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, sorbitol, any of a variety of TWEEN compounds, and liquids such as water, saline, glycerol, and ethanol. They may include pharmaceutically acceptable salts, such as inorganic acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates, sulfates, and the like; and organic acid salts such as acetates, propionates, malonates, benzoates, and the like. Additionally, auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering substances, and the like may be present in such carriers. A thorough discussion of pharmaceutically acceptable excipients is available in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Композиции могут быть жидкими или твердыми, например, лиофилизированными. Композиции также можно вводить в виде аэрозолей.The compositions may be liquid or solid, for example lyophilized. The compositions may also be administered as aerosols.

Одна особенно эффективная композиция содержит вирион rAAV, представляющий интерес, в сочетании с одним или нескольким двухатомными или многоатомными спиртами и, необязательно, с детергентом, таким как сложный эфир сорбитана. См., например, патент США № 6764845, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.One particularly effective composition comprises an rAAV virion of interest in combination with one or more dihydric or polyhydric alcohols and, optionally, a detergent such as a sorbitan ester. See, for example, U.S. Patent No. 6,764,845, incorporated herein by reference in its entirety.

B. ДоставкаB. Delivery

Как правило, рекомбинантные вирионы вводят субъекту, используя способы трансдукции in vivo или in vitro. В случае трансдукции in vitro, желаемую клетку-реципиента забирают у субъекта, трансдуцируют рекомбинантным вектором и повторно вводят субъекту. Альтернативно, можно использовать изогенные или ксеногенные клетки, где эти клетки не вызывают у субъекта ненадлежащего иммунного ответа. Подходящие клетки для доставки млекопитающим животным-хозяевам включают типы клеток млекопитающих из органов, опухолей или клеточных линий. Например, можно использовать клетки человека, мыши, козы, овцы, коровы, собаки, кошки и свиньи. Подходящие типы клеток для использования включают, без ограничения, фибробласты, гепатоциты, эндотелиальные клетки, кератиноциты, гематопоэтические клетки, эпителиальные клетки, миоциты, нервные клетки и стволовые клетки. Дополнительно, нервные клетки-предшественники можно трансдуцировать in vitro и затем доставлять в ЦНС.Typically, recombinant virions are administered to a subject using methods transductionsin vivo or in vitro. In case of transductionin vitro, the desired recipient cell is removed from the subject, transduced with the recombinant vector, and reintroduced into the subject. Alternatively, isogenic or xenogenic cells can be used, wherein the cells do not elicit an inappropriate immune response in the subject. Suitable cells for delivery to mammalian host animals include mammalian cell types from organs, tumors, or cell lines. For example, human, mouse, goat, sheep, cow, dog, cat, and pig cells can be used. Suitable cell types for use include, but are not limited to, fibroblasts, hepatocytes, endothelial cells, keratinocytes, hematopoietic cells, epithelial cells, myocytes, neural cells, and stem cells. Additionally, neural progenitor cells can be transducedin vitroand then delivered to the central nervous system.

Клетки можно трансдуцировать in vitro, объединяя рекомбинантные вирионы с желаемой клеткой в соответствующей среде, и можно осуществлять скрининг клеток для обнаружения тех клеток, которые несут ДНК, представляющую интерес, используя общепринятые способы, такие как Саузерн-блоттинг и/или ПЦР, или используя селективные маркеры. Затем трансдуцированные клетки можно вводить в фармацевтические композиции, как описано выше, и вводить композицию субъекту различными способами, как описано ниже, одной или несколькими дозами.The cells can be transduced in vitro by combining the recombinant virions with the desired cell in an appropriate medium, and the cells can be screened to detect those cells that carry the DNA of interest using conventional methods such as Southern blotting and/or PCR, or using selectable markers. The transduced cells can then be introduced into pharmaceutical compositions as described above, and the composition can be administered to a subject by various routes as described below, in one or more doses.

В случае доставки in vivo, рекомбинантные вирионы вводят в фармацевтические композиции, и одну или несколько дозировок можно напрямую вводить указанным образом. Об идентификации структур головного мозга человека см., например, в публикациях The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; и Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. Об идентификации структур головного мозга мыши см., например, в публикации The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2nd ed., Academic Press, 2000. При желании, можно сопоставлять структуры головного мозга человека и схожие структуры головного мозга другого млекопитающего. Например, большинство млекопитающих, включая человека и грызунов, обладают схожей топографической организацией энториально-гиппокампальных проекций, с проекцией нейронов в латеральной части как латеральной, так и медиальной энторинальной коры, на дорзальную часть или септальное поле гиппокампа, тогда как проекция в вентральный гиппокамп главным образом берет начало из нейронов в медиальных частях энторинальной коры (Principles of Neural Science, 4th ed., eds Kandel et al., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2nd ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Кроме того, клетки II слоя энторинальной коры проецируются на зубчатую извилину, и они заканчиваются в наружных двух третях молекулярного слоя зубчатой извилины. Аксоны от клеток III слоя проецируются билатерально на области CA1 и CA3 аммонова рога (гиппокампа), терминируются в stratum lacunosum-moleculare.For in vivo delivery, the recombinant virions are incorporated into pharmaceutical compositions, and one or more dosages can be directly administered in this manner. For identification of human brain structures, see, for example, The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; and Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. For identification of mouse brain structures, see, for example, The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2nd ed., Academic Press, 2000. If desired, one can compare human brain structures with similar brain structures in another mammal. For example, most mammals, including humans and rodents, have a similar topographic organization of entorhinal-hippocampal projections, with neurons in the lateral portion of both the lateral and medial entorhinal cortex projecting to the dorsal portion or septal area of the hippocampus, whereas the projection to the ventral hippocampus originates primarily from neurons in the medial portions of the entorhinal cortex (Principles of Neural Science, 4th ed., eds Kandel et al., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2nd ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). In addition, layer II cells of the entorhinal cortex project to the dentate gyrus, and they terminate in the outer two-thirds of the molecular layer of the dentate gyrus. Axons from layer III cells project bilaterally to the CA1 and CA3 areas of the hippocampus and terminate in the stratum lacunosum-moleculare .

Чтобы доставить вектор точно в конкретную область центральной нервной системы, в частности, в конкретную область головного мозга, его можно вводить посредством стереотаксической микроинъекции. Например, в день операции пациенту прикрепляют стереотаксическую опорную раму (привинчивают к черепу). Головной мозг со стереотаксической опорной рамой (МРТ-совместимая с опорными маркерами) визуализируют, используя МРТ высокого разрешения. Затем МР-томограммы переносят в компьютер, на котором запущено стереотаксическое программное обеспечение. Последовательность фронтальных, сагиттальных и аксиальных изображений используют для определения целевого места инъекции вектора и траектории. Программное обеспечение непосредственно переводит траекторию в трехмерные координаты, адаптированные для стереотаксической рамы. Трепанационные отверстия сверлят над местом входа и размещают стереотаксическое устройство, локализованное с иглой, введенной на заданную глубину. Затем инъецируют вектор в фармацевтически приемлемом носителе. Затем вектор вводят непосредственной инъекцией в основное целевое место и посредством аксона ретроградный транспорт доставляет его в дистальные целевые места. Можно использовать дополнительные пути введения, например, поверхностное кортикальное применение при непосредственной визуализации или другое нестереотаксическое применение.In order to deliver the vector precisely to a specific area of the central nervous system, in particular to a specific area of the brain, it can be administered by stereotactic microinjection. For example, on the day of surgery, a stereotactic support frame is attached (screwed to the skull) to the patient. The brain with the stereotactic support frame (MRI compatible with fiducial markers) is imaged using high-resolution MRI. The MRI images are then transferred to a computer running stereotactic software. A sequence of coronal, sagittal and axial images are used to determine the target site of vector injection and the trajectory. The software directly translates the trajectory into three-dimensional coordinates adapted for the stereotactic frame. Burr holes are drilled over the entry site and the stereotactic device is positioned, localized with the needle inserted to a predetermined depth. The vector is then injected in a pharmaceutically acceptable carrier. The vector is then administered by direct injection into the primary target site and retrograde transport via the axon delivers it to distal target sites. Additional routes of administration may be used, such as superficial cortical application for direct visualization or other non-stereotactic applications.

Рекомбинантный AAV любого серотипа можно использовать в настоящем изобретении, где рекомбинантный AAV может представлять или самокомплементарный AAV, или несамокомплементарный AAV. Серотип вирусного вектора, используемого в определенных вариантах осуществления, выбирают из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9 (см., например, Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854 11859; и Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Помимо перечисленных в настоящем документе, можно использовать другие серотипы. Кроме того, в способах, описанных в настоящем документе, также можно использовать псевдотипированные векторы AAV. Псевдотипированные векторы AAV представляют собой векторы AAV, которые содержат геном одного серотипа AAV в капсиде второго серотипа AAV; например, вектор AAV, который содержит капсид AAV2 и геном AAV1, или вектор AAV, который содержит капсид AAV5 и геном AAV2 (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81).Recombinant AAV of any serotype can be used in the present invention, wherein the recombinant AAV can be either a self-complementary AAV or a non-self-complementary AAV. The serotype of the viral vector used in certain embodiments is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, and AAV9 (see, e.g., Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854 11859; and Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Other serotypes in addition to those listed herein can be used. Additionally, pseudotyped AAV vectors can also be used in the methods described herein. Pseudotyped AAV vectors are AAV vectors that contain the genome of one AAV serotype within the capsid of a second AAV serotype; for example, an AAV vector that contains the AAV2 capsid and the AAV1 genome, or an AAV vector that contains the AAV5 capsid and the AAV2 genome (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81).

Рекомбинантные вирионы или клетки, трансдуцированные in vitro, можно доставлять непосредственно в нервную ткань, такую как периферические нервы, сетчатка, дорсальные корешковые ганглии, нервно-мышечное соединение, а также ЦНС, посредством инъекции, например, в желудочковую область, например, в один или оба боковых желудочка, а также в полосатое тело (например, в хвостатое ядро или скорлупу полосатого тела), мозжечок, спинной мозг и нервно-мышечные соединения, с использованием иглы, катетера или сходного устройства, используя нейрохирургические способы, известные в данной области, например, посредством стереотаксической инъекции (см., например, Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat.Genet. 3:219-223, 1993; и Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000). В иллюстративном варианте осуществления доставку осуществляют непосредственной инъекцией раствора вектора с высоким титром в спинной мозг субъекта или пациента.Recombinant virions or cells transduced in vitro can be delivered directly to neural tissue, such as peripheral nerves, retina, dorsal root ganglia, neuromuscular junction, and the CNS, by injection, for example, into the ventricular region, such as one or both lateral ventricles, and into the striatum (e.g., the caudate nucleus or putamen), cerebellum, spinal cord, and neuromuscular junctions, using a needle, catheter, or similar device, using neurosurgical techniques known in the art, such as by stereotactic injection (see, for example, Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet . 3:219-223, 1993; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000). In an illustrative embodiment, delivery is accomplished by direct injection of a high titer vector solution into the spinal cord of a subject or patient.

В другом иллюстративном варианте осуществления предоставлен способ доставки трансгена в область спинного мозга и/или ствола головного мозга субъекта посредством введения рекомбинантного вектора AAV, содержащего трансген, по меньшей мере в одну область из областей глубоких ядер мозжечка (DCN) головного мозга субъекта. В глубине мозжечка расположено серое вещество, называемое глубокими ядрами мозжечка, которое обозначают как медиальное ядро (ядро шатра), промежуточное ядро и латеральное (зубчатое) ядро. Используемый в настоящем документе термин «глубокие ядра мозжечка» в совокупности относится к этим трем областям, где одна или несколько из этих трех областей может быть мишенью. Вирусная доставка происходит в условиях, которые способствуют экспрессии трансгена в области спинного мозга и/или ствола головного мозга, по меньшей мере в одном подотделе спинного мозга субъекта. Эти подотделы включают один или несколько шейных, грудных, поясничных или крестцовых сегментов.In another exemplary embodiment, a method is provided for delivering a transgene to a region of the spinal cord and/or brainstem of a subject by administering a recombinant AAV vector comprising the transgene to at least one region of the deep cerebellar nuclei (DCN) regions of the subject's brain. Located deep within the cerebellum is a gray matter called the deep cerebellar nuclei, which are referred to as the medial nucleus (tent nucleus), the intermediate nucleus, and the lateral (dentate) nucleus. As used herein, the term "deep cerebellar nuclei" collectively refers to these three regions, where one or more of these three regions can be a target. Viral delivery occurs under conditions that promote expression of the transgene in a region of the spinal cord and/or brainstem, in at least one subdivision of the spinal cord of the subject. These subdivisions include one or more cervical, thoracic, lumbar, or sacral segments.

