RU2835209C1 - Test system for detection of apple chlorotic leafspot virus by real-time pcr method - Google Patents
Test system for detection of apple chlorotic leafspot virus by real-time pcr method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2835209C1 RU2835209C1 RU2024124256A RU2024124256A RU2835209C1 RU 2835209 C1 RU2835209 C1 RU 2835209C1 RU 2024124256 A RU2024124256 A RU 2024124256A RU 2024124256 A RU2024124256 A RU 2024124256A RU 2835209 C1 RU2835209 C1 RU 2835209C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- apple
- virus
- insdseq
- insdqualifier
- detection
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title abstract description 20
- 241000710009 Apple chlorotic leaf spot virus Species 0.000 title description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title description 6
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 abstract description 34
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 abstract description 34
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 abstract description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 abstract description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 abstract description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 abstract description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 abstract description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 abstract description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000219998 Philenoptera violacea Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
В открытых базах данных не было обнаружено российских патентов, посвященных ПЦР-диагностике вируса хлоротической пятнистости листьев яблони. Единственным обнаруженным патентом является RU2384045C2, предметом которого является разработка способа оценки растений яблони на вирусную инфекцию с использованием оптических характеристик листьев - степени когерентности светорассеяния и оценки изменения оптической плотности листа. Данный подход предполагает выявление заражённости ACLSV, в том числе при латентном протекании инфекции. Однако, эффективность предполагаемого подхода в значительной степени зависит от квалификации персонала, а также использование специализированного оборудования. No Russian patents devoted to PCR diagnostics of apple leaf chlorotic spot virus were found in open databases. The only patent found is RU2384045C2, the subject of which is the development of a method for assessing apple plants for viral infection using optical characteristics of leaves - the degree of coherence of light scattering and assessment of changes in leaf optical density. This approach involves identifying ACLSV infection, including latent infection. However, the effectiveness of the proposed approach largely depends on the qualifications of personnel, as well as the use of specialized equipment.
Было обнаружено несколько патентов Китайской Народной Республики, предметом которых являются методы ПЦР-диагностики ACLSV.Several patents of the People's Republic of China have been identified that cover PCR diagnostic methods for ACLSV.
CN103382508A (прекратил свое действие, но может быть восстановлен). Предметом патентования являются 4 тест-системы на 3 ключевых вируса (в т.ч. ACLSV) с использованием мультиплексной ПЦР с обратной транскрипцией. При этом, способом детекции в предлагаемом подходе является гель-электрофорез, использование которого сопряжено с высокими рисками контаминации рабочего пространства продуктами амплификации, приводящей, в конечном итоге к получению ложноположительных результатов. Также проблемой мультиплексного подхода является возможное конкурентное ингибирование параллельных реакций, особенно в случаях, когда генетический материал патогена находится в низкой концентрации. Кроме того, не вполне понятна чувствительность разработанных систем.CN103382508A (expired but may be reinstated). The subject of the patent is 4 test systems for 3 key viruses (including ACLSV) using multiplex PCR with reverse transcription. At the same time, the detection method in the proposed approach is gel electrophoresis, the use of which is associated with high risks of contamination of the working space with amplification products, ultimately leading to false positive results. Another problem with the multiplex approach is the possible competitive inhibition of parallel reactions, especially in cases where the pathogen's genetic material is in low concentration. In addition, the sensitivity of the developed systems is not entirely clear.
CN111057794A (прекратил свое действие, но может быть восстановлен). Предмет патентования - несколько праймерных систем для выявления ключевых вирусных патогенов яблони, в т.ч. ACLSV. Однако и в данном случае детекция осуществляется исключительно электрофоретическим методом. CN111057794A (expired, but may be reinstated). The subject of the patent is several primer systems for detecting key apple viral pathogens, including ACLSV. However, in this case, detection is carried out exclusively by the electrophoretic method.
CN103966362A (прекратил свое действие, но может быть восстановлен). Метод определения 4-х вирусов яблони в формате мультиплексной ПЦР с обратной транскрипцией. Преимуществом данной разработки является то, что, помимо специфических праймеров, в её состав входят также праймеры внутреннего контроля (ген фактора элонгации трансляции 1 альфа яблони), позволяющие проводить выявление ложноотрицательных результатов. Детекция результатов также осуществляется исключительно в формате гель-электрофореза. Также не приводятся данные по чувствительности тест-системы.CN103966362A (has ceased to be effective, but can be restored). A method for detecting 4 apple viruses in the format of multiplex PCR with reverse transcription. The advantage of this development is that, in addition to specific primers, it also includes internal control primers (the gene of the apple translation elongation factor 1 alpha), allowing for the detection of false negative results. Detection of results is also carried out exclusively in the format of gel electrophoresis. Also, no data on the sensitivity of the test system are provided.
