RU2832884C1 - Method of extracting target dna fragments from multicomponent mixture - Google Patents
Method of extracting target dna fragments from multicomponent mixture Download PDFInfo
- Publication number
- RU2832884C1 RU2832884C1 RU2024109042A RU2024109042A RU2832884C1 RU 2832884 C1 RU2832884 C1 RU 2832884C1 RU 2024109042 A RU2024109042 A RU 2024109042A RU 2024109042 A RU2024109042 A RU 2024109042A RU 2832884 C1 RU2832884 C1 RU 2832884C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna fragments
- dna
- buffer
- washing
- sorbent
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 45
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 36
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 9
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 8
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical group [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims 1
- MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M lithium perchlorate Chemical compound [Li+].[O-]Cl(=O)(=O)=O MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229910001486 lithium perchlorate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 162
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 47
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 23
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 22
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 16
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 108091092240 circulating cell-free DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 108020003564 Retroelements Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 102000011759 adducin Human genes 0.000 description 1
- 108010076723 adducin Proteins 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения фрагментов ДНК заданной длины из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей смесь разных по длине фрагментов нуклеиновых кислот, в присутствии биологического матрикса на основе плазмы крови для дальнейшего лабораторного исследования, которое может включать в себя постановку полимеразно-цепной реакции и/или определение нуклеотидной последовательности методом секвенирования ДНК. Фрагменты нуклеиновых кислот, полученные с помощью описываемого изобретения, можно использовать для молекулярно-генетического анализа биомаркеров плазмы крови, ассоциированных как с физиологическими, так и - в большей степени - с патологическими состояниями организма человека, такими как онкологические заболевания (Kim Y.J., et al. A method for early diagnosis of lung cancer from tumor originated DNA fragments using plasma cfDNA methylome and fragmentome profiles. Mol Cell Probes. 2022; 66: 101873, Foda Z.H., et al. Detecting liver cancer using cell-free DNA fragmentomes. Cancer Discov. 2022: CD-22-0659).The invention relates to the field of biotechnology and can be used to isolate DNA fragments of a given length from a multicomponent liquid phase containing a mixture of nucleic acid fragments of different lengths, in the presence of a biological matrix based on blood plasma for further laboratory testing, which may include setting up a polymerase chain reaction and/or determining the nucleotide sequence using DNA sequencing. The nucleic acid fragments obtained using the described invention can be used for molecular genetic analysis of blood plasma biomarkers associated with both physiological and, to a greater extent, pathological conditions of the human body, such as oncological diseases (Kim Y.J., et al. A method for early diagnosis of lung cancer from tumor originated DNA fragments using plasma cfDNA methylome and fragmentome profiles. Mol Cell Probes. 2022; 66: 101873, Foda Z.H., et al. Detecting liver cancer using cell-free DNA fragmentomes. Cancer Discov. 2022: CD-22-0659).
Фрагментация геномной ДНК происходит в клетках в результате направленных катаболических процессов, приводящих к секреции продуктов распада нуклеиновых кислот в системный кровоток. Присутствие фрагментов геномной ДНК в плазме крови в настоящее время представляет собой хорошо известное биологическое явление. Фрагменты геномной ДНК в плазме крови, которые находятся вне источника своего происхождения, называются свободноциркулирующей внеклеточной ДНК или сцДНК. Обычно длина фрагментов ДНК варьирует от 100 до 800 п.о. (пар оснований) (Rumore P.M., Steinman CR. Endogenous circulating DNA in systemic lupus erythematosus. Occurrence as multimeric complexes bound to histone. J Clin Invest. 1990; 86(1): 69-74). В зависимости от наличия патологического процесса в организме человека концентрация сцДНК в плазме крови может варьироваться в широких пределах от 1 до 1380 нг/мл (Chen Е., et al. Cell-free DNA concentration and fragment size as a biomarker for prostate cancer. Sci Rep.2021; 11(1): 5040). В условиях онкологического заболевания сцДНК образуется в результате опухоль-ассоциированного клеточного апоптоза. Такая сцДНК представлена на электрофореграммах двумя пиками, соответствующими фрагментам ДНК с длиной 166 и 320 п.о., что свидетельствует о наличии мононуклеосомной и динуклеосомной ДНК (Mouliere F., et al. Circulating tumor-derived DNA is shorter than somatic DNA in plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112(11): 3178-9). Такой размер фрагментов обусловлен способом упаковки гетерохроматина (макромолекулярный комплекс ДНК и гистоновых белков) эукариот: на каждую нуклеосому приходится «виток» ДНК длиной около 166 п.о. Считается, что эпигенетическое состояние хроматина («открытый» или «закрытый» хроматин) в участках межнуклеосомных линкеров, а также аномальная активность нуклеаз вносят основной вклад в появление конкретного профиля фрагментации геномной ДНК, который отражает динамику стабильности генома в целом и может указывать на наличие патологических состояний организма человека, в том числе на онкологические заболевания (Snyder M.W., et al. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 2016; 164(1-2): 57-68).Fragmentation of genomic DNA occurs in cells as a result of directed catabolic processes leading to the secretion of nucleic acid breakdown products into the systemic circulation. The presence of genomic DNA fragments in blood plasma is now a well-known biological phenomenon. Fragments of genomic DNA in blood plasma that are outside their source of origin are called cell-free circulating DNA or cfDNA. Typically, the length of DNA fragments varies from 100 to 800 bp (base pairs) (Rumore PM, Steinman CR. Endogenous circulating DNA in systemic lupus erythematosus. Occurrence as multimeric complexes bound to histone. J Clin Invest. 1990; 86(1): 69-74). Depending on the presence of a pathological process in the human body, the concentration of cfDNA in blood plasma can vary widely from 1 to 1380 ng/ml (Chen E., et al. Cell-free DNA concentration and fragment size as a biomarker for prostate cancer. Sci Rep. 2021; 11(1): 5040). In oncological diseases, cfDNA is formed as a result of tumor-associated cellular apoptosis. Such cfDNA is represented on electropherograms by two peaks corresponding to DNA fragments with a length of 166 and 320 bp, which indicates the presence of mononucleosomal and dinucleosomal DNA (Mouliere F., et al. Circulating tumor-derived DNA is shorter than somatic DNA in plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112(11): 3178-9). This size of fragments is due to the way heterochromatin (a macromolecular complex of DNA and histone proteins) is packaged in eukaryotes: each nucleosome contains a DNA “turn” of approximately 166 bp. It is believed that the epigenetic state of chromatin (“open” or “closed” chromatin) in the regions of internucleosomal linkers, as well as abnormal nuclease activity, make the main contribution to the emergence of a specific fragmentation profile of genomic DNA, which reflects the dynamics of genome stability as a whole and may indicate the presence of pathological conditions in the human body, including cancer (Snyder M.W., et al. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 2016; 164(1-2): 57-68).
Совокупность участков ДНК в составе сцДНК называют фрагментомом (Mathios D., et al. Detection and characterization of lung cancer using cell-free DNA fragmentomes. Nat Commun. 2021. 12(1): 5060). Молекулярно-генетический анализ фрагментома сцДНК плазмы крови позволяет определить опухоль-ассоциированные точковые мутации, аномальное метилирование и фрагментацию ДНК (Kustanovich A., et al. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biol Ther. 2019; 20(8): 1057-1067, Joosse S.A. and Pantel K. Circulating DNA and Liquid Biopsies in the Management of Patients with Cancer. Cancer Res. 2022; 82(12):2213-2215).The set of DNA regions within cfDNA is called a fragmentome (Mathios D., et al. Detection and characterization of lung cancer using cell-free DNA fragmentomes. Nat Commun. 2021. 12(1): 5060). Molecular genetic analysis of the cfDNA fragmentome of blood plasma allows us to identify tumor-associated point mutations, abnormal methylation, and DNA fragmentation (Kustanovich A., et al. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biol Ther. 2019; 20(8): 1057-1067, Joosse S.A. and Pantel K. Circulating DNA and Liquid Biopsies in the Management of Patients with Cancer. Cancer Res. 2022; 82(12):2213-2215).
Из предшествующего уровня техники известны несколько близких аналогов заявляемого способа, описание сути которых представлено ниже.Several close analogues of the claimed method are known from the prior art, the essence of which is described below.
На российском рынке среди коммерчески доступных продуктов (формулы изобретений не найдены в открытых источниках), с помощью которых достигается похожий технический результат, есть «Набор для выделения циркулирующей нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) на парамагнитных частицах SileksMagNA-Direct из плазмы, сыворотки, мочи и других биологических образцов» производства ООО «Силекс», Россия (https://sileks.com/ru/products/free-circulating-nucleic-acid-dna-rna-isolation-sileksmagna-direct.html), «Набор реагентов для выделения свободноциркулирующей ДНК из плазмы крови (ДНК-Плазма-M-RT) по ТУ 21.20.23-010-97638376-2017)» производства ООО «Тест-Ген» и коммерческий набор реагентов NucleoSnap® cfDNA от компании Takara Bio, Япония (https://www.takarabio.com/). Последний предназначен для выделения фрагментов ДНК длиной от 50 до 1000 п.о. из образцов плазмы крови или мочи человека на колонке с кварцевой мембраной. Два этапа промывки направлены на удаление примесей, после чего связавшуюся ДНК элюируют с колонки.On the Russian market, among the commercially available products (the invention formulas were not found in open sources), with the help of which a similar technical result is achieved, there is the “Kit for the isolation of circulating nucleic acid (DNA/RNA) on paramagnetic particles SileksMagNA-Direct from plasma, serum, urine and other biological samples” manufactured by Sileks LLC, Russia (https://sileks.com/ru/products/free-circulating-nucleic-acid-dna-rna-isolation-sileksmagna-direct.html), “A kit of reagents for the isolation of free circulating DNA from blood plasma (DNA-Plasma-M-RT) according to TU 21.20.23-010-97638376-2017)” manufactured by Test-Gen LLC and the commercial reagent kit NucleoSnap® cfDNA from Takara Bio, Japan (https://www.takarabio.com/). The latter is designed to isolate DNA fragments of 50 to 1000 bp in length from human blood plasma or urine samples on a column with a quartz membrane. Two washing stages are aimed at removing impurities, after which the bound DNA is eluted from the column.