Без ограничения теорией, один из вариантов осуществления изобретения заключается в возможности предоставления терапевтической молекулы (например, белка или пептида) в каждый отдел спинного мозга. Это можно осуществить инъекцией вектора AAV, включая вектор scAAV, в DCN. Кроме того, может быть важным нацеливание на отдельную пластинку в каждом отделе спинного мозга. Пластинки представляют собой конкретные подобласти внутри областей головного мозга и спинного мозга. В определенных вариантах осуществления может быть желательным нацеливание на конкретную пластинку в определенном отделе спинного мозга. Поскольку повреждение двигательных нейронов также может происходить в верхних двигательных нейронах, также может быть желательным предоставлять терапевтические молекулы (например, белок или пептид) в отделах ствола головного мозга. В одном из вариантов осуществления может быть желательным предоставлять терапевтическую молекулу как в спинном мозге, включая некоторые или все подотделы, а также в стволе головного мозга, включая некоторые или все подотделы. В настоящем изобретении используют введение вектора AAV в DCN для осуществления описанной выше доставки терапевтической молекулы в область(и) спинного мозга и/или ствол головного мозга.Without being limited by theory, one embodiment of the invention is the ability to provide a therapeutic molecule (e.g., a protein or peptide) to each section of the spinal cord. This can be accomplished by injecting an AAV vector, including a scAAV vector, into the DCN. Additionally, targeting a distinct lamina within each section of the spinal cord may be important. Laminae are specific subregions within regions of the brain and spinal cord. In certain embodiments, it may be desirable to target a specific lamina within a specific section of the spinal cord. Since motor neuron injury can also occur in upper motor neurons, it may also be desirable to provide therapeutic molecules (e.g., a protein or peptide) to sections of the brainstem. In one embodiment, it may be desirable to provide a therapeutic molecule both in the spinal cord, including some or all subregions, and in the brainstem, including some or all subregions. The present invention utilizes the administration of an AAV vector into DCN to accomplish the above-described delivery of a therapeutic molecule to the spinal cord and/or brainstem region(s).

Другой способ нацеленного воздействия на спинной мозг (например, на глию) состоит в доставке под оболочки, а не в саму ткань спинного мозга. Такая доставка дает множество преимуществ. Высвобождение нацеленного белка происходит в окружающей CSF, и, в отличие от вирусов, высвобождаемые белки могут проникать в паренхиму спинного мозга так же, как это происходит после экстренных интратекальных инъекций. Действительно, интратекальная доставка вирусных векторов может сохранять локальную экспрессию. Дополнительное преимущество интратекальной генной терапии состоит в том, что интратекальный путь имитирует введение поясничной пункцией (т.е. поясничным проколом), которая уже вошла в обычное использование у человека.Another way to target the spinal cord (eg, glia) is to deliver the drug submeningeally rather than into the spinal cord tissue itself. This delivery offers many advantages. The target protein is released into the surrounding CSF, and, unlike viruses, the released proteins can enter the spinal cord parenchyma in a manner similar to that seen after acute intrathecal injections. Indeed, intrathecal delivery of viral vectors can preserve local expression. An additional advantage of intrathecal gene therapy is that the intrathecal route mimics the lumbar puncture (i.e., lumbar puncture) route that has come into routine use in humans.

Другой способ введения рекомбинантных векторов или трансдуцированных клеток состоит в доставке в нейроны дорсальных корешковых ганглиев (DRG), например, инъекцией в эпидуральное пространство c последующей диффузией в DRG. Например, рекомбинантные векторы или трансдуцированные клетки можно доставлять через интратекальное канюлирование в условиях, где белок диффундирует в DRG. См., например, Chiang et al., Acta Anaesthesiol. Sin. (2000) 38:31-36; Jain, K.K., Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9:2403-2410.Another route of administration of recombinant vectors or transduced cells is to deliver them to dorsal root ganglia (DRG) neurons, such as by injection into the epidural space and subsequent diffusion into the DRG. For example, recombinant vectors or transduced cells can be delivered via intrathecal cannulation under conditions where the protein diffuses into the DRG. See, for example, Chiang et al., Acta Anaesthesiol . Sin . (2000) 38 :31–36; Jain, KK, Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9 :2403–2410.

В еще одном другом способе введения в ЦНС используют систему конвекционной доставки (CED), которая представляет собой любую неручную доставку вектора. В одном из вариантов осуществления CED градиент давления создают посредством использования системы неручной доставки. Используя CED, рекомбинантные векторы можно доставлять во многие клетки через большие области ЦНС. Кроме того, доставляемые векторы эффективно экспрессируют трансгены в клетках ЦНС (например, в глиальных клетках). Любое устройство конвекционной доставки может подходить для доставки рекомбинантных векторов. В предпочтительном варианте осуществления устройство может представлять собой осмотический насос или инфузионный насос. Осмотические и инфузионные насосы коммерчески доступны от различных поставщиков, например, Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Palo Alto, California. Обычно рекомбинантный вектор доставляют через устройства CED следующим образом. Катетер, канюлю или другое инъекционное устройство вводят в ткань ЦНС выбранного субъекта. Стереотаксические карты и позиционирующие устройства доступны, например, от ASI Instruments, Warren, MI. Позиционирование также можно осуществлять, используя анатомические карты, получаемые посредством КТ и/или МРТ визуализации, чтобы помочь направлять инъекционное устройство к выбранной мишени. Кроме того, нужно меньше инфузионных канюль, поскольку описанные в настоящем документе способы можно осуществлять на практике так, что относительно большие области субъекта захватывают рекомбинантные векторы. Поскольку хирургические осложнения часто связаны с множеством проникновений, этот режим доставки способствует уменьшению побочных эффектов, наблюдаемых при использовании стандартных способов доставки. Подробное описание конвекционной доставки см. в патенте США № 6309634, который включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.In yet another method of administration to the CNS, a convection delivery system (CED) is used, which is any non-manual delivery of the vector. In one embodiment of the CED, a pressure gradient is created by using a non-manual delivery system. Using a CED, recombinant vectors can be delivered to many cells across large areas of the CNS. In addition, the delivered vectors efficiently express transgenes in CNS cells (e.g., glial cells). Any convection delivery device can be suitable for delivering recombinant vectors. In a preferred embodiment, the device can be an osmotic pump or an infusion pump. Osmotic and infusion pumps are commercially available from various suppliers, such as Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Palo Alto, California. Typically, the recombinant vector is delivered through CED devices as follows. A catheter, cannula, or other injection device is inserted into the CNS tissue of a selected subject. Stereotactic maps and positioning devices are available, for example, from ASI Instruments, Warren, MI. Positioning can also be accomplished using anatomical maps obtained through CT and/or MR imaging to help guide the injection device to the selected target. Additionally, fewer infusion cannulas are needed because the methods described herein can be practiced such that relatively large areas of the subject are captured by recombinant vectors. Because surgical complications often involve multiple penetrations, this delivery mode helps reduce the side effects seen with standard delivery methods. For a detailed description of convection delivery, see U.S. Patent No. 6,309,634, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Интрацеребровентрикулярную, или внутрижелудочковую, доставку рекомбинантного вектора AAV можно осуществлять в любой один или несколько желудочков головного мозга, которые заполнены спинномозговой жидкостью (CSF). CSF представляет собой прозрачную жидкость, которая заполняет желудочки, присутствует в субарахноидальном пространстве и окружает головной мозг и спинной мозг. Образование CSF происходит в хороидных сплетениях посредством выпотевания или пропускания тканевой жидкости головного мозга в желудочки. Хороидное сплетение представляет собой структуру, которая выстилает дно латерального желудочка и свод третьего и четвертого желудочков. Определенные исследования показывают, что эти структуры способны образовывать 400-600 см3 жидкости в сутки, и этого количества достаточно для того, чтобы заполнить пространства центральной нервной системы четыре раза в сутки. Вычислено, что у взрослого человека объем этой жидкости составляет 125-150 мл (4-5 унций). Образование, циркуляция и абсорбция CSF происходит постоянно. Определенные исследования показывают, что каждые сутки происходит образование приблизительно 430-450 мл CSF (приблизительно 2 чашки). Определенные вычисления оценивают скорость образования приблизительно равной 0,35 мл в минуту у взрослых людей и 0,15 мл в минуту у детей. В хороидных сплетениях латеральных желудочков происходит образования наибольшей части CSF. Она течет через отверстие Монро в третий желудочек, где происходит объединение с CSF, образовавшейся в третьем желудочке, и продолжает движение через сильвиев водопровод в четвертый желудочек. Четвертый желудочек образует дополнительную CSF; затем жидкость проходит в субарахноидальное пространство через отверстия Мажанди и Люшки. Затем она циркулирует по всему основанию головного мозга, вниз вокруг спинного мозга и вверх через полушария головного мозга. CSF выходит в кровь через арахноидальные грануляции и внутричерепные сосудистые синусы.Intracerebroventricular, or intraventricular, delivery of the recombinant AAV vector can be performed into any one or more ventricles of the brain that are filled with cerebrospinal fluid (CSF). CSF is a clear fluid that fills the ventricles, is present in the subarachnoid space, and surrounds the brain and spinal cord. CSF is produced in the choroid plexuses by exudation or leakage of brain tissue fluid into the ventricles. The choroid plexus is a structure that lines the floor of the lateral ventricle and the roof of the third and fourth ventricles. Some studies indicate that these structures are capable of producing 400-600 cc of fluid per day, which is enough to fill the spaces of the central nervous system four times per day. In an adult, this fluid volume is estimated to be 125-150 ml (4-5 oz). CSF is continually being produced, circulated, and absorbed. Some studies indicate that approximately 430-450 ml of CSF (about 2 cups) are formed each day. Some calculations estimate the rate of formation to be approximately 0.35 ml per minute in adults and 0.15 ml per minute in children. The choroid plexuses of the lateral ventricles produce the largest portion of the CSF. It flows through the foramen of Monro into the third ventricle, where it combines with the CSF formed in the third ventricle and continues through the aqueduct of Sylvius into the fourth ventricle. The fourth ventricle forms additional CSF; the fluid then passes into the subarachnoid space through the foramina of Magendie and Luschka. It then circulates throughout the base of the brain, down around the spinal cord, and up through the cerebral hemispheres. CSF exits into the blood through the arachnoid granulations and the intracranial vascular sinuses.

В одном из аспектов описанные способы включают введение в ЦНС пораженного субъекта вириона rAAV, несущего трансген, который кодирует терапевтический продукт и обеспечивает возможность экспрессии трансгена в ЦНС рядом с местом введения на уровне, достаточном для проявления терапевтического эффекта, поскольку CSF транспортирует экспрессируемый белок по всей ЦНС. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение композиции вириона с высоким титром, которая несет терапевтический трансген, чтобы экспрессировать продукт трансгена на терапевтическом уровне в первом месте в ЦНС, дистальном относительно основного места действия экспрессируемого продукта.In one aspect, the disclosed methods comprise administering to the CNS of an affected subject an rAAV virion carrying a transgene that encodes a therapeutic product and allows the transgene to be expressed in the CNS near the site of administration at a level sufficient to exert a therapeutic effect, since the CSF transports the expressed protein throughout the CNS. In some embodiments, the methods comprise administering a high titer virion composition that carries a therapeutic transgene to express the transgene product at a therapeutic level at a first location in the CNS distal to the primary site of action of the expressed product.

У экспериментальных мышей общий объем инъецированного раствора AAV составляет, например, от 1 до 20 мкл. Для других млекопитающих, включая человека, объемы и скорости доставки масштабируют соответствующим образом. Лечение может состоять из одной инъекции в каждое целевое место или может повторяться в одном или нескольких местах. Можно использовать несколько мест инъекции. Например, в некоторых вариантах осуществления, в дополнение к первому месту введения, композицию, содержащую вирусный вектор, который несет трансген, вводят в другое место, которое может быть расположено на той же или на противоположной стороне относительно первого места введения. Инъекции могут быть однократными или многократными, односторонними или двусторонними.In experimental mice, the total volume of the injected AAV solution is, for example, 1 to 20 μl. For other mammals, including humans, the volumes and delivery rates are scaled accordingly. The treatment may consist of a single injection at each target site or may be repeated at one or more sites. Multiple injection sites may be used. For example, in some embodiments, in addition to the first administration site, a composition comprising a viral vector that carries a transgene is administered to another site, which may be located on the same or opposite side of the first administration site. Injections may be single or multiple, unilateral or bilateral.