Анализ опубликованных на сегодняшний день литературных источников показывает, что для диагностики ACLSV используются, главным образом три подхода: визуальная диагностика, иммунохимические методы (ELISA), и различные модификации методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот. При этом визуальные методы диагностики трудоемки и не позволяют выявлять латентную инфекцию. Иммунохимические подходы недостаточно чувствительны, и этот факт существенно снижает возможность их применения с учетом того факта, что в растительном соке вирусы содержатся, как правило, в низких концентрациях. Кроме того, существуют сложности с получением моноклональных антител. Что касается методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, то на эту тематику опубликован целый ряд работ, но детальный анализ опубликованных разработок позволяет выявить их некоторые недостатки. Некоторые статьи описывают разработку методов ПЦР-диагностики, при которых детекция осуществляется методом гель-электрофореза, что, как сказано выше, влечет высокий риск контаминации рабочей зоны [1-3]. Salmon et al., [4] предложили вариант флуоресцентной детекции ACLSV с использованием красителя, связывающегося с большой бороздкой ДНК. Такой подход позволяет снизить до минимума риск контаминации, однако поскольку интеркалирующий краситель может связываться с любой двуцепочечной ДНК, то существует риск неспецифической флуоресценции. An analysis of the literature published to date shows that three approaches are mainly used for the diagnosis of ACLSV: visual diagnostics, immunochemical methods (ELISA), and various modifications of methods based on nucleic acid amplification. However, visual diagnostic methods are labor-intensive and do not allow for the detection of latent infection. Immunochemical approaches are not sensitive enough, and this fact significantly reduces the possibility of their use, given the fact that viruses are usually contained in plant juice in low concentrations. In addition, there are difficulties in obtaining monoclonal antibodies. As for methods based on nucleic acid amplification, a number of works have been published on this topic, but a detailed analysis of the published developments allows us to identify some of their shortcomings. Some articles describe the development of PCR diagnostic methods, in which detection is carried out by gel electrophoresis, which, as stated above, entails a high risk of contamination of the working area [1-3]. Salmon et al., [4] proposed a variant of fluorescent detection of ACLSV using a dye that binds to the major groove of DNA. This approach minimizes the risk of contamination, but since the intercalating dye can bind to any double-stranded DNA, there is a risk of non-specific fluorescence.
Альтернативой классической и флуоресцентной ПЦР могут быть изотермические методы амплификации, при использовании которых синтез специфического продукта происходит при постоянной температуре. Lu et al., [5] предложили системы выявления ACLSV и других вирусов яблони с использованием петлевой изотермической амплификации (LAMP). Jeong et al., [6] разработали системы выявления ACLSV с использованием рекомбиназно-полимеразной амплификации (RPA), которые, согласно опубликованным данным, в 100 раз превосходят тест-системы на основе классической ПЦР с точки зрения чувствительности. Однако авторы проводили сравнение с тест-системами, не обладающими высокой чувствительностью, поэтому сделать окончательный вывод относительно этого параметра затруднительно. Очевидным недостатком систем на основе изотермических методов является необходимость дизайна 6-8 праймеров, что существенно сужает перечень потенциальных генов-мишеней, а также создаёт риски недостаточной специфичности. An alternative to classical and fluorescent PCR may be isothermal amplification methods, in which the synthesis of a specific product occurs at a constant temperature. Lu et al., [5] proposed systems for detecting ACLSV and other apple viruses using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Jeong et al., [6] developed systems for detecting ACLSV using recombinase polymerase amplification (RPA), which, according to published data, are 100 times more sensitive than test systems based on classical PCR. However, the authors conducted a comparison with test systems that do not have high sensitivity, so it is difficult to make a final conclusion regarding this parameter. An obvious disadvantage of systems based on isothermal methods is the need to design 6-8 primers, which significantly narrows the list of potential target genes and also creates risks of insufficient specificity.
Canales et al., [7] и Costa et al. [8] для изучения спектра вирусов, заражающих яблоню, использовали мультиплексную ПЦР и высокопроизводительное секвенирование. Метод высокопроизводительного секвенирования позволяет получать информацию о полном спектре вирусных патогенов, присутствующих в пробе, однако является дорогостоящим и не может быть использован в рутинной диагностической практике.Canales et al., [7] and Costa et al. [8] used multiplex PCR and high-throughput sequencing to study the spectrum of viruses infecting apple trees. High-throughput sequencing provides information on the full spectrum of viral pathogens present in a sample, but is expensive and cannot be used in routine diagnostic practice.
