RU2833410C1 - Гемостатическое средство - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к гемостатическому средству. Гемостатическое средство представляет собой композицию находящихся в твердой форме тромбина и нативной гиалуроновой кислоты, ее водорастворимой соли либо ее/соли сольвата, содержание тромбина в нем составляет не менее 0,01 МЕ/см² и не более 0,06 МЕ/см². Вышеописанное средство является биосовместимым и биорезорбируемым, не набухает и обеспечивает минимальный срок достижения гемостаза. 1 н. п. и 1 з.п. ф-лы, 7 пр.

Description

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, а именно медицинских изделий и композиций, которые могут быть использованы для остановки кровотечения и заживления ран. Гемостатическое средство является биосовместимым и биорезорбируемым за счет применения в нем гиалуроновой кислоты, ее солей и сольватов совместно с тромбином, предпочтительно человеческим.

Гиалуроновая кислота является полисахаридом, состоящим из повторяющихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и звеньев N-ацетил-D-глюкозамина. В зависимости от количества повторов выделяют низко- (до 100-300 тыс. Да) и высокомолекулярную (от 500 тыс., иногда от 1000 тыс. Да). Гиалуроновая кислота образует соли, а также сольваты, в том числе сольваты солей. Для описания этого разнообразия соединений обычно используют термин «гиалуронан», а для подмножества различных солей гиалуроновой кислоты используют термин «гиалуронат».

Гиалуроновая кислота имеет схожие свойства со своими аммониевой, магниевой и щелочно-металлическими солями, в частности, растворимость в воде (Petr Snetkov, Kseniia Zakharova, Svetlana Morozkina, Roman Olekhnovich, Mayya Uspenskaya. Hyaluronic Acid: The Influence of Molecular Weight on Structural, Physical, Physico-Chemical, and Degradable Properties of Biopolymer, стр. 3. doi: 10.3390/polyml2081800).

Также специалистам известно, что при высушивании раствора вещества в полученном в твердой фазе веществе часто сохраняются остатки растворителя («остаточная влажность»). Такие вещества принято называть сольватами. При этом некоторые вещества, включая гиалуронан, являются весьма гигроскопичными и могут даже набирать влагу из атмосферного воздуха.

Из научно-технической литературы известно, что в организме млекопитающих, включая человека, гиалуроновая кислота в основном представлена высокомолекулярной формой натриевой соли. При этом в организме гиалуронат постоянно резорбируется и синтезируется, ежедневно происходит резорбция и синтез до трети всей находящейся в организме человека гиалуроновой кислоты.

Также из научно-технической литературы известно, что в растворах цепи гиалуронанов могут формировать различные вторичные и третичные структуры, в том числе сетки, удерживающие молекулы воды.

В промышленности гиалуронаны получают в основном либо выделением из биологических объектов (в первую очередь, гребней петухов) либо биотехнологическим синтезом. Полученный промышленным способом гиалуронан представляет собой аморфный мелкодисперсный порошок белого цвета с размерами частиц 0,05-0,25 мм.

Известен компонент крови человека - белок тромбин (Earl W. Davie, John D. Kulman. An overview of the structure and function of thrombin, doi: 10.1055/s-2006-939550). При активации свертывания крови тромбин преобразует фибриноген в фибрин и активирует другие факторы свертывания крови. Фибрин образует сетку, захватывающую эритроциты, совместно с тромбоцитами образующими тромб, приводящий к остановке кровотечения.

Известны различные гемостатические средства, основанные на полисахаридах, в частности, хитозане, целлюлозе, гиалуроновой кислоте и их производных. Однако следует отметить, что наибольшей биосовместимостью с человеком обладает гиалуронан, поскольку он формирует внеклеточный матрикс позвоночных, а целлюлоза и хитозан выполняют схожую функцию в растениях и ракообразных, грибах и насекомых соответственно. В организме человека целлюлоза и хитозан отсутствуют.