Лечение дозами может представлять собой режим однократного дозирования, режим непрерывного или периодического или множественного дозирования. Кроме того, субъекту можно вводить столько доз, сколько целесообразно. Если вводят несколько доз, то первый введенный состав может быть таким же, как последующие составы, или может отличаться от них. Таким образом, например, первое введение может быть в форме вектора AAV, а второе введение в форме аденовирусного вектора, плазмидной ДНК, белковой композиции или тому подобного. Кроме того, последующая доставка может также совпадать со вторым режимом доставки или отличаться от него.The dose treatment may be a single dosing regimen, a continuous or intermittent dosing regimen, or multiple dosing. In addition, the subject may be administered as many doses as appropriate. If multiple doses are administered, the first formulation administered may be the same as or different from subsequent formulations. Thus, for example, the first administration may be in the form of an AAV vector, and the second administration in the form of an adenovirus vector, plasmid DNA, protein composition, or the like. In addition, subsequent delivery may also be the same as or different from the second delivery regimen.

Кроме того, субъект может получать вектор rAAV по настоящему изобретению посредством сочетания способов доставки, раскрытых в настоящем документе. Таким образом, субъект может получать инъекции вектора AAV по меньшей мере в два места инъекции, выбранные из группы, состоящей из интрацеребровентрикулярных инъекций, прямых инъекций в спинной мозг, интратекальных инъекций и инъекций в паренхиму головного мозга (например, в полосатое тело, мозжечок, включая глубокие ядра мозжечка). В одном из вариантов осуществления субъект может получать вектор rAAV через 1) по меньшей мере одну интрацеребровентрикулярную инъекцию и по меньшей мере одну прямую инъекцию в спинной мозг или 2) по меньшей мере одну интрацеребровентрикулярную инъекцию и по меньшей мере одну интратекальную инъекцию, или 3) по меньшей мере одну интрацеребровентрикулярную инъекцию и по меньшей мере одну инъекцию в паренхиму головного мозга, или 4) по меньшей мере одну прямую инъекцию в спинной мозг и по меньшей мере одну интратекальную инъекцию, или 5) по меньшей мере одну прямую инъекцию в спинной мозг и по меньшей мере одну инъекцию в паренхиму головного мозга, или 6) по меньшей мере одну интратекальную инъекцию и по меньшей мере одну инъекцию в паренхиму головного мозга.In addition, the subject may receive the rAAV vector of the present invention via a combination of the delivery methods disclosed herein. Thus, the subject may receive injections of the AAV vector at least two injection sites selected from the group consisting of intracerebroventricular injections, direct injections into the spinal cord, intrathecal injections, and injections into the brain parenchyma (e.g., into the striatum, cerebellum, including the deep cerebellar nuclei). In one embodiment, the subject may receive the rAAV vector via 1) at least one intracerebroventricular injection and at least one direct injection into the spinal cord, or 2) at least one intracerebroventricular injection and at least one intrathecal injection, or 3) at least one intracerebroventricular injection and at least one injection into the brain parenchyma, or 4) at least one direct injection into the spinal cord and at least one intrathecal injection, or 5) at least one direct injection into the spinal cord and at least one injection into the brain parenchyma, or 6) at least one intrathecal injection and at least one injection into the brain parenchyma.

Следует понимать, что более чем один трансген можно экспрессировать посредством доставленного рекомбинантного вириона. Альтернативно, отдельные векторы, каждый из которых экспрессирует один или несколько различных трансгенов, также можно доставлять субъекту, как описано в настоящем документе. Таким образом, несколько трансгенов можно доставлять параллельно или последовательно. Кроме того, также предполагается, что векторы, доставляемые способами по настоящему изобретению, можно сочетать с другими подходящими композициями и способами лечения. Дополнительно, можно использовать сочетание лечения белком и нуклеиновой кислотой.It should be understood that more than one transgene can be expressed by the delivered recombinant virion. Alternatively, separate vectors, each expressing one or more different transgenes, can also be delivered to a subject as described herein. Thus, multiple transgenes can be delivered in parallel or sequentially. In addition, it is also contemplated that the vectors delivered by the methods of the present invention can be combined with other suitable compositions and treatments. Additionally, a combination of protein and nucleic acid treatments can be used.

Способы определения наиболее эффективного средства введения и терапевтически эффективных дозировок хорошо известны специалистам в данной области и будут зависеть от вектора, терапевтической композиции, целевых клеток и субъекта, подлежащего лечению. Терапевтически эффективные дозы можно легко определить с использованием, например, одной или нескольких животных моделей рассматриваемого конкретного заболевания. «Терапевтически эффективное количество» попадает в относительно широкий диапазон, который можно определить с помощью клинических исследований. Например, для инъекции вирионов rAAV in vivo доза составит порядка приблизительно от 106 до 1015 геномных частиц рекомбинантного вируса, более предпочтительно от 108 до 1014 геномных частиц рекомбинантного вируса, или любую дозу в этих диапазонах, которая достаточна для обеспечения желаемого эффекта. В определенных вариантах осуществления концентрация или титр вектора в композиции составляет по меньшей мере: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или 50 (×1012 гч/мл); (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или 50 (×109 те/мл); или (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или 50 (×1010 ие/мл).Methods for determining the most effective means of administration and therapeutically effective dosages are well known to those skilled in the art and will depend on the vector, the therapeutic composition, the target cells, and the subject being treated. Therapeutically effective dosages can be readily determined using, for example, one or more animal models of the particular disease in question. A "therapeutically effective amount" falls within a relatively broad range that can be determined using clinical studies. For example, for in vivo injection of rAAV virions, the dosage would be on the order of about 10 6 to 10 15 recombinant virus genomic particles, more preferably 10 8 to 10 14 recombinant virus genomic particles, or any dosage within these ranges that is sufficient to provide the desired effect. In certain embodiments, the concentration or titer of the vector in the composition is at least: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, or 50 (×10 12 g h/mL); (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, or 50 (×10 9 iu/mL); or (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, or 50 (×10 10 iu/mL).

Для трансдукции in vitro эффективное количество вирионов rAAV, подлежащее доставке в клетки, составляет порядка от 108 до 1013 рекомбинантных вирусов. В свою очередь, количество трансдуцированных клеток в фармацевтических композициях составляет приблизительно от 104 до 1010 клеток, более предпочтительно от 105 до 108 клеток. Специалист в данной области может легко установить другие эффективные дозировки путем обычных испытаний для определения кривой доза-эффект.For in vitro transduction, the effective amount of rAAV virions to be delivered to cells is in the order of 10 8 to 10 13 recombinant viruses. In turn, the number of transduced cells in pharmaceutical compositions is approximately 10 4 to 10 10 cells, more preferably 10 5 to 10 8 cells. Other effective dosages can be readily determined by one skilled in the art through routine dose-response curve testing.

Как правило, доставляют от 1 мкл до 1 мл композиции, например, доставляют от 0,01 до приблизительно 0,05 мл, например, приблизительно от 0,05 до приблизительно 0,3 мл композиции, например, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2 и т.д. и любое число в этих диапазонах.Typically, from 1 µl to 1 ml of the composition is delivered, for example, from 0.01 to about 0.05 ml, for example, from about 0.05 to about 0.3 ml of the composition is delivered, for example, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, etc., and any number in these ranges.

Животные моделиAnimal models

Терапевтическую эффективность и безопасность использования вирионов AAV, содержащих трансгены, как описано выше, можно тестировать на соответствующей животной модели. Например, животные модели, которые кажутся наиболее близкими к заболеванию человека, включают виды животных, у которых происходит спонтанное развитие конкретного заболевания с высокой частотой заболеваемости, или те, у которых оно вызвано.The therapeutic efficacy and safety of using AAV virions containing transgenes as described above can be tested in an appropriate animal model. For example, animal models that appear to be closest to a human disease include animal species that spontaneously develop a particular disease with a high incidence or that are induced by it.

В частности, известно несколько созданных животных моделей SMA. См., например, Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245; Schmid et al., J. Child Neurol. (2007) 22:1004-1012. Как объясняется выше, молекулярная основа SMA, аутосомного рецессивного нервно-мышечного нарушения, заключается в гомозиготной утрате гена выживаемости двигательных нейронов 1 (SMN1). У человека найдена почти идентичная копия гена SMN1, названная SMN2, которая модулирует тяжесть заболевания. В отличие от человека, у мышей есть один ген (SMN), который соответствует SMN1. Гомозиготная утрата этого гена летальна для эмбрионов и ведет к массовой гибели клеток, указывая на то, что продукт гена SMN необходим для клеточной выживаемости и функции. Введение 2 копий SMN2 мышам, у которых отсутствует SMN, спасает эмбрионы от смерти, в результате чего получают мышей с фенотипом SMA (Monani et al., Hum. Mol. Genet. (2000) 9:333-339. Высокое число копий SMN2 спасает мышей потому, что в двигательных нейронах происходит образование достаточного количества белка SMN. См. также публикацию Hsieh-Li, et al., Nat. Genet. (2000) 24:66-70, где сообщается о получении линий трансгенных мышей, которые экспрессируют SMN2 человека. В частности, трансгенные мыши, несущие SMN2 при генотипе SMN-/-, имеют патологические изменения в спинном мозге и скелетных мышцах, которые схожи с таковыми у пациентов с SMA. Тяжесть патологических изменений у этих мышей коррелирует с количеством белка SMN, которое содержит область, кодируемая экзоном 7. Фенотипы в этой модели на мышах включают потерю двигательных нейронов, атрофию скелетных мышц, неправильные нервно-мышечные соединения (NMJ), дефицит поведения, паралич и укороченную продолжительность жизни, приблизительно равную двум неделям. Le et al., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857.In particular, several animal models of SMA have been developed. See, for example, Sumner CJ, NeuroRx (2006) 3 :235–245; Schmid et al., J. Child Neurol . (2007) 22 :1004–1012. As explained above, the molecular basis of SMA, an autosomal recessive neuromuscular disorder, is the homozygous loss of the survival motor neuron 1 (SMN1) gene. In humans, a nearly identical copy of the SMN1 gene, called SMN2, has been found to modulate the severity of the disease. In contrast, mice have a single gene (SMN) that corresponds to SMN1. Homozygous loss of this gene is embryonic lethal and leads to massive cell death, indicating that the SMN gene product is essential for cellular survival and function. Injection of two copies of SMN2 into mice lacking SMN rescues the embryos from death, resulting in mice with the SMA phenotype (Monani et al., Hum. Mol. Genet . (2000) 9 :333–339. The high copy number of SMN2 rescues the mice because sufficient amounts of SMN protein are produced in motor neurons. See also Hsieh-Li, et al., Nat. Genet. (2000) 24 :66–70, for a report on the generation of transgenic mouse lines that express human SMN2. In particular, transgenic mice carrying SMN2 with the SMN -/- genotype have pathological changes in the spinal cord and skeletal muscle that are similar to those seen in patients with SMA. The severity of the pathological changes in these mice correlates with the amount of SMN protein, which contains a region encoded by exon 7. Phenotypes in this mouse model include motor neuron loss, skeletal muscle atrophy, abnormal neuromuscular junctions (NMJs), behavioral deficits, paralysis, and a shortened lifespan of approximately two weeks. Le et al., Hum. Mol. Genet . (2005) 14 :845–857.

Аналогично, известны животные модели для ALS. ALS представляет собой смертельное нейродегенеративное заболевание, которое отличается избирательной потерей двигательных нейронов в коре, стволе головного мозга и спинном мозге. Развитие заболевания может вести к атрофии мышц конечностей, аксиальных и дыхательных мышц. Гибель двигательных нейронов сопровождает реактивный глиоз, аномалии нейрофиламентов и значительная утрата крупных миелинизированных волокон в корково-спинномозговом пути и передних корешках. Несмотря на то, что этиология ALS изучена мало, накопленные факты указывают на то, что спорадический (SALS) и семейный (FALS) ALS имеют много общих патологических признаков; таким образом, давая надежду на то, что исследование одной из форм приведет к общему лечению. FALS насчитывает приблизительно 10% диагностированных случаев, из которых 20% связаны с доминантно наследуемыми мутациями в Cu/Zn-супероксиддисмутазе (SODI). Трансгенные мыши, которые экспрессируют мутантный белок SODI человека (например, мыши SODIG93A), повторяют многие патологические признаки ALS и представляют собой доступную животную модель для изучения ALS. В качестве первопричины в SALS участвует множество патологических механизмов, включая индуцированную глутаматом эксцитотоксичность, воздействие токсинов, нарушение функции протеосом, повреждение митохондрий, разрушение нейрофиламентов и утрату нейротрофической поддержки.Similarly, animal models for ALS are known. ALS is a fatal neurodegenerative disease characterized by selective loss of motor neurons in the cortex, brainstem, and spinal cord. Disease progression may lead to atrophy of limb, axial, and respiratory muscles. Motor neuron loss is accompanied by reactive gliosis, neurofilament abnormalities, and significant loss of large myelinated fibers in the corticospinal tract and ventral roots. Although the etiology of ALS is poorly understood, accumulating evidence indicates that sporadic (SALS) and familial (FALS) ALS share many pathological features; thus, providing hope that investigation of one of the forms will lead to a common treatment. FALS accounts for approximately 10% of diagnosed cases, of which 20% are associated with dominantly inherited mutations in Cu/Zn superoxide dismutase (SODI). Transgenic mice that express a mutant human SODI protein (e.g., SODIG93A mice) recapitulate many of the pathological features of ALS and provide a readily available animal model for studying ALS. Multiple pathological mechanisms have been implicated in SALS as underlying causes, including glutamate-induced excitotoxicity, toxin exposure, proteasome dysfunction, mitochondrial damage, neurofilament disruption, and loss of neurotrophic support.