Тест-системой с наиболее оптимальными характеристиками, и наиболее близкой к разработке, описываемой в настоящем патенте, является предложенный Nickel and Fajardo [9] предложили метод мультиплексной ПЦР с использованием гидролизуемых (TaqMan) зондов для определения трех вирусов яблони в одной пробе. Как было упомянуто выше, ограничением мультиплексной ПЦР может быть ингибирование одной или инескольких параллельных реакций амплификации. Кроме того, авторы не дают точной информации о чувствительности тест-системы: предел обнаружения составил 2 фг тотальной кДНК, однако данных по минимально детектируемому количеству геном-эквивалентов на реакцию не приводится.The test system with the most optimal characteristics and the closest to the development described in this patent is the one proposed by Nickel and Fajardo [9] who proposed a multiplex PCR method using hydrolyzable (TaqMan) probes for the detection of three apple viruses in one sample. As mentioned above, a limitation of multiplex PCR may be the inhibition of one or more parallel amplification reactions. In addition, the authors do not provide precise information on the sensitivity of the test system: the detection limit was 2 fg of total cDNA, but no data on the minimum detectable number of genome equivalents per reaction are provided.
Список иллюстрацийList of illustrations
Рис. 1. Выравнивание фрагментов генов белка оболочки ACLSV и близкородственных вирусов, использованных для подбора прямого (ACLSVF) и обратного (ACLSVR) праймеров. Последовательности праймеров подчёркнуты. Fig. 1. Alignment of the envelope protein gene fragments of ACLSV and closely related viruses used to design the forward (ACLSVF) and reverse (ACLSVR) primers. Primer sequences are underlined.
Рис. 2. Карта вектора pAL2T, использованного для клонирования положительных контролей.Fig. 2. Map of the pAL2T vector used for cloning positive controls.
Рис. 3. Результаты ПЦР последовательных десятикратных разведений плазмиды, содержащей специфический продукт амплификации. По оси абсцисс показано логарифмические значения концентраций (геном-эквиваленты/реакцию), по оси ординат - значения соответствующих пороговых циклов. Fig. 3. Results of PCR of successive tenfold dilutions of a plasmid containing a specific amplification product. The abscissa axis shows the logarithmic values of concentrations (genome equivalents/reaction), and the ordinate axis shows the values of the corresponding threshold cycles.
Рис. 4. Флуоресцентный сигнал, детектируемый при ПЦР-анализе последовательных десятикратных разведений плазмид, содержащих специфический ампликон, с парой праймеров ACLSVF-ACLSVR и зондом ACLSVT Fig. 4. Fluorescent signal detected during PCR analysis of serial tenfold dilutions of plasmids containing a specific amplicon with the primer pair ACLSVF-ACLSVR and probe ACLSVT
Техническим результатом является разработка тест-системы для проведения высокоспецифичной идентификации кДНК, с высокой чувствительностью для обнаружения вируса хлоротической пятнистости листьев яблони методом пцр в реальном времени.The technical result is the development of a test system for highly specific identification of cDNA, with high sensitivity. for detection of apple leaf chlorotic spot virus by real-time PCR.
Предлагаемое техническое решение позволяет повысить чувствительность детекции, а также избежать проблем, связанных с контаминацией рабочего пространства продуктами амплификации. The proposed technical solution allows to increase detection sensitivity and avoid problems associated with contamination of the working space with amplification products.
Тест-система включает: смесь для проведения амплификации, состоящую из реакционного буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов, двух олигонуклеотидных праймеров, специфичных к фрагменту гена, кодирующего белок оболочки вируса, одного олигонуклеотидного зонда, меченного флуоресцентным красителем FAM, положительного контрольного образца, представляющего собой рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую соответствующий фрагмент генома вируса. Изобретение позволяет проводить высокоспецифичную идентификацию кДНК, с высокой чувствительностью (количество геном-эквивалентов, детектируемое в одной реакционной пробирке - не менее 10).The test system includes: a mixture for carrying out amplification, consisting of a reaction buffer, deoxynucleotide triphosphates, two oligonucleotide primers specific to a fragment of the gene encoding the virus envelope protein, one oligonucleotide probe labeled with a fluorescent dye FAM, a positive control sample, which is a recombinant plasmid DNA containing the corresponding fragment of the virus genome. The invention allows for highly specific identification of cDNA, with high sensitivity (the number of genome equivalents detected in one reaction tube is at least 10).