В частности, известна гемостатическая губка, состоящая из биоматериала - пористой матрицы и материала, усиливающего адгезию матрицы к органу (US 8771258). Биоматериал пористой матрицы включает в себя различные вещества, включая полисахариды, преимущественно хитозан. Также губка включает адгезивный материал - два перекрестно сшивающихся компонента, представленные, в первую очередь, полиэтиленгликолями. Недостатком губки, кроме чужеродных для человека материалов, является относительно медленный гемостаз - 2 минуты согласно примеру 10.

Также известна гемостатическая губка (патент US 2021/0228764), представляющая собой композицию окисленной целлюлозы безжелатинового биоадгезивного материала. Недостатком данного средства является наличие в нем чужеродной для человеческого организма целлюлозы.

Известен быстродействующий сухой клей, методы его производства и применения (WO 2008/016983). Данная композиция состоит из двух перекрестно сшивающихся компонентов, которые сшиваются между собой при наличии условий для такой реакции с формированием пористого материала, и компонента, формирующего гидрогель. В качестве сшивающихся компонентов используют полиэтиленгликоль. Данное средство применяли совместно с тромбином в различных концентрациях (пример 23), но преимуществ добавления тромбина не было обнаружено. Недостатком данного средства является относительно длительная остановка кровотечения (от 1 минуты в примере 22 до 2 минут в примере 26).

Известна гемостатическая, антисептическая и ранозаживляющая губка (патент RU 2226406). Губка приготовлена из денатурированного коллагена - желатина, впитывает кровь, в 45-50 раз превышающую ее собственный вес. Недостатком данного средства является его набухание, что ограничивает его применение рядом с нервами и сосудами, а также длительный (2-8 минут) срок остановки кровотечения.

Известен основанный на ионном полисахариде пористый полимерный материал (патент RU 2762729), который может быть использован в качестве покрытий на раны и ожоги. Данный пористый полимерный материал готовят из альгинатов, пектинов, каррагинанов, хондроитинсульфатов или хитозана и его производных. Гиалуронан в качестве основы для материала не используется, о его гемостатическом действии не известно. При этом, согласно п. 2 формулы изобретения, материал переводится в водонерастворимую форму.

Известен микронаноструктурированный биопластический материал (патент RU 2481127). Его основой является нанос труктурированная матрица, сформированная из гиалуроновой кислоты, которая содержит протеогликаны, гликопротеины, фибриллярные белки и антисептик. Материал используют для лечения ожогов, о его гемостатическом эффекте не известно.

Известен способ получения модифицированной гиалуроновой кислоты (патент RU 2191782). Образующаяся химически модифицированная пленка способствует активной регенерации тканей, предупреждает воспалительный и спаечный процессы. О ее гемостатическом эффекте не известно.

Известен биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, включающий производные гиалуроновой кислоты (патент RU 2177332), а именно ее бензиловый эфир. О гемостатическом эффекте данного материала не известно.

Известно раневое покрытие, обладающее гемостатическим действием (патент RU 2624242). Данное покрытие состоит из биополимерного материала на основе бактериальной целлюлозы и биологически активных компонентов (до 10% гемостатических и до 3% антимикробных). Гемостатическое средство имеет довольно хорошее быстродействие. Недостатком средства является то, что оно использует чужеродную для человеческого организма целлюлозу и имеет довольно высокий расход ценного компонента - «добываемого» из человека тромбина (от 0,5 до 150 ME/см²).

Известна гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту (патент RU 2486921). Данная композиция включает желатин и не менее 10% нативной (без использования химических сшивающих агентов) гиалуроновой кислоты или ее производных. Композиция стабилизируется сухим жаром при температуре от 110°С до 200°С. Преимуществом композиции является ее меньшее набухание, недостатком - относительно медленный гемостаз, составляющий 2 минуты и более.