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE), также называемый экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом, предоставляет животную модель MS. EAE очень похож на различные формы и стадии MS. EAE представляет собой острое или хронически рецидивирующее приобретенное, воспалительное и демиелинизирующее аутоиммунное заболевание. Для того чтобы вызвать заболевание, животным вводят белки, которые входят в состав миелина, изолирующей оболочки, которая окружает нейроны. Эти белки индуцируют аутоиммунный ответ у инъецированных животных, у которых развивается патологический процесс, который очень похож на MS у людей. EAE вызывали у животных многих различных видов, включая мышей, крыс, морских свинок, кроликов, макак, макак-резусов и мартышек.Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), also called experimental allergic encephalomyelitis, provides an animal model of MS. EAE closely resembles the various forms and stages of MS. EAE is an acute or chronically relapsing acquired, inflammatory, and demyelinating autoimmune disease. To induce the disease, animals are injected with proteins that make up myelin, the insulating sheath that surrounds neurons. These proteins induce an autoimmune response in the injected animals, which develop a disease process that is very similar to MS in humans. EAE has been induced in many different animal species, including mice, rats, guinea pigs, rabbits, macaques, rhesus macaques, and marmosets.

Спинально-бульбарная мышечная атрофия (SBMA) представляет собой заболевание двигательных нейронов с началом во взрослом возрасте, которое вызывает экспансия тринуклеотидных повторов (TNR) в экзоне 1 гена андрогенового рецептора (AR). Это нарушение отличается дегенерацией двигательных и чувствительных нейронов, атрофией проксимальных мышц и эндокринными аномалиями, такими как гинекомастия и пониженная фертильность. Развитие симптомов происходит только у самцов, тогда как самки-носители обычно не имеют симптомов. Молекулярной основой SBMA является экспансия тринуклеотидного повтора CAG, который кодирует полиглутаминовый (polyQ) тракт, в первом экзоне гена андрогенового рецептора (AR). Патологическим признаком являются ядерные включения (NI), содержащие мутантный и усеченный AR с увеличенным polyQ, в оставшихся двигательных нейронах ствола головного мозга и спинного мозга, а также некоторых других висцеральных органов. Для изучения патогенеза SBMA создано несколько моделей на трансгенных мышах. См., например, Katsuno et al., Cytogen. And Genome Res. (2003) 100:243-251. Например, на модели на трансгенных мышах, несущих чистые 239 CAG под управлением промотора AR человека, и на другой модели, несущей усеченный AR с увеличенными CAG, в двигательных нейронах выявлена двигательная недостаточность и ядерные NI. Трансгенные мыши, несущие полноразмерный AAR человека с увеличенным polyQ, демонстрируют прогрессирующую двигательную недостаточность и нейрогенные патологии, а также половые различия фенотипов. Эти модели повторяют экспрессируемый фенотип, который наблюдают при SBMA.Spinal bulbar muscular atrophy (SBMA) is an adult-onset motor neuron disease caused by a trinucleotide repeat (TNR) expansion in exon 1 of the androgen receptor (AR) gene. This disorder is characterized by degeneration of motor and sensory neurons, proximal muscle atrophy, and endocrine abnormalities such as gynecomastia and subfertility. Symptoms develop only in males, while carrier females are usually asymptomatic. The molecular basis of SBMA is an expansion of the CAG trinucleotide repeat, which encodes a polyglutamine (polyQ) tract, in exon 1 of the androgen receptor (AR) gene. The pathological hallmark is nuclear inclusions (NIs) containing mutant and truncated AR with expanded polyQ in the remaining motor neurons of the brainstem and spinal cord, as well as some other visceral organs. Several transgenic mouse models have been developed to study the pathogenesis of SBMA. See, for example, Katsuno et al., Cytogen. And Genome Res . (2003) 100 :243–251. For example, a transgenic mouse model carrying pure 239 CAGs under the control of the human AR promoter and another model carrying a truncated AR with expanded CAGs show motor deficits and nuclear NIs in motor neurons. Transgenic mice carrying full-length human AAR with expanded polyQ exhibit progressive motor deficits and neurogenic pathologies, as well as sex-specific phenotypes. These models recapitulate the expressed phenotype observed in SBMA.

Болезнь Мачадо-Джозефа (MJD), которую также называют спиноцеребеллярной атаксией 3 типа, вызывает мутантный атаксин-3 с полиглутаминовой экспансией. На мышах созданы модели MJD, а также других полиглутаминовых спиноцеребеллярных атаксий. Обзор таких моделей см., например, в публикации Gould, V.F.C. NeuroRX (2005) 2:480-483.Machado-Joseph disease (MJD), also called spinocerebellar ataxia type 3, is caused by a mutant ataxin-3 with a polyglutamine expansion. Mouse models of MJD, as well as other polyglutamine spinocerebellar ataxias, have been created. For a review of such models, see, for example, Gould, VFC NeuroRX (2005) 2 :480–483.

Таким образом, в данной области доступен стандарт для животных моделей с целью скрининга и/или оценки активности и/или эффективности способов и композиций по изобретению для лечения нарушений двигательных нейронов.Thus, a standard is available in the art for animal models for the purpose of screening and/or evaluating the activity and/or efficacy of the methods and compositions of the invention for the treatment of motor neuron disorders.

Наборы по изобретениюInvention kits

Изобретение также относится к наборам. В определенных вариантах осуществления наборы по изобретению включают один или несколько контейнеров, которые содержат рекомбинантные векторы, кодирующие белок, представляющий интерес. Наборы дополнительно могут содержать соответствующий набор инструкций, как правило, письменных инструкций, которые касаются использования векторов в любом способе, описанном в настоящем документе. The invention also relates to kits. In certain embodiments, the kits of the invention comprise one or more containers that contain recombinant vectors encoding a protein of interest. The kits may further comprise a corresponding set of instructions, typically written instructions, that relate to the use of the vectors in any method described herein.

Наборы могут содержать компоненты в любой подходящей удобной упаковке. Например, если рекомбинантные векторы представлены в виде сухого состава (например, лиофилизированного или сухого порошка), то обычно используют сосуд с эластичной пробкой с тем, чтобы векторы можно было легко ресуспендировать посредством инъекции текучего вещества через эластичную пробку. Для жидких составов удобнее всего использовать ампулы с неэластичными съемными закупоривающими устройствами (например, запаянное стекло) или эластичными пробками. Также предполагается упаковка для использования в сочетании с конкретным устройством, таким как шприц или инфузионное устройство, такое как мининасос.Kits may contain the components in any suitable, convenient packaging. For example, if the recombinant vectors are presented as a dry formulation (e.g., lyophilized or dry powder), a vial with a flexible stopper is typically used so that the vectors can be easily resuspended by injection of a flowable substance through the flexible stopper. For liquid formulations, ampoules with non-flexible, removable closures (e.g., sealed glass) or flexible stoppers are most convenient. Packaging for use in conjunction with a specific device, such as a syringe or an infusion device such as a minipump, is also contemplated.

Инструкции, относящиеся к использованию или рекомбинантным векторам, как правило, содержат информацию о дозировке, режиме дозирования и пути введения для предполагаемого способа использования. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, насыпные упаковки (например, многодозовые упаковки) или субстандартные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, лист бумаги, включенный в набор), однако также приемлемы машиночитаемые инструкции (например, инструкции, расположенные на магнитном или оптическом носителе).Instructions relating to use or recombinant vectors typically contain information on the dosage, dosing regimen, and route of administration for the intended method of use. Containers may be unit doses, bulk packages (e.g., multi-dose packages), or sub-unit doses. Instructions supplied in kits of the invention typically are written instructions on a label or package insert (e.g., a sheet of paper included in the kit), but machine-readable instructions (e.g., instructions located on a magnetic or optical carrier) are also acceptable.

2. Экспериментальная часть2. Experimental part

Ниже приведены примеры конкретных вариантов осуществления для выполнения настоящего изобретения. Примеры предложены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.The following are examples of specific embodiments for carrying out the present invention. The examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температур и т.д.), но конечно следует предусматривать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения.Efforts have been made to ensure accuracy with respect to the numbers used (e.g. quantities, temperatures, etc.), but some experimental error and variation should of course be allowed for.

Вещества и способыSubstances and methods

Векторы AAV. Открытую рамку считывания иллюстративного гена SMN1 человека (открытая рамка считывания последовательности показана на фиг.9A; соответствующая аминокислотная последовательность показана на фиг.9B; полная нуклеотидная последовательность найдена под номером доступа Genbank NM_000344)) клонировали в челночную плазмиду, содержащую или инвертированные концевые повторы (ITR) AAV2 и энхансер цитомегаловируса/промотор β-актина (CBA) курицы длиной 1,6 т.п.н., или ITR scAAV2 и промотор β-глюкуронидазы (GUSB) человека длиной 0,4 т.п.н. Ограничение размера рекомбинантного генома в реакции упаковки scAAV требует использования маленького промотора (McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Таким образом, был выбран промотор GUSB длиной 0,4 т.п.н., поскольку его экспрессия происходит повсеместно на всем протяжении ЦНС, включая двигательные нейроны спинного мозга (Passini et al., J. Virol. (2001) 75:12382-12392). Каждую рекомбинантную плазмиду упаковывали в капсид серотипа AAV-8 посредством совместной трансфекции клеток 293 человека тремя плазмидами (см., например, патент США № 6001650, в полном объеме включенный в настоящий документ посредством ссылки) и очищали вирионы на колонке, как сообщалось ранее (O’Riordan et al., J. Gene Med. (2000) 2:444-454). Титры получаемых векторов AAV2/8-CBA-hSMN1 (AAV-hSMN1) и scAAV2/8-GUSB-hSMN1 (scAAV-hSMN1) составляли 8,3 e12 и 2,8 e12 копий генома на мл, соответственно. AAV Vectors . The open reading frame of the exemplary human SMN1 gene (the open reading frame sequence is shown in Fig. 9A; the corresponding amino acid sequence is shown in Fig. 9B; the complete nucleotide sequence is found under Genbank accession number NM_000344)) was cloned into a shuttle plasmid containing either the AAV2 inverted terminal repeats (ITRs) and the 1.6-kb chicken cytomegalovirus enhancer/β-actin (CBA) promoter, or the scAAV2 ITR and the 0.4-kb human β-glucuronidase (GUSB) promoter. Limiting the size of the recombinant genome in the scAAV packaging reaction requires the use of a small promoter (McCarty, DM Molec. Ther . (2008) 16 :1648–1656). Thus, the 0.4 kb GUSB promoter was chosen because it is expressed ubiquitously throughout the CNS, including spinal cord motor neurons (Passini et al., J. Virol . (2001) 75:12382–12392). Each recombinant plasmid was packaged into the AAV-8 serotype capsid by co-transfection of human 293 cells with the three plasmids (see, e.g., U.S. Patent No. 6,001,650, incorporated herein by reference in its entirety) and the virions were column purified as previously reported (O'Riordan et al., J. Gene Med . (2000) 2 :444-454). The titers of the resulting AAV2/8-CBA-hSMN1 (AAV-hSMN1) and scAAV2/8-GUSB-hSMN1 (scAAV-hSMN1) vectors were 8.3 e12 and 2.8 e12 genome copies per ml, respectively.