В описаниях изобретений, защищенных патентным законодательством, были найдены по меньшей мере восемь аналогов.At least eight analogues were found in the descriptions of inventions protected by patent law.
1. Набор реактивов для выделения ДНК, RU2650865C1 (https://patenton.ru/patent/RU2650865C1). предназначен для манипуляций с твердыми биологическими объектами (что следует из описания изобретения), тогда как заявляемый способ ориентирован на выделение фрагментов ДНК из жидкой фазы.1. A set of reagents for DNA extraction, RU2650865C1 (https://patenton.ru/patent/RU2650865C1). is intended for manipulations with solid biological objects (as follows from the description of the invention), while the claimed method is focused on the extraction of DNA fragments from the liquid phase.
2. Способ выделения ДНК, RU2485178 (http://allpatents.ru/patent/2485178.html), предназначен для манипуляций с твердыми биологическими объектами (костная ткань, роговые ткани) и отличается сорбцией ДНК на парамагнитных наночастицах, модифицированных хитозаном. Эти признаки отличают заявляемый способ, в котором используются парамагнитные частицы с иными сорбционными свойствами для выделения фрагментов ДНК из жидкой фазы.2. The method of DNA extraction, RU2485178 (http://allpatents.ru/patent/2485178.html), is intended for manipulations with solid biological objects (bone tissue, horn tissue) and is characterized by DNA sorption on paramagnetic nanoparticles modified with chitosan. These features distinguish the claimed method, which uses paramagnetic particles with other sorption properties to isolate DNA fragments from the liquid phase.
3. Способ выделения коротких РНК из биологических жидкостей, RU2558292C1 (https://yandex.ru/patents/doc/RU2558292C1_20150727). Способ включает в себя обработку образца денатурирующим буферным раствором, сорбцию коротких РНК, в том числе и микроРНК, на стекловолоконном сорбенте производства «Biosilica» в присутствии хаотропного агента, с последующей отмывкой сорбента от несвязавшихся биополимеров и химических реагентов и элюцией РНК.3. Method for isolating short RNAs from biological fluids, RU2558292C1 (https://yandex.ru/patents/doc/RU2558292C1_20150727). The method includes treating the sample with a denaturing buffer solution, sorption of short RNAs, including microRNAs, on a glass fiber sorbent manufactured by Biosilica in the presence of a chaotropic agent, followed by washing the sorbent from unbound biopolymers and chemical reagents and eluting the RNA.
4. Способ выделения циркулирующих ДНК из плазмы или сыворотки крови на колонках со стекловолокнистым сорбентом производства ООО «БиоСилика», RU2603098C1 (https://vandex.ru/patents/doc/RU2603098C1_20161120). Способ включает стадию денатурации в присутствии гуанидин-изотиоционата и стадию дополнительного осаждения нецелевых биополимеров при добавлении равного объема буферного раствора, содержащего 1 М ацетата натрия (рН 6,0) и 0,5-2,5% октановой кислоты. Отличие заявляемого способа от аналога заключается в использовании процедуры двухстадийного выделения фрагментов ДНК и селекции их по длине на парамагнитных частицах с разными сорбционными свойствами, а также иной химической композицией лизирующего и промывочных буферов.4. A method for isolating circulating DNA from blood plasma or serum on columns with a glass fiber sorbent manufactured by BioSilica LLC, RU2603098C1 (https://vandex.ru/patents/doc/RU2603098C1_20161120). The method includes a denaturation step in the presence of guanidine isothiocyanate and a step of additional precipitation of non-target biopolymers by adding an equal volume of a buffer solution containing 1 M sodium acetate (pH 6.0) and 0.5-2.5% octanoic acid. The difference between the claimed method and its analogue is in the use of a two-stage procedure for isolating DNA fragments and selecting them by length on paramagnetic particles with different sorption properties, as well as a different chemical composition of the lysis and washing buffers.
5. Набор для выделения ДНК, RU2753768C1 (https://patenton.ru/patent/RU2753768C1) отличает то, что используется ДНК-аффинный пептид на основе термического полилизина с молекулярной массой 10-30 кДа. Это позволяет сконцентрировать короткие фрагменты ДНК длиной 100 п.о. и ниже из всего объема образца и отделить ДНК от избытка белков с последующим осаждением комплекса ДНК-пептид путем центрифугирования. Отсутствует стадия инкубации образца с протеолитическим ферментом, которая используется в большинстве коммерческих наборов реагентов для выделения ДНК. Вместе с тем ферментативный гидролиз белковых примесей и термическое воздействие на биологический матрикс могут повышать эффективность экстракции ДНК, связанной с белками. В описании примера выделение ДНК проводили из осадка белых клеток крови, что указывает скорее на выделение геномной ДНК, чем на выделение не связанных с клетками фрагментов ДНК, циркулирующих в плазме крови.5. DNA extraction kit, RU2753768C1 (https://patenton.ru/patent/RU2753768C1) is distinguished by the fact that it uses a DNA affinity peptide based on thermal polylysine with a molecular weight of 10-30 kDa. This allows concentrating short DNA fragments of 100 bp and below in length from the entire sample volume and separating DNA from excess proteins, followed by precipitation of the DNA-peptide complex by centrifugation. There is no step of incubating the sample with a proteolytic enzyme, which is used in most commercial DNA extraction kits. At the same time, enzymatic hydrolysis of protein impurities and thermal action on the biological matrix can increase the efficiency of extraction of protein-bound DNA. In the description of the example, DNA was isolated from a sediment of white blood cells, which indicates the isolation of genomic DNA rather than the isolation of cell-unbound DNA fragments circulating in blood plasma.
6. Способ выделения внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот из крови, RU2372405C1 (https://patenton.ru/patent/RU2372405C1), предполагает выделение как несвязанной, так и связанной с поверхностью клеток крови внеклеточной ДНК. Клетки крови лизируют в присутствии Nonidet Р-40 или тритона Х-100 (конечная концентрация детергента 0,5-1,5%) с последующим отделением ядерной фракции центрифугированием. Способ включает дополнительную стадию гидролиза РНК в образце. Внеклеточную ДНК выделяли далее с помощью коммерческого набора «Biosilica» (аналог по п. 3, см. выше). Принципиальное отличие заявляемого способа от аналога заключается в типе биологического матрикса: для выделения фрагментов ДНК используют биологический матрикс на основе плазмы крови, которая лишена форменных элементов крови, что исключает контаминацию образца фрагментами ДНК, связанными с поверхностью форменных элементов крови, и контаминацию геномной ДНК. Также заявляемый способ отличается от аналога по химической композиции лизирующего и промывочных буферов.6. The method for isolating extracellular deoxyribonucleic acids from blood, RU2372405C1 (https://patenton.ru/patent/RU2372405C1), involves isolating both unbound and cell-bound extracellular DNA. Blood cells are lysed in the presence of Nonidet P-40 or Triton X-100 (final detergent concentration 0.5-1.5%), followed by separation of the nuclear fraction by centrifugation. The method includes an additional step of RNA hydrolysis in the sample. Extracellular DNA was then isolated using the commercial Biosilica kit (analogous to item 3, see above). The fundamental difference between the claimed method and its analogue is in the type of biological matrix: to isolate DNA fragments, a biological matrix based on blood plasma is used, which is devoid of formed elements of blood, which eliminates contamination of the sample with DNA fragments associated with the surface of formed elements of blood, and contamination with genomic DNA. The claimed method also differs from its analogue in the chemical composition of the lysing and washing buffers.
7. В патенте RU2232768C2 (доступен по ссылке https://ru.espacenet.com/publicationDetails/biblio?CC=RU&NR=2232768C2&KC=C2&FT=D& ND=4&date=20040720&DB=EPODOC& locale=ru_RU) описан способ выделения ДНК на кремнийсодержащем сорбенте в присутствии хаотропного агента. В качестве сорбента используют мелкодисперсное мешированное стекло, предварительно обработанное 3,5-7,0% раствором плавиковой кислоты в течение 2-6 ч. Промывку сорбента проводят дважды раствором, содержащим хаотропный агент, а затем дважды раствором, содержащим 25% изопропанола. Элюцию ДНК осуществляют раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната (рН 8,0-10,0). Способ позволяет выделять фрагменты ДНК размером более 50 п.о. Отличие аналога от заявляемого способа следует из химической композиции лизирующего и промывочных буферов, температурного режима и времени инкубации, а также использования других сорбентов.7. Patent RU2232768C2 (available at https://ru.espacenet.com/publicationDetails/biblio?CC=RU&NR=2232768C2&KC=C2&FT=D& ND=4&date=20040720&DB=EPODOC& locale=ru_RU) describes a method for isolating DNA on a silicon-containing sorbent in the presence of a chaotropic agent. Finely dispersed mixed glass, pre-treated with a 3.5-7.0% hydrofluoric acid solution for 2-6 hours, is used as a sorbent. The sorbent is washed twice with a solution containing a chaotropic agent, and then twice with a solution containing 25% isopropanol. DNA is eluted with a solution containing 5-50 mM bicarbonate ions (pH 8.0-10.0). The method allows to isolate DNA fragments larger than 50 bp. The difference between the analogue and the claimed method follows from the chemical composition of the lysis and washing buffers, the temperature regime and incubation time, as well as the use of other sorbents.