Известен носитель с твердым фибриногеном и твердым тромбином (патент US 7399483, прототип). Данный носитель имеет сходные черты с изобретением, а именно: 1) он используется для гемостаза; 2) в качестве основы носителя среди прочих может использоваться гиалуроновая кислота (в реализации изобретения, однако, ее использование не раскрыто: использовались только губки лиофилизованного и вспененного коллагена, желатина, окисленной целлюлозы и полиглактина/диоксанона); 3) носитель покрывается тромбином (1,5-2,5 МЕ/см²) (а также фибриногеном в количестве 4,3-6,7 мг/см²). Недостатком данного средства является относительно высокий расход тромбина и использование фибриногена - ценных ресурсов, «добываемых» из человека, а также, как известно из медицинской литературы (В.А. Горский, A.M. Зрянин, М.А. Агапов. Эффективность использования ТахоКомба в гепатобилиарной хирургии // Современные технологии в медицине. - 2011, №2, стр. 61-68), относительно длительным сроком наступления гемостаза - около 3 минут.

Техническая задача изобретения заключается в расширении технического арсенала гемостатических средств и сокращении срока достижения гемостаза.

Технический результат изобретения состоит в создании нового гемостатического средства на основе гиалуронана и тромбина, которое является биосовместимым и биорезорбируемым, не набухает и обеспечивает минимальный срок достижения гемостаза.

Предварительно были проведены эксперименты с различными формами гиалуронана и концентрациями тромбина, которые неожиданно показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда гемостатическое средство представляет собой композицию нативного гиалуронана (а именно гиалуроновой кислоты, ее водорастворимой соли, либо ее/соли сольвата) и тромбина, находящихся в твердой форме, при этом содержание тромбина составляет не менее 0,01 ME на см². В некоторых вариантах изобретения гиалуронан может находится в форме как минимум частично кристаллизованного полимера. Указанный результат достигается за счет того, что гиалуронан связывает воду плазмы крови, что повышает концентрацию находящихся в плазме крови компонентов и обеспечивает более эффективное и быстрое слипание тромбоцитов, а находящийся в составе средства тромбин преобразует нативный фибриноген в фибрин, который образует дополнительные к сетям гиалуронана сети фибрина, иммобилизующие эритроциты, в результате чего образуется останавливающий кровотечение сгусток (тромб), при этом образование данного тромба и остановка кровотечения тем быстрее, чем более реакционно активным является гиалуронан и чем выше концентрация тромбина в средстве. Для придания дополнительных свойств или ускорения быстродействия гемостатическое средство может включать иные факторы свертываемости крови, факторы роста клеток, антисептики, анестетики и/или ранозаживляющие вещества (например, метилурацил, декспантенол). Также в средстве могут использоваться вспомогательные вещества, не определяющие его ключевую функциональность, такие, как например, рибофлавин, силикон для различения «активной» и обратной поверхности и повышения удобства наложения средства на рану. Средство может быть стерилизовано известными специалисту методами, например, этиленоксидом.

Предлагаемое техническое решение является новым и не описано в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое гемостатическое средство может быть использовано, например, для остановки кровотечения и ускорения заживления ран.

Содержание изобретения, отличия и преимущества предложенного гемостатического средства иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

Гиалуронат натрия молекулярной массой 11,6*10⁵, произведенный биотехнологическим способом компанией Swedlight АВ (Швеция), навеской 10 г растворяли в 2 л дистиллированной воды и выливали на поддон площадью 1478 см². Далее к нему, равномерно распределяя по поверхности, добавляли раствор тромбин-реагента ПГ-9А для исследований гемостаза производства НПО «Ренам» (МБООИ Общество больных гемофилией) активностью 9 ME. Полученный раствор замораживали на поддоне до температуры -60°С и высушивали в аппарате лиофильной сушки путем ступенчатого повышения температуры от температуры замораживания до +25°С при повышении давления в течение 96 часов, при этом на последнем этапе сушки снова создавали максимально возможный для лиофильного аппарата вакуум. Было получено однородное нетканое полотно белого цвета, которое было нарезано на образцы 3×4 см. Концентрация тромбина в композиции составила 0,006 ME/см².

Пример 2

Гиалуронат натрия молекулярной массой 11,6*10⁵, произведенный биотехнологическим способом компанией Swedlight АВ (Швеция), навеской 10 г растворяли в 2 л дистиллированной воды и выливали на поддон площадью 1478 см². Далее к нему, равномерно распределяя по поверхности, добавляли раствор тромбин-реагента ПГ-9А для исследований гемостаза производства НПО «Ренам» (МБООИ Общество больных гемофилией) активностью 18 ME. Полученный раствор замораживали на поддоне до температуры -60°С и высушивали в аппарате лиофильной сушки путем ступенчатого повышения температуры от температуры замораживания до +25°С при повышении давления в течение 96 часов, при этом на последнем этапе сушки снова создавали максимально возможный для лиофильного аппарата вакуум. Было получено однородное нетканое полотно белого цвета, которое было нарезано на образцы 3×4 см. Концентрация тромбина в композиции составила 0,01 ME/см².

Пример 3

Гиалуронат натрия молекулярной массой 11,6*10⁵, произведенный биотехнологическим способом компанией Swedlight АВ (Швеция), навеской 10 г растворяли в 2 л дистиллированной воды, и выливали на поддон площадью 1478 см². Далее к нему, равномерно распределяя по поверхности, добавляли раствор тромбин-реагента ПГ-9А для исследований гемостаза производства НПО «Ренам» (МБООИ Общество больных гемофилией) активностью 90 ME. Полученный раствор замораживали на поддоне до температуры -60°С и высушивали в аппарате лиофильной сушки путем ступенчатого повышения температуры от температуры замораживания до +25°С при повышении давления в течение 96 часов, при этом на последнем этапе сушки снова создавали максимально возможный для лиофильного аппарата вакуум. Было получено однородное нетканое полотно белого цвета, которое было нарезано на образцы 3×4 см. Концентрация тромбина в композиции составила 0,06 ME/см².

Пример 4

Был проведен эксперимент на взрослых крольчихах женского пола. Для эксперимента моделировалась рана печени: сначала проводилась срединная лапаротомия с обнажением края печени, далее паренхима с капсулой печени рассекалась, и на рану накладывались композиции из примеров 1-3.

Композиция из примера 1 практически сразу растворялась без видимых изменений в ране, по истечении 3 минут гемостаз не наблюдался.

Композиция из примера 2 растворилась за 15 секунд, наблюдалось начало тромбообразования, которое завершилось гемостазом через 1,5 минуты.

Композиция из примера 3 растворилась не полностью, в течение 15 секунд наступил гемостаз.

Пример 5

Гиалуронат натрия молекулярной массой 11,6*10⁵, произведенный биотехнологическим способом компанией Swedlight АВ (Швеция), навеской 10 г и 0,2 г бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммония хлорида моногидрата растворяли в 2 л дистиллированной воды и выливали на поддон площадью 1478 см². Далее к нему, равномерно распределяя по поверхности, добавляли раствор тромбин-реагента ПГ-9А для исследований гемостаза производства НПО «Ренам» (МБООИ Общество больных гемофилией) активностью 18 ME. Полученный раствор замораживали на поддоне до температуры -60°С и высушивали в аппарате лиофильной сушки путем ступенчатого повышения температуры от температуры замораживания до +25°С при повышении давления в течение 96 часов, при этом на последнем этапе сушки снова создавали максимально возможный для лиофильного аппарата вакуум. Было получено однородное нетканое полотно белого цвета.

Полученный образец использовали для исследования антимикробного действия в соответствии с ОФС 1.2.4.0002.18 (источник: Государственная фармакопея РФ IV издание. Том 1 Методы анализа лекарственных средств. Методы биологического анализа. Микробиологичеекая чистота, стр. 1128).

Использовали тест-штаммы микроорганизмов - представителей различных таксономических групп бактерий и тест-штамм дрожжеподобных грибов: Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli -представители Грам-отрицательных бактерий; Bacillus cereus представитель Грам-положительных спорообразующих бактерий; Staphylococcus aureus - представитель Грам-положительных бактерий; Candida albicans - представитель дрожжеподобных грибов.

По итогам испытания роста ни одного из микроорганизмов не выявлено.

Пример 6

Гиалуронат натрия молекулярной массой 11,6*10⁵, произведенный биотехнологическим способом компанией Swedlight АВ (Швеция), навеской 10 г и 0,2 г бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммония хлорида моногидрата растворяли в 2 л дистиллированной воды и выливали на поддон площадью 1478 см² в 3-х повторениях.

Далее на каждый поддон, равномерно распределяя по поверхности, добавляли раствор тромбин-реагента ПГ-9А для исследований гемостаза производства НПО «Ренам» (МБООИ Общество больных гемофилией) активностью 9, 18 и 90 ME соответственно. Полученные растворы замораживали на поддоне до температуры -60°С и высушивали в аппарате лиофильной сушки путем ступенчатого повышения температуры от температуры замораживания до +25°С при повышении давления в течение 96 часов, при этом на последнем этапе сушки снова создавали максимально возможный для лиофильного аппарата вакуум. Были получены однородные нетканые полотна белого цвета, которые были нарезаны на образцы 3×4 см.

Далее полученные образцы испытывались в эксперименте на модели раны бедра. Для проведения эксперимента использовались взрослые крольчихи женского пола. Для создания ранения мышцы бедра рассекалась кожа, подкожная жировая клетчатка, фасция и сама мышца (продольно, для моделирования выраженного кровотечения). После аппликаций рану оставляли открытой на 3 дня.

По результатам эксперимента:

- композиция с активностью тромбина 0,006 МЕ/см² - аппликация полностью растворилась, гемостаз не наблюдался более 3 минут, спустя 3 суток в ране обнаруживалась экссудация с признаками воспаления;

- композиция с активностью тромбина 0,01 МЕ/см² - аппликация полностью растворилась, гемостаз наступил через 2 минуты, спустя 3 суток в ране обнаруживалась минимальная экссудация с ограниченными признаками воспаления;

- композиция с активностью тромбина 0,06 МЕ/см² - гемостаз наступил через 20 секунд, спустя 3 суток рана полностью сухая, экссудации и очагов воспаления нет, в ране присутствуют остатки не полностью растворившейся аппликации.

Пример 7

Гиалуронат натрия молекулярной массой 11,6*10⁵, произведенный биотехнологическим способом компанией Swedlight АВ (Швеция), навеской 10 г, и 0,2 г бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммония хлорида моногидрата, и 20 г лидокаина растворяли в 2 л дистиллированной воды и выливали на поддон площадью 1478 см². Далее к нему, равномерно распределяя по поверхности, добавляли раствор тромбин-реагента ПГ-9А для исследований гемостаза производства НПО «Ренам» (МБООИ Общество больных гемофилией) активностью 90 ME. Полученный раствор замораживали на поддоне до температуры -60°С и высушивали в аппарате лиофильной сушки путем ступенчатого повышения температуры от температуры замораживания до +25°С при повышении давления в течение 96 часов, при этом на последнем этапе сушки снова создавали максимально возможный для лиофильного аппарата вакуум. Было получено однородное нетканое полотно белого цвета. Из данного полотна были вырезан образцы 1×1 см.

Данные образцы были применены путем размещения в лунке удаленного зуба для остановки кровотечения у двух взрослых пациентов мужского пола после удаления 38 и 48 зуба. Кровотечение у пациентов остановилось в течение 10 и 15 секунд. При повторном приеме через 3 дня рана затянулась, без воспаления, дополнительная анестезия пациентам не требовалась.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенное гемостатическое средство имеет высокую скорость действия и эффективность и может применяться в различных условиях, в том числе для остановки кровотечения в инфицированных ранах либо для предотвращения их инфицирования.

Claims (2)

1. Гемостатическое средство, представляющее собой композицию находящихся в твердой форме тромбина и нативной гиалуроновой кислоты, ее водорастворимой соли либо ее/соли сольвата, отличающееся тем, что содержание тромбина в нем составляет не менее 0,01 МЕ/см² и не более 0,06 МЕ/см².

2. Гемостатическое средство по п.1, отличающееся тем, что нативная гиалуроновая кислота, ее водорастворимая соль либо ее/соли сольват частично находится в кристаллической форме.