Животные и процедуры. Скрещивали гетерозиготные (SMN+/-, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+) племенные пары, и в день рождения (P0) новорожденные детеныши получали всего 3 инъекции по 2 мкл каждая в боковые желудочки обоих полушарий головного мозга и в верхнюю часть поясничного отдела спинного мозга. Общие дозы вирусных векторов составляли 5,0 e10 и 1,7 e10 копий генома для AAV-hSMN1 и scAAV-hSMN1, соответственно. Все инъекции осуществляли с использованием высококачественной вытянутой иглы стеклянной микропипетки, как описано (Passini et al, J. Virol. (2001) 75:12382-12392). После инъекций детенышам отрезали пальцы стопы и определяли их генотипы (Le et al., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857), чтобы идентифицировать мышей с SMA (SMN-/-, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+), гетерозиготных мышей и мышей дикого типа (SMN+/+, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+). Весь помет отбраковывали, оставив 7 детенышей для контроля размера помета по выживаемости. Часть помета не получала инъекции для того, чтобы создать не получавшие лечение контрольные группы. Animals and procedures . Heterozygous (SMN +/- , hSMN2 +/+ , SMNΔ7 +/+ ) breeding pairs were mated and on the day of birth (P0), neonatal pups received a total of 3 injections of 2 μl each into the lateral ventricles of both cerebral hemispheres and into the upper lumbar spinal cord. Total doses of viral vectors were 5.0 e10 and 1.7 e10 genome copies for AAV-hSMN1 and scAAV-hSMN1, respectively. All injections were performed using a high-quality pulled glass micropipette needle as described (Passini et al, J. Virol . (2001) 75 :12382–12392). Following injections, pups were toe-excised and genotyped (Le et al., Hum. Mol. Genet . (2005) 14 :845–857) to identify SMA mice (SMN -/- , hSMN2 +/+ , SMNΔ7 +/+ ), heterozygous mice, and wild-type mice (SMN +/+ , hSMN2 +/+ , SMNΔ7 +/+ ). The entire litter was discarded, leaving 7 pups as a litter size control for survival. A subset of the litter was not injected to create untreated controls.

Вестерн-блоттинг. Для биохимического анализа получавших и не получавших лечение мышей умерщвляли на 16 и 58-66 сутки, проводили реперфузию фосфатно-солевым буфером (PBS), спинной мозг иссекали, разделяли на поясничный, грудной и шейный отделы и быстро замораживали в жидком азоте. Ткани гомогенизировали в концентрации 50 мг/мл, используя буфер для лизиса T-Per и коктейль ингибиторов протеаз (Pierce, Rockford, IL). Гомогенаты осветляли посредством центрифугирования на скорости 10000 RCF в течение 6 минут и измеряли концентрацию белка посредством анализа с BCA (Pierce, Rockford, IL). 10-20 мкг белка гомогената разделяли на 4-12% SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и исследовали с использованием моноклональных антител мыши против SMN (1:5000 BD Biosciences, San Jose, CA) и поликлональных антител кролика против β-тубулина (1:750, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Мембраны инкубировали с инфракрасными вторичными антителами (1:20000, LI-COR Biosciences, Lincoln NB) и полосы белка визуализировали посредством количественной флуоресценции, используя Odyssey (LI-COR Biosciences). Маркеры молекулярной массы подтверждали размеры полос. Western blot . For biochemical analysis, treated and untreated mice were sacrificed at days 16 and 58–66, reperfused with phosphate-buffered saline (PBS), and the spinal cords were dissected, divided into lumbar, thoracic, and cervical sections, and snap frozen in liquid nitrogen. Tissues were homogenized at 50 mg/ml using T-Per lysis buffer and protease inhibitor cocktail (Pierce, Rockford, IL). Homogenates were clarified by centrifugation at 10,000 RCF for 6 min, and protein concentration was measured by the BCA assay (Pierce, Rockford, IL). 10–20 μg of protein homogenate were separated on 4–12% SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membrane, and probed with mouse monoclonal anti-SMN antibody (1:5000, BD Biosciences, San Jose, CA) and rabbit polyclonal anti-β-tubulin antibody (1:750, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Membranes were incubated with infrared secondary antibodies (1:20,000, LI-COR Biosciences, Lincoln NB), and protein bands were visualized by quantitative fluorescence using Odyssey (LI-COR Biosciences). Molecular weight markers confirmed band sizes.

Иммуногистохимия. Для гистологического анализа получавших и не получавших лечение мышей умерщвляли на 16 и 58-66 сутки, проводили реперфузию с использованием 4% параформальдегида (pH 7,4), спинной мозг удаляли и помещали в 30% сахарозу на 48-72 часа, заливали в OCT и резали на 10 мкм замороженные срезы посредством криостата. Срезы спинного мозга блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре (КТ) и затем инкубировали или с моноклональными антителами мыши против SMN (разведение 1:200) для идентификации экспрессии hSMN, обусловленной AAV, или с поликлональными антителами козы против холинацетилтрансферазы (ChAT) (Millipore; Burlington, MA; разведение 1:100) для идентификации двигательных нейронов 8 и 9 пластинок (передний рог) спинного мозга, или с поликлональными антителами кролика против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (Sigma-Aldrich, разведение 1:2500) для обнаружения астроцитов. Первичные антитела инкубировали в течение 1 часа при КТ с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C в увлажнительной камере. Затем срезы спинного мозга инкубировали в течение 1 часа при КТ или с ФИТЦ-конъюгированным вторичным антителом против антитела кролика, или с Cy3-конъюгированным вторичным антителом против антитела козы (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA; разведение 1:250). Для усиления иммуноположительного сигнала SMN и ChAT использовали TSA signal amplification kit (Perkin Elmer; Waltham, MA) или протокол восстановления антигена лимонной кислотой (Vector Labs; Burlingame, CA) в соответствии с инструкциями производителя, соответственно. Срезы закрывали покровными стеклами с использованием среды для заливки Vectashield (Vector Labs; Burlingame, CA). Immunohistochemistry . For histological analysis, treated and untreated mice were sacrificed at days 16 and 58–66, reperfused with 4% paraformaldehyde (pH 7.4), spinal cords were removed and placed in 30% sucrose for 48–72 h, embedded in OCT, and cryostat-cut into 10 μm frozen sections. Spinal cord sections were blocked for 1 h at room temperature (RT) and then incubated with either mouse monoclonal anti-SMN antibody (1:200 dilution) to identify AAV-mediated hSMN expression, goat polyclonal anti-choline acetyltransferase (ChAT) antibody (Millipore; Burlington, MA; 1:100 dilution) to identify spinal cord lamina 8 and 9 (anterior horn) motor neurons, or rabbit polyclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody (Sigma-Aldrich; 1:2500 dilution) to detect astrocytes. Primary antibodies were incubated for 1 h at RT followed by overnight incubation at 4°C in a humidified chamber. Spinal cord sections were then incubated for 1 h at RT with either FITC-conjugated anti-rabbit secondary antibody or Cy3-conjugated anti-goat secondary antibody (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA; 1:250 dilution). To enhance the immunopositive signal of SMN and ChAT, a TSA signal amplification kit (Perkin Elmer; Waltham, MA) or a citric acid antigen retrieval protocol (Vector Labs; Burlingame, CA) were used according to the manufacturer's instructions, respectively. Sections were coverslipped using Vectashield mounting medium (Vector Labs; Burlingame, CA).

Подсчет двигательных нейронов. Число иммуноположительных по ChAT клеток считали в шейном, грудном и поясничном отделах. Двусторонний подсчет осуществляли при 100× увеличении в передних рогах вдоль рострокаудальной оси трех отделов спинного мозга. Соседние срезы имели расстояние по меньшей мере 100 мкм, чтобы предотвратить двойной подсчет одной клетки. Особое внимание уделяли сравнению анатомически совпадающих срезов между различными животными, и один наблюдатель вслепую определял все количества клеток. Клетки, расположенные в 8 и 9 пластинках спинного мозга, которые давали флуоресцентный ChAT сигнал заметно выше фонового, считали двигательными нейронами. Motor neuron counting . ChAT-immunopositive cells were counted in the cervical, thoracic, and lumbar regions. Bilateral counts were performed at 100× magnification in the anterior horns along the rostrocaudal axis of the three spinal cord regions. Adjacent sections were separated by at least 100 μm to prevent double counting of a single cell. Special care was taken to compare anatomically matched sections between different animals, and all cell counts were determined blinded by one observer. Cells located in lamina 8 and 9 of the spinal cord that yielded a ChAT fluorescent signal significantly above background were considered motor neurons.

Размер мышечного волокна. Для гистологического анализа периферии фиксированные квадрицепсы, икроножные и межреберные мышцы с правой стороны каждой мыши обрабатывали в парафине и окрашивали гематоксилин-эозином для определения размера мышечного волокна, как сообщалось (Avila et al., J. Clin. Invest. (2007) 117:659-671). Приблизительно 500 неперекрывающихся мышечных волокон из каждой мышцы каждого животного случайно выбирали и фотографировали при 60× увеличении. Площадь поперечного сечения каждого мышечного волокна измеряли, используя программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Muscle fiber size . For histological analysis of the periphery, fixed quadriceps, gastrocnemius, and intercostal muscles from the right side of each mouse were paraffin-embedded and stained with hematoxylin and eosin to determine muscle fiber size as reported (Avila et al., J. Clin. Invest . (2007) 117 :659–671). Approximately 500 non-overlapping muscle fibers from each muscle of each animal were randomly selected and photographed at 60× magnification. The cross-sectional area of each muscle fiber was measured using Metamorph software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Окрашивание нервно-мышечных соединений (NMJ). Фиксированные мышечные группы с левой стороны каждой мыши хранили в PBS для анализа NMJ. Осуществляли окрашивание расправленных мышечных волокон квадрицепсов, икроножных и межреберных мышц in toto, как сообщалось (Lesbordes et al., Hum. Mol. Genet. (2003) 12:1233-1239). Пресинаптические терминали нервов метили посредством инкубации при 4°C в течение ночи с поликлональными антителами кролика против 150 кДа изоформы нейрофиламента (NF-M, Millipore, Billerica, MA, разведение 1:200), за которым следовало биотинилированное вторичное антитело против антитела кролика (Jackson ImmunoResearch, разведение 1:200). Ацетилхолиновые рецепторы на концевых пластинках мышц метили Alexa 555-конъюгированным α-бунгаротоксином (Molecular Probes, Eugene, OR) в разведении 1:5000 в течение 3 часов при КТ. Окрашенные мышечные волокна помещали на предметные стекла, накрывали покровными стеклами с использованием Vectashield и наблюдали под эпифлуоресцентным микроскопом. Для количественного анализа NMJ минимум 100 NMJ от каждой мышцы каждого животного случайно выбирали и оценивали под микроскопом. Захват конфокальных изображений осуществляли, используя микроскоп Zeiss LSM 510-META. Neuromuscular junction (NMJ) staining . Fixed muscle groups from the left side of each mouse were stored in PBS for NMJ analysis. In toto staining of extended muscle fibers of the quadriceps, gastrocnemius, and intercostal muscles was performed as reported (Lesbordes et al., Hum. Mol. Genet . (2003) 12 :1233–1239). Presynaptic nerve terminals were labeled by incubation at 4°C overnight with a rabbit polyclonal antibody against the 150 kDa neurofilament isoform (NF-M, Millipore, Billerica, MA, dilution 1:200), followed by a biotinylated anti-rabbit secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, dilution 1:200). Acetylcholine receptors on muscle end plates were labeled with Alexa 555-conjugated α-bungarotoxin (Molecular Probes, Eugene, OR) at a 1:5000 dilution for 3 h at RT. Stained muscle fibers were placed on glass slides, coverslipped with Vectashield, and observed under an epifluorescence microscope. For NMJ quantification, a minimum of 100 NMJs from each muscle of each animal were randomly selected and evaluated under the microscope. Confocal images were captured using a Zeiss LSM 510-META microscope.

Поведенческие тесты. В тесте на выпрямительный рефлекс каждую мышь помещали в положение лежа на спине и измеряли время, которое у мыши занимала смена на положение на всех четырех лапах. Процедуру повторяли три раза для каждого животного, и среднее значение трех оценок означало оценку выпрямления. Тест прерывали, если мышь не реагировала в течение 60 секунд. В тесте на отрицательный геотаксис каждую мышь помещали на платформу под углом 45° головой вниз. Тест считали успешным, если мышь поворачивалась на 180° в положение головой вверх. Каждой мыши давали три попытки выполнить задание за 180 секунд или менее. В тесте на силу хватания передние конечности и задние конечности помещали вместе на проволочную решетку и осторожно тянули горизонтально вдоль сетки. Сопротивление регистрировали в граммах посредством преобразователя силы. В тесте на разведение задних конечностей каждую мышь подвешивали за хвост на 5 секунд и получаемое разведение оценивали, основываясь на произвольной системе. Здоровому разведению обеих задних конечностей, схожему с наблюдаемым у мышей дикого типа, давали оценку 4. Острому углу разведения или «слабому разведению» обеих задних конечностей давали оценку 3. Разведению одной ноги давали оценку 2. Мышь, которая не показывала разведение, получала оценку 1. В итоге, оценку 0 получали детеныши, которые вытягивали обе задние конечности вместе, фактически скрещивая их друг с другом. Behavioural tests . In the righting reflex test, each mouse was placed in a supine position and the time it took the mouse to shift to a quadrupedal position was measured. The procedure was repeated three times for each animal and the average of the three scores constituted the righting score. The test was terminated if the mouse did not respond within 60 s. In the negative geotaxis test, each mouse was placed on a platform at a 45° angle with the head down. The test was considered successful if the mouse rotated 180° to the head up position. Each mouse was given three attempts to complete the task in 180 s or less. In the grasp strength test, the forelimbs and hindlimbs were placed together on a wire grid and gently pulled horizontally along the grid. The resistance was recorded in grams using a force transducer. In the hindlimb extension test, each mouse was suspended by the tail for 5 s and the resulting extension was scored using an arbitrary system. A healthy abduction of both hind limbs, similar to that seen in wild-type mice, was given a score of 4. A sharp abduction angle, or "weak abduction," of both hind limbs was given a score of 3. Abduction of one leg was given a score of 2. A mouse that did not exhibit abduction was given a score of 1. Finally, a score of 0 was given to pups that extended both hind limbs together, effectively crossing them over each other.

