RU2834919C1 - Variant of corynebacterium glutamicum having improved ability to produce l-lysine, and method of producing l-lysine using same - Google Patents
Variant of corynebacterium glutamicum having improved ability to produce l-lysine, and method of producing l-lysine using same Download PDFInfo
- Publication number
- RU2834919C1 RU2834919C1 RU2023123643A RU2023123643A RU2834919C1 RU 2834919 C1 RU2834919 C1 RU 2834919C1 RU 2023123643 A RU2023123643 A RU 2023123643A RU 2023123643 A RU2023123643 A RU 2023123643A RU 2834919 C1 RU2834919 C1 RU 2834919C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysine
- promoter
- corynebacterium glutamicum
- variant
- strain
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 93
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 22
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 14
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 9
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010014885 Arginine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 1
- 241001014386 Corynebacterium canis Species 0.000 description 1
- 241000644075 Corynebacterium caspium Species 0.000 description 1
- 241001605246 Corynebacterium crudilactis Species 0.000 description 1
- 241000446654 Corynebacterium deserti Species 0.000 description 1
- 241000272936 Corynebacterium doosanense Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 241001134763 Corynebacterium flavescens Species 0.000 description 1
- 241000521406 Corynebacterium freiburgense Species 0.000 description 1
- 241000291063 Corynebacterium halotolerans Species 0.000 description 1
- 241000015585 Corynebacterium humireducens Species 0.000 description 1
- 241000024402 Corynebacterium imitans Species 0.000 description 1
- 241000095130 Corynebacterium lubricantis Species 0.000 description 1
- 241000778959 Corynebacterium marinum Species 0.000 description 1
- 241000128247 Corynebacterium pollutisoli Species 0.000 description 1
- 241000186246 Corynebacterium renale Species 0.000 description 1
- 241000334675 Corynebacterium singulare Species 0.000 description 1
- 241001098119 Corynebacterium spheniscorum Species 0.000 description 1
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 description 1
- 241000158523 Corynebacterium striatum Species 0.000 description 1
- 241000960580 Corynebacterium testudinoris Species 0.000 description 1
- 241000737368 Corynebacterium uterequi Species 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036134 Probable arginine-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical compound [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 101150024756 argS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Abstract
Description
Область изобретенияField of invention
Описание настоящего изобретения относится к варианту Corynebacterium glutamicum, обладающему улучшенной способностью продуцировать L-лизин, и способу продуцирования L-лизина с его использованием.The present invention relates to a variant of Corynebacterium glutamicum having an improved ability to produce L-lysine and a method for producing L-lysine using the same.
Предшествующий уровень техникиPrior art
L-Лизин представляет собой незаменимую аминокислоту, которая не синтезируется у человека или в организме животных и должен поступать извне и, как правило, продуцируется путем ферментации микроорганизмами, такими как бактерии или дрожжи. В производстве L-лизина могут быть использованы природные штаммы дикого типа или их варианты, модифицированные таким образом, что обладают усиленной способностью продуцировать L-лизин. Недавно для того, чтобы улучшить экономическую эффективность производства L-лизина, были разработаны различные рекомбинантные штаммы или варианты, обладающие превосходной способностью продуцировать L-лизин, и способы продукции L-лизина с их использованием, путем применения технологии генетической рекомбинации в отношении микроорганизмов, таких как Escherichia coli и Corynebacterium, и т.п., которые широко используются в производстве L-аминокислот и другие полезных веществ.L-Lysine is an essential amino acid that is not synthesized by humans or animals and must be supplied from outside, and is generally produced by fermentation by microorganisms such as bacteria or yeast. In the production of L-lysine, wild-type natural strains or variants thereof modified to have an enhanced ability to produce L-lysine can be used. Recently, in order to improve the economic efficiency of L-lysine production, various recombinant strains or variants having an excellent ability to produce L-lysine and methods for producing L-lysine using them have been developed by applying genetic recombination technology to microorganisms such as Escherichia coli and Corynebacterium, etc., which are widely used in the production of L-amino acids and other useful substances.
В соответствии с патентами Кореи №№10-0838038 и 10-2139806 нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки, включающие ферменты, связанные с продукцией L-лизина, или их аминокислотные последовательности модифицированы для увеличения экспрессии генов или для удаления генов, не являющихся необходимыми, и, таким образом, улучшения способности продуцировать L-лизин. Кроме того, в публикации патента Кореи №10-2020-0026881 раскрыт способ замены существующего промотора гена на промотор, обладающий сильной активностью, для увеличения экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в продукцию L-лизина.According to Korean Patent Nos. 10-0838038 and 10-2139806, nucleotide sequences of genes encoding proteins including enzymes related to L-lysine production or amino acid sequences thereof are modified to increase gene expression or to delete genes that are not necessary, and thereby improve the ability to produce L-lysine. In addition, Korean Patent Publication No. 10-2020-0026881 discloses a method for replacing an existing gene promoter with a promoter having strong activity to increase the expression of a gene encoding an enzyme involved in L-lysine production.
Как описано, разрабатывается множество способов, увеличивающих способность продуцировать L-лизин. Тем не менее, поскольку существуют десятки типов белков такой как ферменты, транскрипционные факторы, белки-переносчики и т.п, которые непосредственно или косвенно вовлечены в продукцию L-лизина, необходимо провестимножество исследований в отношении того, увеличивается ли или не увеличивается ли способность продуцировать L-лизин в зависимости от изменений активности этих белков.As described, many methods are being developed to increase the ability to produce L-lysine. However, since there are dozens of types of proteins such as enzymes, transcription factors, transport proteins, etc. that are directly or indirectly involved in the production of L-lysine, many studies need to be conducted on whether the ability to produce L-lysine is increased or not depending on the changes in the activity of these proteins.
Документы предшествующего уровня техникиPrior Art Documents
Патентные документыPatent documents
патент Кореи №10-0838038Korean Patent No. 10-0838038
патент Кореи №10-2139806Korean Patent No. 10-2139806
Публикация патента Кореи №10-2020-0026881Korea Patent Publication No.10-2020-0026881
Техническая проблемаTechnical problem
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вариант Corynebacterium glutamicum, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-лизин.The object of the present invention is to provide a variant of Corynebacterium glutamicum having an improved ability to produce L-lysine.
Кроме того, еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ продуцирования L-лизина с использованием варианта. Техническое решениеFurthermore, another object of the present invention is to provide a method for producing L-lysine using the variant. Technical Solution
Авторы настоящего изобретения проводили исследования для разработки нового варианта, обладающего улучшенной способностью продуцировать L-лизин с использованием штамма Corynebacterium glutamicum, и в качестве результата они обнаружили, что продукция L-лизина увеличивается путем замещения нуклеотидной последовательности в конкретной позиции в промоторе гена lysA, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, который действует на последней стадии пути биосинтеза L-лизина, таким образом, завершая описание настоящего изобретения.The present inventors conducted studies to develop a new variant having an improved ability to produce L-lysine using a Corynebacterium glutamicum strain, and as a result, they found that the production of L-lysine is increased by substituting a nucleotide sequence at a specific position in the promoter of the lysA gene encoding diaminopimelate decarboxylase, which acts at the last stage of the L-lysine biosynthesis pathway, thus completing the description of the present invention.