Дизайн праймеров проводили с помощью выравнивания последовательностей нуклеотидов, депонированных в базе данных NCBI c использованием алгоритма ClustalW. Помимо последовательностей нуклеотидов ACLSV, для выравнивания использовались последовательности нуклеотидов близкородственных видов. Наиболее вариабельным и пригодным для подбора праймеров был фрагмент гена белка оболочки. На рис. 1 приведены выравнивания фрагментов генов белка оболочки ACLSV и близкородственных вирусов, использованных для подбора праймеров.Primers were designed by aligning nucleotide sequences deposited in the NCBI database using the ClustalW algorithm. In addition to ACLSV nucleotide sequences, nucleotide sequences of closely related species were used for alignment. The most variable and suitable for primer selection was the coat protein gene fragment. Figure 1 shows the alignments of the coat protein gene fragments of ACLSV and closely related viruses used for primer selection.
В результате проведённого биоинформатического анализа был проведён дизайн олигонуклеотидов: прямого праймера (Seq1), обратного праймера (Seq2) и флуоресцентно-меченого зонда (Seq3). As a result of the conducted bioinformatics analysis, the design of oligonucleotides was carried out: a forward primer (Seq1), a reverse primer (Seq2) and a fluorescently labeled probe (Seq3).
Оценку специфичности тест-системы проводили с использованием заражённых образцов листьев и коры яблони, предоставленных сотрудниками Ставропольского государственного аграрного университета. Диагностика проводилась визуально с использование контрольных (не заражённых) растений в качестве референсов. The specificity of the test system was assessed using infected samples of apple leaves and bark provided by employees of the Stavropol State Agrarian University. Diagnostics were carried out visually using control (non-infected) plants as references.
Ниже приведены результаты ПЦР-анализа 18 образцов растений яблони.Below are the results of PCR analysis of 18 apple plant samples.
Табл. 1. Результаты ПЦР-анализа специфичности используемых систем. Table 1. Results of PCR analysis of the specificity of the systems used.
Продукты ПЦР, полученные в результате амплификации фрагмента ДНК «положительных» образцов были проклонированы в плазмидный вектор pAL2T (схема вектора приведена на рис. 2). Соответствие проклонированной последовательности фрагменту генома ACLSV подтверждали с помощью секвенирования по методу Сэнгера. Для вектора, содержащего вставку специфического продукта (pAL2T-ACLSV, Seq4), было проведено определение концентрации с использованием флуориметра QUBIT. Плазмида pAL2T-ACLSV затем использовалась в качестве положительного контрольного образца.The PCR products obtained from amplification of the DNA fragment of the “positive” samples were cloned into the pAL2T plasmid vector (the vector diagram is shown in Fig. 2). The correspondence of the cloned sequence to the ACLSV genome fragment was confirmed by Sanger sequencing. The vector containing the insert of the specific product (pAL2T-ACLSV, Seq4) was analyzed for concentration using a QUBIT fluorometer. The pAL2T-ACLSV plasmid was then used as a positive control sample.
Чувствительность тест-системы определяли с использованием последовательных десятикратных разведений плазмиды pAL2T-ACLSV. The sensitivity of the test system was determined using serial tenfold dilutions of the pAL2T-ACLSV plasmid.
Табл. 2. Определение чувствительности тест-системыTable 2. Determination of the sensitivity of the test system
Зависимость сигнала ПЦР (пороговый цикл) от концентрации ДНК в реакционной пробирке, выраженной в количестве геном-эквивалентов, приведена на рис. 3. На рис. 4 показаны уровни флуоресцентного сигнала при ПЦР последовательных десятикратных разведений положительного контрольного образца. The dependence of the PCR signal (threshold cycle) on the DNA concentration in the reaction tube, expressed as the number of genome equivalents, is shown in Fig. 3. Fig. 4 shows the levels of the fluorescent signal in PCR of successive tenfold dilutions of the positive control sample.
Тест-системы для определения РНК вируса хлоротической пятнистости листьев яблони используется следующим образом.The test system for detection of RNA of apple leaf spot virus is used as follows.
Предварительно выделяют РНК из биологического материала любым подходящим методом. В настоящей работе использовался подход, основанный на использовании реагента TRIZOL с последующей очисткой смесью фенол:хлороформ и переосаждением этиловым спиртом. RNA is preliminarily isolated from biological material by any suitable method. In this work, an approach based on the use of the TRIZOL reagent, followed by purification with a phenol:chloroform mixture and reprecipitation with ethyl alcohol, was used.
Проводится реакция обратной транскрипции, для чего может быть использован термостат, либо ПЦР-амплификатор.A reverse transcription reaction is carried out, for which a thermostat or a PCR amplifier can be used.
Для проведения реакции используют готовую смесь для амплификации, состоящую из буфера, дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченого зонда, Taq-полимеразы. Готовую реакционную смесь смешивают с образцами кДНК, положительным контрольным образцом и отрицательным контрольным образцом. Амплификацию проводят в течение в соответствии со следующей программой амплификации: ПЦР проводили в амплификаторе ДТ96 по следующей программе аплификации с детекцией в каналах FAM и HEX: 94°C - 90 сек 1 цикл; 94°C - 30 сек, 60°С - 30 сек - 5 циклов; 94°С - 10 сек, 60°С - 30 сек - 45 циклов.To carry out the reaction, a ready-made amplification mixture is used, consisting of a buffer, deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers, a fluorescently labeled probe, and Taq polymerase. The ready-made reaction mixture is mixed with cDNA samples, a positive control sample, and a negative control sample. Amplification is carried out in accordance with the following amplification program: PCR was carried out in a DT96 amplifier according to the following amplification program with detection in the FAM and HEX channels: 94°C - 90 sec 1 cycle; 94°C - 30 sec, 60°C - 30 sec - 5 cycles; 94°C - 10 sec, 60°C - 30 sec - 45 cycles.
Результат, для конкретного образца, считается положительным образца при превышении порового уровня флуоресценции в канале FAM выше определённого уровня. При этом. Пороговый уровень флуоресценции определяется программным обеспечением оборудования. The result for a specific sample is considered positive when the threshold fluorescence level in the FAM channel exceeds a certain level. In this case. The threshold fluorescence level is determined by the equipment software.
Для апробации разработанной тест-системы сотрудниками Ставропольского государственного аграрного университета было передано 6 образцов листьев яблони (вместе с черешками), выделенных в различных хозяйствах в разных районах Ставропольского края. Для проведения анализа на первом этапе проводилось выделение РНК. Для этого зелёную массу листьев гомогенизировали в 1 мл реагента TRIZOL (Ambion, Германия), после чего к гомогенату добавляли 0.3 мл хлороформа, центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин, к верхней фазе добавляли 500 мкл изпропанола, инкубировали 10 мин во льду. После чего повторно центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок промывали 75 % этанолом, после чего растворяли в 50 мкл деионизированной воды. Полученные РНК использовали для обратной транскрипции, которую проводили с использованием набора MMLV RT kit (Евроген, Россия) по протоколу производителя. Полученные кДНК использовали в качестве матриц в ПЦР в реальном времени с использованием разработанных специфических праймеров и зонда. ПЦР и анализ результатов проводили по протоколам, приведённым выше. В таблице 3 приведены результаты ПЦР-анализа. To test the developed test system, the employees of the Stavropol State Agrarian University transferred 6 samples of apple leaves (together with petioles), isolated in different farms in different areas of the Stavropol Territory. For the analysis, RNA was isolated at the first stage. For this, the green mass of the leaves was homogenized in 1 ml of the TRIZOL reagent (Ambion, Germany), after which 0.3 ml of chloroform was added to the homogenate, centrifuged for 10 min at 13,400 rpm, 500 μl of isopropanol were added to the upper phase, and the mixture was incubated for 10 min in ice. After that, the mixture was centrifuged again for 10 min at 13,400 rpm, the supernatant was removed, the sediment was washed with 75% ethanol, and then dissolved in 50 μl of deionized water. The obtained RNAs were used for reverse transcription, which was performed using the MMLV RT kit (Eurogen, Russia) according to the manufacturer's protocol. The obtained cDNAs were used as templates in real-time PCR using the developed specific primers and probe. PCR and analysis of the results were performed according to the protocols given above. Table 3 shows the results of the PCR analysis.
Табл. 3. Результаты ПЦР-анализа образцов, переданных из Ставропольского государственного аграрного университета Table 3. Results of PCR analysis of samples transferred from the Stavropol State Agrarian University
Как видно из полученных данных, 4 из 6 переданных образцов заражены ACLSV. Достоверность полученных данных была подтверждена секвенированием полученных продуктов, показавшим соответствие их нуклеотидных последовательностей структурам специфического фрагмента ACLSV. As can be seen from the data obtained, 4 of the 6 samples transferred were infected with ACLSV. The reliability of the data obtained was confirmed by sequencing the obtained products, which showed that their nucleotide sequences corresponded to the structures of a specific fragment of ACLSV.
По результатам проведённого исследования были предложены рекомендации по принятию мер фитосанитарного контроля. В частности, рекомендовано не использовать зараженные растения в качестве посадочного и/или прививочного материала; желательно утилизировать уже собранный материал. Based on the results of the study, recommendations were proposed for the adoption of phytosanitary control measures. In particular, it was recommended not to use infected plants as planting and/or grafting material; it is advisable to dispose of already collected material.
Перечень используемых нуклеотидных последовательностейList of nucleotide sequences used
Seq1Section 1
Олигонуклеотид: прямой праймерOligonucleotide: forward primer
Наименование: ACLSVF Name: ACLSVF
Последовательность (5’-3’): GGAAAGACAGGGGCAATYCSequence (5’-3’): GGAAAGACAGGGGCAATYC
Seq2Section 2
Олигонуклеотид: обратный праймерOligonucleotide: reverse primer
Наименование: ACLSVRName: ACLSVR
Последовательность (5’-3’): TBACYTTCTGRTCCTCCATBGASequence (5’-3’): TBACYTTCTGRTCCTCCATBGA
В структуру входят вырожденные нуклеотиды: B=C или G или T; Y=C или T; R=G или АThe structure includes degenerate nucleotides: B=C or G or T; Y=C or T; R=G or A
Seq3Section 3
Олигонуклеотид: флуоресецнтно-меченый зондOligonucleotide: fluorescently labeled probe
Наименование: ACLSVTName: ACLSVT
Последовательность (5’-3’): (BHQ1) - TGGAGTCCATCTT(FAMdT)CGCGARCATAGCSequence (5’-3’): (BHQ1) - TGGAGTCCATCTT(FAMdT)CGCGARCATAGC
В структуру входят флуорофор 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM) и гаситель флуоресценции Black Hole Quencher 1 (BHQ1)The structure contains the fluorophore 6-carboxyfluorescein (6-FAM) and the fluorescence quencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1)
Seq4Section 4
Специфический продукт амплификации, представляющий собой фрагмент гена белка оболочки вируса хлоротической пятнистости листьев яблони, проклонированный в плазмидный вектор pAL2T, длина 133 п.о.A specific amplification product, which is a fragment of the coat protein gene of the apple leaf chlorotic spot virus, cloned into the pAL2T plasmid vector, 133 bp in length.
Последовательность (5’-3’): GGAAAGACAGGGGTAATCCTGGAACAGATACTGGAGTCCATCTTCGCGAACATAGCAATCCAAGGGACGTCAGAGCAGACAGAGTTTCTGGACCTGATGGTGGAGGTAAAATCAATGGAGGACCAGAAGGTGASequence (5’-3’): GGAAAGACAGGGGTAATCCTGGAACAGATACTGGAGTCCATCTTCGCGAACATAGCAATCCAAGGGACGTCAGAGCAGACAGAGTTTCTGGACCTGATGGTGGAGGTAAAATCAATGGAGGACCAGAAGGTGA
Список литературыReferences
1. Kinard G.R., Scott S. W. Detection of Apple chlorotic leaf spot and Apple stem grooving viruses using RT-PCR. Plant Disease 1996, 80, 616-621. 1. Kinard G.R., Scott S.W. Detection of Apple chlorotic leaf spot and Apple stem grooving viruses using RT-PCR. Plant Disease 1996, 80, 616-621.
2. Park H., Yoon J., Kim H., Baek K. Multiplex RT-PCR assay for the detection of Apple stem grooving virus and apple chlorotic leaf spot virus in infected Korean apple cultivars. Plant Pathology Journal 2006, 22, 168-173.2. Park H., Yoon J., Kim H., Baek K. Multiplex RT-PCR assay for the detection of Apple stem grooving virus and apple chlorotic leaf spot virus in infected Korean apple cultivars. Plant Pathology Journal 2006, 22, 168-173.
3. Paduch-Cichal E., Tomala K. Detection of Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem grooving virus (ASGV) in different tissues of ‘mustu’ apple cultivar trees by ELISA. Phytopathologia Polonica 2007, 43, 53-59. 3. Paduch-Cichal E., Tomala K. Detection of Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem grooving virus (ASGV) in different tissues of ‘mustu’ apple cultivar trees by ELISA. Phytopathologia Polonica 2007, 43, 53-59.
4. Salmon M.A., Vendrame M., Kummert J., Lepoivre P. Detection of apple chlorotic leaf spot virus using a 5’ nuclease assay with a fluorescent 3’ minor groove binder-DNA probe. Journal of Virological Methods 2002, 104, 99-106.4. Salmon M.A., Vendrame M., Kummert J., Lepoivre P. Detection of apple chlorotic leaf spot virus using a 5’ nuclease assay with a fluorescent 3’ minor groove binder-DNA probe. Journal of Virological Methods 2002, 104, 99-106.
5. Lu Y., Yao B., Wang G., Hong N. The detection of ACLSV and ASPV in pear plants by RT-LAMP assays. Journal of Virological Methods 2017, 252, 80-85. 5. Lu Y., Yao B., Wang G., Hong N. The detection of ACLSV and ASPV in pear plants by RT-LAMP assays. Journal of Virological Methods 2017, 252, 80-85.
6. Jeong H.-W., Go S.-M., Jeong R.-D. Rapid and specific detection of apple chlorotic leaf spot virus in pear by reverse-transcription recombinase polymerase amplification. Acta Virology 2021, 65, 237-241. 6. Jeong H.-W., Go S.-M., Jeong R.-D. Rapid and specific detection of apple chlorotic leaf spot virus in pear by reverse-transcription recombinase polymerase amplification. Acta Virology 2021, 65, 237-241.
7. Canales C., Morán F., Olmos A., Ruiz-García A.B. First detection and molecular characterization of Apple stem grooving virus, Apple chlorotic leaf spot virus and Apple hammerhead viroid in Loquat in Spain. Plants 2021, 10, 2293. 7. Canales C., Morán F., Olmos A., Ruiz-García A.B. First detection and molecular characterization of Apple stem grooving virus, Apple chlorotic leaf spot virus and Apple hammerhead viroid in Loquat in Spain. Plants 2021, 10, 2293.
8. Costa L.C., Athalli B., Hu X., Lamour K., Yang Y., O’Connell M., McFarland C., Foster J.A., Hurtado-Gonzales O.P. High-throughput detection of a large set of viruses and viroids of pome and stone fruit trees by multiplex PCR-based amplicon sequencing. Frontiers in Plant Science 2022, 13, 1072768. 8. Costa L.C., Athalli B., Hu X., Lamour K., Yang Y., O'Connell M., McFarland C., Foster J.A., Hurtado-Gonzales O.P. High-throughput detection of a large set of viruses and viroids of pome and stone fruit trees by multiplex PCR-based amplicon sequencing. Frontiers in Plant Science 2022, 13, 1072768.
9. Nickel O., Fajardo T.V.M. Detection of viruses in apples and pears by real time RT-PCR using 5’-hydrolysis probes. Journal of Plant Pathology 2014, 96, 207-213.9. Nickel O., Fajardo T.V.M. Detection of viruses in apples and pears by real time RT-PCR using 5’-hydrolysis probes. Journal of Plant Pathology 2014, 96, 207-213.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="TEST SYSTEM FOR
ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ DETECTION OF APPLE CHLOROTIC LEAF SPOT VIRUS BY THE METHOD
ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.xml" softwareName="WIPO Sequence" REAL-TIME PCR.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.2.0" productionDate="2024-08-13">softwareVersion="2.2.0" productionDate="2024-08-13">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА <ApplicationNumberText>VIRUS DETECTION TEST SYSTEM
ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ CHLOROTIC SPOT OF APPLE LEAF BY REAL-TIME PCR
ВРЕМЕНИ</ApplicationNumberText>TIME</ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate><FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА <ApplicantFileReference>VIRUS DETECTION TEST SYSTEM
ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ CHLOROTIC SPOT OF APPLE LEAF BY REAL-TIME PCR
ВРЕМЕНИ</ApplicantFileReference>TIME</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal State
бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской budgetary scientific institution State Scientific Center of the Russian Federation
Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина Federation Institute of Bioorganic Chemistry named after Academicians M.M. Shemyakin
и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук</ApplicantName>and Yu.A. Ovchinnikov of the Russian Academy of Sciences</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic <ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic
Chemistry</ApplicantNameLatin>Chemistry</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ <InventionTitle languageCode="en">TEST SYSTEM FOR DETECTION
ВИРУСА ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ПЦР В APPLE CHLOROTIC LEAF SPOT VIRUS BY PCR IN
РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ</InventionTitle>REAL TIME</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggaaagacaggggcaatyc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggaaagacaggggcaatyc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tbacyttctgrtcctccatbga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tbacyttctgrtcctccatbga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"><INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggagtccatcttcgcgarcatagc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tggagtccatcttcgcgarcatagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>133</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>133</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..133</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..133</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"><INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggaaagacaggggtaatcctggaacagatactggagtccatcttcgcga <INSDSeq_sequence>ggaaagacaggggtaatcctggaacagatactggagtccatcttcgcga
acatagcaatccaagggacgtcagagcagacagagtttctggacctgatggtggaggtaaaatcaatggaacatagcaatccaagggacgtcagagcagacagagtttctggacctgatggtggaggtaaaatcaatgga
ggaccagaaggtga</INSDSeq_sequence>ggaccagaaggtga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2835209C1 true RU2835209C1 (en) | 2025-02-24 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2001108572A (en) * | 1998-08-31 | 2004-08-20 | Монсанто Компани | A NEW METHOD FOR IDENTIFICATION OF THE GENES OF THE UNPLANTED RESISTANCE OF PLANTS TO DISEASES |
| CN104531904B (en) * | 2015-01-27 | 2016-09-07 | 河北科技师范学院 | A kind of apple chlorotic leaf spot virus real-time fluorescence quantitative PCR detection method |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2001108572A (en) * | 1998-08-31 | 2004-08-20 | Монсанто Компани | A NEW METHOD FOR IDENTIFICATION OF THE GENES OF THE UNPLANTED RESISTANCE OF PLANTS TO DISEASES |
| CN104531904B (en) * | 2015-01-27 | 2016-09-07 | 河北科技师范学院 | A kind of apple chlorotic leaf spot virus real-time fluorescence quantitative PCR detection method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101903535A (en) | System and method for high resolution of nucleic acids to detect sequence variations | |
| CN113186313A (en) | Salmonella detection primer group, method and kit based on RPA-LbCas12a-TTECDS system | |
| WO2009006743A1 (en) | Nucleic acid sequences and combination thereof for sensitive amplification and detection of bacterial and fungal sepsis pathogens | |
| US6867021B2 (en) | Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli | |
| JP2017516466A (en) | Compositions and methods for detecting yellow dragon disease | |
| CN111286559A (en) | Primer, probe and kit for detecting African swine fever virus | |
| CN103725798A (en) | Primer, kit and detection method of detecting haemorrhagic fever with renal syndrome virus by RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) method | |
| US20090246754A1 (en) | Optimized probes and primers and methods of using same for the detection and quantitation of bk virus | |
| RU2835209C1 (en) | Test system for detection of apple chlorotic leafspot virus by real-time pcr method | |
| CN118600085A (en) | Application of SNP molecular markers for YZCd1 gene related to cadmium content in rice grains | |
| RU2837395C1 (en) | Test system for apple stem pitting virus detection by real-time pcr method | |
| RU2835202C1 (en) | Test system for detection of apple stem grooving virus by real-time pcr method | |
| González-Garza | Evolution of diagnostic technics for plant viruses | |
| CN116377112A (en) | Universal polymorphism microsatellite molecular marker for twelve kinds of armillaria parasitica, and primers and application thereof | |
| CN112226541A (en) | Special primer, kit and detection method for detecting strawberry vein banding virus | |
| WO2021183902A1 (en) | Methods and kits for the detection of sars-cov-2 | |
| RU2791958C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF SARS-CoV-2 MUTATION S:N501Y | |
| RU2795016C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF MUTATION S:delVYY143-145 OF SARS-CoV-2 | |
| RU2795018C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF SARS-CoV-2 MUTATION S:L452R | |
| CN110578014A (en) | A kit and detection method for nucleic acid detection of Candida parapsilosis | |
| RU2795017C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF SARS-COV-2 MUTATION S:Ins214EPE | |
| CN112626263B (en) | Kit for detecting respiratory tract infection fungal pathogens at constant temperature by using enzyme digestion probe | |
| RU2795019C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF SARS-CoV-2 MUTATION S:P681R | |
| RU2762759C1 (en) | METHOD FOR SAMPLE PREPARATION OF SARS-CoV-2 CORONAVIRUS ISOLATES AND OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR ITS IMPLEMENTATION | |
| Yimer et al. | Diagnostics of the peach root-knot nematode, Meloidogyne floridensis using multiplex real-time PCR |