Статистика. Поведенческие тесты, число двигательных нейронов, площади поперечного сечения мышечных волокон и нервно-мышечные соединения анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного критерия Бонферрони для множественных сравнений и непарного двустороннего критерия Стьюдента. Кривую выживаемости Каплана-Мейера анализировали с помощью логарифмического рангового критерия, эквивалентного критерию Мантеля-Гензеля. Весь статистический анализ осуществляли в GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Значимыми считали значения с p<0,05. Statistics . Behavioral tests, motor neuron numbers, muscle fiber cross-sectional areas, and neuromuscular junctions were analyzed using one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test for multiple comparisons and unpaired two-tailed Student's t-test. Kaplan-Meier survival curves were analyzed using the log-rank test equivalent to the Mantel-Haenszel test. All statistical analyses were performed in GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Values with p<0.05 were considered significant.

Пример 1Example 1

Значимое увеличение выживаемости при лечении с использованием AAV-опосредованной доставки SMN1Significant increase in survival with treatment using AAV-mediated delivery of SMN1

В постнатальные сутки 0 (P0) мыши с SMA получали интрацеребровентрикулярную инъекцию AAV-hSMN1 в оба боковых желудочка головного мозга и прямую спинномозговую инъекцию в верхнюю часть поясничного отдела спинного мозга с общей дозой 5,0 e10 копий генома на мышь. Мышей с SMA, получавших и не получавших лечение, случайно определяли или в когорту выживаемости, в которой всех мышей оставляли в покое и умерщвляли в гуманной конечной точке, или в когорту с совпадающим возрастом, в которой всех мышей умерщвляли на 16 сутки для сравнения с не получавшими лечение мышами в терминальной стадии SMA с совпадающим возрастом.On postnatal day 0 (P0), SMA mice received an intracerebroventricular injection of AAV-hSMN1 into both lateral ventricles of the brain and a direct spinal injection into the upper lumbar spinal cord for a total dose of 5.0 e10 genome copies per mouse. Treated and untreated SMA mice were randomly assigned to either a survival cohort in which all mice were spared and sacrificed at a humane endpoint, or an age-matched cohort in which all mice were sacrificed at day 16 for comparison with age-matched, untreated, terminal SMA mice.

В когорте выживаемости мыши с SMA, которых лечили с использованием AAV-hSMN1, демонстрировали значительное увеличение среднего значения продолжительности жизни до 50 суток (p<0,0001) по сравнению с 15 сутками у не получавших лечение контрольных мышей с SMA (фиг.1). Все мыши с SMA, получавшие лечение, оставались живы на 15 сутки и 87,5% мышей с SMA, получавших лечение, оставались на 19 сутки по сравнению с 0% у мышей с SMA, не получавших лечение. Кривая Каплана-Мейера при лечении показывала бимодальное распределение выживаемости, в котором первая группа погибала на 17-27 сутки, а вторая группа на 58-66 сутки (фиг.1). В первой группе большинство мышей с SMA, получавших лечение, демонстрировало способность передвигаться, но мыши имели задержки роста и в итоге их находили мертвыми в клетке. Вторая группа мышей с SMA, получавших лечение, на 58-66 сутки демонстрировала способность передвигаться и увеличение массы, но в итоге происходило развитие тяжелого некроза задних конечностей, который приводил к эвтаназии животного. По существу, параллельно анализировали мышей в возрасте 58-66 суток и когорту с совпадающим возрастом в 16 суток.In the survival cohort, SMA mice treated with AAV-hSMN1 demonstrated a significant increase in median survival to 50 days (p<0.0001) compared to 15 days in untreated control SMA mice (Fig. 1). All treated SMA mice were alive at day 15 and 87.5% of treated SMA mice survived at day 19 compared to 0% in untreated SMA mice. The Kaplan-Meier curve for treatment showed a bimodal survival distribution with the first group dying at days 17-27 and the second group at days 58-66 (Fig. 1). In the first group, most of the treated SMA mice demonstrated ambulatory ability, but the mice were growth-retarded and were eventually found dead in their cages. The second group of treated SMA mice demonstrated ambulation and weight gain at 58-66 days, but eventually developed severe hindlimb necrosis, leading to euthanasia. In essence, the 58-66 day old mice and the 16 day age matched cohort were analyzed in parallel.

Пример 2Example 2

AAV-опосредованная экспрессия SMN в спинном мозге и число двигательных нейроновAAV-mediated spinal cord SMN expression and motor neuron number

По всему спинному мозгу происходило повышение уровней белка hSMN после введения AAV-hSMN1 в ЦНС. У всех мышей с SMA, получавших лечение AAV, на 16 сутки имело место приблизительно 34,0- и 3,6-кратное повышение уровней белка hSMN в инъецированном поясничном отделе по сравнению с мышами с SMA, не получавшими лечение, и мышами дикого типа, соответственно (фиг.2A). Повышение экспрессии белка hSMN распространялось в другие отделы, что включало более чем 2,0-кратное повышение относительно уровней дикого типа в грудном и шейном отделах спинного мозга на 16 сутки (фиг.2B и 2C). Во второй группе экспрессию белка hSMN поддерживали у мышей с SMA, получавших лечение AAV, на 58-66 сутки. Инъецированная поясничная и соседние грудная и шейная области превышали контроли WT с совпадающим возрастом приблизительно в 2,5, 2,2 и 1,2 раза, соответственно.hSMN protein levels were increased throughout the spinal cord following intracranial AAV-hSMN1 administration. In all AAV-treated SMA mice, there were approximately 34.0- and 3.6-fold increases in hSMN protein levels in the injected lumbar cord at day 16 compared with untreated and wild-type SMA mice, respectively (Fig. 2A). The increase in hSMN protein expression extended to other regions, including greater than 2.0-fold increases relative to wild-type levels in the thoracic and cervical spinal cord at day 16 (Figs. 2B and 2C). In a second group, hSMN protein expression was maintained in AAV-treated SMA mice at days 58–66. Injected lumbar and adjacent thoracic and cervical regions exceeded age-matched WT controls by approximately 2.5, 2.2, and 1.2 times, respectively.

Иммуноокрашивание тканевых срезов показывало белок hSMN в заднем и переднем рогах спинного мозга у мышей с SMA, получавших лечение, на 16 и 58-66 сутки (фиг.3). При более тщательном исследовании трансдуцированных клеток обнаруживали обусловленную вектором экспрессию hSMN в виде пятен по всему цитозолю и кристаллических структур в ядре (фиг.3A). Кроме того, белок hSMN локализован в нейритах в виде четких гранулярных структур, которые можно видеть по всей длине дендритов и аксонов (фиг.3B-3D). Очень низкий уровень эндогенного белка hSMN у мышей с SMA был ниже порога иммунологического определения в клетках (фиг.3E).Immunostaining of tissue sections revealed hSMN protein in the dorsal and anterior horns of the spinal cord of treated SMA mice at days 16 and 58–66 (Fig. 3). Closer examination of transduced cells revealed vector-mediated hSMN expression as spots throughout the cytosol and crystalline structures in the nucleus (Fig. 3A). In addition, hSMN protein was localized in neurites as distinct granular structures that could be seen along the entire length of dendrites and axons (Figs. 3B–3D). The very low levels of endogenous hSMN protein in SMA mice were below the threshold for immunodetection in cells (Fig. 3E).

Совместная локализация с ChAT и hSMN подтверждала, что подмножество трансдуцированных клеток действительно представляло собой двигательные нейроны (фиг.3F-3I). На 16 сутки приблизительно 18-42% ChAT-положительных клеток в поясничном, грудном и шейном отделах спинного мозга трансдуцировали вектором AAV-hSMN1 (фиг.3J). Эта процентная доля была выше на 58-66 сутки, когда 60-70% двигательных нейронов экспрессировали экзогенный hSMN в трех отделах спинного мозга (фиг.3J). Имело место общее увеличение числа двигательных нейронов у мышей с SMA, получавших лечение, по сравнению с мутантами, не получавшими лечение (фиг.4). Однако у мышей с SMA, получавших лечение, двигательных нейронов было значительно меньше по сравнению с мышами дикого типа на 16 и 58-66 сутки (фиг.4).Co-localization with ChAT and hSMN confirmed that a subset of the transduced cells were indeed motor neurons (Figs. 3F–3I). At day 16, approximately 18–42% of ChAT-positive cells in the lumbar, thoracic, and cervical spinal cords were transduced with the AAV-hSMN1 vector (Fig. 3J). This percentage was higher at days 58–66, when 60–70% of motor neurons expressed exogenous hSMN in the three spinal cord regions (Fig. 3J). There was an overall increase in the number of motor neurons in treated SMA mice compared with untreated mutants (Fig. 4). However, treated SMA mice had significantly fewer motor neurons compared with wild-type mice at days 16 and 58–66 (Fig. 4).

Осуществляли иммуноокрашивание hSMN в шейных тканевых срезах гетерозиготных мышей, не получавших лечение, получавших только интрацеребровентрикулярные (ICV) инъекции и получавших только поясничные инъекции. Отдельные ICV инъекции не вносили вклад в поддающиеся оценке паттерны трансдукции AAV в головном мозге, но, тем не менее, создавали существенное нацеливание на шейный отдел спинного мозга, которое не было достижимо при использовании только поясничных инъекций. В частности, только ICV инъекции приводили к экспрессии hSMN в шейном отделе спинного мозга. В этом состояло отличие от интрапаренхимальных инъекций в поясничный отдел, которые показывали очень низкую трансдукцию шейного отдела спинного мозга, предположительно, вследствие дистальной близости места инъекции. Иногда SMN иммуноположительный сигнал с кристаллическим паттерном наблюдали в ядрах получавших лечение гетерозигот и мышей дикого типа. Однако этот паттерн иммуноокрашивания не наблюдали в ядрах мышей с SMA, не получавших лечение.hSMN immunostaining was performed in cervical tissue sections from untreated heterozygous mice, those receiving intracerebroventricular (ICV) injections alone, and those receiving lumbar injections alone. ICV injections alone did not contribute to measurable patterns of AAV transduction in the brain, but nevertheless created significant targeting to the cervical spinal cord that was not achievable with lumbar injections alone. In particular, ICV injections alone resulted in hSMN expression in the cervical spinal cord. This was in contrast to lumbar intraparenchymal injections, which showed very low cervical spinal cord transduction, presumably due to the distal proximity of the injection site. Occasional SMN immunopositive signal with a crystalline pattern was observed in the nuclei of treated heterozygotes and wild-type mice. However, this immunostaining pattern was not observed in the nuclei of untreated SMA mice.

Таким образом, сочетание ICV и поясничных инъекций у P0 мышей обеспечивало обширную повсеместную трансдукцию спинного мозга. ICV инъекции AAV8-hSMN нацеливали на шейный отдел спинного мозга для трансдукции.Thus, the combination of ICV and lumbar injections in P0 mice provided broad, ubiquitous spinal cord transduction. ICV injections of AAV8-hSMN targeted the cervical spinal cord for transduction.