8. Экспресс-метод выделения внеклеточных нуклеиновых кислот раскрыт в международном патенте WO2013045432A1 (доступен по ссылке https://ru.espacenet.com/publicationDetails/biblio?DB=EPODOC&II=0&ND=3&adiacent=true &locale-ru_RU&FT=D&date=20130404&CC=WO&NR=2013045432A1&KC=A1). Способ включает этапы последовательного изменения рН среды: в слабокислой среде (рН≤6,5) проходит связывание нуклеиновых кислот с сорбентом, тогда как градиентная элюция нуклеиновых кислот в условиях рН≥8 до ≤14 позволяет получать образцы, содержащие нуклеиновые кислоты с разной длиной фрагментов. Аналог отличается от заявляемого способа тем, что разделение фрагментов ДНК по длине протекает в буферных растворах с разным уровнем рН, тогда как в заявляемом способе используется определенная концентрация полимерного соединения, например, полиэтиленгликоля и нейтральной натриевой соли.8. An express method for isolating extracellular nucleic acids is disclosed in international patent WO2013045432A1 (available at https://ru.espacenet.com/publicationDetails/biblio?DB=EPODOC&II=0&ND=3&adiacent=true &locale-ru_RU&FT=D&date=20130404&CC=WO&NR=2013045432A1&KC=A1). The method includes the steps of sequentially changing the pH of the medium: in a slightly acidic medium (pH≤6.5), the binding of nucleic acids to the sorbent occurs, while gradient elution of nucleic acids under conditions of pH≥8 to ≤14 allows obtaining samples containing nucleic acids with different fragment lengths. The analogue differs from the claimed method in that the separation of DNA fragments by length occurs in buffer solutions with different pH levels, whereas the claimed method uses a certain concentration of a polymer compound, for example, polyethylene glycol and neutral sodium salt.
Ближайший аналогThe closest analogue
Ближайшим аналогом заявляемого способа выделения фрагментов ДНК следует считать техническое решение, раскрытое в международном патенте WO2021148393A1, который доступен по ссылке https://ru.espacenet.com/publicationDetails/biblio?DB=EPODOC&II=0&ND=3&adjacent=true&locale=ru_RU&FT=D&date=20210729&CC=WO&NR=2021148393А1&KC=А1. В патенте описан способ выделения внеклеточной ДНК, включающий добавление к биологическому образцу в жидкой фазе твердофазного сорбента на основе магнитных микросфер, покрытых диоксидом кремния. Протокол выделения предусматривает выделение фрагментов ДНК длиной от 50 до 400 п. о из образца плазмы крови объемом от 0,5 до 4 мл. Процессы лизиса биологического матрикса и связывания фрагментов ДНК на поверхности микросфер протекают в буфере, содержащем детергент (неионный сурфактант типа Тритон Х-100, п. 4 формулы), хаотропный агент (гуанидин-изотиоционат или перхлорат натрия, п. 5 формулы) и 2-пропанол. По п. 7 формулы объемное соотношение плазмы к лизирующему буферу составляет 1:4-1:2,5). По п. 9 формулы концентрация гуанидин-изотиоционата составляет 1,5-2,5 М, а содержание 2-пропанола - 15-25%. Как альтернатива заявлена обработка образца плазмы крови раствором додецилсульфата натрия и протеиназой К (с инкубацией при температуре 55-65°С в течение 20-30 мин, п. 15 формулы). Согласно пп. 17-18 формулы, промывочный буфер может содержать 50% этиловый спирт, гуанидин-изотиоционат и Тритон Х-100 или 80% этиловый спирт, 10 мМ Трис-HCl и 1 мМ ЭДТА. Для разделения фрагментов ДНК по длине используют специальную комбинацию химических реактивов и магнитных микросфер: 1,5-2,5 М гуанидин-изотиоционата; 20-30% w/v Тритон Х-100; 15-25% v/v 2-пропанол и 25-10% v/v плазмы крови (п. 25 формулы).The closest analogue of the claimed method for isolating DNA fragments should be considered the technical solution disclosed in international patent WO2021148393A1, which is available at the link https://ru.espacenet.com/publicationDetails/biblio?DB=EPODOC&II=0&ND=3&adjacent=true&locale=ru_RU&FT=D&date=20210729&CC=WO&NR=2021148393А1&KC=А1. The patent describes a method for isolating extracellular DNA, which includes adding a solid-phase sorbent based on magnetic microspheres coated with silicon dioxide to a biological sample in the liquid phase. The isolation protocol provides for the isolation of DNA fragments from 50 to 400 bp in length from a blood plasma sample with a volume of 0.5 to 4 ml. The processes of lysis of the biological matrix and binding of DNA fragments on the surface of the microspheres occur in a buffer containing a detergent (a non-ionic surfactant such as Triton X-100, item 4 of the formula), a chaotropic agent (guanidine isothiocyanate or sodium perchlorate, item 5 of the formula) and 2-propanol. According to item 7 of the formula, the volume ratio of plasma to lysis buffer is 1:4-1:2.5). According to item 9 of the formula, the concentration of guanidine isothiocyanate is 1.5-2.5 M, and the content of 2-propanol is 15-25%. As an alternative, the claimed method is to treat the blood plasma sample with a solution of sodium dodecyl sulfate and proteinase K (with incubation at a temperature of 55-65°C for 20-30 min, item 15 of the formula). According to paragraphs 17-18 of the formula, the wash buffer may contain 50% ethyl alcohol, guanidine isothiocyanate and Triton X-100 or 80% ethyl alcohol, 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA. To separate DNA fragments by length, a special combination of chemical reagents and magnetic microspheres is used: 1.5-2.5 M guanidine isothiocyanate; 20-30% w/v Triton X-100; 15-25% v/v 2-propanol and 25-10% v/v blood plasma (item 25 of the formula).
Заявляемый способ отличается от ближайшего аналога сорбцией фрагментов ДНК в присутствии гуанидин-изотиоционата в финальной концентрации до 3 М и использованием парамагнитных частиц на основе парамагнитного ядра, покрытого силикатными функциональными группами разветвленного строения при 65°С в течение 10 минут, трехкратной промывкой парамагнитных частиц разными буферными растворами и последующей элюцией фрагментов ДНК с сорбента при 85°С в течение 5 мин. Далее фрагменты ДНК осаждают на парамагнитных частицах с поверхностными карбоксильными группами в присутствии гелеобразного раствора полиэтиленгликоля (молекулярная масса от 7000 до 9000) с концентрацией до 20% и солей натрия в высокой концентрации до 3 М при 55°С в течение 5 мин, осуществляют трехкратную промывку парамагнитных частиц и последующую элюцию фрагментов ДНК с сорбента при 85°С в течение 5 мин. Использование частиц с поверхностными карбоксильными группами позволяет провести обогащение образца целевыми фрагментами ДНК длиной 100-400 п.о.The claimed method differs from its closest analogue in the sorption of DNA fragments in the presence of guanidine isothiocyanate in a final concentration of up to 3 M and the use of paramagnetic particles based on a paramagnetic core coated with branched silicate functional groups at 65°C for 10 minutes, three-fold washing of the paramagnetic particles with different buffer solutions and subsequent elution of the DNA fragments from the sorbent at 85°C for 5 min. Then, the DNA fragments are precipitated on paramagnetic particles with surface carboxyl groups in the presence of a gel-like solution of polyethylene glycol (molecular weight from 7000 to 9000) with a concentration of up to 20% and sodium salts in a high concentration of up to 3 M at 55°C for 5 min, three-fold washing of the paramagnetic particles and subsequent elution of the DNA fragments from the sorbent at 85°C for 5 min. The use of particles with surface carboxyl groups allows enrichment of the sample with target DNA fragments of 100–400 bp in length.
Первым преимуществом заявляемого способа является возможность получения нуклеиновых кислот, свободных от компонентов биологического матрикса, которые представляют собой всю совокупность фрагментов ДНК (1-я стадия выделения), а затем -нуклеиновых кислот, представленных целевыми фрагментами ДНК длиной 100-400 п.о. (2-я стадия выделения), свободных от примесей высокомолекулярных нуклеиновых кислот. Вторым преимуществом заявляемого способа является пригодность выделяемых нуклеиновых кислот для последующего молекулярно-генетического анализа (полимеразно-цепная реакция и подготовка ДНК-библиотек для секвенирования).The first advantage of the claimed method is the possibility of obtaining nucleic acids free from components of the biological matrix, which represent the entire set of DNA fragments (stage 1 of isolation), and then nucleic acids represented by target DNA fragments 100-400 bp long (stage 2 of isolation), free from impurities of high-molecular nucleic acids. The second advantage of the claimed method is the suitability of the isolated nucleic acids for subsequent molecular genetic analysis (polymerase chain reaction and preparation of DNA libraries for sequencing).
Перечень иллюстрацийList of illustrations
Фиг. 1. Электрофореграмма распределения фрагментов ДНК, выделенных из модельного образца с добавлением ДНК-стандарта №2 (100-700 п.о.). Анализ был выполнен методом капиллярного электрофореза с использованием Agilent 2200 Таре Station (Agilent Technologies, США). По оси X приведены линейные размеры фрагментов ДНК, п.о., по оси Y приведены значения интенсивности выходного сигнала флуоресценции (нормализованные флюоресцентные единицы).Fig. 1. Electropherogram of the distribution of DNA fragments isolated from a model sample with the addition of DNA standard No. 2 (100-700 bp). The analysis was performed by capillary electrophoresis using an Agilent 2200 Tape Station (Agilent Technologies, USA). The X axis shows the linear dimensions of the DNA fragments, bp, and the Y axis shows the intensity values of the fluorescence output signal (normalized fluorescent units).
Фиг. 2. Электрофореграмма пробы, полученной в результате выделения. Анализ выполняли при помощи набора Agilent High Sensitivity DNA Assay (Agilent Technologies, США) на оборудовании Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США). По оси Y приведены значения интенсивности выходного сигнала флуоресценции (FU), по оси X приведены значения длин фрагментов ДНК, п.о.Fig. 2. Electropherogram of the sample obtained as a result of isolation. The analysis was performed using the Agilent High Sensitivity DNA Assay kit (Agilent Technologies, USA) on Agilent 2100 Bioanalyzer equipment (Agilent Technologies, USA). The Y axis shows the values of the output fluorescence signal intensity (FU), the X axis shows the values of the DNA fragment lengths, bp.
Фиг. 3. Электрофореграмма пробы, полученной в результате выделения. Анализ выполняли на оборудовании Agilent 2200 Таре Station (Agilent Technologies, США). По оси Y приведены значения интенсивности выходного сигнала флуоресценции (FU), по оси X приведены значения длин фрагментов ДНК, п.о.Fig. 3. Electropherogram of the sample obtained as a result of extraction. The analysis was performed on Agilent 2200 Tape Station equipment (Agilent Technologies, USA). The Y axis shows the values of the output fluorescence signal intensity (FU), the X axis shows the values of the DNA fragment lengths, bp.