В аспекте описания настоящего изобретения предложен вариант Corynebacterium glutamicum, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-лизин за счет усиления активности диаминопимелатдекарбоксилазы.In an aspect of the description of the present invention, a variant of Corynebacterium glutamicum is proposed that has an improved ability to produce L-lysine due to an increase in the activity of diaminopimelate decarboxylase.
Используемая здесь “диаминопимелатдекарбоксилазя” относится к ферменту, который катализирует реакцию продуцирования диоксида углерода и L-лизина путем расщепления углеродных связей хезо-диаминогептандиоата (mDAP) на последней стадии пути биосинтеза L-лизина.As used herein, “diaminopimelate decarboxylase” refers to the enzyme that catalyzes the reaction producing carbon dioxide and L-lysine by cleaving the carbon bonds of heso-diaminoheptanedioate (mDAP) in the last step of the L-lysine biosynthetic pathway.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения диаминопимелатдекарбоксилаза может быть получена из штамма рода Corynebacterium. Specifically, где штамм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium callunae, Corynebacterium suranareeae, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium pacaense, Corynebacterium singulare, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium marinum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium striatum, Corynebacterium canis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium renale, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium caspium, Corynebacterium testudinoris, Corynebacaterium pseudopelargi или Corynebacterium flavescens, но не ограничивается ими.According to a specific embodiment of the description of the present invention, diaminopimelate decarboxylase can be obtained from a strain of the genus Corynebacterium. Specifically, wherein the strain of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium callunae, Corynebacterium suranareeae, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium pacaense, Corynebacterium singulare, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium marinum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium striatum, Corynebacterium canis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium renale, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium caspium, Corynebacterium testudinoris, Corynebacaterium pseudopelargi, or Corynebacterium flavescens, but is not limited to them.
Используемое здесь “усиление активности” означает то, что уровни экспрессии генов, кодирующих белки, такие как желаемые ферменты, транскрипционные факторы, белки-переносчики и т.п.увеличиваются за счет вновь встроенных генов или путем усиления генов по сравнению с штаммом дикого типа или штаммом перед модификацией. Такое усиление активности также включает случай, когда активность самого белка увеличивается посредством замещения, вставки или делеции нуклеотида, кодирующего ген или их комбинацию по сравнению с активностью белка, которой микроорганизм обладал исходно, и случай, когда общая активность фермента в клетках выше, чем у штамма дикого типа или штамма до модификации, за счет увеличенной экспрессии или увеличенной трансляции кодирующих его генов, и их комбинации.As used herein, "enhancement of activity" means that the expression levels of genes encoding proteins such as desired enzymes, transcription factors, transport proteins, etc. are increased by newly introduced genes or by enhancing the genes compared to the wild-type strain or the strain before modification. Such enhancement of activity also includes the case where the activity of the protein itself is increased by substitution, insertion, or deletion of a nucleotide encoding a gene or a combination thereof compared to the activity of the protein that the microorganism originally possessed, and the case where the total activity of the enzyme in the cells is higher than that of the wild-type strain or the strain before modification, due to increased expression or increased translation of the genes encoding it, and a combination thereof.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения усиление активности диаминопимелатдекарбоксилазы может быть индуцировано путем сайт-специфической мутации в промоторе гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу.According to a specific embodiment of the description of the present invention, an increase in the activity of diaminopimelate decarboxylase can be induced by a site-specific mutation in the promoter of the gene encoding diaminopimelate decarboxylase.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения промотор гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, может быть представлен нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 1.According to a specific embodiment of the description of the present invention, the promoter of the gene encoding diaminopimelate decarboxylase may be represented by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1.
Используемый здесь “промотор” относится к конкретной области ДНК, которая регулирует транскрипцию генов путем включения сайта связывания с РНК-полимеразой, которая инициирует транскрипцию мРНК интересующего гена, и, как правило, располагается против хода транскрипции относительно сайта начала транскрипции. Промотор у прокариот определяется как область около сайта начала транскрипции, где связывается РНК-полимераза, и обычно состоит из двух коротких нуклеотидных последовательностей в области пар оснований от -10 до - 35 против хода транскрипции от сайта начала транскрипции. В описании настоящего изобретения мутация промотора приводит к тому, что промотор улучшается таким образом, что обладает более высокой активностью по сравнению с промотором дикого типа, и может увеличивать экспрессию генов, расположенных по ходу транскрипции, путем индукции мутаций в областипромотора, расположенной против хода транскрипции относительно сайта начала транскрипции.As used herein, a "promoter" refers to a specific region of DNA that regulates the transcription of genes by including a binding site for RNA polymerase that initiates transcription of the mRNA of the gene of interest, and is typically located upstream of the transcription start site. A promoter in prokaryotes is defined as a region near the transcription start site where RNA polymerase binds, and typically consists of two short nucleotide sequences in the region of base pairs from -10 to -35 upstream of the transcription start site. In the description of the present invention, a mutation of a promoter results in the promoter being improved such that it has higher activity compared to a wild-type promoter, and can increase the expression of genes located downstream of transcription by inducing mutations in the region of the promoter located upstream of the transcription start site.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения усиление активности диаминопимелатдекарбоксилазы может быть осуществлено путем замены одного или более чем одного основания в областях от -25 до -10 против хода течения относительно сайта начала транскрипции в последовательности промотора гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу.According to a specific embodiment of the description of the present invention, the enhancement of the activity of diaminopimelate decarboxylase can be achieved by replacing one or more bases in the regions from -25 to -10 upstream of the transcription start site in the promoter sequence of the gene encoding diaminopimelate decarboxylase.
Конкретней, мутация промотора в соответствии с описанием настоящего изобретения может представлять собой последовательную или не последовательную замену одного или более чем одного основания в областях от -25 по -10, предпочтительно, последовательную или непоследовательную замену одного, двух, трех, четырех или пяти оснований в областях от -20 по -15, в областях от -19 по -16 или в областях от -18 по -17.More specifically, a promoter mutation according to the description of the present invention may be a sequential or non-sequential substitution of one or more bases in the regions from -25 to -10, preferably a sequential or non-sequential substitution of one, two, three, four or five bases in the regions from -20 to -15, in the regions from -19 to -16 or in the regions from -18 to -17.
В соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения ген lysA, кодирующий диаминопимелатдекарбоксилазу, образует оперон вместе с геном argS, кодирующим аргинил-тРНК синтетазу, и оперон argS-lysA регулируется одним промотором. Таким образом, CG, который представляет собой нуклеотидную последовательность в областях с-17по-18 последовательности промотора оперона argS-lysA штамма Corynebacterium glutamicum, заменен на СТ с получением варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего новой последовательностью промотора гена lysA. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутантную последовательность промотора гена lysA, которая представлена нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 2.According to one of the embodiment examples of the description of the present invention, the lysA gene encoding diaminopimelate decarboxylase forms an operon together with the argS gene encoding arginyl-tRNA synthetase, and the argS-lysA operon is regulated by a single promoter. Thus, CG, which is a nucleotide sequence in regions from-17 to-18 of the promoter sequence of the argS-lysA operon of the Corynebacterium glutamicum strain, is replaced by CT to obtain a Corynebacterium glutamicum variant having a new promoter sequence of the lysA gene. Such a Corynebacterium glutamicum variant may include a mutant promoter sequence of the lysA gene, which is represented by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения, CG, который представляет собой нуклеотидную последовательность областей от -17 по -18 последовательности промотора оперона argS-lysA штамма Corynebacterium glutamicum, заменен на GA с получением варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего новой последовательностью промотора гена lysA. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутантную последовательность промотора гена lysA, который представлен нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 3.Furthermore, according to one of the embodiment examples of the description of the present invention, CG, which is the nucleotide sequence of the regions from -17 to -18 of the promoter sequence of the argS-lysA operon of the Corynebacterium glutamicum strain, is replaced by GA to obtain a Corynebacterium glutamicum variant having a new promoter sequence of the lysA gene. Such a Corynebacterium glutamicum variant may include a mutant promoter sequence of the lysA gene, which is represented by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 3.
В соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения CG, которая представляет собой нуклеотидную последовательность в областях от -17 по -18 последовательности промотора оперона argS-lysA штамма Corynebacterium glutamicum, заменена на GT с получением варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего новой последовательностью промотора гена lysA. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутантную последовательность промотора гена lysA, который представлен нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 4.According to one of the embodiment examples of the description of the present invention, CG, which is the nucleotide sequence in the regions from -17 to -18 of the sequence of the promoter of the argS-lysA operon of the Corynebacterium glutamicum strain, is replaced by GT to obtain a variant of Corynebacterium glutamicum having a new sequence of the promoter of the lysA gene. Such a variant of Corynebacterium glutamicum may include a mutant sequence of the promoter of the lysA gene, which is represented by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 4.
Используемая здесь “улучшенная способность продуцировать” означает увеличенную продукцию L-лизина по сравнению с родительским штаммом. Родительский штамм относится к штамму дикого типа или варианту штамма, который подвергнут мутации, и включает штамм, который непосредственным образом мутирован или трансформирован рекомбинантным вектором и т.п.В описании настоящего изобретения родительский штамм может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum дикого типа или штамм, подвергнутый мутации из дикого типа.As used herein, “improved production ability” means increased production of L-lysine compared to a parent strain. The parent strain refers to a wild-type strain or a variant strain that has been mutated, and includes a strain that has been directly mutated or transformed with a recombinant vector, etc. In the description of the present invention, the parent strain may be a wild-type Corynebacterium glutamicum strain or a strain that has been mutated from the wild type.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения родительский штамм представляет собой вариант, в котором мутации индуцированы в последовательностях генов (например, гены lysC, zwf и hom), вовлеченных в продукцию лизина, и может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum (далее названный как “штамм Corynebacterium glutamicum DS1”), депонированный в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms) 2 апреля 2021 года под инвентарным №КССМ12969Р.According to a specific embodiment of the description of the present invention, the parent strain is a variant in which mutations are induced in gene sequences (e.g., lysC, zwf, and hom genes) involved in lysine production, and may be a Corynebacterium glutamicum strain (hereinafter referred to as “Corynebacterium glutamicum DS1 strain”) deposited at the Korean Culture Center of Microorganisms on April 2, 2021 under Accession No. KCSM12969P.
В соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения вариант Corynebacterium glutamicum, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-лизин, может включать мутацию промотора гена lysA, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, таким образом, демонстрируя увеличенную способность продуцировать L-лизин по сравнению с родительским штаммом, и в частности, может демонстрировать 2% или большее, в частности, от 2% до 40%, и, конкретней, от 3% до 30% увеличение продукции L-лизина по сравнению с родительским штаммом, таким образом, продуцируя от 60 г до 80 г L-лизина, предпочтительно от 65 г до 75 г L-лизина на 1 л культуры штамма.According to one embodiment of the present invention, a Corynebacterium glutamicum variant having an improved ability to produce L-lysine may comprise a mutation in the promoter of the lysA gene encoding diaminopimelate decarboxylase, thus exhibiting an increased ability to produce L-lysine compared to the parent strain, and in particular may exhibit a 2% or greater, in particular from 2% to 40%, and more particularly from 3% to 30% increase in L-lysine production compared to the parent strain, thus producing from 60 g to 80 g of L-lysine, preferably from 65 g to 75 g of L-lysine per 1 liter of strain culture.
Вариант Corynebacterium glutamicum в соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения может быть получен при помощи рекомбинантного вектора, включающего вариант, в котором часть последовательности промотора гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу в родительском штамме, заменена.A variant of Corynebacterium glutamicum according to a particular embodiment of the description of the present invention can be obtained using a recombinant vector comprising a variant in which a portion of the promoter sequence of the gene encoding diaminopimelate decarboxylase in the parent strain is replaced.
Используемая здесь “часть” обозначает не всю нуклеотидную последовательность или полинуклеотидную последовательность, и может составлять от 1 до 300, предпочтительно, от 1 до 100, и более предпочтительно, от 1 до 50, но не ограничивается этим.The “portion” used herein does not mean the entire nucleotide sequence or polynucleotide sequence, and may be from 1 to 300, preferably from 1 to 100, and more preferably from 1 to 50, but is not limited thereto.
Используемые здесь “вариант” относится к варианту промотора, в котором одно или более чем одно основание в областях от -25 по -10 в последовательности промотора гена диаминопимелатдекарбоксилазы, вовлеченного в биосинтез L-лизина, заменено.As used herein, “variant” refers to a promoter variant in which one or more bases in the -25 to -10 regions of the promoter sequence of the diaminopimelate decarboxylase gene involved in L-lysine biosynthesis are replaced.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения варианты, в каждом из которых нуклеотидная последовательность в-17и-18 областях в последовательности промотора гена диаминопимелатдекарбоксилазы заменена на СТ, GA или GT, могут иметь нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, соответственно.According to a specific embodiment of the description of the present invention, variants in each of which the nucleotide sequence in the -17 and -18 regions in the promoter sequence of the diaminopimelate decarboxylase gene is replaced with CT, GA or GT may have a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, respectively.
Используемый здесь “вектор” представляет собой экспрессирующий вектор, способный экспрессировать желаемый белок в подходящей клетке-хозяине, и относится к генной конструкции, включающей существенные регуляторные элементы, которые функционально связаны таким образом, что экспрессируется генная вставка. Здесь “функционально связанный” означает то, что ген, требующий экспрессии, и его регуляторная последовательность функционально связаны друг с другом, чтобы индуцировать экспрессию гена, и “регуляторные элементы” включают промотор для осуществления транскрипции, любую операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность, контролирующую прекращение транскрипции и трансляции. Такой вектор может включать плазмидный вектор, космидный вектор, бактериофаговый вектор, вирусный вектор и т.п, но не ограничивается ими.As used herein, a "vector" is an expression vector capable of expressing a desired protein in a suitable host cell and refers to a gene construct comprising essential regulatory elements that are operably linked such that a gene insert is expressed. Here, "operably linked" means that a gene requiring expression and its regulatory sequence are operably linked to each other to induce expression of the gene, and "regulatory elements" include a promoter for transcription, any operator sequence for controlling transcription, a sequence encoding a suitable mRNA binding site for the ribosome, and a sequence controlling the termination of transcription and translation. Such a vector may include a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, a viral vector, and the like, but is not limited to them.
Используемый здесь “рекомбинантный вектор” трансформируют в подходящую клетку-хозяина и затем он реплицируется независимо от генома клетки-хозяина, или может быть интегрирован в сам геном. В этом отношении “подходящая клетка-хозяин”, в которой вектор является реплицируемым, может включать ориджин репликации, который представляет собой конкретную нуклеотидную последовательность, для которой инициирована репликация.The “recombinant vector” used herein is transformed into a suitable host cell and then replicates independently of the host cell’s genome, or may be integrated into the genome itself. In this regard, the “suitable host cell” in which the vector is replicable may include an origin of replication, which is a specific nucleotide sequence for which replication is initiated.
Для трансформации подходящую технологию введения вектора выбирают в зависимости от клетки-хозяина для экспрессии гена-мишени в клетке-хозяине. Например, введение вектора может быть осуществлено путем электропорации, теплового шока, осаждения при помощи фосфата кальция (CaPO4), осаждения при помощи хлорида кальция (CaCl2), микроинъекции, способа с использованием полиэтиленгликоля (PEG), способа с использованием DEAE (диэтиламиноэтил)-декстрана, способа с использованием катионнойлипосомы, способа с использованием ацетата лития - DMSO (диметилсульфоксида), или путем их комбинации. Пока трансформированный ген может экспрессироваться в клетке-хозяине, он может быть включен без ограничения, независимо от того, встроен ли ген в хромосому клетки-хозяина или расположен за пределами хромосомы.For transformation, a suitable vector introduction technology is selected depending on the host cell for expressing the target gene in the host cell. For example, the vector introduction can be carried out by electroporation, heat shock, calcium phosphate ( CaPO4 ) precipitation, calcium chloride ( CaCl2 ) precipitation, microinjection, a polyethyleneglycol (PEG) method, a DEAE (diethylaminoethyl)-dextran method, a cationic liposome method, a lithium acetate - DMSO (dimethyl sulfoxide) method, or a combination thereof. As long as the transformed gene can be expressed in the host cell, it can be incorporated without limitation, regardless of whether the gene is integrated into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
Клетки-хозяева включают клетки, трансфицированные, трансформированные или инфицированные рекомбинантным вектором или полинуклеотидом в соответствии с описанием настоящего изобретения in vivo или in vitro. Клетки - хозяева, включающие рекомбинантный вектор в соответствии с описанием настоящего изобретения представляют собой рекомбинантные клетки-хозяева, рекомбинантные клетки или рекомбинантные микроорганизмы.Host cells include cells transfected, transformed or infected with a recombinant vector or polynucleotide according to the description of the present invention in vivo or in vitro. Host cells comprising a recombinant vector according to the description of the present invention are recombinant host cells, recombinant cells or recombinant microorganisms.
Кроме того, рекомбинантный вектор в соответствии с описанием настоящего изобретения может включать селектируемый маркер, который предназначен для отбора транформанта (клетки-хозяина), трансформированного вектором. В среде, обработанной селектируемым маркером, могут выживать только клетки, экспрессирующие селектируемый маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки. Селектируемый маркер может быть представлен канамицином, стрептомицином, хлорамфениколом и т.п., но не ограничивается ими.In addition, the recombinant vector according to the description of the present invention may include a selectable marker, which is intended for selecting a transformant (host cell) transformed with the vector. In a medium treated with a selectable marker, only cells expressing the selectable marker can survive, and thus transformed cells can be selected. The selectable marker may be represented by kanamycin, streptomycin, chloramphenicol, etc., but is not limited to them.
Гены, встроенные в рекомбинантный вектор для трансформации в соответствии с описанием настоящего изобретения, могут быть встроены в клетки-хозяева, такие как микроорганизмы рода Corynebacterium, вследствие гомологичной рекомбинации.Genes inserted into a recombinant transformation vector according to the description of the present invention can be inserted into host cells, such as microorganisms of the genus Corynebacterium, by homologous recombination.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения клетка-хозяин может представлять собой штамм рода Corynebacterium, например, штамм Corynebacterium glutamicum DS1.According to a particular embodiment of the description of the present invention, the host cell may be a strain of the genus Corynebacterium, for example, the strain Corynebacterium glutamicum DS1.
Кроме того, в еще одном аспекте описания настоящего изобретения предложен способ продуцирования L-лизина, где способ включает стадии а) выращивания варианта Corynebacterium glutamicum в среде; и б) выделения L-лизина из варианта или среды, в которой выращивают вариант.Furthermore, in another aspect of the description of the present invention, there is provided a method for producing L-lysine, wherein the method comprises the steps of a) growing a Corynebacterium glutamicum variant in a medium; and b) isolating L-lysine from the variant or the medium in which the variant is grown.
Выращивание может быть осуществлено в соответствии с подходящей средой и условиями выращивания, известными в области техники, и любой специалист в данной области техники может легко скорректировать и использовать среду и условия выращивания. В частности, среда может представлять собой жидкую среду, но не ограничивается этим. Способ выращивания может включать, например, выращивание партиями, непрерывное выращивание, периодическое выращивание с подпиткой или их комбинацию, но не ограничивается этим.The cultivation can be carried out in accordance with a suitable medium and cultivation conditions known in the art, and any person skilled in the art can easily adjust and use the medium and cultivation conditions. In particular, the medium can be a liquid medium, but is not limited to this. The cultivation method can include, for example, batch cultivation, continuous cultivation, periodic cultivation with feeding, or a combination thereof, but is not limited to this.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения среда должна удовлетворять требованиям конкретного штамма подходящим образом, и может быть подходящим образом модифицирована специалистом в данной области техники. В отношении культуральной среды для штамма рода Corynebacterium можно обратиться к известному документу (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), но не ограничиваться этим.According to a specific embodiment of the description of the present invention, the medium must suitably satisfy the requirements of the specific strain, and can be suitably modified by a person skilled in the art. As for the culture medium for the strain of the genus Corynebacterium, reference may be made to a known document (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), but is not limited thereto.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения среда может включать различные источники углерода, источники азота и компоненты микроэлементов. Источники углерода, которые могут быть использованы, включают сахариды и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал, целлюлоза и т.п., масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и т.п., жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут быть использованы индивидуально или в смеси, но не ограничиваются этим. Источники азота, которые могут быть использованы, включают пептон, дрожжевой экстракт, экстракт мяса, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку, мочевину, или неорганические соединения, например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота также могут использоваться по отдельности или в смеси, но не ограничиваются этим. Источники фосфора, которые могут быть использованы, могут включать первичный кислый фосфат калия или вторичный кислый фосфат калия или соответствующие соли, содержащие натрий, но не ограничиваются этим. Культуральная среда может включать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые требуются для роста, но не ограничиваются этим. Кроме того, культуральная среда может включать необходимые ростовые вещества, такие как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральной среде может быть использованы подходящие предшественники. Среда или отдельные компоненты могут быть добавлены в культуральную среду периодически или непрерывным образом при помощи подходящего способа во время выращивания, но не ограничиваясь этим.According to a specific embodiment of the present invention, the medium may include various carbon sources, nitrogen sources and micronutrient components. Carbon sources that can be used include saccharides and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose and the like, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil and the like, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These substances can be used individually or in a mixture, but are not limited to this. Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, meat extract, malt extract, liquid corn steep liquor, soybean meal, urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources can also be used individually or in mixtures, but are not limited to this. Phosphorus sources that can be used can include, but are not limited to, monopotassium phosphate or dipotassium phosphate or the corresponding salts containing sodium. The culture medium can include, but is not limited to, metal salts such as magnesium sulfate or ferrous sulfate that are required for growth. In addition, the culture medium can include necessary growth substances such as amino acids and vitamins. In addition, suitable precursors can be used in the culture medium. The medium or individual components may be added to the culture medium intermittently or continuously by a suitable method during cultivation, but are not limited thereto.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения рН культуральной среды может быть скорректирован путем добавления соединений, таких как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, ортофосфорная кислота и серная кислота, в культурную среду микроорганизма подходящим образом во время выращивания. Кроме того, во время выращивания вспенивание может быть подавлено с использованиемпеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. Кроме того, для поддержания культуральной среды в аэробном состоянии кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух) может быть инжектирован в культуральную среду. Температура культуральной среды как правило может составлять от 20°С до 45°С, пример, от 25°С до 40°С. Выращивание может продолжался до тех пор, пока не получают желаемое количество полезного вещества. Например, время выращивание может составлять от 10 часов до 160 часов.According to a specific embodiment of the present invention, the pH of the culture medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, orthophosphoric acid and sulfuric acid to the culture medium of the microorganism in a suitable manner during cultivation. In addition, during cultivation, foaming can be suppressed using an antifoam such as a polyglycol ester of a fatty acid. In addition, to maintain the culture medium in an aerobic state, oxygen or an oxygen-containing gas (for example, air) can be injected into the culture medium. The temperature of the culture medium can generally be from 20 ° C to 45 ° C, for example, from 25 ° C to 40 ° C. The cultivation can be continued until the desired amount of the useful substance is obtained. For example, the cultivation time can be from 10 hours to 160 hours.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения на стадии выделения L-лизина из выращиваемого варианта и среды, в которой выращивают вариант, продуцированный L-лизин может быть собран или выделен из культурной среды с использованием подходящего способа, известного в области техники, в зависимости от способа выращивания. Например, может быть использовано центрифугирование, фильтрование, экстракция, распыление, сушка, упаривание, осаждение, кристаллизация, электрофорез, фракционное растворение (например, осадка сульфата аммония), хроматография (например, ионный обмен, аффинная, гидрофобная и гель-фильтрационная), и т.п, но способ не ограничивается этим.According to a specific embodiment of the description of the present invention, in the step of isolating L-lysine from the grown variant and the medium in which the variant is grown, the produced L-lysine can be collected or isolated from the culture medium using a suitable method known in the art depending on the growing method. For example, centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (e.g., ammonium sulfate precipitation), chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic and gel filtration), etc. can be used, but the method is not limited thereto.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения на стадии выделения лизина культурную среду центрифугируют при низкой скорости для удаления биомассы, и полученный супернатант может быть разделен при помощи ионообменной хроматографии.According to a specific embodiment of the description of the present invention, in the lysine isolation step, the culture medium is centrifuged at low speed to remove biomass, and the resulting supernatant can be separated by ion exchange chromatography.
В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения стадия выделения L-лизина может включать процесс очистки L-лизина.According to a particular embodiment of the description of the present invention, the step of isolating L-lysine may include a process for purifying L-lysine.
Благоприятные эффектыBeneficial effects
Вариант Corynebacterium glutamicum в соответствии с описанием настоящего изобретения может улучшать выход L-лизина путем увеличения или усиления экспрессии гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, по сравнению с родительским штаммом.The Corynebacterium glutamicum variant according to the present invention can improve the yield of L-lysine by increasing or enhancing the expression of the gene encoding diaminopimelate decarboxylase, compared to the parent strain.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
ФИГ. 1 демонстрирует конструкцию вектора pCGI(Pm1-argS+lysA), включающего промотор оперона argS-lysA, в котором CG в позициях -17 и -18 промотора заменены на СТ в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения;FIG. 1 shows the construction of the pCGI(Pm1-argS+lysA) vector comprising the argS-lysA operon promoter in which CG at positions -17 and -18 of the promoter are replaced with CT in accordance with one embodiment of the present invention;
ФИГ. 2 демонстрирует конструкцию вектора pCGI(Pm2-argS+lysA) включающего промотор оперона argS-lys А, в котором CG в позициях -17 и -18 промотора заменены на GA в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения; и FIG. 2 shows the construction of the pCGI(Pm2-argS+lysA) vector comprising the argS-lysA operon promoter, in which CG at positions -17 and -18 of the promoter are replaced with GA in accordance with one of the exemplary embodiments of the description of the present invention; and
ФИГ. 3 демонстрирует конструкцию вектора pCGI(Pm3-argS+lysA) включающего промотор оперона argS-lysA, в котором CG в позициях -17 и -18 промотора заменены на GT в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения.FIG. 3 shows the construction of the pCGI(Pm3-argS+lysA) vector comprising the argS-lysA operon promoter, in which CG at positions -17 and -18 of the promoter are replaced by GT in accordance with one of the exemplary embodiments of the description of the present invention.
Способ осуществления изобретенияMethod of carrying out the invention
Далее, описание настоящего изобретения будет описано более подробно. Тем не менее, данное описание приведено исключительно с целью понимания описания настоящего изобретения, и объем описания настоящего изобретения не ограничен данным примером описания.Next, the description of the present invention will be described in more detail. However, this description is provided solely for the purpose of understanding the description of the present invention, and the scope of the description of the present invention is not limited to this description example.
Пример 1. Получение варианта Corynebacterium glutamicumExample 1. Obtaining a variant of Corynebacterium glutamicum
Для получения варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего усиленной диаминопимелатдекарбоксилазной активностью, использовали штамм Corynebacterium glutamicum DS1 иЕ. coli DH5a (HIT Competent cells™, кат. №RH618).To obtain a variant of Corynebacterium glutamicum with enhanced diaminopimelate decarboxylase activity, the strain Corynebacterium glutamicum DS1 and E. coli DH5a (HIT Competent cells™, cat. No. RH618) were used.
Штамм Corynebacterium glutamicum DS1 выращивали при температуре 30°C в среде СМ-бульон (рН 6,8), имеющей состав 5 г глюкозы, 2,5 г NaCl, 5,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г мочевины, 10,0 г полипептона и 5,0 г мясного экстракта в 1 л дистиллированной воды.The Corynebacterium glutamicum DS1 strain was grown at 30°C in CM broth medium (pH 6.8) containing 5 g glucose, 2.5 g NaCl, 5.0 g yeast extract, 1.0 g urea, 10.0 g polypeptone, and 5.0 g meat extract in 1 L of distilled water.
Е. coli DH5a выращивали при температуре 37°С в среде LB (Луриа-Бертани), имеющей композицию 10,0 г триптона, 10,0 г NaCl и 5,0 г дрожжевого экстракта в 1 л дистиллированной воды.E. coli DH5a was grown at 37°C in LB (Luria-Bertani) medium containing 10.0 g tryptone, 10.0 g NaCl, and 5.0 g yeast extract in 1 L distilled water.
В качестве антибиотиков использовали канамицин и стрептомицин, произведенные Sigma. Анализ секвенирования тДНК осуществляли в Macrogen Co., Ltd.The antibiotics used were kanamycin and streptomycin, both manufactured by Sigma. The tDNA sequencing analysis was performed by Macrogen Co., Ltd.
1-1. Получение рекомбинантного вектора1-1. Obtaining a recombinant vector
Для увеличения продукции лизина в штамме вводили улучшение диаминопимелатдекарбоксилазы, которая действует на последней стадии пути биосинтеза лизина. Способ, используемый в этом примере, индуцировал специфическую мутацию в промоторе оперона argS-lysA для увеличения экспрессии гена lysA, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу. Нуклеотидная последовательность в позициях -17 и -18 промотора оперона argS-lysA была заменена с CG на СТ, и 510 п. о. левого плеча и 480 п. о. правого плеча, расположенных вокруг оперона argS-lysA в геноме Corynebacterium glutamicum, амплифицировали с использованием ПЦР (полимерадной цепной реакции), и связывали с использованием ПЦР с перекрывающимися праймерами, и затем клонировали в рекомбинантный вектор pCGI (смотри Kim et at, Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130). Плазмида была названа pCGI (Pm1-argS+lysA) (смотри Фиг. 1). Для конструирования плазмиды прайм еры, представленные в таблице 1 ниже, использовали для амплификации каждого фрагмента гена.To increase lysine production, the strain was enhanced with diaminopimelate decarboxylase, which acts at the last step of the lysine biosynthetic pathway. The method used in this example induced a specific mutation in the promoter of the argS-lysA operon to increase the expression of the lysA gene encoding diaminopimelate decarboxylase. The nucleotide sequence at positions -17 and -18 of the argS-lysA operon promoter was changed from CG to CT, and 510 bp of the left arm and 480 bp of the left arm were changed. The right arm genes located around the argS-lysA operon in the Corynebacterium glutamicum genome were amplified using PCR (polymerase chain reaction) and linked using overlapping primer PCR, and then cloned into the recombinant vector pCGI (see Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130). The plasmid was named pCGI (Pm1-argS+lysA) (see Fig. 1). To construct the plasmid, the primers shown in Table 1 below were used to amplify each gene fragment.
ПЦР осуществляли с использованием вышеупомянутых праймеров в следующих условиях. Выполнялось от 25 до 30 циклов с использованием термоциклера (ТР600, TAKARA BIO Inc., Япония) в присутствии 1 единицы смеси ДНК-полимеразы pfu-X (Solgent) с использованием 1 пМ олигонуклеотида и 10 нг хромосомной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum DS1 в качестве матрицы в реакционном растворе, к которому добавляли 100 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dATP (дезоксиаденозина трифосфат), dCTP (дезоксицитидина трифосфат), dGTP (дезоксигуанозина трифосфат), dTTP (дезокситимидина трифосфат)). ПЦР осуществляли в условиях (1) стадии денатурации: при 94°С в течение 30 секунд, (2) стадии отжига: при 58°С в течение 30 секунд, и (3) стадии удлинения: при 72°С в течение от 1 минуты до 2 минут (время полимеризации 2 минуты на 1 т.п.о.).PCR was carried out using the above-mentioned primers under the following conditions. It was carried out for 25 to 30 cycles using a thermal cycler (TP600, TAKARA BIO Inc., Japan) in the presence of 1 unit of pfu-X DNA polymerase mixture (Solgent) using 1 pM of the oligonucleotide and 10 ng of the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum DS1 strain as a template in the reaction solution to which 100 μM of each deoxynucleotide triphosphate (dATP (deoxyadenosine triphosphate), dCTP (deoxycytidine triphosphate), dGTP (deoxyguanosine triphosphate), dTTP (deoxythymidine triphosphate)) was added. PCR was performed under the conditions of (1) denaturation step: at 94°C for 30 seconds, (2) annealing step: at 58°C for 30 seconds, and (3) extension step: at 72°C for 1 minute to 2 minutes (polymerization time 2 minutes per 1 kb).
Каждый полученный таким образом фрагмент гена клонировали в вектор pCGI с использованием самособирающегося клона. Вектор трансформировали в Е. coli DH5a, высевали на чашку с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл канамицина, и выращивали при 37°С в течение 24 часов. Образованные в конце колонии выделяли и подтверждали то, что вставка правильно присутствует в векторе. Этот вектор выделяли и использовали в рекомбинации штамма Corynebacterium glutamicum.Each gene fragment thus obtained was cloned into the pCGI vector using a self-assembling clone. The vector was transformed into E. coli DH5a, plated on LB agar containing 50 μg/ml kanamycin, and grown at 37°C for 24 hours. The resulting colonies were isolated and it was confirmed that the insert was correctly present in the vector. This vector was isolated and used in the recombination of a Corynebacterium glutamicum strain.
В качестве способа, обычно используемого в вышеуказанном способе, соответствующие гены амплифицировали при помощи ПЦР из геномной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum DS1, и встраивали в вектор pCGI с использованием способа самособирающегося клона в соответствии со стратегией и, отбирали в Е. coli DH5a. Для замены оснований в хромосоме каждый фрагмент гена был индивидуально амплифицирован, и фрагмент ДНК-мишени получали при помощи ПЦР сперекрывающимися праймерами. Во время манипуляции с генами полимеразу Ex Taq (Takara) и полимеразу Pfu (Solgent) использовали в качестве ферментов для амплификации путем ПЦР, и различные ферменты рестрикции и ферменты модификации ДНК, доступные от NEB, использовали в соответствии с поставляемым буфером и протоколом. 1-2. Получение вариантаAs a method generally used in the above method, the corresponding genes were amplified by PCR from the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum DS1 strain, and inserted into the pCGI vector using the self-assembling clone method according to the strategy, and selected in E. coli DH5a. To replace the bases in the chromosome, each gene fragment was individually amplified, and the target DNA fragment was obtained by PCR with overlapping primers. During the gene manipulation, Ex Taq polymerase (Takara) and Pfu polymerase (Solgent) were used as enzymes for PCR amplification, and various restriction enzymes and DNA modification enzymes available from NEB were used according to the supplied buffer and protocol. 1-2. Preparation of the variant
Штамм DS3, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием вектора pCGI (Pm1-argS+lysA). Вектор получали в конечной концентрации 1 мкг/мкл, и основная рекомбинация был индуцирована в штамме Corynebacterium glutamicum DS1 с использованием электропорации (смотри Tauch et at, FEMSMicrobiology letters 123 (1994) 343-347). Подвергнутый электропорации штамм затем распределяли по чашке с СМ-агаром, содержащим 20 мкг/мкл канамицина, для того, чтобы изолировать колонии, и затем при помощи ПЦР и анализа секвенирования оснований подтверждали то, был ли вектор правильно встроен в индуцируемую позицию в геноме. Для индукции вторичной рекомбинации выделенный штамм инокулировали в жидкую среду с СМ-агаром, содержащую стрептомицин, выращивали в течение ночи или дольше, и затем распределяли по агаровой среде, содержащей такую же концентрацию стрептомицина, для выделения колоний. После проверки устойчивости к канамицину в окончательных выделенных колониях было подтверждено с помощью анализа секвенирования оснований то, были ли введены мутации в ген lysA в штаммах без устойчивости к антибиотикам (смотри Schafer et at, Gene 145 (1994) 69-73). Наконец, получали вариант Corynebacterium glutamicum (DS3), в который был введен мутантный ген lysA.Strain DS3, which is a variant strain, was prepared using the pCGI (Pm1-argS+lysA) vector. The vector was prepared at a final concentration of 1 μg/μl, and basal recombination was induced in Corynebacterium glutamicum DS1 strain using electroporation (see Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347). The electroporated strain was then spread on a CM agar plate containing 20 μg/μl kanamycin to isolate colonies, and then PCR and base sequencing analysis confirmed whether the vector had been correctly inserted into the inducible position in the genome. To induce secondary recombination, the isolated strain was inoculated into liquid CM agar medium containing streptomycin, grown overnight or longer, and then spread onto agar medium containing the same concentration of streptomycin to isolate colonies. After checking for kanamycin resistance in the final isolated colonies, it was confirmed by base sequencing analysis whether mutations had been introduced into the lysA gene in strains without antibiotic resistance (see Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73). Finally, a variant of Corynebacterium glutamicum (DS3) in which the mutant lysA gene had been introduced was obtained.
Пример 2. Получение варианта Corynebacterium glutamicumExample 2. Obtaining a variant of Corynebacterium glutamicum
Вариант Corynebacterium glutamicum получали тем же самым образом, как в примере 1, за исключением того, что нуклеотидная последовательность в позициях -17 и -18 промотора оперона argS-lysA была заменена с CG на GA.A Corynebacterium glutamicum variant was obtained in the same manner as in Example 1, except that the nucleotide sequence at positions -17 and -18 of the argS-lysA operon promoter was changed from CG to GA.
В данном случае, для конструирования плазмиды праймеры, представленные в таблице 2 ниже, использовали для амплификации каждого фрагмента гена, и штамм DS3-1, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием полученного плазмидного вектора pCGI(Pm2-argS+lysA) (смотри Фиг. 2). Наконец, получили вариант Corynebacterium glutamicum (DS3-1), в который был введен мутантный ген lysA.In this case, to construct the plasmid, the primers shown in Table 2 below were used to amplify each gene fragment, and the strain DS3-1, which is a variant strain, was obtained using the obtained plasmid vector pCGI(Pm2-argS+lysA) (see Fig. 2). Finally, a variant Corynebacterium glutamicum (DS3-1) into which the mutant lysA gene was introduced was obtained.
Пример 3. Получение варианта Corynebacterium glutamicumExample 3. Obtaining a variant of Corynebacterium glutamicum
Вариант Corynebacterium glutamicum получали тем же самым образом, как в примере 1, за исключением того, что нуклеотидная последовательность в позициях -17 и -18 промотора оперона argS-lysA была заменена с CG на GT.A Corynebacterium glutamicum variant was obtained in the same manner as in Example 1, except that the nucleotide sequence at positions -17 and -18 of the argS-lysA operon promoter was changed from CG to GT.
В данном случае, для конструирования плазмиды праймеры, представленные в таблице 3 ниже, использовали для амплификации каждого фрагмента гена, и штамм DS3-2, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием полученного плазмидного вектора pCGI(Pm3-argS+lysA). Наконец, получили вариант Corynebacterium glutamicum (DS3-2), в который был введен мутантный ген lysA.In this case, to construct the plasmid, the primers shown in Table 3 below were used to amplify each gene fragment, and the strain DS3-2, which is a variant strain, was obtained using the obtained plasmid vector pCGI(Pm3-argS+lysA). Finally, a variant Corynebacterium glutamicum (DS3-2) into which the mutant lysA gene was introduced was obtained.
Экспериментальный пример 1. Сравнение продукции L-лизина между вариантамиExperimental Example 1: Comparison of L-Lysine Production Between Variants
Продукцию L-лизина сравнивали между родительским штаммом Corynebacterium glutamicum DS1 и штаммом DS2, штаммом DS2-1 и штаммом DS2-2, которые представляют продуцирующие лизин варианты, полученные в примерах 1-3.L-lysine production was compared between the parental strain Corynebacterium glutamicum DS1 and strain DS2, strain DS2-1 and strain DS2-2, which represent the lysine-producing variants obtained in Examples 1-3.
Каждый штамм инокулировали в колбу объемом 100 мл, содержащую 10 мл лизиновой среды, имеющей состав, представленный в таблице 4 ниже, и выращивали при 30°С в течение 48 часов при встряхивании при 180 об./мин. После завершения выращивания анализ лизина осуществляли путем измерения продукции L-лизина с использованием HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (Shimazu, Japan), и результаты представлены Each strain was inoculated into a 100 ml flask containing 10 ml of lysine medium having the composition shown in Table 4 below and grown at 30°C for 48 hours with shaking at 180 rpm. After completion of the growth, lysine analysis was performed by measuring L-lysine production using HPLC (high performance liquid chromatography) (Shimazu, Japan), and the results are presented
в таблице 5.in table 5.
В соответствии с представленным в таблице 5 варианты Corynebacterium glutamicum DS3, DS3-1 и DS3-2 демонстрировали приблизительно 4,7%, 6,3% и 12,5% увеличения продукции L-лизина, соответственно, по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum DS1, вследствие замены конкретных позиций (области -17 и -18) в последовательности промотора оперона argS-lysA на оптимальную нуклеотидную последовательность (СТ, GA или GT) для усиления пути биосинтеза лизина. Эти результаты свидетельствуют о том, что усиленная экспрессия гена lysA улучшает способность продуцировать L-лизин штаммом за счет того, что способствует расщеплению углеродных связей в предшественнике лизина.As shown in Table 5, Corynebacterium glutamicum DS3, DS3-1 and DS3-2 variants showed approximately 4.7%, 6.3% and 12.5% increase in L-lysine production, respectively, compared with the parental strain Corynebacterium glutamicum DS1, due to the replacement of specific positions (-17 and -18 regions) in the promoter sequence of argS-lysA operon with the optimal nucleotide sequence (CT, GA or GT) to enhance the lysine biosynthetic pathway. These results indicate that the enhanced expression of the lysA gene improves the L-lysine producing ability of the strain by promoting the cleavage of carbon bonds in the lysine precursor.
Вышеприведенное описание настоящего изобретения было описано со ссылкой на предпочтительные примеры его воплощений. Специалисту в данной области техники, для которого приведено описание настоящего изобретения, понятно то, что описание настоящего изобретения может быть осуществлено в модифицированном варианте без отклонения от существенных характеристик описания настоящего изобретения. Соответственно, раскрытые здесь примеры воплощений должны рассматриваться в иллюстративном, а не ограничительном аспекте. Объем описания настоящего изобретения представлен не в вышеуказанном раскрытии, а в приложенной формуле изобретения, и все различия в объеме, эквивалентном ему, следует интерпретировать как включенные в описание настоящего изобретения.The above description of the present invention has been described with reference to preferred embodiments thereof. It is clear to those skilled in the art, to whom the present invention is described, that the present invention may be embodied in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Accordingly, the embodiments disclosed herein should be considered in an illustrative and not limiting aspect. The scope of the present invention is not indicated in the above disclosure but in the appended claims, and all differences in scope equivalent thereto should be interpreted as included in the present invention.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> DAESANG CORPORATION<110>DAESANG CORPORATION
<120> ВАРИАНТ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, ОБЛАДАЮЩИЙ<120> A VARIANT OF CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM THAT HAS
УЛУЧШЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ L-ЛИЗИН, И СПОСОБIMPROVED ABILITY TO PRODUCE L-LYSINE, AND A METHOD
ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМPRODUCTION OF L-LYSINE WITH ITS USE
<130> OPA23234<130>OPA23234
<150> KR 10-2021-0030960<150> KR 10-2021-0030960
<151> 2021-03-09<151> 2021-03-09
<150> KR 10-2021-0054313<150> KR 10-2021-0054313
<151> 2021-04-27<151> 2021-04-27
<160> 16<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1<210> 1
<211> 200<211> 200
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Последовательность промотора гена lysA<223> Sequence of the lysA gene promoter
<400> 1<400> 1
cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60
caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120
ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180
ctcggctaga atttctcccc 200ctcggctaga atttctcccc 200
<210> 2<210> 2
<211> 200<211> 200
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Мутантная последовательность промотора гена lysA<223> Mutant sequence of the lysA gene promoter
<400> 2<400> 2
cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60
caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120
ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180
ctctgctaga atttctcccc 200ctctgctaga atttctcccc 200
<210> 3<210> 3
<211> 200<211> 200
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Мутантная последовательность промотора гена lysA<223> Mutant sequence of the lysA gene promoter
<400> 3<400> 3
cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60
caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120
ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180
ctgagctaga atttctcccc 200ctgagctaga atttctcccc 200
<210> 4<210> 4
<211> 200<211> 200
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Мутантная последовательность промотора гена lysA<223> Mutant sequence of the lysA gene promoter
<400> 4<400> 4
cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60
caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120
ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180
ctgtgctaga atttctcccc 200ctgtgctaga atttctcccc 200
<210> 5<210> 5
<211> 30<211> 30
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-LA-F1<223> lysA-LA-F1
<400> 5<400> 5
tgattacgcc tccgcgaggc tgcactgcaa 30tgattacgcc tccgcgaggc tgcactgcaa 30
<210> 6<210> 6
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-LA-F2<223> lysA-LA-F2
<400> 6<400> 6
tccgcgaggc tgcactgcaa 20tccgcgaggc tgcactgcaa 20
<210> 7<210> 7
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-LA-R1<223> lysA-LA-R1
<400> 7<400> 7
gtacacccgt cgcacagaat 20gtacacccgt cgcacagaat 20
<210> 8<210> 8
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-LA-R2<223> lysA-LA-R2
<400> 8<400> 8
tctagcagag gtacacccgt 20tctagcagag gtacacccgt 20
<210> 9<210> 9
<211> 30<211> 30
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-RA-F1<223> lysA-RA-F1
<400> 9<400> 9
ctctgctaga atttctcccc atgacaccag 30ctctgctaga atttctcccc atgacaccag 30
<210> 10<210> 10
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-RA-F2<223> lysA-RA-F2
<400> 10<400> 10
atttctcccc atgacaccag 20atttctcccc atgacaccag 20
<210> 11<210> 11
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-RA-R1<223> lysA-RA-R1
<400> 11<400> 11
gcacacgacc caaagagtca 20gcacacgacc caaagagtca 20
<210> 12<210> 12
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-RA-R2<223> lysA-RA-R2
<400> 12<400> 12
gaagcctcca gcacacgacc 20gaagcctcca gcacacgacc 20
<210> 13<210> 13
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-LA2-R2<223> lysA-LA2-R2
<400> 13<400> 13
tctagctcag gtacacccgt 20tctagctcag gtacacccgt 20
<210> 14<210> 14
<211> 30<211> 30
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-RA2-F1<223> lysA-RA2-F1
<400> 14<400> 14
ctgagctaga atttctcccc atgacaccag 30ctgagctaga atttctcccc atgacaccag 30
<210> 15<210> 15
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-LA3-R2<223> lysA-LA3-R2
<400> 15<400> 15
tctagcacag gtacacccgt 20tctagcacag gtacacccgt 20
<210> 16<210> 16
<211> 30<211> 30
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> lysA-RA3-F1<223> lysA-RA3-F1
<400> 16<400> 16
ctgtgctaga atttctcccc atgacaccag 30ctgtgctaga atttctcccc atgacaccag 30
<---<---
Claims (6)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2021-0030960 | 2021-03-09 | ||
| KR10-2021-0054313 | 2021-04-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2834919C1 true RU2834919C1 (en) | 2025-02-17 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008033001A1 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Cj Cheiljedang Corporation | A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same |
| US8535915B2 (en) * | 2008-01-31 | 2013-09-17 | Cj Cheiljedang Corporation | Promoter, and a production method for L-lysine using the same |
| RU2535973C2 (en) * | 2010-06-15 | 2014-12-20 | Пайк Кванг Индастриал Ко., Лтд. | Method of producing amino acids of asparate family with application of microorganisms |
| US20200347419A1 (en) * | 2017-11-01 | 2020-11-05 | Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd | Recombinant bacterium capable of producing l-lysine, construction method thereof and production method of l-lysine |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008033001A1 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Cj Cheiljedang Corporation | A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same |
| US8535915B2 (en) * | 2008-01-31 | 2013-09-17 | Cj Cheiljedang Corporation | Promoter, and a production method for L-lysine using the same |
| RU2535973C2 (en) * | 2010-06-15 | 2014-12-20 | Пайк Кванг Индастриал Ко., Лтд. | Method of producing amino acids of asparate family with application of microorganisms |
| US20200347419A1 (en) * | 2017-11-01 | 2020-11-05 | Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd | Recombinant bacterium capable of producing l-lysine, construction method thereof and production method of l-lysine |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TARUTINA M.G. et al. Assessment of effectiveness of Corynebacterium glutamicum promoters and their application for the enhancement of gene activity in lysine-producing bacteria. Appl Biochem Microbiol 52, 692-698 (2016). https://doi.org/10.1134/S0003683816070073. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6848067B2 (en) | A novel isopropylmalate synthase mutant and a method for producing L-leucine using it. | |
| RU2683551C1 (en) | Microorganism which possess productivity of l-lysine, and method of producing l-lysine using this microorganism | |
| RU2834919C1 (en) | Variant of corynebacterium glutamicum having improved ability to produce l-lysine, and method of producing l-lysine using same | |
| EP4056675A1 (en) | Mutant of corynebacterium glutamicum with enhanced l-lysine productivity and method for preparing l-lysine using the same | |
| EP3964572A1 (en) | Mutant of corynebacterium glutamicum with enhanced l-lysine productivity and method for preparing l-lysine using the same | |
| RU2837131C2 (en) | Variant of corynebacterium glutamicum, having improved ability to produce l-lysine, and method of producing l-lysine by using same | |
| RU2829715C2 (en) | Variant of corynebacterium glutamicum with improved ability to produce l-lysine and method of producing l-lysine using same | |
| EP4306644A1 (en) | Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine by using same | |
| JP7620123B2 (en) | Corynebacterium glutamicum mutant with improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| US20240218405A1 (en) | Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine using same | |
| JP7475408B2 (en) | Corynebacterium sp. microorganism having improved L-arginine or L-citrulline producing ability and method for producing L-arginine or L-citrulline using the same | |
| EP4083197A1 (en) | Corynebacterium glutamicum mutant strain having enhanced l-lysine productivity and method of producing l-lysine using the same | |
| KR20220126610A (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| JP2024014657A (en) | Microorganism of corynebacterium genus having enhanced l-arginine or l-citrulline productivity and method for producing l-arginine or l-citrulline using the same | |
| KR20230053351A (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| KR20230108790A (en) | Mutant in Escherichia with enhanced L-histidine productivity and method for preparing L-histidine using the same | |
| KR20230084993A (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| KR20220148694A (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| CN115261246A (en) | Corynebacterium glutamicum mutant strain having improved L-lysine productivity and method for producing L-lysine using the same |