Пример 3Example 3

Влияние лечения с использованием AAV на размер мышечных волокон, нервно-мышечные соединения и поведениеEffects of AAV treatment on muscle fiber size, neuromuscular junctions and behavior

Для анализа выбирали квадрицепсы (проксимальные), икроножные (дистальные) и межреберные (дыхательные) мышцы, поскольку они проявляли заметную дегенерацию. На 16 сутки у мышей с SMA, не получавших лечение, мышечные волокна имели малые размеры, и площадь поперечного сечения большинства отдельных клеток составляла <100 мкм2 (фиг.5A). Менее чем у 10% мышечных волокон мышей с SMA, не получавших лечение, площадь поперечного сечения составляла более 200 мкм2. В отличие от этого, распределение размеров мышечных волокон у мышей с SMA, получавших лечение AAV-hSMN1, сходно с мышами дикого типа, и площадь поперечного сечения многих клеток составляла боле 200 и более 400 мкм2 на 16 и 58-66 сутки, соответственно (фиг.5A и 5B). Показано, что общее среднее значение на 16 сутки для мышечных волокон мышей с SMA, получавших лечение, более чем в 2 раза превышало таковое мышей с SMA, не получавших лечение (фиг.5C). Кроме того, средняя площадь поперечного сечения мышечного волокна у мышей с SMA, получавших лечение, на 58-66 сутки составляла 67%, 76% и 82% от таковой квадрицепсов, икроножных и межреберных мышц мышей дикого типа, соответственно (фиг.5C).The quadriceps (proximal), gastrocnemius (distal), and intercostal (respiratory) muscles were chosen for analysis because they exhibited marked degeneration. At day 16, untreated SMA mice had small muscle fibers and most individual cells had a cross-sectional area <100 μm2 (Fig. 5A ). Less than 10% of muscle fibers from untreated SMA mice had a cross-sectional area greater than 200 μm2 . In contrast, the fiber size distribution in AAV-hSMN1-treated SMA mice was similar to that of wild-type mice, and many cells had a cross-sectional area greater than 200 and greater than 400 μm2 at days 16 and 58–66, respectively (Figs. 5A and 5B). The overall mean value at day 16 for muscle fibers of treated SMA mice was shown to be more than 2-fold higher than that of untreated SMA mice (Fig. 5C). In addition, the mean muscle fiber cross-sectional area of treated SMA mice at days 58–66 was 67%, 76%, and 82% of that of the quadriceps, gastrocnemius, and intercostal muscles of wild-type mice, respectively (Fig. 5C).

Анализ нервно-мышечных соединений (NMJ) мышей с SMA, не получавших лечение, на 16 сутки показал аномальное накопление белка нейрофиламента в пресинаптических терминалях (фиг.6A). Приблизительно в 75-90% пресинаптических терминалей квадрицепсов, икроножных и межреберных мышц мышей с SMA, не получавших лечение (фиг.6F), наблюдали эту характерную патологию. В отличие от этого, большинство пресинаптических терминалей мышей с SMA, получавших лечение AAV-hSMN1, не содержало эти поврежденные структуры (фиг.6B, 6D). Только у 10-25% и 5% пресинаптических терминалей мышей с SMA, получавших лечение, наблюдали эту характерную патологию на 16 и 58-66 сутки, соответственно (фиг.6F). Однако лечение приводило к большему разветвлению пресинаптических терминалей, чем у мышей дикого типа (фиг.6B-6E). Окрашивание постсинаптических NMJ мышей с SMA, получавших лечение, и мышей дикого типа α-бунгаротоксином давало «кренделевидные» структуры, которые указывали на функциональную сеть ацетилхолиновых рецепторов (фиг.6B-6E).Analysis of neuromuscular junctions (NMJs) from untreated SMA mice at day 16 revealed abnormal accumulation of neurofilament protein in presynaptic terminals (Fig. 6A). Approximately 75–90% of presynaptic terminals from the quadriceps, gastrocnemius, and intercostal muscles of untreated SMA mice (Fig. 6F) exhibited this characteristic pathology. In contrast, the majority of presynaptic terminals from AAV-hSMN1-treated SMA mice did not contain these abnormal structures (Figs. 6B, 6D). Only 10–25% and 5% of presynaptic terminals from treated SMA mice exhibited this characteristic pathology at days 16 and 58–66, respectively (Fig. 6F). However, treatment resulted in greater arborization of presynaptic terminals than in wild-type mice (Figs. 6B-6E). Staining of postsynaptic NMJs of SMA-treated and wild-type mice with α-bungarotoxin yielded "pretzel-shaped" structures that were indicative of a functional acetylcholine receptor network (Figs. 6B-6E).

Мышей, получавших и не получавших лечение, периодически подвергали поведенческим тестам, которые одобрены для этой животной модели (Butchbach et al., Neurobiol. Dis. (2007) 27:207-219; El-Khodar et al., Exp. Neurol. (2008) 212:29-43). Мыши с SMA, получавшие лечение, имели хорошие оценки для корпуса и ходильные навыки, тогда как мыши с SMA, не получавшие лечение, были свободны и парализованы (фиг.7A). Мыши с SMA, получавшие лечение, были значительно тяжелее по массе, чем контрольные мыши с SMA, не получавшие лечение, хотя они никогда не достигали размера мышей дикого типа (фиг.7B). Мыши с SMA, получавшие лечение, показывали значимое улучшение задержки выпрямления (фиг.7C). Также мыши с SMA, получавшие лечение, значительно лучше выполняли тест на отрицательный геотаксис, который является мерой пространственного локомоторного поведения (фиг.7D). Кроме того, мыши с SMA, получавшие лечение, показывали значимое улучшение силы хватания и способности разводить свои задние конечности (фиг.7E, 7F).Treated and untreated mice were periodically subjected to behavioral tests that are validated for this animal model (Butchbach et al., Neurobiol. Dis . (2007) 27 :207–219; El-Khodar et al., Exp. Neurol . (2008) 212 :29–43). Treated SMA mice had good trunk scores and walking skills, whereas untreated SMA mice were free and paralyzed (Fig. 7A). Treated SMA mice were significantly heavier in weight than untreated SMA control mice, although they never reached the size of wild-type mice (Fig. 7B). Treated SMA mice showed significant improvement in righting latency (Fig. 7C). Also, treated SMA mice performed significantly better on the negative geotaxis test, which is a measure of spatial locomotor behavior (Fig. 7D). In addition, treated SMA mice showed significant improvements in grasp strength and the ability to spread their hind limbs (Figs. 7E, 7F).

Пример 4Example 4

Влияние использования самокомплементарного AAV на срок жизниImpact of self-complementary AAV use on survival

Без ограничения теорией предполагается, что самокомплементарные векторы AAV (scAAV) имеют более высокие кинетические показатели экспрессии благодаря двухцепочечному рекомбинантному геному (обсуждается в McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Это быстрое повышение экспрессии может быть полезным при очень агрессивных заболеваниях или состояниях, где временной интервал для вмешательства мал. Таким образом, чтобы определить, может ли более ранняя экспрессия повысить эффективность, конструировали и тестировали вектор scAAV (scAAV-hSMN1). Используя то же место инъекции, что и в примере 1, вводили дозу 1,7 e10 копий генома scAAV-hSMN1 мышам с SMA в P0.Without being limited by theory, it is proposed that self-complementary AAV (scAAV) vectors have higher kinetic expression rates due to the double-stranded recombinant genome (discussed in McCarty, DM Molec. Ther. (2008) 16 :1648–1656). This rapid increase in expression may be beneficial in very aggressive diseases or conditions where the time window for intervention is short. Thus, to determine whether earlier expression could improve efficacy, an scAAV vector (scAAV-hSMN1) was constructed and tested. Using the same injection site as in Example 1, a dose of 1.7 e10 copies of the scAAV-hSMN1 genome was administered to SMA mice at P0.

Лечение вектором scAAV-hSMN1 приводило к яркому и заметному улучшению среднего значения выживаемости, равной 157 суткам (p<0,0001), что составляло увеличение на 214% и 881% по сравнению с мышами с SMA, получавшими лечение вектором AAV-hSMN1 и не получавшими лечение, соответственно (фиг.8). Приблизительно 42% мышей, получавших лечение scAAV, имели более чем 1000% увеличение (log-кратное увеличение) среднего значения выживаемости. Кроме того, лечение с использованием scAAV2/8-GUSB-hSMN1 у 88% мышей с SMA приводило к выживанию после 66 суток в отличие от 0% при использовании AAV2/8-CBA-hSMN1. Мыши с SMA, получавшие лечение с использованием scAAV, обладали оценками для здорового корпуса, были хорошо ухожены, набирали вес и сохраняли способность передвигаться в течение всей их жизни. Интересно, что у мышей с SMA, получавших лечение с использованием scAAV, развивался только умеренный некроз задних конечностей, который никогда не прогрессировал в тяжелый фенотип. Большинство мышей с SMA, получавших лечение с использованием scAAV, умерщвляли вследствие непредвиденного и внезапного возникновения дыхательной недостаточности, которая включала слышимую щелкающую одышку при дыхании и сниженную частоту дыхания.Treatment with scAAV-hSMN1 vector resulted in a dramatic and significant improvement in median survival of 157 days (p<0.0001), which represented a 214% and 881% increase compared to AAV-hSMN1 vector-treated and untreated SMA mice, respectively (Fig. 8). Approximately 42% of scAAV-treated mice had a greater than 1000% increase (log-fold increase) in median survival. Furthermore, treatment with scAAV2/8-GUSB-hSMN1 resulted in 88% of SMA mice surviving beyond 66 days, compared to 0% with AAV2/8-CBA-hSMN1. SMA mice treated with scAAV had healthy body scores, were well groomed, gained weight, and maintained ambulation throughout their lives. Interestingly, scAAV-treated SMA mice developed only mild hindlimb necrosis, which never progressed to a severe phenotype. Most scAAV-treated SMA mice were sacrificed due to unexpected and sudden onset of respiratory failure, which included an audible clicking gasp and decreased respiratory rate.

Чтобы лучше понять основу наблюдаемого повышения выживаемости при использовании scAAV8-hSMN, дополнительные мыши с SMA получали лечение в P0, и их умерщвляли на 16 или 64 (58-66) сутки после инъекции и проводили анализ кривой выживаемости вместе с долгоживущими мышами, получавшими лечение scAAV8 (фиг.8). На 16 сутки уровни экспрессии SMN в группе scAAV8-hSMN составляли приблизительно 60-90% от наблюдаемых у животных WT. Эти уровни были по существу ниже достигаемых лечением с использованием AAV8-hSMN в этот момент времени. У мышей с SMA, получавших лечение с использованием scAAV8-hSMN, уровни SMN как в поясничном, так и в грудном отделе превышали уровни WT на 58-66 и 120-220 сутки, соответственно, или были равны им (фиг.2A и 2B). В отличие от этого, уровни SMN в шейном отделе спинного мозга оставались относительно низкими во все моменты времени.To better understand the basis for the observed survival benefit with scAAV8-hSMN, additional SMA mice were treated at P0 and sacrificed at days 16 or 64 (58-66) post-injection and survival curve analysis was performed along with long-lived scAAV8-treated mice (Fig. 8). At day 16, SMN expression levels in the scAAV8-hSMN group were approximately 60-90% of those observed in WT animals. These levels were substantially lower than those achieved with AAV8-hSMN treatment at this time point. In scAAV8-hSMN-treated SMA mice, SMN levels in both the lumbar and thoracic regions were greater than or equal to WT levels at days 58-66 and 120-220, respectively (Figs. 2A and 2B). In contrast, SMN levels in the cervical spinal cord remained relatively low at all time points.

Сравнение тропизма вектора AAV в поясничном отделе спинного мозга исследовали с использованием иммуноокрашивания hSMN в замороженных срезах тканей мышей с SMA, не получавших лечение, мышей с SMA, получавших лечение с использованием AAV8-hSMN, и мышей с SMA, получавших лечение с использованием scAAV8-hSMN, на 16 сутки и 157 сутки после инъекции. Диффузный паттерн иммуноокрашивания hSMN, соответствующий морфологии глиальных клеток, наблюдали на 16 сутки при использовании AAV8-hSMN. Двойное иммунное мечение hSMN и mGFAP подтверждало, что подмножество трансдуцированных AAV8-hSMN клеток представляло собой астроциты. В отличие от этого, лечение с использованием scAAV8 приводило к экспрессии hSMN только в отдельных телах клеток с нейрональной морфологией, которая не была локализована совместно с GFAP. Двойное иммунное мечение hSMN и маркера двигательных нейронов mChAT подтверждало, что подмножество клеток, трансдуцированных scAAV8-hSMN и AAV8-hSMN, представляло собой двигательные нейроны. Экспрессию hSMN также наблюдали в слоях вставочных нейронов спинного мозга при использовании обоих вирусных векторов, как показано на примере scAAV8-hSMN на 157 сутки. Таким образом, в отличие от AAV8-hSMN, гистологический анализ мышей с SMA, получавших лечение с использованием scAAV8-hSMN, показал, что экспрессия hSMN в нейронах в значительной степени ограничена.A comparison of AAV vector tropism in the lumbar spinal cord was examined using hSMN immunostaining in frozen tissue sections from untreated SMA mice, AAV8-hSMN-treated SMA mice, and scAAV8-hSMN-treated SMA mice at days 16 and 157 post-injection. A diffuse pattern of hSMN immunostaining consistent with glial cell morphology was observed at day 16 with AAV8-hSMN. Double immunolabeling of hSMN and mGFAP confirmed that a subset of AAV8-hSMN-transduced cells were astrocytes. In contrast, scAAV8 treatment resulted in hSMN expression only in isolated cell bodies with neuronal morphology that did not co-localize with GFAP. Double immunolabeling of hSMN and the motor neuron marker mChAT confirmed that a subset of cells transduced with scAAV8-hSMN and AAV8-hSMN were motor neurons. hSMN expression was also observed in the spinal cord interneuron layers with both viral vectors, as demonstrated for scAAV8-hSMN at day 157. Thus, in contrast to AAV8-hSMN, histological analysis of scAAV8-hSMN-treated SMA mice revealed that hSMN expression in neurons was largely restricted.