Фиг. 4. Контрольная электрофореграмма полученных ДНК-библиотек. Анализ выполняли на оборудовании Agilent 2200 Таре Station (Agilent Technologies, США).Fig. 4. Control electropherogram of the obtained DNA libraries. The analysis was performed on Agilent 2200 Tape Station equipment (Agilent Technologies, USA).
Фиг. 5. Контрольная электрофореграмма образца, полученного в ходе ПЦР с использованием пары специфичных праймеров на Alu-повтор. Анализ выполняли на оборудовании Agilent 2200 Таре Station (Agilent Technologies, США)Fig. 5. Control electropherogram of the sample obtained during PCR using a pair of specific primers for the Alu repeat. The analysis was performed on Agilent 2200 Tape Station equipment (Agilent Technologies, USA)
Описание сущности изобретенияDescription of the essence of the invention
Задача изобретения состояла в разработке способа препаративного выделения всей смеси фрагментов ДНК из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей смесь разных фрагментов ДНК в присутствии биологического матрикса на основе плазмы крови, на первой стадии и селективного выделения фрагментов ДНК заданной длины на второй стадии, а также в демонстрации пригодности выделенной ДНК для постановки полимеразно-цепной реакции и подготовки ДНК-библиотек.The objective of the invention was to develop a method for the preparative isolation of the entire mixture of DNA fragments from a multicomponent liquid phase containing a mixture of different DNA fragments in the presence of a biological matrix based on blood plasma, at the first stage, and the selective isolation of DNA fragments of a given length at the second stage, as well as to demonstrate the suitability of the isolated DNA for setting up a polymerase chain reaction and preparing DNA libraries.
Поставленная задача решается тем, что заявляемый способ выделения фрагментов ДНК осуществляется посредством использования: а) двух типов парамагнитных частиц с разными сорбционными свойствами; б) магнитного штатива для пробирок; в) комбинации лизирующего, двух связывающих и трех промывочных буферов с определенной химической композицией; г) специально адаптированного температурного и временного режимов химического воздействия.The stated problem is solved by the fact that the claimed method for isolating DNA fragments is carried out by using: a) two types of paramagnetic particles with different sorption properties; b) a magnetic stand for test tubes; c) a combination of a lysing, two binding and three washing buffers with a specific chemical composition; d) specially adapted temperature and time regimes of chemical action.
Достигаемый технический результат заключается в создании способа для выделения целевых фрагментов ДНК длиной от 100 до 400 п.о. из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей смесь фрагментов ДНК в присутствии биологического матрикса на основе плазмы крови, который включает выделение фрагментов ДНК (лизис биологического матрикса лизирующим буфером, связывание фрагментов ДНК на магнитном сорбенте №1 на основе парамагнитного ядра, покрытого силикатными функциональными группами разветвленного строения; серию стадий, включающих в себя промывки связавшихся фрагментов ДНК тремя промывочными буферами; элюцию связавшихся фрагментов ДНК элюирующим буфером) и затем выделение фрагментов ДНК (селективное связывание фрагментов на магнитном сорбенте №2 с твердым парамагнитным ядром, поверхность которого функционализирована карбоксильными группами, последующие промывки связавшихся фрагментов ДНК и элюцию связавшихся фрагментов ДНК элюирующим буфером).The achieved technical result consists in creating a method for isolating target DNA fragments of length from 100 to 400 bp from a multicomponent liquid phase containing a mixture of DNA fragments in the presence of a biological matrix based on blood plasma, which includes isolating DNA fragments (lysis of the biological matrix with a lysis buffer, binding of DNA fragments on magnetic sorbent No. 1 based on a paramagnetic core coated with silicate functional groups of a branched structure; a series of stages including washing of the bound DNA fragments with three washing buffers; elution of the bound DNA fragments with an elution buffer) and then isolating DNA fragments (selective binding of fragments on magnetic sorbent No. 2 with a solid paramagnetic core, the surface of which is functionalized with carboxyl groups, subsequent washing of the bound DNA fragments and elution of the bound DNA fragments with an elution buffer).
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Способ выделения фрагментов ДНК заданной длины из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей смесь разных по длине фрагментов ДНК, в присутствии биологического матрикса на основе плазмы крови, осуществляется посредством двух стадий:The method for isolating DNA fragments of a given length from a multicomponent liquid phase containing a mixture of DNA fragments of different lengths, in the presence of a biological matrix based on blood plasma, is carried out in two stages:
- 1-я стадия - сорбция фрагментов ДНК на парамагнитных частицах (тип I), покрытых силикатными группами разветвленного строения;- 1st stage - sorption of DNA fragments on paramagnetic particles (type I) coated with branched silicate groups;
- 2-я стадия - селективная сорбция целевых фрагментов ДНК длиной от 100 до 400 п.о. на парамагнитных частицах (тип II), покрытых карбоксильными группами, основанная на твердофазной обратимой иммобилизации фрагментов ДНК в растворе в присутствии гелеобразующего агента - полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой от 7000 до 9000 и натриевой соли.- 2nd stage - selective sorption of target DNA fragments from 100 to 400 bp in length on paramagnetic particles (type II) coated with carboxyl groups, based on solid-phase reversible immobilization of DNA fragments in solution in the presence of a gelling agent - polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 7000 to 9000 and sodium salt.
Осуществление способа позволяет получить образец, содержащий целевые фрагменты ДНК длиной от 100 до 400 п.о. Фрагменты ДНК в данном диапазоне длин имеют важное значение для разработки методов малоинвазивной диагностики онкологических заболеваний по мутационному, метиломному и фрагментомному профилю ДНК.The implementation of the method allows obtaining a sample containing target DNA fragments of length from 100 to 400 bp. DNA fragments in this length range are important for the development of methods for minimally invasive diagnostics of oncological diseases based on the mutational, methylome and fragmentome profile of DNA.
Материалы и реактивы, используемые для выделения фрагментов ДНК, представлены в таблице 1.The materials and reagents used for the extraction of DNA fragments are presented in Table 1.
1-я стадия. Лизирующий буфер и образец плазмы крови, содержащий фрагменты ДНК, смешивали в объемном отношении 1:1 с последующим термостатированием при 56°С в течение 10-30 мин в присутствии или в отсутствие ферментативного протеолитического препарата в финальной концентрации 0,5-0,6 мг/мл. Затем в пробирку добавляли около 2 мкг магнитного сорбента №1 в связывающем буфере №1 до финальной концентрации натриевой соли 200 мМ с последующим термостатированием при 65°С в течение 10 мин. Далее на магнитном штативе осаждали парамагнитные частицы и отбирали супернатант, после чего следовала серия промывок сорбированных фрагментов ДНК на парамагнитных частицах тремя разными промывочными буферами, в состав которых входили спирты. Элюцию связавшихся фрагментов ДНК осуществляли при 85°С в течение 5 мин буфером с добавлением солей натрия в объеме 100 мкл.Stage 1. The lysis buffer and the blood plasma sample containing DNA fragments were mixed in a volume ratio of 1:1, followed by thermostatting at 56°C for 10-30 min in the presence or absence of an enzymatic proteolytic preparation at a final concentration of 0.5-0.6 mg/ml. Then, about 2 μg of magnetic sorbent #1 in binding buffer #1 were added to the test tube to a final concentration of sodium salt of 200 mM, followed by thermostatting at 65°C for 10 min. Next, paramagnetic particles were precipitated on a magnetic stand and the supernatant was collected, after which a series of washes of the sorbed DNA fragments on the paramagnetic particles followed with three different washing buffers, which included alcohols. Elution of bound DNA fragments was carried out at 85°C for 5 min with a buffer containing sodium salts in a volume of 100 µl.
2-я стадия. К образцу объемом 100 мкл, полученному при осуществлении способа по 1-й стадии, добавляли около 1 мкг магнитного сорбента №2 и до 5 объемов связывающего буфера №2 с последующим термостатированием при 55°С в течение 5 мин. Далее на магнитном штативе осаждали парамагнитные частицы на стенке пробирки и отбирали супернатант, после чего следовала серия промывок сорбированных фрагментов ДНК на парамагнитных частицах двумя разными промывочными буферами, в состав которых входили спирты. Элюцию связавшихся фрагментов ДНК осуществляли при 85°С в течение 5 мин буфером с добавлением солей натрия в объеме 100 мкл.Stage 2. About 1 μg of magnetic sorbent No. 2 and up to 5 volumes of binding buffer No. 2 were added to a 100 μl sample obtained by implementing the method according to stage 1, followed by thermostatting at 55°C for 5 min. Then, paramagnetic particles were deposited on the wall of the test tube using a magnetic stand and the supernatant was collected, after which a series of washes of the sorbed DNA fragments on the paramagnetic particles followed with two different washing buffers, which included alcohols. Elution of the bound DNA fragments was carried out at 85°C for 5 min with a buffer with the addition of sodium salts in a volume of 100 μl.
Применение изобретенияApplication of the invention
Применение способа можно продемонстрировать следующими примерами.The application of the method can be demonstrated by the following examples.
Пример 1Example 1
Выделение фрагментов ДНК заданной длины из многокомпонентной жидкой фазы (без добавления биологического матрикса)Isolation of DNA fragments of a given length from a multicomponent liquid phase (without adding a biological matrix)
Цель данного эксперимента состояла в демонстрации эффективности селекции фрагментов ДНК по длинам из модельных образцов, содержащих смесь фрагментов ДНК разной длины, при использовании магнитных частиц типа II в отсутствие биологического матрикса. Были приготовлены три партии модельных образцов. Каждый модельный образец объемом 100 мкл содержал дистиллированную воду и лабораторные ДНК-стандарты (приготовлены на основе смешивания разных образцов фрагментированной ДНК). Первая партия модельных образцов содержала стандарт №1 (фрагменты ДНК длиной 100-300 п.о.), вторая партия - стандарт №2 (фрагменты ДНК длиной 100-700 п.о.), третья партия - стандарт №3 (фрагменты ДНК длиной 100-1000 п.о.).The aim of this experiment was to demonstrate the efficiency of DNA fragment selection by length from model samples containing a mixture of DNA fragments of different lengths using type II magnetic particles in the absence of a biological matrix. Three batches of model samples were prepared. Each 100 μl model sample contained distilled water and laboratory DNA standards (prepared by mixing different samples of fragmented DNA). The first batch of model samples contained standard #1 (DNA fragments 100-300 bp long), the second batch - standard #2 (DNA fragments 100-700 bp long), the third batch - standard #3 (DNA fragments 100-1000 bp long).
Далее эксперимент выполняли по следующему протоколу.The experiment was then carried out according to the following protocol.
1. Для приготовления суспензии сорбента в отдельной пробирке смешивали 20 мкл предварительно ресуспендированного магнитного сорбента №2 и 500 мкл связывающего буфера №2, после чего суспензию переносили в модельный образец.1. To prepare the sorbent suspension, 20 µl of pre-suspended magnetic sorbent No. 2 and 500 µl of binding buffer No. 2 were mixed in a separate test tube, after which the suspension was transferred to the model sample.
2. Пробирку помещали в термостат и инкубировали при 55°С в течение 5 мин.2. The test tube was placed in a thermostat and incubated at 55°C for 5 minutes.
3. По окончании инкубации осаждали капли жидкости на настольной микроцентрифуге, после чего помещали пробирку в магнитный штатив на 2 мин.3. At the end of the incubation, the liquid droplets were sedimented in a tabletop microcentrifuge, after which the test tube was placed in a magnetic stand for 2 minutes.
4. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц.4. Using a manual dispenser, the supernatant liquid was collected without touching the magnetic particles.
5. Добавляли промывочный буфер №2 в пробирку с магнитным сорбентом №2,5. Add washing buffer No. 2 to the test tube with magnetic sorbent No. 2,
перемешивали и осаждали капли жидкости, и снова помещали на магнитный штатив на 2 мин.The liquid drops were stirred and precipitated, and again placed on the magnetic stand for 2 minutes.
6. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц.6. Using a manual dispenser, the supernatant liquid was collected without touching the magnetic particles.
7. Добавляли промывочный буфер №3 в пробирку с магнитным сорбентом №2, перемешивали и осаждали капли жидкости, снова помещали на магнитный штатив на 2 мин.7. Add washing buffer No. 3 to the test tube with magnetic sorbent No. 2, mix and precipitate drops of liquid, and place again on the magnetic stand for 2 min.
8. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц, после чего инкубировали пробирки с открытой крышкой при комнатной температуре в течение 5 мин.8. Using a manual dispenser, the supernatant was collected without touching the magnetic particles, after which the tubes were incubated with the lid open at room temperature for 5 min.
9. Добавляли в пробирку 100 мкл элюирующего буфера, аккуратно перемешивали так, чтобы на стенках пробирок не оставался магнитный сорбент.9. Add 100 µl of elution buffer to the test tube and mix carefully so that no magnetic sorbent remains on the walls of the test tubes.
10. Пробирку помещали в закрытый термостат и инкубировали при 85°С в течение 5 мин.10. The test tube was placed in a closed thermostat and incubated at 85°C for 5 min.
11. По окончании инкубации пробирки помещали в магнитный штатив на 2 мин и отбирали ручным дозатором надосадочную жидкость в новые пробирки.11. At the end of the incubation, the test tubes were placed in a magnetic stand for 2 minutes and the supernatant liquid was collected into new test tubes using a manual dispenser.
Результаты оценки концентрации выделенной ДНК приведены в таблице 2, из которой видно, что эффективность выделения фрагментов ДНК достигала примерно 87%. Пример электрофореграммы распределения выделенной ДНК по длинам с использованием модельных образцов, содержащих ДНК-стандарт №2 (100-700 п.о.), приведен на Фиг. 1. Из Фиг. 1 следует, что образцы были обогащены выделенными фрагментами ДНК длиной 151 и 320 п.о., что в целом соответствует профилю распределения фрагментов мононуклеосомной и динуклеосомной ДНК в образцах плазмы крови соответственно. Также из Фиг. 1 видно, что основная фракция выделенных фрагментов ДНК распределена в интервале длин от 100 до 400 п.о.The results of the evaluation of the concentration of the isolated DNA are presented in Table 2, from which it is evident that the efficiency of the isolation of DNA fragments reached approximately 87%. An example of an electropherogram of the distribution of the isolated DNA by lengths using model samples containing DNA standard No. 2 (100-700 bp) is shown in Fig. 1. It follows from Fig. 1 that the samples were enriched in isolated DNA fragments of 151 and 320 bp in length, which generally corresponds to the distribution profile of mononucleosomal and dinucleosomal DNA fragments in blood plasma samples, respectively. It is also evident from Fig. 1 that the main fraction of the isolated DNA fragments is distributed in the length range from 100 to 400 bp.
Пример 2Example 2
Выделение фрагментов ДНК заданной длины из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей биологический матрикс на основе плазмы крови.Isolation of DNA fragments of a given length from a multicomponent liquid phase containing a biological matrix based on blood plasma.
Забор и начальная пробоподготовка образцов, содержащих плазму крови от условно здоровых субъектов, были выполнены по следующему протоколуCollection and initial sample preparation of samples containing blood plasma from apparently healthy subjects were performed according to the following protocol
Забор периферической венозной крови осуществляли в пробирки типа PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN, США) или Cell-Free DNA BCT (Streck, США) со стабилизатором, который препятствует клеточному лизису и контаминации образца внутриклеточной ДНК. Далее содержимое пробирок перемешивали плавными движениями, избегая встряхивания. Хранили пробирки в холодильной камере при температуре от +4°С до +10°С не более семи дней с момента забора крови. Пробирки с кровью центрифугировали в горизонтальном роторе при 1300 g в течение 20 мин. Далее отбирали надосадочную жидкость (плазму) в новую пробирку, не задевая промежуточный лейкоцитарный слой белого цвета, и повторно центрифугировали при 2000-2500 g в течение 15 мин. Отобранную надосадочную жидкость переносили в криопробирки для последующего хранения в морозильной камере при -80°С не более 3 мес.Peripheral venous blood was collected in PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN, USA) or Cell-Free DNA BCT (Streck, USA) tubes with a stabilizer that prevents cell lysis and contamination of the intracellular DNA sample. The contents of the tubes were then mixed with smooth movements, avoiding shaking. The tubes were stored in a refrigerator at a temperature of +4°C to +10°C for no more than seven days from the time of blood collection. The tubes with blood were centrifuged in a horizontal rotor at 1300 g for 20 min. Then the supernatant (plasma) was collected in a new tube, without touching the intermediate white leukocyte layer, and centrifuged again at 2000-2500 g for 15 min. The collected supernatant was transferred into cryovials for subsequent storage in a freezer at -80°C for no more than 3 months.
Способ выделения фрагментов ДНК заданной длины из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей смесь фрагментов ДНК, и биологический матрикс на основе плазмы крови, был осуществлен по нижеописанному протоколу.The method for isolating DNA fragments of a given length from a multicomponent liquid phase containing a mixture of DNA fragments and a biological matrix based on blood plasma was carried out according to the protocol described below.
Для выделения использовали магнитные сорбенты двух типов. Характеристики основных свойств парамагнитных частиц (тип I): микрогранулы силикагеля, содержащие парамагнитные нанокристаллы магнетита/маггемита; средний размер частиц - 1,8 мкм. Характеристики основных свойств парамагнитных частиц (тип II): парамагнитные микросферы с карбоксилированной поверхностью; средний размер частиц - 1,4 мкм. Могут быть использованы аналогичные типы парамагнитных частиц, поверхность которых функционализирована либо силикатными группами разветвленного строения, либо карбоксильными группами.Magnetic sorbents of two types were used for extraction. Characteristics of the main properties of paramagnetic particles (type I): silica gel microgranules containing paramagnetic magnetite/maghemite nanocrystals; average particle size is 1.8 μm. Characteristics of the main properties of paramagnetic particles (type II): paramagnetic microspheres with a carboxylated surface; average particle size is 1.4 μm. Similar types of paramagnetic particles can be used, the surface of which is functionalized either with branched silicate groups or with carboxyl groups.
Двухстадийный способ выделения фрагментов ДНК тестировали на модельных образцах, содержащих известную концентрацию экзогенной ДНК и биологический матрикс на основе плазмы крови. Таким образом, в модельных образцах можно имитировать наличие фрагментов ДНК в диапазоне концентраций сцДНК плазмы крови субъектов с онкологическим заболеванием (Chen Е., et al. Cell-free DNA concentration and fragment size as a biomarker for prostate cancer. Sci Rep.2021; 11(1): 5040). В качестве экзогенной ДНК использовали образец ДНК-ампликонов с ориентировочной длиной фрагментов в интервале от 100 до 400 п.о.).The two-stage method for isolating DNA fragments was tested on model samples containing a known concentration of exogenous DNA and a biological matrix based on blood plasma. Thus, the model samples can simulate the presence of DNA fragments in the range of cfDNA concentrations in the blood plasma of subjects with cancer (Chen E., et al. Cell-free DNA concentration and fragment size as a biomarker for prostate cancer. Sci Rep. 2021; 11(1): 5040). A sample of DNA amplicons with an approximate fragment length in the range from 100 to 400 bp was used as exogenous DNA.
В первом случае выделение фрагментов ДНК выполняли из модельных образцов, содержащих ДНК-ампликон в конечной концентрации 1,5 нг/мкл.In the first case, DNA fragments were isolated from model samples containing DNA amplicon at a final concentration of 1.5 ng/μl.
Во втором случае выделение фрагментов ДНК выполняли из модельных образцов, содержащих ДНК-ампликон в конечной концентрации 0,32 нг/мкл.In the second case, DNA fragments were isolated from model samples containing DNA amplicon at a final concentration of 0.32 ng/μl.
1-я стадияStage 1
1. Образец плазмы крови объемом 2 мл аликвотировали по 500 мкл в 4 пробирки объемом 1,5 мл; к образцам плазмы добавляли ДНК-амликоны для приготовления модельных образцов.1. A 2 ml blood plasma sample was aliquoted at 500 µl into four 1.5 ml tubes; DNA amplicons were added to the plasma samples to prepare model samples.
2. В каждую пробирку с модельным образцом добавляли 500 мкл лизирующего буфера (альтернативно в каждую пробирку дополнительно добавляли 440 мкл лизирующего буфера и 60 мкл раствора протеиназы К в качестве ферментативного протеолитического препарата).2. 500 µl of lysis buffer were added to each test tube with the model sample (alternatively, 440 µl of lysis buffer and 60 µl of proteinase K solution as an enzymatic proteolytic preparation were additionally added to each test tube).
3. После перемешивания на вортексе в течение 5 с пробирки инкубировали в закрытом термостате при 56°С в течение 10-30 мин.3. After vortex mixing for 5 s, the tubes were incubated in a closed thermostat at 56°C for 10–30 min.
4. Для приготовления суспензии сорбента (из расчета на 500 мкл плазмы крови) в отдельной пробирке смешивали 30 мкл предварительно ресуспендированного магнитного сорбента №1 и 50 мкл связывающего буфера №1.4. To prepare the sorbent suspension (based on 500 µl of blood plasma), 30 µl of pre-suspended magnetic sorbent No. 1 and 50 µl of binding buffer No. 1 were mixed in a separate test tube.
5. По окончании инкубации пробирки охлаждали при комнатной температуре в течение 2 мин, затем в каждую из них добавляли суспензию магнитного сорбента №1 в связывающем буфере №1 объемом 80 мкл, перемешивали и осаждали капли жидкости на настольной микроцентрифуге.5. After incubation, the tubes were cooled at room temperature for 2 min, then 80 μl of magnetic sorbent No. 1 suspension in binding buffer No. 1 was added to each of them, mixed, and liquid droplets were precipitated in a tabletop microcentrifuge.
6. Пробирки инкубировали в закрытом термостате при 65°С в течение 10 мин.6. The tubes were incubated in a closed thermostat at 65°C for 10 min.
7. По окончании инкубации осаждали капли жидкости на настольной микроцентрифуге, после чего помещали пробирки в магнитный штатив на 2 мин.7. At the end of the incubation, the liquid droplets were sedimented in a tabletop microcentrifuge, after which the test tubes were placed in a magnetic stand for 2 minutes.
8. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц.8. Using a manual dispenser, the supernatant liquid was collected without touching the magnetic particles.
9. Добавляли промывочный буфер №1 в пробирки с магнитным сорбентом №1, перемешивали и осаждали капли жидкости, снова помещали на магнитный штатив на 2 мин.9. Add washing buffer No. 1 to the test tubes with magnetic sorbent No. 1, mix and precipitate drops of liquid, place again on the magnetic stand for 2 min.
10. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц.10. Using a manual dispenser, the supernatant liquid was collected without touching the magnetic particles.
11. Добавляли промывочный буфер №2 в пробирки с магнитным сорбентом №1, перемешивали и осаждали капли жидкости, снова помещали на магнитный штатив на 2 мин.11. Add washing buffer No. 2 to test tubes with magnetic sorbent No. 1, mix and precipitate drops of liquid, place again on the magnetic stand for 2 min.
12. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц.12. Using a manual dispenser, the supernatant liquid was collected without touching the magnetic particles.
13. Добавляли промывочный буфер №3 в пробирки с магнитным сорбентом №1, перемешивали и осаждали капли жидкости, снова помещали на магнитный штатив на 2 мин.13. Add washing buffer No. 3 to test tubes with magnetic sorbent No. 1, mix and precipitate drops of liquid, and place again on a magnetic stand for 2 min.
14. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц, после чего инкубировали пробирки с открытой крышкой при комнатной температуре в течение 5 мин.14. Using a manual dispenser, the supernatant was collected without touching the magnetic particles, after which the tubes were incubated with the lid open at room temperature for 5 min.
15. Добавляли в каждую пробирку по 100 мкл элюирующего буфера, аккуратно перемешивали - так, чтобы на стенках пробирок не оставался магнитный сорбент.15. Add 100 µl of elution buffer to each test tube and mix carefully so that no magnetic sorbent remains on the walls of the test tubes.
16. Пробирки помещали в закрытый термостат и инкубировали при 85°С в течение 5 мин.16. The tubes were placed in a closed thermostat and incubated at 85°C for 5 min.
17. По окончании инкубации пробирки помещали в магнитный штатив на 2 мин и отбирали ручным дозатором надосадочную жидкость в новые пробирки.17. At the end of the incubation, the test tubes were placed in a magnetic stand for 2 minutes and the supernatant liquid was collected into new test tubes using a manual dispenser.
2-я стадияStage 2
1. Для приготовления суспензии сорбента (из расчета на одну пробирку с выделенной ДНК на 1-й стадии) в отдельной пробирке смешивали 20 мкл предварительно ресуспендированного магнитного сорбента №2 и 500 мкл связывающего буфера №2, после чего переносили в пробирку с выделенной ДНК.1. To prepare the sorbent suspension (per one test tube with isolated DNA at stage 1), 20 µl of pre-suspended magnetic sorbent No. 2 and 500 µl of binding buffer No. 2 were mixed in a separate test tube, after which they were transferred to a test tube with isolated DNA.
2. Пробирку помещали в термостат и инкубировали при 55°С в течение 5 мин.2. The test tube was placed in a thermostat and incubated at 55°C for 5 minutes.
3. По окончании инкубации осаждали капли жидкости на настольной микроцентрифуге, после чего помещали пробирку в магнитный штатив на 2 мин.3. At the end of the incubation, the liquid droplets were sedimented in a tabletop microcentrifuge, after which the test tube was placed in a magnetic stand for 2 minutes.
4. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц.4. Using a manual dispenser, the supernatant liquid was collected without touching the magnetic particles.
5. Добавляли промывочный буфер №2 в пробирку с магнитным сорбентом №2, перемешивали и осаждали капли жидкости, снова помещали на магнитный штатив на 2 мин.5. Add washing buffer No. 2 to the test tube with magnetic sorbent No. 2, mix and precipitate drops of liquid, place again on the magnetic stand for 2 min.
6. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц.6. Using a manual dispenser, the supernatant liquid was collected without touching the magnetic particles.
7. Добавляли промывочный буфер №3 в пробирку с магнитным сорбентом №2, перемешивали и осаждали капли жидкости, снова помещали на магнитный штатив на 2 мин.7. Add washing buffer No. 3 to the test tube with magnetic sorbent No. 2, mix and precipitate drops of liquid, again place on the magnetic stand for 2 min.
8. С помощью ручного дозатора отбирали надосадочную жидкость, не касаясь магнитных частиц, после чего инкубировали пробирки с открытой крышкой при комнатной температуре в течение 5 мин.8. Using a manual dispenser, the supernatant was collected without touching the magnetic particles, after which the tubes were incubated with the lid open at room temperature for 5 min.
9. Добавляли в пробирку 100 мкл элюирующего буфера, аккуратно перемешивали - так, чтобы на стенках пробирок не оставался магнитный сорбент.9. Add 100 µl of elution buffer to the test tube and mix carefully so that no magnetic sorbent remains on the walls of the test tubes.
10. Пробирку помещали в закрытый термостат и инкубировали при 85°С в течение 5 мин.10. The test tube was placed in a closed thermostat and incubated at 85°C for 5 min.
11. По окончании инкубации пробирки помещали в магнитный штатив на 2 мин и отбирали ручным дозатором надосадочную жидкость в новые пробирки.11. At the end of the incubation, the test tubes were placed in a magnetic stand for 2 minutes and the supernatant liquid was collected into new test tubes using a manual dispenser.
Типовая электрофореграмма пробы, полученной в результате выделения фрагментов ДНК из модельных образцов, содержащих ДНК-ампликон в конечной концентрации 1,5 нг/мкл, приведена на Фиг. 2.A typical electropherogram of a sample obtained as a result of the isolation of DNA fragments from model samples containing a DNA amplicon at a final concentration of 1.5 ng/μl is shown in Fig. 2.
Типовая электрофореграмма пробы, полученной в результате выделения фрагментов ДНК из модельных образцов, содержащих ДНК-ампликон в конечной концентрации 0,32 нг/мкл, приведена на Фиг. 3.A typical electropherogram of a sample obtained as a result of the isolation of DNA fragments from model samples containing a DNA amplicon at a final concentration of 0.32 ng/μl is shown in Fig. 3.
Таким образом, осуществление способа позволило выделить из модельного образца, содержащего биологический матрикс на основе плазмы крови, фрагменты ДНК заданной длины.Thus, the implementation of the method made it possible to isolate DNA fragments of a given length from a model sample containing a biological matrix based on blood plasma.
Пример 3Example 3
Приготовление ДНК-библиотек для геномного секвенированияPreparation of DNA libraries for genomic sequencing
Показатели чистоты ДНК являются одними из ключевых показателей пригодности выделяемой ДНК из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей биологический матрикс, для дальнейшего лабораторного исследования.DNA purity indicators are one of the key indicators of the suitability of DNA isolated from a multicomponent liquid phase containing a biological matrix for further laboratory research.
Для демонстрации примера осуществления заявляемого способа проводили выделение ДНК из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей биологический матрикс на основе плазмы крови, полученной от условно здорового субъекта.To demonstrate an example of the implementation of the claimed method, DNA was isolated from a multicomponent liquid phase containing a biological matrix based on blood plasma obtained from a conditionally healthy subject.
Способ выделения фрагментов ДНК заданной длины из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей смесь фрагментов ДНК и биологический матрикс на основе плазмы крови, описан в Примере 2.A method for isolating DNA fragments of a given length from a multicomponent liquid phase containing a mixture of DNA fragments and a biological matrix based on blood plasma is described in Example 2.
По результатам измерения концентраций было установлено, что соотношения средних показателей поглощения образцов с выделенной ДНК на различных длинах волн А260/А280 и А260/А230 составили 1,5 и 1,3 соответственно, что говорит о предварительной пригодности фрагментов ДНК, выделенных заявляемым способом, для дальнейших лабораторных исследований.Based on the results of concentration measurements, it was established that the ratios of the average absorption indices of samples with isolated DNA at different wavelengths A 260 /A 280 and A 260 /A 230 were 1.5 and 1.3, respectively, which indicates the preliminary suitability of DNA fragments isolated by the claimed method for further laboratory research.
В Примере 3 ДНК, выделенную из плазмы крови условно здорового субъекта при осуществлении заявляемого способа, использовали далее для подготовки ДНК-библиотек для геномного секвенирования при помощи набора реагентов NEBNEXT ULTRA II DNA LIBRARY PREP KIT FOR ILLUMINA (New England Biolabs Inc., США) в соответствии с протоколом, описанным ниже.In Example 3, DNA isolated from the blood plasma of a conditionally healthy subject during the implementation of the claimed method was then used to prepare DNA libraries for genomic sequencing using the NEBNEXT ULTRA II DNA LIBRARY PREP KIT FOR ILLUMINA reagent kit (New England Biolabs Inc., USA) in accordance with the protocol described below.
Была приготовлена смесь End Prep Master Mix - согласно исходным данным, указанным в Таблице 3.End Prep Master Mix was prepared according to the initial data given in Table 3.
Протокол программы инкубации для термоциклера приведен в Таблице 4.The incubation program protocol for the thermal cycler is given in Table 4.
Лигирование адаптеров осуществляли по следующему протоколу.Adaptor ligation was performed according to the following protocol.
1. Достать из набора реагентов из холодильника и перед началом работы прогреть буферы Ligation Enhancer и USER Enzyme до комнатной температуры.1. Remove the Ligation Enhancer and USER Enzyme buffers from the refrigerator and warm them to room temperature before starting work.
2. Измерить концентрацию ДНК после инкубации на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific Inc., США) с помощью красителя QuDye dsDNA HS Assay Kit.2. Measure the DNA concentration after incubation on a Qubit 4 fluorimeter (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) using the QuDye dsDNA HS Assay Kit dye.
3. Развести растворы адаптеров согласно Таблице 5. В данном примере разведение составляло 1:10, т.к. входное количество ДНК составляло 22,85 нг (50 мкл ДНК * 0,457 нг/мкл=22,85 нг).3. Dilute the adapter solutions according to Table 5. In this example, the dilution was 1:10, since the input amount of DNA was 22.85 ng (50 µl DNA * 0.457 ng/µl = 22.85 ng).
Смесь End Prep Reaction Mixture была приготовлена в порядке и объеме, указанных в Таблице 6.The End Prep Reaction Mixture was prepared in the order and volume shown in Table 6.
4. Взять дозатор с объемом 100 мкл или 200 мкл и выставить значение отбираемого объема на 80 мкл. Перемешать Adapter Master Mix пипетированием вверх и вниз в количестве 10 раз. Воспользоваться мини-центрифугой/вортексом для осаждения капель.4. Take a 100 µl or 200 µl dispenser and set the volume to 80 µl. Mix the Adapter Master Mix by pipetting up and down 10 times. Use a mini-centrifuge/vortex to sediment the droplets.
5. Поместить образец в инкубатор, инкубировать в течение 15 мин при 20°C с отключенным нагревом крышки амплификатора.5. Place the sample in the incubator and incubate for 15 min at 20°C with the thermocycler lid heating turned off.
6. После инкубации добавить по 3 мкл USER Enzyme в образец.6. After incubation, add 3 µl USER Enzyme to the sample.
7. Перемешать образец и инкубировать в течение 15 мин при 37°C с включенным нагревом крышки при температуре ≥47°С.7. Mix the sample and incubate for 15 min at 37°C with the lid heating on at ≥47°C.
8. Достать из холодильника магнитные частицы SPRIselect и перемешать.8. Remove SPRIselect magnetic particles from the refrigerator and stir.
9. Добавить по 87 мкл SPRIselect к образцу и хорошо перемешать пипетированием с помощью дозатора. Воспользоваться мини-центрифугой/вортексом для осаждения капель. Не допускать осаждения магнитных частиц на дно пробирки.9. Add 87 µl of SPRIselect to each sample and mix well by pipetting with a pipette. Use a mini-centrifuge/vortex to settle the droplets. Avoid settling magnetic particles to the bottom of the tube.
10. Поместить смесь в термостат, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.10. Place the mixture in a thermostat and incubate for 5 minutes at room temperature.
11. Поместить пробирку на магнитный штатив и дождаться полного осаждения магнитных частиц (смесь должна стать прозрачной), затем отобрать и утилизировать надосадочную жидкость.11. Place the test tube on a magnetic stand and wait until the magnetic particles are completely precipitated (the mixture should become transparent), then collect and dispose of the supernatant liquid.
12. Аккуратно добавить 200 мкл свежеприготовленного 80% раствора этилового спирта к осадку, не убирая образец с магнитного штатива и не допуская его ресуспендирования.12. Carefully add 200 µl of freshly prepared 80% ethyl alcohol solution to the sediment without removing the sample from the magnetic stand and without allowing it to resuspend.
13. Инкубировать в течение 30 с при комнатной температуре. Аккуратно отобрать спиртовой раствор (надосадочную жидкость), не задевая примагниченные частицы. Надосадочную жидкость утилизировать. Повторить промывку.13. Incubate for 30 sec at room temperature. Carefully collect the alcohol solution (supernatant), without touching the magnetized particles. Dispose of the supernatant. Repeat the wash.
14. Убедиться, что вся жидкость была отобрана после второй промывки.14. Make sure that all liquid has been collected after the second wash.
15. При необходимости центрифугировать пробирку для сброса капель, затем установить ее на магнитный штатив и отобрать остатки 80% этилового спирта.15. If necessary, centrifuge the test tube to discard the drops, then place it on a magnetic stand and collect the remaining 80% ethyl alcohol.
16. Просушить частицы в пробирке с открытой крышкой от остатков спирта в течение не более 5 мин, не допуская растрескивания магнитных частиц.16. Dry the particles in a test tube with an open lid to remove any remaining alcohol for no more than 5 minutes, avoiding cracking of the magnetic particles.
17. Добавить элюирующий буфер (17 мкл 0,1 × ТЕ из набора NEBNEXT ULTRA II DNA LIBRARY PREP KIT FOR ILLUMINA (New England Biolabs Inc., США) или 10 ммоль Tris-HCl).17. Add elution buffer (17 µl 0.1×TE from the NEBNEXT ULTRA II DNA LIBRARY PREP KIT FOR ILLUMINA (New England Biolabs Inc., USA) or 10 mM Tris-HCl).
18. Перемешать смесь пипетированием с помощью дозатора и поставить в штатив без магнита инкубироваться в течение 2 мин при комнатной температуре.18. Mix the mixture by pipetting with a dispenser and place in a rack without a magnet to incubate for 2 minutes at room temperature.
19. Поместить пробирку на магнитный штатив и дождаться полного осаждения магнитных частиц (раствор должен стать прозрачным).19. Place the test tube on a magnetic stand and wait until the magnetic particles are completely precipitated (the solution should become transparent).
20. Отобрать 15 мкл элюата в новую пробирку для последующей амплификации.20. Collect 15 µl of eluate into a new tube for subsequent amplification.
Амплификацию адаптер-лигированной ДНК осуществляли по следующему протоколу.Amplification of adapter-ligated DNA was performed according to the following protocol.
1. Разнести компоненты для амплификации, указанные в Таблице 7, в пробирку из п. 20,1. Place the amplification components specified in Table 7 into the test tube from step 20,
2. Запрограммировать термоциклер под протокол амплификации, указанный в Таблице 8.2. Program the thermal cycler for the amplification protocol specified in Table 8.
3. Поставить пробирку в термоциклер и запустить программу.3. Place the test tube in the thermal cycler and start the program.
Пост-амплификационную очистку осуществляли по следующему протоколу.Post-amplification purification was performed according to the following protocol.
1. Достать магнитные частицы SPRIselect из холодильника и прогреть до комнатной температуры, тщательно ресуспендировать магнитные частицы.1. Remove SPRIselect magnetic particles from the refrigerator and warm to room temperature, thoroughly resuspend the magnetic particles.
2. Добавить 45 мкл ресуспендированных магнитных частиц в пробирку для проведения ПЦР-реакции. Перемешать пипетированием с помощью механического дозатора вверх и вниз в количестве 10 раз. Убедиться в однородности суспензии. Воспользоваться мини-центрифугой/вортексом для осаждения капель.2. Add 45 µl of resuspended magnetic particles to the PCR tube. Mix by pipetting up and down 10 times with a mechanical pipette. Ensure that the suspension is homogeneous. Use a mini-centrifuge/vortex to sediment the droplets.
3. Инкубировать образцы в течение 5 минут при комнатной температуре.3. Incubate samples for 5 minutes at room temperature.
4. Добавить 200 мкл свежеприготовленного 80% раствора этанола к магнитным частицам. Инкубировать в течение 30 с при комнатной температуре,4. Add 200 µl of freshly prepared 80% ethanol solution to the magnetic particles. Incubate for 30 s at room temperature,
5. Аккуратно отобрать спиртовой раствор (надосадочную жидкость), не задевая примагниченные частицы. Надосадочную жидкость утилизировать. Повторить промывку.5. Carefully collect the alcohol solution (supernatant), without touching the magnetized particles. Dispose of the supernatant. Repeat the wash.
6. Просушить магнитные частицы в открытой пробирке в течение 5 мин, не снимая ее с магнитного штатива. Не допускать пересыхания частиц.6. Dry the magnetic particles in an open test tube for 5 minutes without removing it from the magnetic stand. Do not allow the particles to dry out.
7. Добавить к образцам ДНК по 33 мкл элюирующего буфера 0,1 × ТЕ из набора NEBNEXT ULTRA II DNA LIBRARY PREP KIT FOR ILLUMINA (New England Biolabs Inc., США).7. Add 33 µl of 0.1×TE elution buffer from the NEBNEXT ULTRA II DNA LIBRARY PREP KIT FOR ILLUMINA (New England Biolabs Inc., USA) to each DNA sample.
8. Перемешать пипетированием с помощью дозатора. Воспользоваться мини-центрифугой/вортексом для осаждения капель.8. Mix by pipetting with a dispenser. Use a mini-centrifuge/vortex to sediment the drops.
9. Поместить пробирки в штатив без магнита, открыть крышки и выдержать в течение 2 минут при комнатной температуре.9. Place the test tubes in a rack without a magnet, open the lids and leave for 2 minutes at room temperature.
10. Поместить образцы в магнитный штатив и дождаться полного осаждения магнитных частиц (раствор должен стать прозрачным). Затем отобрать 30 мкл образца и перенести в новую пробирку.10. Place the samples in a magnetic stand and wait until the magnetic particles have completely settled (the solution should become transparent). Then take 30 µl of the sample and transfer it to a new test tube.
Контроль качества выделенной ДНК проводили путем оценки длин фрагментов выделенной ДНК с помощью набора реагентов High Sensitivity D1000 ScreenTape Assay (Agilent Technologies, Inc.) на системе автоматического электрофореза 4200 Таре Station.Quality control of the isolated DNA was performed by assessing the lengths of the isolated DNA fragments using the High Sensitivity D1000 ScreenTape Assay reagent kit (Agilent Technologies, Inc.) on a 4200 Tare Station automated electrophoresis system.
На Фиг. 4 представлены результаты оценки длины фрагментов ДНК в составе подготовленных ДНК-библиотек (на электрофореграмме регистрируется единичный пик фрагмента ДНК длиной 263 п.о.).Fig. 4 shows the results of assessing the length of DNA fragments in the prepared DNA libraries (a single peak of a DNA fragment 263 bp long is recorded on the electropherogram).
Таким образом, результаты эксперимента, изложенные в Примере 3, подтверждают валидность заявляемого способа в выделении ДНК, которая пригодна для проведения молекулярно-генетического исследования, а именно для подготовки ДНК-библиотек с целью последующего секвенирования ДНК.Thus, the results of the experiment presented in Example 3 confirm the validity of the claimed method for isolating DNA that is suitable for conducting molecular genetic research, namely for preparing DNA libraries for the purpose of subsequent DNA sequencing.
Пример 4Example 4
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) на Alu-повторыPolymerase chain reaction (PCR) for Alu repeats
Для демонстрации примера осуществления заявляемого способа проводили выделение ДНК из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей биологический матрикс на основе плазмы крови, полученной от условно здорового субъекта.To demonstrate an example of the implementation of the claimed method, DNA was isolated from a multicomponent liquid phase containing a biological matrix based on blood plasma obtained from a conditionally healthy subject.
Способ выделения фрагментов ДНК заданной длины из многокомпонентной жидкой фазы, содержащей смесь фрагментов ДНК, и биологический матрикс на основе плазмы крови, описан в Примере 2.A method for isolating DNA fragments of a given length from a multicomponent liquid phase containing a mixture of DNA fragments and a biological matrix based on blood plasma is described in Example 2.
В Примере 4 ДНК, выделенную из образца плазмы крови условно здорового субъекта при осуществлении заявляемого способа, использовали далее для постановки ПЦР.In Example 4, DNA isolated from a blood plasma sample of a conditionally healthy subject during the implementation of the claimed method was then used to perform PCR.
Alu-повторы относят к группе ретро-элементов, которые представлены в достаточно большом количестве в ДНК человека (Bennett Е.А., et al. Active Alu retrotransposons in the human genome. Genome Research. 2008; 18, 1875-1883). Следовательно, они могут быть амплифицированы в ходе ПЦР при помощи специфических праймеров.Alu repeats belong to a group of retro-elements that are present in fairly large quantities in human DNA (Bennett E.A., et al. Active Alu retrotransposons in the human genome. Genome Research. 2008; 18, 1875-1883). Therefore, they can be amplified during PCR using specific primers.
Перед постановкой ПЦР измеряли концентрацию фрагментов ДНК на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).Before PCR, the concentration of DNA fragments was measured using a Qubit 4 fluorimeter (Thermo Fisher Scientific Inc., USA).
Расчет количества реагентов, необходимых для постановки ПЦР, указан в Таблице 9.The calculation of the amount of reagents required for PCR is shown in Table 9.
Дальнейшие операции осуществляли по следующему протоколу.Further operations were carried out according to the following protocol.
1. Реагенты перед смешиванием прогреть при комнатной температуре, препарат HS Taq полимеразы поместить на лед.1. Warm the reagents at room temperature before mixing; place the HS Taq polymerase preparation on ice.
2. Аликвоты, содержащие фрагменты ДНК и ПЦР-смесь, смешать в пробирке объемом 0,2 мл (Таблица 9).2. Mix aliquots containing DNA fragments and PCR mixture in a 0.2 ml test tube (Table 9).
3. Запрограммировать амплификатор, используя температурный режим из Таблицы 10.3. Program the amplifier using the temperature mode from Table 10.
4. Тщательно перемешать ПЦР-смесь на вортексе, осадить капли в течение 3-5 секунд, поставить образцы в амплификатор и запустить программу.4. Thoroughly mix the PCR mixture using a vortex mixer, sediment the drops for 3-5 seconds, place the samples in the amplifier and start the program.
5. После выполнения программы амплификации необходимо оценить длину фрагментов выделенной ДНК с помощью набора реагентов High Sensitivity D1000 ScreenTape Assay (Agilent Technologies, Inc.) на системе автоматического электрофореза 4200 Таре Station, используя инструкцию к набору.5. After completing the amplification program, it is necessary to evaluate the length of the fragments of the isolated DNA using the High Sensitivity D1000 ScreenTape Assay reagent kit (Agilent Technologies, Inc.) on the 4200 Tare Station automatic electrophoresis system, using the instructions for the kit.
На Фиг. 5 представлена контрольная электрофореграмма образца, полученного в ходе ПЦР с использованием пары специфичных праймеров на Alu-повтор. Из Фиг. 5 видно, что в образце присутствуют фрагменты ДНК длиной 286 п.о.Fig. 5 shows a control electropherogram of the sample obtained during PCR using a pair of specific primers for the Alu repeat. It can be seen from Fig. 5 that the sample contains DNA fragments of 286 bp in length.
Таким образом, результаты эксперимента, изложенные в Примере 4, подтверждают валидность заявляемого способа в выделении ДНК, которая пригодна для проведения молекулярно-генетического исследования, а именно для постановки полимеразно-цепной реакции.Thus, the results of the experiment presented in Example 4 confirm the validity of the claimed method for isolating DNA that is suitable for conducting molecular genetic research, namely for conducting the polymerase chain reaction.
В целом Примеры 3 и 4 демонстрируют пригодность выделенной при осуществлении заявляемого способа ДНК для выполнения дальнейшего лабораторного исследования.In general, Examples 3 and 4 demonstrate the suitability of the DNA isolated during the implementation of the claimed method for further laboratory research.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2832884C1 true RU2832884C1 (en) | 2025-01-09 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2650865C1 (en) * | 2016-11-29 | 2018-04-17 | Общество с ограниченной ответственностью "Магнэтик" | Set of reactives for dna purification |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2650865C1 (en) * | 2016-11-29 | 2018-04-17 | Общество с ограниченной ответственностью "Магнэтик" | Set of reactives for dna purification |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TYUMENTSEVA A.V. et al., Silica-Coated Iron Oxide Nanoparticles for DNA Isolation for Molecular Genetic Studies in Hematology, Genet Test Mol Biomarkers, 2021, vol. 25, N. 9, pp. 611-614. HADDAD Y. et al., The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size, Int J Mol Sci, 2016, vol. 17, N. 4, 550. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| M Carpi et al. | Human DNA extraction methods: patents and applications | |
| CA2614069C (en) | Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives | |
| ES2954252T3 (en) | Protein-based arrays and sample collection devices | |
| US8846897B2 (en) | Method for filtering nucleic acids, in particular from fixed tissue | |
| US20060240449A1 (en) | Methods and compositions for preparation of biological samples | |
| JPH10501246A (en) | A general method for isolating and purifying nucleic acids from extremely diverse starting materials that are extremely small and very contaminated | |
| EP2971109B1 (en) | Methods for one step nucleic acid amplification of non-eluted samples | |
| ES2616110T3 (en) | One-stage method of DNA elution from blood samples | |
| EP1932913A1 (en) | Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives | |
| JP2023511213A (en) | Methods and kits for DNA isolation | |
| Brahma et al. | CUT&RUN profiling of the budding yeast epigenome | |
| JP2004500002A (en) | Elution reagents, methods and kits for isolating DNA | |
| RU2832884C1 (en) | Method of extracting target dna fragments from multicomponent mixture | |
| CN109680343B (en) | Library building method for exosome micro DNA | |
| JP4616990B2 (en) | Method for isolating, amplifying and characterizing DNA | |
| AU2018277094A1 (en) | DNA stabilization of RNA | |
| ES2665280T3 (en) | Methods for the extraction and purification of components of biological samples | |
| CN112538657B (en) | Cerebrospinal fluid gene sequencing library building and detecting method and application thereof | |
| US20220090166A1 (en) | Preparation methods and apparatus adapted to filter small nucleic acids from biological samples | |
| RU2829656C1 (en) | Method of isolating total dna of bacteria from soil samples, method of assessing bacterial composition of soils by metagenomic sequencing and kits for implementing methods | |
| RU2808832C1 (en) | Method of isolating viral ribonucleic acid from cerebrospinal fluid for molecular biological research | |
| ES2950581T3 (en) | Procedure to enrich nucleic acids | |
| Tajammal et al. | BLADE-R: streamlined RNA extraction for molecular diagnostics and high-throughput applications | |
| RU2595816C1 (en) | Method of preparing suspension of human lymphocytes in ethanol-acetic retainer for dna extraction | |
| Brodzka et al. | Optimized Protocol For DNA Extraction from Human Whole Blood. |