Кроме того, двойное иммуноокрашивание hSMN и mChAT показало значительное увеличение процентной доли двигательных нейронов, трансдуцированных scAAV8-hSMN, по сравнению с AAV8-hSMN (фиг.10A). Более эффективное нацеливание на двигательные нейроны при использовании scAAV коррелировало со значимым увеличением числа ChAT-положительных клеток (фиг.10B-10D). Анализ нервно-мышечных соединений (NMJ) в квадрицепсах и межреберных мышцах на 16 сутки также показывал значимое уменьшение числа поврежденных структур при использовании scAAV-hSMN по сравнению с AAV8-hSMN (фиг.10E и 10F). Однако имело место увеличение числа неправильных NMJ на 216-269 сутки, которому сопутствовало уменьшение числа двигательных нейронов в группе scAAV-hSMN (фиг.10B-10F). Furthermore, double immunostaining of hSMN and mChAT revealed a significant increase in the percentage of motor neurons transduced with scAAV8-hSMN compared to AAV8-hSMN (Fig. 10A). The more efficient targeting of motor neurons with scAAV correlated with a significant increase in the number of ChAT-positive cells (Figs. 10B-10D). Analysis of neuromuscular junctions (NMJs) in the quadriceps and intercostal muscles at day 16 also showed a significant decrease in the number of damaged structures with scAAV-hSMN compared to AAV8-hSMN (Figs. 10E and 10F). However, there was an increase in the number of abnormal NMJs at days 216-269, which was accompanied by a decrease in the number of motor neurons in the scAAV-hSMN group (Figs. 10B-10F).

В целом, инъекция AAV8-hSMN при рождении в ЦНС модели SMA на мышах приводила к повсеместной экспрессии SMN по всему спинному мозгу, которая переходила в устойчивое улучшение физиологии скелетных мышц. Животные с SMA, получавшие лечение, также показывали значимые улучшения в поведенческих тестах, что указывает на выполнение нервно-мышечными соединениями своей функции. Важно, что лечение с использованием AAV8-hSMN увеличивало среднее значение продолжительности жизни мышей с SMA до 50 суток по сравнению с 15 сутками у контрольных животных, не получавших лечение. Кроме того, инъекция самокомплементарного вектора AAV мышам с SMA приводила к повышению эффективности, включая значимое увеличение среднего значения выживаемости до 157 суток. Эти данные доказывают, что направленное на ЦНС, опосредованное AAV повышение SMN является высокоэффективным в отношении как нейрональных, так и мышечных патологий в модели тяжелой SMA на мышах.Overall, injection of AAV8-hSMN at birth into the CNS of a mouse SMA model resulted in widespread SMN expression throughout the spinal cord, which translated into robust improvements in skeletal muscle physiology. Treated SMA animals also showed significant improvements in behavioral tests, indicating that the neuromuscular junction is functioning. Importantly, treatment with AAV8-hSMN increased median survival to 50 days in SMA mice compared to 15 days in untreated controls. Furthermore, injection of the self-complementary AAV vector into SMA mice resulted in enhanced efficacy, including a significant increase in median survival to 157 days. These data demonstrate that CNS-targeted AAV-mediated SMN enhancement is highly effective against both neuronal and muscle pathologies in a mouse model of severe SMA.

Таким образом, описаны композиции и способы для лечения нарушений спинного мозга. Несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления рассматриваемого изобретения описаны с некоторыми подробностями, понятно, что различные изменения можно выполнять, не отступая от сущности и объема изобретения как, определено в настоящем документе.Thus, compositions and methods for treating spinal cord disorders are described. Although preferred embodiments of the subject invention have been described in some detail, it will be appreciated that various changes can be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined herein.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> GENZYME CORPORATION<110> GENZYME CORPORATION

PASSINI, Marco A.PASSINI, Marco A.

SHIHABUDDIN, LamyaSHIHABUDDIN, Lamya

CHENG, Seng H.CHENG, Seng H.

<120> ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ<120> GENE THERAPY FOR NEURODEGENERATIVE DISORDERS

<130> 0800-0056.40<130> 0800-0056.40

<150> US 61/174,982<150> US 61/174,982

<151> 2009-05-02<151> 2009-05-02

<150> US 61/268,059<150> US 61/268,059

<151> 2009-06-08<151> 2009-06-08

<160> 2 <160> 2

<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 885<211> 885

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> misc_feature<221> misc_feature

<223> последовательность кДНК гена выживаемости двигательных нейронов (SMN1)<223> cDNA sequence of the survival motor neuron gene (SMN1)

человекаhuman

<400> 1<400> 1

atggcgatga gcagcggcgg cagtggtggc ggcgtcccgg agcaggagga ttccgtgctg 60atggcgatga gcagcggcgg cagtggtggc ggcgtcccgg agcaggagga ttccgtgctg 60

ttccggcgcg gcacaggcca gagcgatgat tctgacattt gggatgatac agcactgata 120ttccggcgcg gcacaggcca gagcgatgat tctgacattt gggatgatac agcactgata 120

aaagcatatg ataaagctgt ggcttcattt aagcatgctc taaagaatgg tgacatttgt 180aaagcatatg ataaagctgt ggcttcattt aagcatgctc taaagaatgg tgacatttgt 180

gaaacttcgg gtaaaccaaa aaccacacct aaaagaaaac ctgctaagaa gaataaaagc 240gaaacttcgg gtaaaccaaa aaccacacct aaaagaaaac ctgctaagaa gaataaaagc 240

caaaagaaga atactgcagc ttccttacaa cagtggaaag ttggggacaa atgttctgcc 300caaaagaaga atactgcagc ttccttacaa cagtggaaag ttggggacaa atgttctgcc 300

atttggtcag aagacggttg catttaccca gctaccattg cttcaattga ttttaagaga 360atttggtcag aagacggttg catttaccca gctaccattg cttcaattga ttttaagaga 360

gaaacctgtg ttgtggttta cactggatat ggaaatagag aggagcaaaa tctgtccgat 420gaaacctgtg ttgtggttta cactggatat ggaaatagag aggagcaaaa tctgtccgat 420

ctactttccc caatctgtga agtagctaat aatatagaac aaaatgctca agagaatgaa 480ctactttccc caatctgtga agtagctaat aatatagaac aaaatgctca agagaatgaa 480

aatgaaagcc aagtttcaac agatgaaagt gagaactcca ggtctcctgg aaataaatca 540aatgaaagcc aagtttcaac agatgaaagt gagaactcca ggtctcctgg aaataaatca 540

gataacatca agcccaaatc tgctccatgg aactcttttc tccctccacc accccccatg 600gataacatca agcccaaatc tgctccatgg aactcttttc tccctccacc accccccatg 600

ccagggccaa gactgggacc aggaaagcca ggtctaaaat tcaatggccc accaccgcca 660ccagggccaa gactgggacc aggaaagcca ggtctaaaat tcaatggccc accaccgcca 660

ccgccaccac caccacccca cttactatca tgctggctgc ctccatttcc ttctggacca 720ccgccaccac caccacccca cttactatca tgctggctgc ctccatttcc ttctggacca 720

ccaataattc ccccaccacc tcccatatgt ccagattctc ttgatgatgc tgatgctttg 780ccaataattc ccccaccacc tcccatatgt ccagattctc ttgatgatgc tgatgctttg 780

ggaagtatgt taatttcatg gtacatgagt ggctatcata ctggctatta tatgggtttc 840ggaagtatgt taatttcatg gtacatgagt ggctatcata ctggctatta tatgggtttc 840

agacaaaatc aaaaagaagg aaggtgctca cattccttaa attaa 885agacaaaatc aaaaagaagg aaggtgctca cattccttaa attaa 885

<210> 2<210> 2

<211> 294<211> 294

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> misc_feature<221> misc_feature

<223> аминокислотная последовательность гена выживаемости двигательных<223> amino acid sequence of the motor survival gene

нейронов (SMN1) человекаneurons (SMN1) of humans

<400> 2<400> 2

Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp

20 25 30 20 25 30

Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala

35 40 45 35 40 45

Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp

85 90 95 85 90 95

Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr

100 105 110 100 105 110

Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr

115 120 125 115 120 125

Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro

130 135 140 130 135 140

Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu

145 150 155 160 145 150 155 160

Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro

165 170 175 165 170 175

Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser

180 185 190 180 185 190

Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly Phe Leu Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly

195 200 205 195 200 205

Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

210 215 220 210 215 220

Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro

225 230 235 240 225 230 235 240

Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp

245 250 255 245 250 255

Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr

260 265 270 260 265 270

His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg

275 280 285 275 280 285

Cys Ser His Ser Leu Asn Cys Ser His Ser Leu Asn

290 290

<---<---

Claims (11)

1. Способ лечения спинальной мышечной атрофии (SMA), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества рекомбинантных вирионов аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащих самокомплементарный аденоассоциированный вирусный (scAAV) вектор, содержащий гетерологичную конструкцию нуклеиновой кислоты, где гетерологичная конструкция нуклеиновой кислоты содержит:1. A method for treating spinal muscular atrophy (SMA), comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions comprising a self-complementary adeno-associated virus (scAAV) vector comprising a heterologous nucleic acid construct, wherein the heterologous nucleic acid construct comprises: a) первый инвертированный концевой повтор (ITR) AAV2,a) the first inverted terminal repeat (ITR) of AAV2, b) энхансер цитомегаловируса/промотор β-актина (CBA) курицы,b) chicken cytomegalovirus enhancer/beta-actin promoter (CBA), c) полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости двигательных нейронов (SMN), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID. NO:2, иc) a polynucleotide encoding a survival motor neuron (SMN) protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID. NO:2, and d) вторую ITR AAV2, и d) the second ITR AAV2, and где вирионы rAAV содержат капсид AAV8 или AAV9, и где вирионы scAAV вводят путем интратекальной инъекции.wherein the rAAV virions contain the AAV8 or AAV9 capsid, and wherein the scAAV virions are administered by intrathecal injection. 2. Способ по п. 1, где первый или второй ITR мутирован.2. The method of claim 1, wherein the first or second ITR is mutated. 3. Способ по п. 1 или 2, где первый или второй ITR содержит мутацию в последовательности концевого разрешения.3. The method according to claim 1 or 2, wherein the first or second ITR comprises a mutation in the terminal resolution sequence. 4. Способ по п. 2 или 3, где мутация включает делецию в последовательности концевого разрешения первого или второго ITR.4. The method according to claim 2 or 3, wherein the mutation comprises a deletion in the terminal resolution sequence of the first or second ITR. 5. Способ по любому из пп. 1-4, где вводят одноразовую дозу вирионов rAAV. 5. The method according to any one of paragraphs. 1-4, wherein a single dose of rAAV virions is administered. 6. Способ по любому из пп. 1-5, где вводят 106 до 1015 вирионов rAAV.6. The method according to any one of claims 1-5, wherein 10 6 to 10 15 rAAV virions are administered.
RU2021102985A 2009-05-02 2021-02-09 Gene therapy of neurodegenerative disorders RU2836835C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61/174,982 2009-05-02
US61/268,059 2009-06-08

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016140850A Division RU2743398C2 (en) 2009-05-02 2010-04-27 Gene therapy of neurodegenerative disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021102985A RU2021102985A (en) 2022-08-09
RU2836835C2 true RU2836835C2 (en) 2025-03-24

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119341A2 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Genzyme Corporation Gene therapy for spinal cord disorders
US20080187512A1 (en) * 2007-02-07 2008-08-07 Academia Sinica Treatment for spinal muscular atrophy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119341A2 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Genzyme Corporation Gene therapy for spinal cord disorders
US20080187512A1 (en) * 2007-02-07 2008-08-07 Academia Sinica Treatment for spinal muscular atrophy

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AZZOUZ M. et al., Lentivector-mediated SMN replacement in a mouse model of spinal muscular atrophy, J Clin Invest, 2004, v. 114(12), pp. 1726-1731. HOLLIS E.R. et al., Efficient retrograde neuronal transduction utilizing self-complementary AAV1, Mol Ther, 2008, v. 16(2), pp. 296-301. ИСЛАМОВ Р.Р. и др., Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний, Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2007, т. 2, номер 3, стр. 29-39. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12350311B2 (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
CA2606490C (en) Gene therapy for spinal cord disorders
RU2836835C2 (en) Gene therapy of neurodegenerative disorders
HK40073109A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders