RU2832110C1 - Поливалентная векторная вакцина hvt - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. Предложен рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT) для получения вакцины для предотвращения или снижения заражения MDV, IBDV, NDV и/или AIV или ассоциированных с ними признаков заболевания у домашней птицы, экспрессирующий ген вирусного белка 2 (VP2) вируса инфекционного бурсита (IBDV) и ген слитого белка (F) вируса болезни Ньюкасла (NDV) из первой и второй кассет экспрессии. Первая и вторая кассета экспрессии вставлены в уникальную малую (Us) область генома указанного rHVT, при этом обе встроены в ген Us2. Указанный rHVT также экспрессирует ген гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа (AIV) из третьей кассеты экспрессии, которая встроена в уникальную длинную (UL) область генома указанного rHVT либо между генами UL40 и UL41, либо между генами UL44 и UL45. Предложена птичья клетка-хозяин для получения вакцины; вакцина для предотвращения или снижения заражения MDV, IBDV, NDV и/или AIV или ассоциированных с ними признаков заболевания у домашней птицы. Предложен способ получения вакцины для домашней птицы; применение rHVT, клетки-хозяина или любой их комбинации для получения вакцины для домашней птицы; применение вакцины; способ профилактики или уменьшения заражения MDV, IBDV NDV и/или AIV или связанных с ними признаков заболевания; способ вакцинации домашней птицы. Векторная конструкция обеспечивает хорошую репликацию вектора и его вставок как in vitro, так и in vivo, а также эффективную экспрессию всех гетерологичных генов на достаточно высоком уровне и в течение значительного периода времени, чтобы индуцировать и поддерживать защитный иммунный ответ у вакцинированной мишени против всех предполагаемых патогенов. 8 н. и 7 з.п. ф-лы, 13 табл., 3 пр.

Description

Сведения о перечне последовательностей

Перечень последовательностей, связанных с данной заявкой, представлен в текстовом формате вместо бумажной копии и включен в данное описание посредством ссылки. Имя текстового файла, содержащего список последовательностей: 930585_402WO _SEQUENCE_LISTING.txt. Текстовый файл - 328 КБ, был создан 24 февраля 2021 года и передается в электронном виде через EFS-Web.

Предшествующий уровень техники

В конце 2019 года в китайском городе Ухань (Wuhan) появился новый бетакоронавирус. По состоянию на 19 февраля 2021 года во всем мире было подтверждено около 110 миллионов случаев инфицирования этим вирусом (называемым, среди прочего, SARS-CoV-2 (коронавирус-2 тяжелого острого респираторного синдрома) и первоначально идентифицированным как коронавирус Ухань), что привело к приблизительно 2,45 миллионам смертей. Необходимы методы предотвращения или лечения инфекции SARS-CoV-2 и диагностические инструменты для диагностики инфекции SARS-CoV-2.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1A и 1B показано связывание антителами (1A) S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67) и (1B) S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) по настоящему изобретению с рекомбинантным RBD (рецептор-связывающий домен) SARS-CoV-2, как описано в примере 2.

На фиг. 2A и 2B показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью определенных антител по настоящему изобретению, как описано в примере 4.

На фиг. 3A-3I показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2, как описано в примере 4. На фиг. 3A показывает нейтрализацию с помощью донорской плазмы у выживших жертв SARS-CoV-1. На фиг. 3B-3D и 3I показана нейтрализация с помощью супернатанта из В-клеток, экспрессирующих определенные антитела по настоящему изобретению. На фиг. 3E-3H показана нейтрализация с помощью определенных рекомбинантных антител IgG1.

На фиг. 4A и 4B показано связывание супернатанта В-клеток, содержащего антитело, с белком SARS-CoV-2, экспрессируемым на клетках ExpiCHO (CHO - клетки яичника китайского хомячка), как описано в примере 1. Графики, показывающие профили связывания антител S300-S310, обозначены рамками.

На фиг. 5A и 5B показано связывание антител S311 и S312 в супернатанте культивированных В-клеток с SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, как описано в примере 6. Концентрации антител являются приблизительными. SARS S1 Sino: белок от Sino Biological. RBD2: RBD SARS-CoV-2, полученный собственными силами.

На фиг. 6A-6E показаны кривые (сверху) связывания некоторых антител по настоящему изобретению с RBD SARS-CoV-1 (SARS1) и RBD SARS-CoV-2 (SARS2), измеренные с помощью прибора Octet и кривые (снизу) значений KD. Значения KD для антител (например, менее 1,0×10^-12 M) с очень сильным связыванием и медленной диссоциацией являются приблизительными. Эти данные и эксперименты описаны далее в Примере 3.

На фиг. 7 показана нейтрализация инфекции с помощью антител S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83) и S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), по отдельности или в комбинации, против псевдотипированного SARS-CoV-2 вируса, как описано в примере 5.

На фиг. 8A-8K показаны кривые связывания некоторых антител с RBD SARS-CoV-1, RBD SARS-CoV-2 и эктодоменами различных коронавирусов, измеренных с помощью ELISA (иммуноферментный анализ). См. пример 8.

На фиг. 9 показана нейтрализация инфекции S309 rIgG1 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) и S315 rIgG1 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182) против псевдотипированного SARS-CoV-2 вируса, как описано в примере 7.

На фиг. 10 показана нейтрализация инфекции с помощью полноразмерного S309 rIgG1 и S309 rFab (оба из которых содержат VH с SEQ ID NO:105 и VL с SEQ ID NO:168) против псевдотипированного SARS-CoV-2 вируса, как описано в примере 7.

На фиг. 11 показано связывание антитела S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) со спайк-белком SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, экспрессируемым на клетках ExpiCHO, как описано в примере 9. Сложенные гистограммы графиков проточной цитометрии демонстрируют дозозависимое связывание антитела S309 с SARS-CoV и SARS-CoV-2.

На фиг. 12A и 12B показано зависимое от концентрации связывание, измеренное с помощью проточной цитометрии для определенных антител, как описано в примере 9. На фиг. 12A показано связывание с SARS-CoV-2. На фиг. 12B показано связывание с SARS-CoV-1.

На фиг. 13 показана нейтрализация инфекции с помощью антител S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83), S306 (VH SEQ ID NO:87; VL SEQ ID NO:91), S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), S310 (VH SEQ ID NO:155; VL SEQ ID NO:159) и S315 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182) против псевдотипированного SARS-CoV-2 вируса, как описано в примере 4.

На фиг. 14A-14D показана аффинность/авидность связывания антител S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83) и S315 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182) с RBD SARS-CoV-1 (справа) и SARS-CoV-2 (слева), как описано в примере 10.

На фиг. 15А и 15В показана конкуренция пар антител по настоящему изобретению за связывание с RBD SARS-CoV-1 (фиг. 15А) и SARS-CoV-2 (фиг. 15В), как описано в примере 12. Для каждого графика ось x показывает время (от 0 до 1000 секунд), а ось y показывает связывание с RBD, измеренным с помощью BLI (биослойная интерферометрия) (от 0 до 3 нм). Первое антитело указано на левой стороне матрицы, а второе антитело - на верхней части матрицы. Пунктирные вертикальные линии на фиг. 15В иллюстрируют переключение от первого антитела ко второму антителу. Справа ("I" - "IV" на фиг. 15А, "II" и "IV" на фиг. 15В) находятся антигенные сайты, определенные с помощью структурной информации, анализа "ускользнувших" мутантов и связывания эпитопов на основе BLI.

На фиг. 16 показана способность S309 мешать связыванию RBD SARS-CoV-1 (слева) или SARS-CoV-2 (справа) с ACE2 (ангиотензинпревращающий фермент 2) человека (hACE2), как описано в примере 13. hACE2 загружали на сенсоры BLI с последующей инкубацией сенсоров с RBD отдельно или RBD в комбинации с антителом. Вертикальная пунктирная линия указывает на начало ассоциации RBD с антителом или без антитела. На графике слева антитело S230 использовали в качестве положительного контроля ингибирования связывания RBD SARS-CoV-1 с ACE2 на основании предыдущих исследований (см. Walls и др., Cell 176(5):1023-1039.e15 (2019)).

На фиг. 17А И 17В показаны антителозависимые эффекты некоторых антител по настоящему изобретению против модели инфицированных клеток, как описано в примере 14. На фиг. 17A показана антителозависимая цитотоксичность с использованием первичных NK-эффекторных клеток (NK - естественные киллеры) и экспрессирующих SARS-CoV-2- клеток ExpiCHO в качестве клеток-мишеней. Гистограмма справа показывает ADCC (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность) для указанного антитела (антител), рассчитанного как площадь под кривой (AUC). На фиг. 17B показан антителозависимый клеточный фагоцитоз с использованием PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови) в качестве фагоцитарных клеток и PKF67-меченых SARS-CoV-2-экспрессирующих ExpiCHO в качестве клеток-мишеней. Линейные графики показывают среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) PBMC после инкубации с клетками-мишенями и антителами, определенную для одного репрезентативного донора с FcγRIIIa с высокой аффинностью (Fc гамма рецептор IIIa) (символы показывают среднее значение ±SD (стандартное отклонение) повторностей).

На фиг. 18A-18J показаны кривые связывания некоторых антител с RBD SARS-CoV-1, RBD SARS-CoV-2 и эктодоменами различных штаммов коронавирусов, измеренных с помощью ELISA. См. пример 8. Рекомбинантные mAb (моноклональное антитело) тестировали с помощью ELISA в диапазоне концентраций от 5 до 0,00028 мг/мл. RBD2: рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2. RBD1: рецептор-связывающий домен SARS-CoV (также называемый в настоящем документе SARS-CoV-1). Спайк-белок: стабилизированный префузионный тример указанного коронавируса. Некоторые антитела рекомбинантно экспрессировались как IgG1 (иммуноглоулин IgG1) (rIgG1), а некоторые антитела рекомбинантно экспрессировались как IgG1 с мутацией MLNS (M428L и N434S (нумерация EU)) в Fc (rIgG1-LS).

На фиг. 19A и 19B показана способность некоторых антител препятствовать связыванию RBD с человеческим ACE2, как описано в примере 13. Человеческий ACE2 (hACE2) загружали на сенсоры BLI с последующей инкубацией сенсоров только с RBD или RBD в комбинации с рекомбинантным антителом. Вертикальная пунктирная линия указывает на начало загрузки RBD с антителом или без антитела. RBD: рецептор-связывающий домен. На фиг. 19A показано связывание RBD SARS-CoV-1 с ACE2. На фиг. 19В показано связывание RBD SARS-CoV-2 с ACE2.

На фиг. 20A и 20B показаны аффинность связывания и авидность антитела S309 IgG (фиг. 20A) по сравнению с S309 Fab (фиг. 20B) для RBD SARS-CoV-1 (внизу каждой фиг.) и RBD SARS-CoV-2 (вверху каждой фиг.), как описано в примере 10. Как для IgG, так и для Fab: VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168. RBD загружали на цилиндры BLI и измеряли ассоциацию различных концентраций S309-IgG-MLNS или S309 Fab. Вертикальные пунктирные линии указывают на начало фазы диссоциации, когда цилиндры BLI были переключены на буфер.

На фиг. 21A-21C показана реактивность антител S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83), S306 (VH SEQ ID NO:87; VL SEQ ID NO:91), S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) и S310 (VH SEQ ID NO:155; VL SEQ ID NO:159) против SARS-CoV-2, как описано в примере 15. На фиг. 21A показана реактивность антител S304, S306, S309 и S310 против лизата, экстрагированного T×100, клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2. На фиг. 21B показана реактивность тех же антител против лизата, экстрагированного SDS, клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2. На фиг. 21C показаны сыворотки выздоравливающего человека от SARS-CoV-1 против экстрагированного T×100 или экстрагированного SDS лизата клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2. На фиг. 21A и 21B также показаны данные для сравнительного антитела LCA57, которое является специфичным для спайк-белка MERS-CoV (Corti и др. PNAS 112(33):10473-10478 (2015).

На фиг. 22A-22D показана нейтрализация инфекции с помощью SARS-CoV-2 антител, что оценивалось по ингибированию экспрессии нуклеопротеина (NP) через 24 и 45 часов после инфицирования. См. пример 16. На фиг. 22A показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью S304 S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83). На фиг. 22B показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168. На фиг. 22C показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 комбинацией S304 и S309. На фиг. 22D показана контрольная нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью сравнительного антитела LCA57, которое является специфичным для спайк-белка MERS-CoV (коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (Corti и др. PNAS 112(33):10473-10478 (2015).

На фиг. 23 показана нейтрализация инфекции с помощью антител S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) и S315 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182) отдельно или в комбинации против псевдотипированного SARS-CoV-2 вируса, как описано в примере 5.

На фиг. 24А И 24В показаны антителозависимые эффекты некоторых антител по настоящему изобретению против модели инфицированных клеток, как описано в примере 14. На фиг. 24A показана антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) с использованием первичных NK-эффекторных клеток и экспрессирующих SARS-CoV-2- клеток ExpiCHO в качестве клеток-мишеней. График показывает процент уничтожения клеток-мишеней после инкубации с антителом или комбинацией антител, показанных в условных обозначениях. На фиг. 24В показана ADCC для указанного антитела (антител), рассчитанная как площадь под кривой (AUC). Слева: AUC, определенная с использованием клеток с генотипом FcγRIIIa VV; справа: AUC, определенная для клеток с генотипом FcγRIIIa FF или FV.

На фиг. 25А и 25В показаны дополнительные антителозависимые эффекты некоторых антител по настоящему изобретению, как описано в примере 14. На фиг. 25A показан антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) с использованием PBMC в качестве фагоцитарных клеток и PKF67-меченых SARS-CoV-2-экспрессирующих ExpiCHO клетки в качестве клеток-мишеней. Графики показывают среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) PBMC после инкубации с клетками-мишенями и антителами, определенную для одного репрезентативного донора c FcγRIIIa с высокой аффинностью (символы показывают среднее значение ±SD повторностей). На фиг. 24В показана ADCC для указанного антитела (антител), рассчитанная как площадь под кривой (AUC).

На фиг. 26 показано связывание антитела, измеренное с помощью проточной цитометрии. Связывание антитела S309 со спайк-белком SARS-CoV-2, экспрессируемым в клетках Expi-CHO, обнаруживали с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией.

На фиг. 27 показано связывание антитела S309 (помеченного как "11" в ключе фигуры) и четырех сконструированных вариантов S309 (помеченного как "12" - "15", соответственно) с S-белком, измеренное с помощью проточной цитометрии. См. пример 9. Четыре сконструированных варианта антител являются следующими: S309 N55Q содержит мутацию N55Q в CDRH2, что приводит к последовательности варианта VH (SEQ ID NO:113), и последовательность VL дикого типа (SEQ ID NO:168) S309; S309 W50F содержит последовательность VH варианта W50F (SEQ ID NO: 129) и последовательность VL дикого типа (SEQ ID NO:168) S309; S309 W105F содержит последовательность VH варианта W105F (SEQ ID NO: 119) и последовательность VL дикого типа (SEQ ID NO:168) S309; и S309 W50F/G56A/W105F содержит последовательность варианта VH W50F/G56A/W105F (SEQ ID NO:172) и последовательность VL дикого типа S309. На фиг. 27 S309 N55Q помечен как «12», S309 W50F помечен как «13», S309 W105F помечен как «14», а S309 W50F-G56A-W105F помечен как «15». Связывание антитела со спайк-белком SARS-CoV-2, экспрессируемым на клетках Expi-CHO, обнаруживали с помощью флуоресцентно меченого вторичного антитела. Показаны данные двух экспериментов.

На фиг. 28 показана нейтрализация инфекции с помощью антитела S309 (называемое в фиг. "Вариант-11 (wt (дикий тип))") и четырех вариантных антител S309 против псевдотипированных SARS-CoV-2 вирусов, как описано в примере 19. На фиг. 28S309 N55Q помечен как «Вариант-12», S309 W50F помечен как «Вариант-13», S309 W105F помечен как «Вариант-14», а S309 W50F-G56A-W105F помечен как «Вариант-15». Псевдотипированные вирусы представляют собой псевдотипированные VSV (вирус везикулярного стоматита) со спайк-белком SARS-CoV-2.

На фиг. 29 показан обзор результатов анализов связывания и нейтрализации псевдовирусов с помощью антитела S309 ("S309-WT") и четырех сконструированных вариантов S309 ("N55Q"; "W50F"; "W105F"; "W50F/G56A/W105F"). Пунктирная горизонтальная линия показывает изменение функции сконструированного варианта по сравнению с базовой линией S309-WT. Заштрихованные различными способами полосы демонстрируют связывание с гликозилированным RBD, измеренное с помощью SPR (поверхностный плазмонный резонанс), связывание с дегликозилированным RBD, измеренное с помощью SPR, связывание с антигенэкспрессирующими клетками, измеренное с помощью FACS (cортировка клеток с активированной флуоресценцией), и нейтрализацию, измеренную с помощью псевдовирусов SARS-CoV-2.

На фиг. 30A-30F показана кинетика связывания примерных антител с гликозилированным или дегликозилированным RBD SARS-CoV-2, измеренная с помощью SPR. См. пример 18. Были протестированы антитела S309 (имеющие аминокислотные последовательности VH (SEQ ID NO:105) и VL (SEQ ID NO: 168) S309 дикого типа), S309 N55Q, S309 W50F, S309 W105F и S309 W50F/G56A/W105F. На фиг. 30A показана кинетика связывания антитела S309 дикого типа (2 повторных эксперимента). На фиг. 30B показана кинетика связывания S309 N55Q (снизу) по сравнению с антителом S309 дикого типа (сверху). На фиг. 30C показана кинетика связывания S309 W50F (снизу) по сравнению с антителом S309 дикого типа (сверху). На фиг. 30D показана кинетика связывания S309 W105F (снизу) по сравнению с антителом S309 дикого типа (сверху). На фиг. 30E показано связывание S309 W50F/G56A/W105F (снизу) по сравнению с антителом дикого типа S309 (сверху). На фиг. 30F показано связывание S309 W50F/G56A/W105F с использованием 10-минутного периода инъекции (сверху) или 3-минутного периода инъекции (снизу).

На фиг. 31 показана активация FcγRIIIa с высокой аффинностью (158V) (слева) или FcγRIIIa с низкой аффинностью (158F) (справа) антителами S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83), S306 (VH SEQ ID NO:87; VL SEQ ID NO:91), S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) и комбинацией S309 и S315, наряду со сравнительным антителом S230. См. пример 20. Активацию измеряли с использованием S-экспрессирующих SARS-CoV-2 клеток ExpiCHO в качестве клеток-мишеней и репортерных клеток Jurkat, стабильно трансфицированных репортерным геном люциферазы, управляемым NFAT (ядерный фактор активированных Т-клеток). Активация FcγRIIIa приводит к NFAT-опосредованной экспрессии репортерного гена люциферазы. Результаты получены в результате одного эксперимента, одного или двух измерений на mAb (моноклональное антитело).

На фиг. 32 показана активация FcγRIIa с помощью примерных антител S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83), S306 (VH SEQ ID NO:87; VL SEQ ID NO:91), S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) и комбинации S309 и S315, наряду со сравнительным моноклональным антителом S230. См. пример 20. Активацию измеряли с использованием S-экспрессирующих SARS-CoV-2 клеток ExpiCHO в качестве клеток-мишеней и репортерных клеток Jurkat, стабильно трансфицированных репортерным геном люциферазы, управляемым NFAT (ядерный фактор активированных Т-клеток). Активация FcγRIIa приводит к NFAT-опосредованной экспрессии репортерного гена люциферазы.

На фиг. 33A и 33B показано связывание антител S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83), S306 (VH SEQ ID NO:87; VL SEQ ID NO:91), S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), S310 (VH SEQ ID NO:155; VL SEQ ID NO:159) и S315 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182), наряду со сравнительными антителами S110, S230 и S109, с S-белком, экспрессируемым на поверхности клетки. См. пример 9. На фиг. 33A показано связывание с клетками ExpiCHO, трансфицированными S-белком SARS-CoV-2. На фиг. 33В показано связывание с клетками ExpiCHO, трансфицированными S-белком SARS-CoV-1. Среднюю интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии для каждого антитела. Исследованные концентрации антител указаны по оси X.

На фиг. 34 показана нейтрализация инфекции с помощью примерных антител S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83), S306 (VH SEQ ID NO:87; VL SEQ ID NO:91), S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), S310 (VH SEQ ID NO:155; VL SEQ ID NO:159) и S315 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182) против псевдотипированного SARS-CoV-2 вируса, как описано в примере 4. См. пример 4.

На фиг. 35A и 35B показана консервация остатков S-белка, как описано в примере 21. На фиг. 35A показаны варианты спайк-белка, встречающиеся с частотой n более 1 в виде сфер, отображаемых в закрытой (слева) и открытой (справа) форме полного тримерного спайк-эктодомена. RBD и другие домены спайк-белка показаны как указано. Показано 40 мутаций (из 2229 в общей сложности). Только остаток 367 (представляет собой 8) выделен в RBD, но не остатки 476 (n представляет собой 7) и 483 (n представляет собой 17). На фиг. 35B показано преобладание вариантов спайк-гликопротеинов по аминокислотам. Каждая точка является отдельным вариантом. Показаны местоположения домена A и RBD. Варианты, соответствующие пороговому значению частоты 0,1%, являются такими, как указано.

На фиг. 36 показана нейтрализация SARS-CoV-2-MLV (MLV - вирус лейкоза мышей) с помощью антитела S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) в комбинации с эквивалентным количеством антитела S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83). Для коктейлей из антител концентрация, показанная на оси x, равна концентрации отдельных антител. См. пример 4.

На фиг. 37 показана нейтрализация SARS-CoV2-MLV с помощью антитела S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) в сочетании с эквимолярным количеством антител S315 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182). Для коктейлей из антител концентрация, показанная на оси x, равна концентрации отдельных антител. См. пример 4.

На фиг. 38A-38D показано связывание определенных антител с RBD SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1, как описано в примере 6. Антитела экспрессировали рекомбинантно и связывание анализировали с использованием ELISA. 96-луночные планшеты для ELISA покрывали RBD SARS-CoV-2 (полученный собственными силами; остатки 331-550 спайк-белка из BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947) при 10 мкг/мл и RBD SARS-CoV-1 (Sino Biological, 40150-V08B1) при 1 мкг/мл. После блокирования 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) в PBS (фосфатно-солевой буфер) антитела добавляли в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты промывали и добавляли вторичные антитела козы против IgG-AP человека (Southern Biotechnology, 2040-04). Субстрат п-нитрофинилфосфат (pNPP, Sigma-Aldrich, 337 71768) использовали для создания цвета. OD405 анализировали на планшетном ридере ELx808IU (Biotek). Слева на каждой фигуры показано связывание с RBD SARS-CoV-2, а справа показано связывание с RBD SARS-CoV-1.

На фиг. 39А и 39В показано связывание определенных антител со спайк-белком SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1, как описано в примере 9. Клетки Expi-CHO временно трансфицировали phCMV1-SARS-CoV-2-S, SARS-спайк-pcDNA (ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) елонирующая плазмиду).3 (штамм SARS) или пустой phCMV1 с использованием Expifectamine CHO Enhancer. Через два дня после трансфекции клетки собирали для иммуноокрашивания антителами. Для обнаружения использовали меченный Alexa647 вторичное антитело против Fc IgG человека. Связывание антител с трансфицированными клетками анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием клеточного анализатора ZE5 (BioRad). На фиг. 39A показано связывание рекомбинантного антитела S300 (VH: SEQ ID NO:1; VL: SEQ ID NO:5). На фиг. 39B показано связывание рекомбинантного антитела S307. Символы показывают значения одного измерения. Слева на каждой фигуре показаны данные, представленные как % положительных клеток, а на правой панели показаны данные, представленные как средняя интенсивность флуоресценции (MFI).

На фиг. 40A и 40B показано связывание типовых антител с S-гликопротеинами SARS-CoV-2 (фиг. 40A) или SARS-CoV-1 (фиг. 40B), экспрессируемыми на поверхности клеток ExpiCHO, как описано в примере 9. Символы представляют собой повторности одного эксперимента.

На фиг. 41A и 41B показаны аффинность связывания и авидность IgG S309 (фиг. 41A) и Fab S309 (фиг. 41B) по отношению к RBD SARS-CoV-2 (сверху) или спайк-белку SARS-CoV-2 (снизу). Как для IgG, так и для Fab: VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168. См. Пример 11. Биотинилированный RBD SARS-CoV-2 или биотинилированный префузионный тример S-эктодомена SARS-CoV-2 загружали в биосенсоры стрептавидина и измеряли ассоциацию различных концентраций S309-IgG-MLNS (содержащего мутации M428L и N434S Fc (нумерация EU)) или Fab S309. Вертикальные пунктирные линии указывают на начало фазы диссоциации, когда биосенсоры были переключены на буфер.

На фиг. 42А И 42В показано связывание антител S303, S304, S306, S309, S310 и S315, наряду со сравнительными антителами S110, S124, S230 и S109, с S-белком, экспрессируемым на поверхности клетки. См. пример 9. На фиг.42A показано связывание с клетками ExpiCHO, трансфицированными S-белком SARS-CoV-2. На фиг. 42В показано связывание с клетками ExpiCHO, трансфицированными S-белком SARS-CoV-1. Среднюю интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии для каждого антитела. Исследованные концентрации антител указаны по оси X.

На фиг. 43 показано сохранение остатков спайк-белка, как описано в примере 21. Варианты спайк-белка, подтверждаемые по меньшей мере двумя последовательностями, как указано, сферами, отображенными в закрытой (слева) и открытой (справа) форме полного тримерного спайк-эктодомена. RBD и другие домены спайк-белка показаны как указано. Показаны 171 вариант (из 11 839 проанализированных последовательностей спайк-белка).

На фиг. 44A-44C показан отбор на устойчивость к SARS-CoV-2, как описано в примере 23. На фиг. 44А показана блок-схема, иллюстрирующая способ отбора на устойчивость. На фиг. 44B показана временная шкала, иллюстрирующая процедуру, используемую для каждого пассажа процесса отбора на устойчивость. На фиг. 44C показаны результаты отбора на устойчивость SARS-CoV-2 к антителу S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащего VH согласно SEQ ID NO:113 и VL согласно SEQ ID NO:168, с мутациями G236A, A330L, I332E, M428L и N434S в Fc (нумерация EU).

На фиг. 45 показана антителозависимая цитотоксичность некоторых антител по настоящему изобретению с использованием первичных NK-клеток в качестве эффекторных клеток и SARS-CoV-2-экспрессирующих клеток ExpiCHO в качестве клеток-мишеней. См. пример 14. На графике показан процент уничтожения клеток-мишеней после инкубации с антителами S309 LS (также называемое в настоящем документе S309 MLNS), S309 GRLR (G236R/L328R; вариант, не связывающий FcR) или S309 LS GAALIE (также называемое в настоящем документе S309 MLNS GAALIE, содержащем мутации Fc G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация EU)).

На фиг. 46 показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 в клетках легких человека Calu-3 (клеточная линия рака легкого человека) и клетках VeroE6 с помощью антитела S309 N55Q MLNS, как описано в примере 24.

На фиг. 47 показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью антитела S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), как обнаружено с помощью нанолюциферазного анализа. См. пример 25. Ось X показывает концентрацию антител. Три кривые представляют собой анализы с использованием трех различных концентраций вируса в единицах MOI (множественность инфекции), как показано на рисунке справа. Данные собирали через шесть часов после инфицирования вирусом SARS-CoV-2. Рассчитанные значения IC50 (концентрация полумаксимального ингибирования) для каждого MOI показаны в полях под графиком.

На фиг. 48A и 48B показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью антитела S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), как проанализировано с помощью IFA (иммунофлюоресцентный анализ). См. пример 25. Данные собирали через шесть часов после инфицирования вирусом SARS-CoV-2. На фиг. 48А показаны фотографии репрезентативных лунок, на которых ядра клеток окрашивали синим цветом, а нуклеокапсиды SARS-CoV-2 окрашивали красным цветом, что более ярко проявляется на фотографиях. Каждое красное пятно на каждом изображении представляет собой отдельную инфицированную клетку. Нейтрализация инфекции с помощью антитела S309 может наблюдаться как уменьшение количества ярких пятен, указывающих на инфицированные клетки, так как концентрация S309 была увеличена. Концентрации антител показаны сверху, а концентрации вирусов в единицах MOI (множественность инфекции) показаны слева. На фиг. 48B показаны количественные данные из анализа IFA. Рассчитанные значения IC50 для каждого MOI показаны в полях под графиком.

На фиг. 49 показана нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью антител S309 N55Q LS (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S (нумерация EU)) и S309 N55Q LS GAALIE (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащего мутации Fc G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация ЕС)). См. пример 26. Каждый из S309 N55Q LS и S309 N55Q LS GAALIE содержит VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Данные представляют собой среднее значение четырех повторностей, +/- стандартное отклонение. Показанный график является репрезентативным для трех независимых экспериментов.

На фиг. 50A и 50B показана нейтрализация инфекции псевдотипированными SARS-CoV-2 вирусами с использованием антител S309 N55Q LS (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S (нумерация EU)) (фиг. 50A) и S309 N55Q LS GAALIE (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащего мутации Fc G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация EU)) (фиг. 50B). См. пример 27. Псевдотипированные вирусы представляют собой псевдотипированные VSV со спайк-белком SARS-CoV-2. Данные представляют собой среднее значение четырех повторностей, +/- стандартное отклонение. Каждый показанный график является репрезентативным для четырех независимых экспериментов.

На фиг. 51A и 51B показано связывание антител S309 N55Q MLNS (фиг. 51A) и S309 N55Q MLNS GAALIE (фиг. 51B) с RBD SARS-CoV-2, измеренное с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). См. пример 28. Значения взяты из двух независимых экспериментов.

На фиг. 52A и 52B показано связывание антител S309 N55Q LS (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S (нумерация EU)) (фиг. 52A) и S309 N55Q LS GAALIE (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащего мутации Fc G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация EU)) (фиг. 52B) с экспрессируемым на поверхности клетки спайк-белком SARS-CoV-2, как измерено с помощью проточной цитометрии. См. пример 29. Данные выражены в виде процента клеток, идентифицированных как положительные на связывание антител. Представленные результаты получены в ходе одного эксперимента и являются репрезентативными для трех независимых отдельных проведенных экспериментов.

На фиг. 53 показано связывание антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE с FcγRIIa человека (как аллеля R131 с низкой аффинностью, так и H131 с высокой аффинностью), FcγRIIIa (как аллеля F158 с низкой аффинностью, так и V158 с высокой аффинностью) и FCγRIIb с использованием SPR. См. пример 30. Биотинилированные очищенные FcγR захватывали на поверхности сенсорного чипа перед инъекцией антитела. Профили ассоциации и диссоциации (разделенные вертикальной пунктирной линией на каждом графике) измеряли в режиме реального времени как изменение сигнала SPR.

На фиг. 54 показано связывание антител S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе S309 MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S), S309 N55Q (VH: SEQ ID NO:113; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S (нумерация EU)) и S309 N55Q LS GAALIE (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащего мутации Fc G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация EU)) с компонентом комплемента C1q, что измеряется с помощью BLI на приборе Octet. См. пример 31. Профили ассоциации и диссоциации (разделенные вертикальной пунктирной линией на графике) измеряли в режиме реального времени как изменение интерференционной картины.

На фиг. 55A-55D показана активация in vitro FcγR человека антителами S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе S309 MLNS, содержащим мутации Fc M428L/N434S), S309 N55Q (VH: SEQ ID NO:113; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе как S309 N55Q MLNS, содержащим мутации Fc M428L/N434S) (нумерация EU) и S309 N55Q LS GAALIE (также называемое настоящем документе S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащим мутации Fc G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация EU), наряду с отрицательным контролем антител S309 GRLR. См. пример 32. Клетки CHO, стабильно трансфицированные спайк-белком SARS-CoV-2, служили в качестве мишеней антител. Серийные разведения антитела инкубировали с клетками-мишенями при комнатной температуре в течение 15 минут. Эффекторные клетки Jurkat, экспрессирующие указанный FcγR и сконструированные с помощью NFAT-опосредованного репортера люциферазы, ресуспендировали в буфере для анализа, а затем добавляли в планшеты для анализа. После инкубации при 37°С в течение 18 часов добавляли реагент для люциферазного анализа Bio-Glo™ (Promega) и количественно определяли люминесценцию с помощью лиминометра (Bio-Tek). На графиках показана активация FcγRIIa человека (сверху слева), FcγRIIb (сверху справа), FcγRIIIa аллеля F158 с низкой аффинностью (снизу слева) и FCγRIIb аллеля V158 с высокой аффинностью (снизу справа). Показаны средние значения +/- стандартного отклонения повторностей.

На фиг. 56A и 56B показано опосредованное NK-клетками уничтожение (ADCC) клеток, экспрессирующих спайк-белок SARS-CoV-2, in vitro в присутствии антител S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе S309 MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S), S309 N55Q (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S (нумерация EU)) или S309 N55Q LS GAALIE (также называемое в настоящем документе как S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащего Fc мутации G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация EU)) или контрольного антитела S309 GRLR. См. пример 33. Серийные разведения антитела (серийно разбавленные в 10 раз в среде AIM-V от 40 000 нг/мл до 0,075 нг/мл) инкубировали с клетками CHO-CoV-2 со спайк-белком в течение 10 минут перед смешиванием с NK-клетками в течение 4 часов. NK-клетки свежевыделены от двух доноров, ранее генотипированных для гомозиготной экспрессии низкой аффинности (F/F158; фиг. 56A) или высокой аффинности (V/V158; фиг. 56B). ADCC измеряли с использованием анализа высвобождения LDH (лактатдегидрогеназа). Показаны средние значения +/- стандартное отклонение четырех повторностей.

На фиг. 57 показан моноцит-опосредованный фагоцитоз (ADCC) клеток, экспрессирующих спайк-белок SARS-CoV-2, in vitro в присутствии антител S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе S309 MLNS, содержащего мутации Fc M428L/N434S), S309 N55Q (VH: SEQ ID NO:113; VL: SEQ ID NO:168) LS (также называемое в настоящем документе S309 N55Q MLNS, содержащего мутации Fc M428L и N434S (нумерация EU)) или S309 N55Q LS GAALIE (также называемое в настоящем документе как S309 N55Q MLNS GAALIE, содержащего Fc мутации G236A, A330L, I332E, M428L и N434S (нумерация EU)) или контрольного антитела S309 GRLR. См. пример 33. Антитела инкубировали с PKH67-мечеными клетками со спайк-белком CHO-CoV-2-в течение 10 минут перед смешиванием со свежевыделенными клетками PBMC, меченными Cell Trace Violet. Активность ADCP измеряли после инкубации в течение ночи с помощью проточной цитометрии в процентах от CD14+ моноцитов, которые были двойными положительными в отношении PKH67 и cell trace violet. Показаны средние значения +/- стандартного отклонения повторностей.

На фиг. 58A и 58B показано, что антитело S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) ингибирует слияние клеток, опосредованное спайк-белком SARS-CoV-2. См. пример 34. На фиг. 58A показаны микрофотографии клеток, сконструированных для сверхэкспрессии спайк-белка SARS-CoV-2 в присутствии (снизу) или в отсутствии (сверху) S309. На фиг. 58B показаны количественные данные из анализа ингибирования слияния при различных концентрациях антитела.

На фиг. 59 представлены данные анализа на бляшкообразующие единицы; (FFU), демонстрирующие, что вариант антител S309 N55Q не вызывают опосредованного антителами усиления репликации SARS-CoV-2 в PBMC, полученных от доноров, или дендритных клетках человека. См. пример 35.

На фиг. 60 показана экспрессия (иммунофлуоресценция) трансгенов DC-SIGN (молекулы межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина)/L-SIGN (молекула межклеточной адгезии клеток печени/лимфатического узла 3-захватывающего неинтегрина), DC-SIGN и ACE2 в клетках HEK293T (эмбриональная почка человека 293, экспрессирующая большой Т-антиген SV40), сконструированных для сверхэкспрессии указанного белка. См. пример 37.

На фиг. 61 показаны уровни инфекции псевдовирусом VSV в клетках HEK293T дикого типа и в клетках HEK293T, сконструированных для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN или ACE2. Псевдовирус экспрессировал рекомбинантный спайк-белок SARS-CoV-2 с репортером люциферазы. См. пример 37.

На фиг. 62 показана нейтрализация моноклональным антителом S309 (VH SEQ ID NO:105, VL SEQ ID NO:168) инфекции псевдовирусом VSV в клетках HEK293T, сконструированных для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN или ACE2. В этом примере антитело S309 содержит мутации Fc M428L и N434S (нумерация EU). См. пример 37.

На фиг. 63 показаны уровни инфекции живым SARS-CoV-2 в клетках HEK293T дикого типа и в клетках HEK293T, сконструированных для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN или ACE2. Инфекцию определяли с использованием рекомбинантного S-белка с репортером люциферазы. См. пример 37.

На фиг. 64 показана нейтрализация примерным моноклональным антителом S309 (VH SEQ ID NO:105, VL SEQ ID NO:168) инфекции живым SARS-CoV-2 в клетках HEK293T, сконструированных для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN или ACE2. В этом примере антитело S309 содержит мутации Fc M428L и N434S (нумерация EU). См. пример 37.

На фиг. 65показана экспрессия (иммунофлуоресценция) трансгенов L-SIGN, DC-SIGN, SIGLEC1 и ACE2 в клетках HEK293T, сконструированных для сверхэкспрессии указанного белка (белков). См. пример 37.

На фиг. 66 показаны уровни инфекции живым SARS-CoV-2 в клетках HEK293T дикого типа и в клетках HEK293T, сконструированных для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2. Инфекцию определяли с использованием рекомбинантного S-белка с репортером люциферазы. См. пример 37.

На фиг. 67 показана нейтрализация примерным моноклональным антителом S309 (VH SEQ ID NO:105, VL SEQ ID NO:168) инфекции живым вирусом SARS-CoV-2 в клетках HEK293T, сконструированных для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2. В этом примере антитело S309 содержит мутации Fc M428L и N434S (нумерация EU). См. пример 37.

На фиг. 68A и 68B показан анализ экспрессии рецепторных белков, включая белки CD209 (DC-SIGN) и SIGLEC в нескольких типах клеток. Размер точки коррелирует с процентом клеток указанного типа, которые экспрессируют белок, а интенсивность затенения точки коррелирует с уровнем экспрессии белка. См. пример 37.

На фиг. 69 показана инфекция, вызванная живым SARS-CoV-2, экспрессирующим N-люциферазу в клетках HEK293T («исходные») или клетках HEK293T, стабильно экспрессирующих DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2. Данные представляют собой эксперименты по тестированию SARS-CoV-2 при трех множественностях инфекций (MOI). См. пример 37.

На фиг. 70 показана инфекция VSV псевдотипированным SARS-CoV-2 в клетках HEK293T, клетках HeLa и клетках MRC5, временно трансдуцированных лентивирусом для экспрессии DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2. Неинфицированные клетки показаны как отрицательный контроль. См. пример 37.

На фиг. 71A и 71B показано связывание (измеренное с помощью биослойной интерферометрии) S309, S309 N55Q MLNS, S309 N55Q MLNS GAALIE (фиг. 71A) и сравнительных антител REGN10933 и REGN10987 (фиг. 71B) дикого типа с мутировавшими вариантами RBD. См. пример 39.

На фиг. 72 показана нейтрализация SARS-CoV-2 ("WT" представляет собой Wuhan-Hu-1; "UK" представляет собой SARS-CoV-2 вариант B.1.1.7; и "SA" представляет собой вариант B.1.351) псевдовируса MLV в клетках Vero-E6 с помощью антител S309, как описано в примере 39. Также оценивали сравнительные антитела REGN10987, REGN10933 и комбинацию REGN10987 + REGN10933.

На фиг. 73A-73D показано, что S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) обеспечивает надежную защиту против инфекции in vivo SARS-CoV-2. Сирийским хомякам вводили указанное количество mAb за 48 часов до интраназальной инфекции SARS-CoV-2. (A) Количественное определение вирусной РНК (рибонуклеиновая кислота) в легких через 4 дня после инфицирования. (B) Количественное определение реплицирующего вируса в гомогенатах легких, собранных через 4 дня после инфицирования с использованием анализа TCID50 (доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток). (C) Гистологический показатель легочной ткани оценивали через 4 дня после инфицирования. (D) Концентрация mAb, измеренная в сыворотке до инфицирования (день 0), обратно коррелирует с вирусной нагрузкой РНК в легком через 4 дня после инфицирования. См. пример 38.

Подробное описание изобретения

В настоящем документе предложены антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые способны связываться с SARS-CoV-2 (например, с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 и/или RBD, как описано в настоящем документе, в вирионе SARS-CoV-2 и/или экспрессируемыми на поверхности клетки-хозяина, такой как клетка, инфицированная SARS-CoV-2). Клетка-хозяин может представлять собой, например, клетку легкого, клетку СНО (такую как, например, клетка ExpiCHO, трансфицированная для экспрессии поверхностного гликопротеина) или т. п. В некоторых вариантах осуществления раскрытые в настоящем документе антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 на модели инфекции in vitro и/или у субъекта-человека. Также предложены полинуклеотиды, кодирующие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, векторы, клетки-хозяева и связанные композиции, а также способы применения антител, нуклеиновых кислот, векторов, клеток-хозяев и связанных композиций для лечения (например, уменьшения, задержки, устранения или предотвращения) инфекции SARS-CoV-2 у субъекта и/или для получения лекарственного средства для лечения инфекции SARS-CoV-2 у субъекта.

Прежде чем излагать это изобретение более подробно, может быть полезно для его понимания дать определения некоторых терминов, которые будут использоваться в настоящем документе. Дополнительные определения представлены на протяжении всего данного описания изобретения.

В контексте настоящего документа "SARS-CoV-2", также называемый в настоящем документе "уханьский коронавирус" или "уханьский вирус пневмонии рынка морепродуктов", или "уханьский CoV", или "новый CoV", или "nCoV", или "2019 nCoV", или "уханьский nCoV", представляет собой бетакоронавирус, предположительно принадлежащий к роду B (сарбековирус). SARS-CoV-2 был впервые выявлен в Ухане, провинция Хубэй, Китай, в конце 2019 года и распространился в Китае и других частях мира к началу 2020 года. Симптомы SARS-CoV-2 включают лихорадку, сухой кашель и одышку.

Геномная последовательность изолята SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 представлена в SEQ ID NO:163 (см. также GenBank MN908947.3, 23.01.2020), а аминокислотная трансляция генома представлена в SEQ ID NO:164 (см. также GenBank QHD43416.1, 23.01.2020). Как и другие коронавирусы (например, SARS CoV), SARS-CoV-2 содержит трансмембранный гликопротеин I типа "спайк" или поверхностный ("S"), содержащий рецептор-связывающий домен (RBD). Считается, что RBD опосредует проникновение коронавируса SARS линии B в клетки эпителия дыхательных путей путем связывания с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2). В частности, считается, что рецептор-связывающий мотив (RBM) в RBD вируса взаимодействует с ACE2.

Аминокислотная последовательность поверхностного гликопротеина (S) SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 представлена в SEQ ID NO:165. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению способны связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS CoV-2, таким как Wuhan-Hu-1. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом в RBD S-белка Wuhan-Hu-1.

Аминокислотная последовательность RBD SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 представлена в SEQ ID NO:166. S-белок SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 имеет приблизительно 73% идентичности с аминокислотной последовательностью с S-белком SARS-CoV. Аминокислотная последовательность RBM SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 представлена в SEQ ID NO:167. SARS-CoV-2 RBD имеет сходство аминокислотной последовательности приблизительно от 75 до 77% с RBD коронавируса SARS, а SARS-CoV-2 Wuhan Hu-1RBM имеет сходство аминокислотной последовательности приблизительно 50% с RBM коронавируса SARS.

Если в настоящем документе не указано иное, SARS-CoV-2 Wuhan Hu-1 относится к вирусу, содержащему аминокислотную последовательность, представленную в любой одной или более из SEQ ID NO:164, 165 и 166, необязательно с геномной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:163.

Существует ряд новых вариантов SARS-CoV-2. Некоторые варианты SARS-CoV-2 содержат мутацию N439K, которая обладает повышенной аффинностью связывания с рецептором ACE2 человека (Thomson, E.C., и др., The circulating SARS-CoV-2 spike variant N439K maintains fitness while evading antibody-mediated immunity. bioRxiv, 2020). Некоторые варианты SARS-CoV-2 содержат мутацию N501Y, которая связана с повышенной трансмиссивностью, включая линии B.1.1.7 (также известные как 20I/501Y.V1 и VOC 202012/01; (мутации del69-70, del144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, и D1118H)) и B.1.351 (также известные как 20H/501Y.V2; мутации L18F, D80A, D215G, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G и A701V), которые были обнаружены в Великобритании и Южной Африке, соответственно (Tegally,H., и др. al, Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Africa. medRxiv, 2020: p. 2020.12.21.2024864; Leung, K., и др., Early empirical assessment of the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2 in the United Kingdom, October to November 2020. medRxiv, 2020: p. 2020.12.20.20248581). B.1.351 также содержит две другие мутации в домене RBD спайк-белка SARS-CoV2, K417N и E484K (Tegally, H., и др., Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Africa. medRxiv, 2020: p. 2020.12.21.202486400). Другие варианты SARS-CoV-2 включают линию B.1.1.28, которая была впервые зарегистрирована в Бразилии; вариант P.1, линия B.1.1.28 (также известная как 20J/501Y.V3), который был впервые зарегистрирован в Японии; вариант L452R, который был впервые зарегистрирован в Калифорнии в Соединенных Штатах (Pan American Health Organization, Epidemiological update: Occurrence of variants of SARS-CoV-2 in the Americas, January 20, 2021, доступно на reliefweb.int/sites/reliefweb.int/files/resources/2021-jan-20-phe-epi-update-SARS-CoV-2.pdf). Другие варианты SARS-CoV-2 включают SARS CoV-2 из группы 19A; SARS CoV-2 из группы 19B; SARS CoV-2 из группы 20A; SARS CoV-2 из группы 20B; SARS CoV-2 из группы 20C; SARS CoV-2 из группы 20D; SARS CoV-2 из группы 20E (EU1); SARS CoV-2 из группы 20F; SARS CoV-2 из группы 20G; и SARS CoV-2 B1.1.207; и другие линии SARS CoV-2, описанные в Rambaut, A., и др., A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2 lineages to assist genomic epidemiology. Nat Microbiol 5, 1403-1407 (2020). Вышеуказанные варианты SARS-CoV-2 и их аминокислотные и нуклеотидные последовательности включены в настоящий документ посредством ссылки.

В настоящем описании любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон отношений или целочисленный диапазон, приведенные в настоящем документе, следует понимать как включающие значение любого целого числа в пределах указанного диапазона и, когда это необходимо, его фракций (таких как одна десятая и одна сотая целое число), если не указано иное. Кроме того, любой диапазон чисел, указанных в настоящем документе, относящийся к любому физическому признаку, такому как полимерные субъединицы, размер или толщина, следует понимать как включающее любое целое число в пределах указанного диапазона, если не указано иное. В контексте настоящего документа «около» означает ±20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное. Следует понимать, что термины в единственном числе в контексте настоящего документа подразумевают "один или более" из перечисленных терминов. Таким образом, использование альтернативы (например, «или») следует понимать как одну, обе или любую комбинацию этих альтернатив. В контексте настоящего документа "включать", "иметь" и "содержать" используются как синонимы, а эти термины и их варианты следует рассматривать как неограничивающие.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что описанный далее элемент, компонент, событие или обстоятельство необязательно должно иметь место, и что описание включает случаи, в которых элемент, компонент, событие или обстоятельство имеет место, и случаи, когда их нет.

Кроме того, следует понимать, что отдельные конструкции или группы конструкций, полученные из различных комбинаций структур и субъединиц, описанных в настоящей заявке, раскрыты в настоящей заявке в той же степени, как если бы каждая конструкция или группа конструкций была изложена отдельно. Таким образом, выбор конкретных структур или конкретных субъединиц находится в пределах объема настоящего изобретения.

Термин «состоящий по существу из» не эквивалентен термину «содержащий» и относится к указанным материалам или стадиям формулы изобретения или к тем, которые не оказывают существенного влияния на основные характеристики заявленного объекта изобретения. Например, белковый домен, область или модуль (например, связывающий домен) или белок "состоит по существу из" конкретной аминокислотной последовательности, когда аминокислотная последовательность домена, области, модуля или белка включает удлинения, делеции, мутации или их комбинацию (например, аминокислоты на амино- или карбоксиконце или между доменами), которые в комбинации вносят вклад не более чем в 20% (например, не более 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%) длины домена, области, модуля или белка и по существу не влияют (т.е., не снижают активность более чем на 50%, например, не более чем на 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1%) на активность домена (доменов), области (областей), модуля (модулей) или белка (например, на аффинность связывания с мишенью связывающего белка).

В контексте настоящего документа "аминокислота" относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые впоследствии модифицируются, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота, то есть, α-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которая функционирует аналогично встречающейся в природе аминокислоте.

В контексте настоящего документа "мутация" относится к изменению последовательности молекулы нуклеиновой кислоты или молекулы полипептида по сравнению с эталонной молекулой или молекулой нуклеиновой кислоты дикого типа или молекулой полипептида, соответственно. Мутация может привести к нескольким различным типам изменения последовательности, включая замену, вставку или делецию нуклеотида (нуклеотидов) или аминокислоты (аминокислот).

"Консервативная замена" относится к аминокислотным заменам, которые существенно не влияют или не изменяют характеристики связывания конкретного белка. Как правило, консервативные замены представляют собой замены, в которых замещенный аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. Консервативные замены включают замену, основанную на одной из следующих групп: группа 1: аланин (Ala или A), глицин (Gly или G), серин (Ser или S), треонин (Thr или T); группа 2: аспарагиновая кислота (Asp или D), глутаминовая кислота (Glu или Z); группа 3: аспарагин (Asn или N), глутамин (Gln или Q); группа 4: аргинин (Arg или R), лизин (Lys или K), гистидин (His или H); группа 5: изолейцин (Ile или I), лейцин (Leu или L), метионин (Met или M), валин (Val или V); и группа 6: фенилаланин (Phe или F), тирозин (Tyr или Y), триптофан (Trp или W). Дополнительно или альтернативно, аминокислоты могут быть сгруппированы в консервативные группы замещения по аналогичной функции, химической структуре или составу (например, кислотные, основные, алифатические, ароматические или серосодержащие). Например, алифатическая группа может включать, для целей замены, Gly, Ala, Val, Leu и Ile. Другие группы консервативных замен включают: серосодержащие: Met и цистеин (Cys или C); кислые: Asp, Glu, Asn и Gln; небольшие алифатические, неполярные или слегка полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и большие ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Дополнительную информацию можно найти в Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company.

В контексте настоящего документа "белок" или "полипептид" относится к полимеру аминокислотных остатков. Белки применяются к встречающимся в природе аминокислотным полимерам, а также к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков являются искусственными химическими миметиками соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, и не встречающимся в природе аминокислотным полимерам. Также рассматриваются варианты белков, пептидов и полипептидов согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления варианты белков, пептидов и полипептидов содержат или состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентична аминокислотной последовательности определенной или эталонной аминокислотной последовательности, как описано в настоящем документе.

"Молекула нуклеиновой кислоты" или "полинуклеотид" или "полинуклеиновая кислота" относится к полимерному соединению, включающему ковалентно связанные нуклеотиды, которые могут состоять из природных субъединиц (например, пуриновые или пиримидиновые основания) или неприродных субъединиц (например, морфолиновое кольцо). Пуриновые основания включают аденин, гуанин, гипоксантин и ксантин, а пиримидиновые основания включают урацил, тимин и цитозин. Молекулы нуклеиновой кислоты включают полирибонуклеиновую кислоту (РНК), которая включает мРНК (матричная РНК), микроРНК, миРНК (малая интерферирующая РНК), вирусную геномную РНК и синтетическую РНК, и полидезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), которая включает кДНК (комплементарная ДНК), геномную ДНК и синтетическую ДНК, каждая из которых может быть одноцепочечной или двухцепочечной. В случае одноцепочечной цепи молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую) цепь. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотную последовательность, включает все нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность. Некоторые варианты нуклеотидных последовательностей могут также включать интрон (интроны) в той степени, в которой интрон (интроны) будет удален с помощью ко- или посттранскрипционных механизмов. Другими словами, различные нуклеотидные последовательности могут кодировать одну и ту же аминокислотную последовательность в результате избыточности или вырожденности генетического кода или путем сплайсинга.

Также рассматриваются варианты молекул нуклеиновых кислот по данному описанию. Варианты молекул нуклеиновой кислоты имеют по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90% и предпочтительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичности с молекулой нуклеиновой кислоты определенного или эталонного полинуклеотида, как описано в настоящем документе, или которые гибридизуются с полинуклеотидом в жестких условиях гибридизации, составляющих 0,015 М хлорида натрия, 0,0015 М цитрата натрия при около 65-68°C или 0,015 М хлорида натрия, 0,0015 М цитрата натрия и 50% формамида при около 42°C. Варианты молекул нуклеиновых кислот сохраняют способность кодировать их связывающий домен, имеющий функциональность, описанную в настоящем документе, такую как связывание молекулы-мишени.

"Процент идентичности последовательностей" относится к взаимосвязи между двумя или более последовательностями, как определено путем сравнения последовательностей. Предпочтительные способы определения идентичности последовательностей предназначены для обеспечения наилучшего соответствия между сравниваемыми последовательностями. Например, последовательности выровнены для целей оптимального сравнения (например, гэпы могут быть введены в одну или обе из первой и второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности для оптимального выравнивания). Кроме того, негомологичные последовательности могут быть проигнорированы для целей сравнения. Процент идентичности последовательности, указанный в настоящем документе, рассчитывают по длине эталонной последовательности, если не указано иное. Способы определения идентичности и сходства последовательностей можно найти в общедоступных компьютерных программах. Выравнивание последовательностей и расчеты процента идентичности могут быть выполнены с использованием программы BLAST (например, BLAST 2.0, BLASTP, BLASTN или BLASTX). Математический алгоритм, используемый в программах BLAST, можно найти в Altschul и др., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997. В контексте настоящего документа следует понимать, что для анализа при применении аналитического программного обеспечения результаты анализа основаны на «установленных по умолчанию значениях» упоминаемой программы. «Установленные по умолчанию значения» означают любой набор значений или показателей, загружаемых исходно с программным обеспечением при первом запуске.

Термин «выделенный» означает, что материал извлечен из своего исходного окружения (например, природной среды, если он встречается в естественных условиях). Например, встречающаяся в природе нуклеиновая кислота или полипептид, присутствующий в живом животном, не является выделенным, но та же нуклеиновая кислота или полипептид, отделенный от материалов, совместно с ним присутствующих в естественной системе, является выделенным. Такая нуклеиновая кислота может быть частью вектора и/или такая нуклеиновая кислота или полипептид могут быть частью композиции (например, клеточного лизата) и все еще могут быть выделены в том смысле, что такой вектор или композиция не является частью природной среды для нуклеиновой кислоты или полипептида. "Выделенный" может, в некоторых вариантах осуществления, также описывать антитело, антигенсвязывающий фрагмент, полинуклеотид, вектор, клетку-хозяина или композицию, которая находится вне организма человека.

Термин "ген" означает сегмент ДНК или РНК, участвующий в получении полипептидной цепи; в некоторых контекстах он включает области, предшествующие и следующие за кодирующей областью (например, 5’-нетранслируемая область (UTR) и 3’-UTR), а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

"Функциональный вариант" относится к полипептиду или полинуклеотиду, который структурно схож или по существу структурно схож с исходным или эталонным соединением согласно настоящему изобретению, но незначительно отличается по составу (например, одно основание, атом или функциональная группа отличаются, добавлены или удалены), так что полипептид или кодируемый полипептид способен выполнять по меньшей мере одну функцию исходного полипептида с по меньшей мере 50% эффективностью, предпочтительно по меньшей мере 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% или 100% уровнем активности исходного полипептида. Другими словами, функциональный вариант полипептида или кодируемого полипептида согласно настоящему изобретению имеет "сходное связывание", "сходную аффинность" или "сходную активность", когда функциональный вариант демонстрирует снижение производительности в выбранном анализе не более чем на 50% по сравнению с исходным или эталонным полипептидом, таким как анализ для измерения аффинности связывания (например, окрашивание Biacore® или тетрамером, измеряющее константу ассоциации (K_a) или диссоциации (K_D)).

В контексте настоящего документа "функциональная часть" или "функциональный фрагмент" относится к полипептиду или полинуклеотиду, который содержит только домен, часть или фрагмент исходного или эталонного соединения, и полипептид или кодируемый полипептид сохраняет по меньшей мере 50% активность, связанную с доменом, частью или фрагментом исходного или эталонного соединения, предпочтительно по меньшей мере 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% или 100% уровень активности исходного полипептида, или обеспечивает биологическое преимущество (например, эффекторную функцию). «Функциональная часть» или «функциональный фрагмент» полипептида или кодируемого полипептида согласно настоящему изобретению имеет «аналогичное связывание» или «аналогичную активность», когда функциональная часть или фрагмент демонстрирует снижение производительности в выбранном анализе не более чем на 50% по сравнению с исходным или эталонным полипептидом (предпочтительно не более чем на 20% или 10%, или не более чем на логарифмическую (log) разницу по сравнению с исходным или эталонным по отношению к аффинности).

В контексте настоящего документа термин "сконструированный", "рекомбинантный" или "неприродный" относится к организму, микроорганизму, клетке, молекуле нуклеиновой кислоты или вектору, который включает по меньшей мере одно генетическое изменение или был модифицирован путем введения экзогенной или гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, где такие изменения или модификации вводятся с помощью генной инженерии (т.е.вмешательства человека). Генетические изменения включают, например, модификации, вводящие экспрессируемые молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие функциональную РНК, белки, слитые белки или ферменты, или другие добавления, делеции, замены молекул нуклеиновых кислот или другие функциональные нарушения генетического материала клетки. Дополнительные модификации включают, например, некодирующие регуляторные области, в которых модификации изменяют экспрессию полинуклеотида, гена или оперона.

В контексте настоящего документа термин "гетерологичный" или "неэндогенный" или "экзогенный" относится к любому гену, белку, соединению, молекуле нуклеиновой кислоты или активности, которая не является нативной для клетки-хозяина или субъекта, или любому гену, белку, соединению, молекуле нуклеиновой кислоты или активности, которая является нативной для клетки-хозяина или субъекта, который был изменен. Гетерологичные, неэндогенные или экзогенные включают гены, белки, соединения или молекулы нуклеиновых кислот, которые были мутированы или иным образом изменены таким образом, что структура, активность или и то и другое различаются между нативными и измененными генами, белками, соединениями или молекулами нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления гетерологичные, неэндогенные или экзогенные гены, белки или молекулы нуклеиновых кислот (например, рецепторы, лиганды и т.д.) могут быть неэндогенными для клетки-хозяина или субъекта, но вместо этого нуклеиновые кислоты, кодирующие такие гены, белки или молекулы нуклеиновых кислот, могут быть добавлены в клетку-хозяина путем конъюгации, трансформации, трансфекции, электропорации или тому подобного, где добавленная молекула нуклеиновой кислоты может интегрироваться в геном клетки-хозяина или может существовать в виде внехромосомного генетического материала (например, в виде плазмиды или другого самовоспроизводящегося вектора). Термин "гомологичный" или "гомолог" относится к гену, белку, соединению, молекуле нуклеиновой кислоты или активности, обнаруженной в или полученной из клетки-хозяина, вида или штамма. Например, гетерологичный или экзогенный полинуклеотид или ген, кодирующий полипептид, может быть гомологичным нативному полинуклеотиду или гену и кодировать гомологичный полипептид или активность, но полинуклеотид или полипептид может иметь измененную структуру, последовательность, уровень экспрессии или любую их комбинацию. Неэндогенный полинуклеотид или ген, а также кодируемый полипептид или активность могут быть из одного и того же вида, другого вида или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты или ее часть, нативная для клетки-хозяина, будет считаться гетерологичной по отношению к клетке-хозяину, если она была изменена или мутирована, или молекула нуклеиновой кислоты, нативная для клетки-хозяина, может считаться гетерологичной, если она была изменена с помощью гетерологичной последовательности контроля экспрессии или была изменена с помощью эндогенной последовательности контроля экспрессии, обычно не связанной с молекулой нуклеиновой кислоты, нативной для клетки-хозяина. Кроме того, термин "гетерологичный" может относиться к биологической активности, которая отличается, изменена или не эндогенна для клетки-хозяина. Как описано в настоящем документе, более чем одна гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в клетку-хозяина в виде отдельных молекул нуклеиновой кислоты, в виде множества индивидуально контролируемых генов, в виде молекулы полицистронной нуклеиновой кислоты, в виде одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или антигенсвязывающий фрагмент (или другой полипептид), или любую их комбинацию.

В контексте настоящего документа термин "эндогенный" или "нативный" относится к полинуклеотиду, гену, белку, соединению, молекуле или активности, которые обычно присутствуют в клетке-хозяине или субъекте.

В контексте настоящего документа «экспрессия» в данном контексте относится к процессу, посредством которого получали полипептид на основе кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ген. Способ может включать транскрипцию, посттранскрипционный контроль, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционный контроль, посттрансляционную модификацию или любую их комбинацию. Экспрессируемая молекула нуклеиновой кислоты обычно функционально связана с последовательностью контроля экспрессии (например, промотором).

Термин "функционально связанный" относится к ассоциации двух или более молекул нуклеиновой кислоты на одном фрагменте нуклеиновой кислоты, так что функция одной из них зависит от другой. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен регулировать экспрессию указанной кодирующей последовательности (т.е. кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем указанного промотора). "Несвязанный" означает, что ассоциированные генетические элементы не тесно связаны друг с другом и функция одного не влияет на другого.

Как описано в настоящем документе, более чем одна гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в клетку-хозяина в виде отдельных молекул нуклеиновой кислоты, в виде множества индивидуально контролируемых генов, в виде молекулы полицистронной нуклеиновой кислоты, в виде одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок (например, тяжелую цепь антитела) или любую их комбинацию. Когда в клетку-хозяина вводят две или более гетерологичных молекул нуклеиновой кислоты, следует понимать, что две или более гетерологичных молекул нуклеиновой кислоты могут быть введены в виде одной молекулы нуклеиновой кислоты (например, на одном векторе), на отдельных векторах, интегрированных в хромосому-хозяина на одном сайте или нескольких сайтах, или любой их комбинации. Количество упомянутых гетерологичных молекул нуклеиновых кислот или белковых активностей относится к количеству кодирующих молекул нуклеиновых кислот или количеству белковых активностей, а не к количеству отдельных молекул нуклеиновых кислот, введенных в клетку-хозяина.

Термин «конструкция» относится к любому полинуклеотиду, который содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты (или, когда контекст явно указывает, слитый белок по настоящему изобретению). Конструкция (полинуклеотида) может присутствовать в векторе (например, бактериальном векторе, вирусном векторе) или может быть интегрирована в геном. "Вектор" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна транспортировать другую молекулу нуклеиновой кислоты. Векторы могут представлять собой, например, плазмиды, космиды, вирусы, вектор РНК или линейную или круговую молекулу ДНК или РНК, которые могут включать хромосомные, нехромосомные, полусинтетические или синтетические молекулы нуклеиновых кислот. Векторы согласно настоящему изобретению также включают транспозонные системы (например, Sleeping Beauty, см., например, Geurts и др., Mol. Ther. 8:108, 2003: Mátés и др., Nat. Genet. 41:753, 2009). Примерные векторы представляют собой векторы, способные к автономной репликации (эписомальный вектор), способные доставлять полинуклеотид в геном клетки (например, вирусный вектор) или способные экспрессировать молекулы нуклеиновых кислот, с которыми они связаны (экспрессионные векторы).

В контексте настоящего документа "вектор экспрессии" или "вектор" относится к конструкции ДНК, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, которая функционально связана с подходящей контрольной последовательностью, способной осуществлять экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в подходящем хозяине. Такие контрольные последовательности включают промотор для осуществления транскрипции, необязательную операторную последовательность для контроля такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания мРНК-рибосом, и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Вектор может представлять собой плазмиду, фаговую частицу, вирус или просто потенциальную геномную вставку. После трансформации в подходящего хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина, или в некоторых случаях может интегрироваться в сам геном или доставлять полинуклеотид, содержащийся в векторе, в геном без последовательности вектора. В настоящем описании термины "плазмида", "экспрессионная плазмида", "вирус" и "вектор" часто используются взаимозаменяемо.

Термин "вводимый" в контексте вставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку означает "трансфекцию", "трансформацию" или "трансдукцию" и включает ссылку на включение молекулы нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где молекула нуклеиновой кислоты может быть включена в геном клетки (например, хромосомы, плазмиды, пластиды или митохондриальной ДНК), преобразована в автономны репликон или временно экспрессирована (например, трансфицированная мРНК).

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть функционально связаны с определенными элементами вектора. Например, полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы, могут быть функционально связаны. Последовательности контроля экспрессии могут включать соответствующие последовательности инициации, терминации, промотора и энхансера транскрипции; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусные последовательности Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, возможно, последовательности, которые повышают секрецию белка. Последовательности контроля экспрессии могут быть функционально связаны, если они смежны с представляющим интерес геном и последовательностями контроля экспрессии, которые действуют в транс или на расстоянии для контроля представляющего интерес гена.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит плазмидный вектор или вирусный вектор (например, лентивирусный вектор или γ-ретровирусный вектор). Вирусные векторы включают ретровирус, аденовирус, парвовирус (например, аденоассоциированные вирусы), коронавирус, вирусы РНК с отрицательной цепью, такие как ортомиксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, корь и Сендай), вирусы РНК с положительной цепью, такие как пикорнавирус и альфавирус, и вирусы двухцепочечной ДНК, включая аденовирус, герпесвирус (например, вирус простого герпеса 1 и 2 типов, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус) и поксвирус (например, осповакцны, оспу кур и оспу канареек). Другие вирусы включают, например, вирус Норуолк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповавирус, гепаднавирус и вирус гепатита. Примеры ретровирусов включают лейкоз-саркому птиц, вирусы C-типа млекопитающих, вирусы B-типа, вирусы D-типа, группу HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

"Ретровирусы" представляют собой вирусы, имеющие геном РНК, который обратно транскрибируется в ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы, затем обратно транскрибируемая ДНК включается в геном клетки-хозяина. "Gammaretrovirus" относится к роду ретровирусов (Retroviridae). Примеры гаммаретровирусов включают вирус стволовых клеток мыши, вирус лейкоза мыши, вирус лейкоза кошек, вирус саркомы кошек и вирусы ретикулоэндотелиоза птиц.

"Лентивирусные векторы" включают в себя основанные на ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) лентивирусные векторы для доставки генов, которые могут быть интегрирующими или неинтегрирующими, обладают относительно большой упаковочной емкостью и могут трансдуцировать ряд различных типов клеток. Лентивирусные векторы обычно генерируют после временной трансфекции трех (упаковки, оболочки и переноса) или более плазмид в клетки-продуценты. Как и ВИЧ, лентивирусные векторы проникают в клетку-мишень через взаимодействие гликопротеинов вирусной поверхности с рецепторами на поверхности клетки. При вводе вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, которая опосредуется комплексом вирусной обратной транскриптазы. Продуктом обратной транскрипции является двухцепочечная линейная вирусная ДНК, которая является субстратом для вирусной интеграции в ДНК инфицированных клеток.

В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор может представлять собой гаммаретровирус, например, векторы, полученные из вируса лейкоза мышей Молони (MLV). В других вариантах осуществления вирусный вектор может представлять собой более сложный вектор, полученный из ретровируса, например, вектор, полученный из лентивируса. К этой категории относятся векторы, происходящие из ВИЧ-1. Другие примеры включают лентивирусные векторы, полученные из ВИЧ-2, FIV (вирус иммунодефицита кошки), вируса инфекционной анемии лошадей, SIV и вируса Маеди-Висна (лентивируса овец). Способы применения ретровирусных и лентивирусных вирусных векторов и упаковки клеток для трансдукции клеток-хозяев млекопитающих с вирусными частицами, содержащими трансгены, известны в данной области техники и были описаны ранее, например, в: патенте США 8119772; Walchli и др., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao и др., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha и др., Mol. Ther.18:1748, 2010; и Verhoeyen и др., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. Ретровирусные и лентивирусные векторные конструкции и системы экспрессии также коммерчески доступны. Другие вирусные векторы также могут быть использованы для доставки полинуклеотидов, включая ДНК-вирусные векторы, включая, например, векторы на основе аденовируса и векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV); векторы, полученные из вирусов простого герпеса (HSV), включая векторы ампликона, репликационно дефектный HSV и аттенуированный HSV (Krisky и др., Gene Ther. 5:1517, 1998).

Другие векторы, которые могут быть использованы с композициями и способами согласно настоящему изобретению, включают векторы, полученные из бакуловирусов и α-вирусов. (Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp. 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab), или плазмидные векторы (такие как "спящая красавица" или другие транспозонные векторы).

Когда геном вирусного вектора содержит множество полинуклеотидов, подлежащих экспрессии в клетке-хозяине в виде отдельных транскриптов, вирусный вектор может также содержать дополнительные последовательности между двумя (или более) транскриптами, обеспечивающие бицистронную или мультицистронную экспрессию. Примеры таких последовательностей, используемых в вирусных векторах, включают внутренние сайты входа рибосом (IRES), сайты расщепления фурином, вирусный пептид 2А или любую их комбинацию.

Плазмидные векторы, включая плазмидные векторы, кодирующие антитело на основе ДНК или антигенсвязывающий фрагмент, для прямого введения субъекту, описаны далее в настоящем документе.

В данном контексте термин "хозяин" относится к клетке или микроорганизму, предназначенному для генетической модификации гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты с получением представляющего интерес полипептида (например, антитела по настоящему изобретению).

Клетка-хозяин может включать любую отдельную клетку или клеточную культуру, которая может получать вектор или включение нуклеиновых кислот или экспрессирующих белков. Термин также охватывает потомство клетки-хозяина, генетически или фенотипически одинаковое или различное. Подходящие клетки-хозяева могут зависеть от вектора и могут включать клетки млекопитающих, клетки животных, клетки человека, клетки обезьяны, клетки насекомых, клетки дрожжей и бактериальные клетки. Эти клетки могут быть индуцированы для включения вектора или другого веества с помощью вирусного вектора, трансформации путем осаждения фосфата кальция, DEAE-декстрана (DEAE - диэтиламиноэтил), электропорации, микроинъекции или других способов. См., например, Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

В контексте инфекции SARS-CoV-2 "хозяин" относится к клетке или субъекту (например, человеку), инфицированному SARS-CoV-2.

"Антиген" или "Ag" в данном контексте относится к иммуногенной молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Этот иммунный ответ может включать продукцию антител, активацию специфических иммунологически-компетентных клеток, активацию комплемента, антителозависимую цитотоксичность или любую их комбинацию. Антиген (иммуногенная молекула) может представлять собой, например, пептид, гликопептид, полипептид, гликополипептид, полинуклеотид, полисахарид, липид или т. п. Очевидно, что антиген может быть синтезирован, получен рекомбинантным способом или получен из биологического образца. Примерные биологические образцы, которые могут содержать один или более антигенов, включают образцы тканей, образцы кала, клетки, биологические жидкости или их комбинации. Антигены могут продуцироваться клетками, которые были модифицированы или генетически сконструированы для экспрессии антигена. Антигены также могут присутствовать в SARS-CoV-2 (например, поверхностном гликопротеине или его части), например, присутствовать в вирионе, или экспрессироваться или презентироваться на поверхности клетки, инфицированной SARS-CoV-2.

Термин "эпитоп" или "антигенный эпитоп" включает любую молекулу, структуру, аминокислотную последовательность или детерминанту белка, которая распознается и специфически связывается родственной связывающей молекулой, такой как иммуноглобулин, или другой связывающей молекулой, доменом или белком. Эпитопные детерминанты обычно содержат расположенные на химически активные поверхностные группы молекул, такие как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обычно обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими характеристиками заряда. Если антиген представляет собой или содержит пептид или белок, эпитоп может состоять из последовательных аминокислот (например, линейного эпитопа) или может состоять из аминокислот из различных частей или областей белка, которые сближены за счет сворачивания белка (например, прерывистого или конформационного эпитопа), или несмежных аминокислот, которые находятся в непосредственной близости независимо от сворачивания белка.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и способны связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемом на поверхности клетки-хозяина, и/или на вирионе SARS-CoV-2.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению ассоциируется или объединяется с поверхностным эпитопом или антигеном гликопротеина SARS-CoV-2, содержащим указанный эпитоп, при этом существенно не ассоциируясь или не объединяясь с любыми другими молекулами или компонентами в образце.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается или объединяется (например, связывается) с поверхностным эпитопом гликопротеина SARS-CoV-2, а также может связываться или объединяться с эпитопом из другого коронавируса (например, SARS CoV), присутствующего в образце, но существенно не ассоциирующегося или объединяющегося с любыми другими молекулами или компонентами в образце. Другими словами, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению является перекрестно реактивным по отношению к SARS-CoV-2 и одному или более дополнительным коронавирусам.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению специфически связывается с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2. В контексте настоящего документа "специфически связывается" относится к ассоциации или объединению антитела или антигенсвязывающего фрагмента с антигеном с аффинностью или K_a (т.е. константой равновесной ассоциации конкретного связывающего взаимодействия с единицами измерения 1/M) с 10⁵ M^-1 или более (что равно отношению скорости ассоциации [K_on] к скорости диссоциации [K_off] для этой реакции ассоциации), при этом не ассоциируясь или не объединяясь в значительной степени с любыми другими молекулами или компонентами в образце.В качестве альтернативы, аффинность может быть определена как равновесная константа диссоциации (K_d) отдельного связывающего взаимодействия, выражаемая в единицах измерения М (например, от 10^-5 M до 10^-13 M). Антитела могут быть классифицированы как "высокоаффинные" антитела или как "низкоаффинные" антитела. "Высокоаффинные" антитела относятся к тем антителам, которые имеют K_a по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1или по меньшей мере 10¹³ M^-1. «Низкоаффинные» антитела относятся к тем антителам, которые имеют K_a до 10⁷ M^-1, до 10⁶ M^-1, до 10⁵ M^-1. В качестве альтернативы, аффинность может быть определена как равновесная константа диссоциации (K_d) отдельного связывающего взаимодействия, выражаемая в единицах измерения М (например, от 10^-5 M до 10^-13 M).

В некоторых контекстах антитело и антигенсвязывающие фрагменты могут быть описаны со ссылкой на аффинность и/или авидность к антигену. Если не указано иное, авидность относится к общей силе связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном и отражает аффинность связывания, валентность антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, содержит ли антитело или антигенсвязывающий фрагмент один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более сайтов связывания) и, например, присутствует ли другой агент, который может влиять на связывание (например, неконкурентный ингибитор антитела или антигенсвязывающего фрагмента).

Известно множество анализов для идентификации антител по настоящему изобретению, которые связывают конкретную мишень, а также для определения аффинности связывающего домена или связывающего белка, таких как вестерн-блоттинг, ELISA (например, прямой, непрямой или сэндвич), аналитическое ультрацентрифугирование, спектроскопия и анализ поверхностного плазмонного резонанса (Biacore®) (см., например, Scatchard и др., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff и др., Cancer Res. 53:2560, 1993; и патенты США № 5,283,173, 5,468,614 или их эквивалент). Также известны анализы для оценки аффинности или кажущейся аффинности или относительной аффинности.

В некоторых примерах связывание может быть определено путем рекомбинантной экспрессии антигена SARS-CoV-2 в клетке-хозяине (например, путем трансфекции) и иммуноокрашивания (например, фиксированной или фиксированной и пермеабилизированной) клетки-хозяина антителом и анализа связывания с помощью проточной цитометрии (например, с использованием анализатора клеток ZE5 (BioRad®) и программного обеспечения FlowJo (TreeStar). В некоторых вариантах осуществления положительное связывание может быть определено дифференциальным окрашиванием антителом клеток, экспрессирующих SARS-CoV-2, по сравнению с контрольными (например, имитирующими) клетками.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с S-белком SARS-CoV-2, как измерено с помощью биослойной интерферометрии. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению связывается с S-белком SARS-CoV-2 с K_D менее чем около 4,5×10^-9 M, менее чем около 5×10^-9 M, менее чем около 1×10^-10 M, менее чем около 5×10^-10 M, менее чем около 1×10^-11 M, менее чем около 5×10^-11 M, менее чем около 1×10^-12 M или менее чем около 5×10^-12 M. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с RBD S-белка SARS-CoV-2 с K_D менее чем около 4,5×10^-9 M, менее чем около 5×10^-9 M, менее чем около 1×10^-10 M, менее чем около 5×10^-10 M, менее чем около 1×10^-11M, менее чем около 5×10^-11 M, менее чем около1×10^-12 M или менее чем около 5×10^-12 M. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с S-белком SARS-CoV-2 (например, гликозилированным или дегликозилированным S-белком RBD) с K_D, к_а и/или k_d, как показано в таблице 8, таблице 9 или таблице 10 настоящего документа.

В частных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с гликозилированным S-белком RBD с K_D, составляющей около 0,35 нМ, около 0,36 нМ, около 0,37 нМ, около 0,38 нМ, около 0,39 нМ, около 0,40 нМ, около 0,41 нМ, около 0,42 нМ, около 0,43 нМ, около 0,44 нМ, около 0,45 нМ, около 0,46 нМ, около 0,47 нМ, около 0,48 нМ, около 0,49 нМ, около 0,50 нМ, около 0,51 нМ или около 1,7 нМ, необязательно измеренным с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и/или с k_a, составляющей около 8,5e4 1/Мс, около 8,6e4 1/Мс, около 8,7e4 1/Мс, около 8,8e4 1/Мс, около 8,9e4 1/Мс, около 9,0e4 1/Мс, около 9,1e4 1/Мс, около 9,2e4 1/Мс, около 9,3e4 1/Мс, около 9,4e4 1/Мс, около 9,5e4 1/Мс, около 9,6e4 1/Мс, около 9,7e4 1/Мс, около 9,8e4 1/Мс, около 9,9e4 1/Мсили около 1,0e5 1/Мс, необязательно при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и/или с k_d около 1,6e-4 1/с, около 3,3e-5 1/с, около 3,4e-5 1/с, около 3,5e-5 1/с, около 3,6e-5 1/с, около 3,7e-5 1/с, около 3,8e-5 1/с, около 3,9e-5 1/с, около 3,9e-5 1/с, около 4,0e-5 1/с, около 4,1e-5 1/S, около 4,2e-5 1/с, около 4,3e-5 1/с, около 4,4e-5 1/с, около 4,5e-5 1/с, около 4,6e-5 1/с, около 4,7e-5 1/с, около 4,8e-5 1/с, около 4,9e-5 1/с, около 5,0e-5 1/с около 5,1e-5 1/с, около 5,2e-5 1/с, около 5,3e-5 1/с, около 5,4e-5 1/с, около 5,5e-5 1/с, около 5,6e-5 1/с, около 5,7e-5 1/с, около 5,8e-5 1/с, около 5,9e-5 1/с, около 6,0e-5 1/с, около 6,1e-5 1/с, около 6,2e-5 1/с, около 6,3e-5 1/с, около 6,4e-5 1/с или около 6,5e-5 1/с, необязательно, как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с дегликозилированным S-белком RBD с K_D , составляющей около 0,95, около 0,96 нМ, около 0,97 нМ, около 0,98 нМ, около 0,99 нМ, около 1,0 нМ, около 1,1 нМ, около 1,2 нМ, около 1,3 нМ, около 1,4 нМ, около 1,5 нМ или около 1,6 нМ, необязательно, как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и/или с k_a, составляющей около (1/с) около 2,5e5, около 2,6e5, около 2,7e5, около 2,8e5, около 2,9e5, около 3,0e5, около 3,1e5, необязательно, как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и/или с k_d (1/с) около 2,8e-4, около 2,9e-4, около 3,0e-4, около 3,1e-4, около 3,2e-4, около 3,3e-4, около 3,4e-4, около 3,5e-4, около 3,6e-4, около 3,7e-4, около 3,8e-4, около 3,9e-4, около 4,0e-4, около 4,1e-4, около 4,2e-4, около 4,3e-4, около 4,4e-4, около 4,5e-4, около 4,6e-4 около 4,7e-4, около 4,8e-4, около 4,9e-4 или около 5,0e-4, как необязательно, как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В некоторых вариантах осуществления для определения связывания с RBD поверхностный плазмонный резонанс включает использование, проводимое с использованием сенсорного чипа с ковалентно иммобилизованным Fc против человека (например, из GE). Буфер может представлять собой 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) с pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 0,05% моющего средства P20. SPR можно проводить при 25°C. Антитела могут быть разведены от супернатанта жидкости до приблизительно 2 мкг/мл. Концентрации RBD могут составлять 0,8 нМ, 3,1 нМ, 12,5 нМ, 50 нМ и/или 200 нМ.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с рецептор-связывающим доменом (RBD) поверхностного гликопротеина SARS-CoV-2, когда RBD гликозилирован и/или дегликозилирован, где связывание определяли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), где необязательно: (1) SPR выполняли с использованием прибора Biacore T200 с использованием одноциклового кинетического подхода, дополнительно необязательно с 3-минутным периодом инъекции и 20-минутным периодом диссоциации; (2) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент захватывали на поверхности; (3) RBD присутствует в концентрации 0,8 нМ, 3,1 нМ, 12,5 нМ., 50 нМ или 200 нМ; (4) антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с гликозилированным RBD с KD, составляющей около 2,0 нМ, около 1,9 нМ, около 1,8 нМ, около 1,7 нМ, около 1,6 нМ, около 1,5 нМ, около 1,4 нМ, около 1,3 нМ, около 1,2 нМ, около 1,1 нМ, около 1,0 нМ, около 0,9 нМ, около 0,8 нМ, около 0,7 нМ, около 0,6 нМ, около 0,5 нМ или около 0,4 нМ, или с KD, составляющей 0,4±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,45±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,5±0,05 нМ, или с KD 0,6±0,05 нМ, или с KD 0,7±0,05 нМ, или с KD 1,7±0,05 нМ; и/или (5) антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с дегликозилированной RBD с KD около 37,0 нМ, около 8,0 нМ, около 2,0 нМ, около 1,9 нМ, около 1,8 нМ, около 1,7 нМ, около 1,6 нМ, около 1,5 нМ, около 1,4 нМ, около 1,3 нМ, около 1,2 нМ, около 1,1 нМ, около 1,0 нМ, или около 0,9 нМ, или с KD 37,0±0,05 нМ, или с KD 8,0±0,05 нМ, или с KD 1,0±0,05 нМ, или с KD 0,9±0,05 нМ, или с KD 1,3±0,05 нМ, или с KD 1,8±0,05 нМ, или с KD 1,7±0,05 нМ.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению способно нейтрализовать инфекцию с помощью SARS-CoV-2. В данном контексте "нейтрализующее антитело" представляет собой антитело, которое может нейтрализовать, т.е. предотвращать, ингибировать, уменьшать, задерживать или препятствовать способности патогена инициировать и/или продлять инфекцию в организме хозяина. Нейтрализация может быть количественно оценена, например, путем оценки уровней РНК SARS-CoV-2 в образце (n, например, легкого), оценки вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в образце (n, например, легкого), оценки гистопатологии образца (n, например, легкого) или тому подобное. Термины «нейтрализующее антитело» и «антитело, которое нейтрализует» или «антитела, которые нейтрализуют» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В любом из раскрытых в данном документе вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно предотвращать и/или нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 на модели инфекции in vitro и/или на животной модели инфекции in vivo (например, с использованием модели сирийского хомячка с интраназальным заражением SARS-CoV-2) и/или у человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 с IC90 (концентрация, необходимая для ингибирования репликации вируса на 90%), составляющей около 9 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 с IC50, составляющей от около 16 до около 20 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 или вирус, псевдотипированный SARS-CoV-2, с IC50 от около 0,3 до около 0,4 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или композиция, содержащая два или более антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 или вирус, псевдотипированный SARS-CoV-2, с IC50 от около 0,07 до около 0,08 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент (i) распознает эпитоп в мотиве связывания рецептора ACE2 (RBM, SEQ ID NO:167) SARS-CoV-2; (ii) способно блокировать взаимодействие между SARS-CoV-2 и ACE2; (ii) способно связываться с S-белком SARS-CoV-2 с большей авидностью, чем с S-белком коронавируса SARS; (iv) способно окрашивать около 30%, около 35%, около 40%, около 50%, около 55%, около 56%, около 57%, около 58%, около 59%, около 60%, или более клеток-мишеней, экспрессирующих поверхностный гликопротеин SARS-CoV-2, в образце, содержащем около 50 000 клеток-мишеней (например, клетки ExpiCHO) в приблизительно 100 мкл, когда антитело или антигенсвязывающий фрагмент присутствует в концентрации 10 мкг/мл (например, окрашивание, определенное с помощью проточной цитометрии ELISA); (v) распознает эпитоп, который является консервативным в ACE2 RBM SARS-CoV-2 и в ACE2 RBM коронавируса SARS; (vi) является перекрестно-реактивным против коронавируса SARS-CoV-2 и SARS; (vii) распознает эпитоп в поверхностном гликопротеине SARS-CoV-2, который отсутствует в ACE2 RBM; или (viii) любая комбинация (i)-(vii).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способно ингибировать взаимодействие между: (i) SARS-CoV-2 и человеческой DC-SIGN; (ii) SARS-CoV-2 и человеческой L-SIGN; (iii) SARS-CoV-2 и человеческим SIGLEC-1; или (iv) любой комбинацией (i)-(iii). Как описано в настоящем документе, DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1 могут быть вовлечены в инфекцию SARS-CoV-2 в ролях, включающих роли рецепторов связывания. Ингибирование взаимодействия между SARS-CoV-2 и DC-SIGN, L-SIGN и/или SIGLEC-1 может в некоторых контекстах нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином: (i) SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (SEQ ID NO:165); (ii) SARS-CoV-2 B.1.1.7; (iii) SARS-CoV-2 B.1.351; (iv) SARS-CoV-2, содержащего любую одну или более из следующих мутаций по типу замены относительно SEQ ID NO:165: N501Y; S477N; N439K; L452R; E484K; Y453F; A520S; K417N; K417V; S494P; N501T; S477R; V367F; P384L; A522S; A522V; V382L; P330S; T478I; S477I; P479S; или (v) любой комбинации (i)-(iv).

Термины, понятные специалистам в данной области техники, каждый из которых имеет значение, приобретенное в данной области техники, если явно не определено иное в настоящем документе. Например, термин "антитело" относится к интактному антителу, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, а также любую антигенсвязывающую часть или фрагмент интактного антитела, который обладает или сохраняет способность связываться с молекулой-мишенью антигена, распознаваемой интактным антителом, таким как фрагмент scFv, Fab или Fab'2. Таким образом, термин "антитело" в настоящем документе используется в самом широком смысле и включает поликлональные и моноклональные антитела, включая интактные антитела и их функциональные (антигенсвязывающие) фрагменты антител, включая фрагменты, связывающие фрагменты антигена (Fab), фрагменты F(ab')2, фрагменты Fab', фрагменты Fv, рекомбинантные фрагменты IgG (rIgG), фрагменты одноцепочечных антител, включая одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), и фрагменты однодоменных антител (sd) (например, sdAb, sdFv, нанотело). Термин охватывает генетически сконструированные и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интратела, пептидные антитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгатные антитела, полиспецифические, например, биспецифические антитела, диатела, триатела, тетратела, тандем ди-scFv и тандем три-scFv. Если не указано иное, термин «антитело» следует понимать как охватывающий его функциональные фрагменты. Термин также охватывает интактные или полноразмерные антитела, включая антитела любого класса или подкласса, включая IgG и его подклассы (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgE, IgA и IgD.

Термины "V_L" или "VL" и "V_H" или "VH" относятся к вариабельной области связывания из легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела, соответственно. В некоторых вариантах осуществления VL представляет собой класс каппа (κ) (также "VK" в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления VL представляет собой класс лямбда (λ). Вариабельные связывающие области включают дискретные, четко определенные подобласти, известные как "определяющие комплементарность области" (CDR) и "каркасные области" (FR). Термины "область, определяющая комплементарность" и "CDR" являются синонимами "гипервариабельной области" или "HVR" и относятся к последовательностям аминокислот в пределах вариабельных областей антитела, которые, как правило, совместно придают антигенную специфичность и/или аффинность связывания антитела, при этом последовательные CDR (т.е. CDR1 и CDR2, CDR2 и CDR3) отделены друг от друга в первичной структуре каркасной областью. В каждой вариабельной области имеется три CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3; LCDR1, LCDR2, LCDR3; также называемые CDRH и CDRL, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело VH содержит четыре FR и три CDR следующим образом: FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4; и антитело VL содержит четыре FR и три CDR следующим образом: FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4. Как правило, VH и VL вместе образуют антигенсвязывающий сайт через свои соответствующие CDR.

В контексте настоящего документа "вариант" CDR относится к функциональному варианту последовательности CDR, имеющей до 1-3 аминокислотных замен (например, консервативных или неконсервативных замен), делеций или их комбинаций.

Нумерация CDR и каркасных областей может быть в соответствии с любым известным способом или схемой, такой как схемы нумерации Kabat, Chothia, EU, IMGT и AHo (см., например, Kabat и др., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Social Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991,5th ed.; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); Lefranc и др., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003; Honegger and Plückthun, J. Mol. Bio. 309:657-670 (2001)). Эквивалентные положения остатков можно аннотировать и сравнивать разные молекулы с помощью программного инструмента для нумерации и классификации рецепторов антигена (ANARCI) (2016, Bioinformatics 15:298-300). Соответственно, идентификация CDR примерной последовательности вариабельного домена (VH или VL), предложенной в настоящем документе, в соответствии с одной схемой нумерации не исключает антитело, содержащее CDR того же вариабельного домена, как определено с использованием другой схемы нумерации. В некоторых вариантах осуществления предлагается антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит CDR из последовательности VH согласно любой из SEQ ID NO:113, 1, 9-15, 23, 24, 27, 28-46, 55, 63, 79, 87, 95, 103, 105, 114-120, 129-146, 155, 172, 176-178, 194, 196, 198, 200, 202, 239, и 267, и из последовательности VL согласно любой из SEQ ID NO:168, 5, 47-50, 59, 67, 71-72, 75, 76, 83, 91, 99, 109, 147-150, 159, 182, 190, 234, и 243, как определено с использованием любого известного способа нумерации CDR, включая способы нумерации Kabat, Chothia, EU, IMGT, Martin (улучшенная Chothia), Contact и AHo. В некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют способу нумерации IMGT. В некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют способу нумерации антител, разработанному Chemical Computing Group (CCG); например, с использованием программного обеспечения Molecular Operating Environment (MOE) (www.chemcomp.com).

В некоторых вариантах осуществления предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где: (i) CDRH1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности согласно любой из SEQ ID NO:106, 2, 56, 64, 80, 88, 96, 156, 179, 195 или 240, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три замены кислоты, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или представляет собой замену аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; (ii) CDRH2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности согласно любой из SEQ ID NO:121, 3, 16-22, 57, 65, 81, 89, 97, 107, 122-126, 157, 180, 197, 199 или 241, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или замену аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; (iii) CDRH3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности согласно любой из SEQ ID NO:108, 4, 25, 26, 58, 66, 82, 90, 98, 104, 127, 128, 158, 181, 201, 203 или 242, или их вариант последовательности, содержащий одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; (iv) CDRL1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности согласно любой из SEQ ID NO:169, 6, 51-54, 60, 68, 73, 74, 84, 92, 100, 110, 160, 183, 235 или 244, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одну или более из которых замены необязательно представляют собой консервативную замену и/или являются заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; (v) CDRL2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности согласно любой из SEQ ID NO:170, 7, 61, 69, 85, 93, 101, 111, 161, 184, 236 или 245, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; и/или (vi) CDRL3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности согласно любой из SEQ ID NO: №:171, 8, 62, 70, 77, 78, 86, 94, 102, 112, 151, 152, 153, 154, 162, 185, 237 или 246, или их вариант последовательности, содержащий одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или замену аминокислоты, кодируемой зародышевой линией, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2, экспрессируемым на поверхности клетки-хозяина, на вирионе или и на том, и другом.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности VH и VL, которые кодируются:

(i) геном VH1-18 и геном VK3-20, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH1-18 и VK3-20, соответственно;

(ii) аллелем VH3-7 и аллелем VL3-25, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH3-7 и VL3-25, соответственно;

(iii) аллелем VH3-23 и аллелем VK1-5, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH3-23 и VK1-5, соответственно;

(iv) аллелем VH3-13 и аллелем VK1-39, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH3-13 и VK1-39, соответственно;

(v) аллелем VH1-18 и аллелем VK3-11, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH1-18 и VK3-11, соответственно; или

(vi) аллелем VH1-69 и аллелем VL2-23, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH1-69 и VL2-23, соответственно.

В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно предотвращать и/или нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 на модели инфекции in vitro и/или на животной модели инфекции in vivo и/или у человека.

В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 согласно SEQ ID NO: (i) 2-4 и 6-8 или 235-237, соответственно; (ii) 2, любой из 16-22, 4 и 6-8 или 235-237, соответственно; (iii) 2, 3, любой из 25-26 и 6-8 или 235-237, соответственно; (iv) 2-4, 51, 7 и 8, соответственно; (v) 2-4, 52, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно; (vi) 2-4, 53, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно; (vii) 2-5, 54, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно; (viii) 56-58 и 60-62, соответственно; (ix) 64-66 и 68-70, соответственно; (x) 64-66, 73 или 74, 69 и 70, соответственно; (xi) 64-66, 68-69 и 77 или 78, соответственно; (xii) 80-82 и 84-86, соответственно; (xiii) 88-90 и 92-94, соответственно; (xiv) 96-98 и 101-102, соответственно; (xv) 96, 97, 104 и 100-102, соответственно; (xvi) 106-108 и 110-112 или 169-171, соответственно; (xvii) 106, любой из 121-126, 108 и 110-112, соответственно; (xviii) 106, 107, 127 или 128 и 110-112, соответственно; (xix) 106-108, 110, 111 и 151, соответственно; (xx) 106-108, 110, 111 и 152, соответственно; (xxi) 106-108, 110, 111 и 153, соответственно; (xxii) 106-108, 110, 111 и 154., соответственно; (xxiii) 106, 107 или любой из 121-126, 108 или 127 или 128 и 169-171, соответственно; (xxiv) 156-158 и 160-162, соответственно; (xxv) 106, 123, 127 и 169-171, соответственно; (xxvi) 2, 17, 25, 6 или 235 или любой из 51-54, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно; (xxvii) 2, 20, 25, 6 или 235 или любой из 51-54, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно; (xxviii) 179-181 и 183-185, соответственно, (xxix) 195, 180, 181 и 183-185, соответственно; (xxx) 195, 197, 181 и 183-185, соответственно; (xxxi) 195, 199, 181 и 183-185, соответственно; (xxxii) 195, 197, 201 и 183-185, соответственно; (xxxiii) 195, 197, 203 и 183-185, соответственно; (xxxiv) 195, 199, 201 и 183-185, соответственно; (xxxv) 195, 199, 203 и 183-185, соответственно; (xxxvi) 179, 180, 181 и 183-185, соответственно; (xxxvii) 179, 197, 181 и 183-185, соответственно; (xxxviii) 179, 199, 181 и 183-185, соответственно; (xxxix) 179, 197, 201 и 183-185, соответственно; (xxxx) 179, 197, 203 и 183-185, соответственно; (xxxxi) 179, 199, 201 и 183-185, соответственно; (xxxxii) 179, 199, 203 и 183-185, соответственно; (xxxxiii) 179, 180, 201 и 183-185, соответственно; (xxxxiv) 179, 180, 203 и 183-185, соответственно; и (xxxxv) 240-242 и 244-246, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO: 80-82 и 84-86, соответственно. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с S-белком SARS-CoV-2 с K_D менее чем около 4,5×10^-9 M, менее чем около 5×10^-9 M, менее чем около 1×10^-10 M, менее чем около 5×10^-10 M, менее чем около 1×10^-11 M, менее чем около 5×10^-11 M, менее чем около 1×10^-12 M или менее чем около 5×10^-12 M. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 и/или нейтрализовать инфекцию клетки-мишени вирусом, псевдотипированным SARS-CoV-2, с IC50 от около 16 до около 20 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO: 106-108 и 169-171 или 106, 121, 108 и 169-171, соответственно. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с S-белком SARS-CoV-2 с K_D менее чем около 4,5×10^-9 M, менее чем около 5×10^-9 M, менее чем около 1×10^-10 M, менее чем около 5×10^-10 M, менее чем около 1×10^-11 M, менее чем около 5×10^-11 M, менее чем около 1×10^-12 M или менее чем около 5×10^-12 M. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 и/или нейтрализовать инфекцию клетки-мишени вирусом, псевдотипированным SARS-CoV-2, с IC50 от около 0,3 до около 0,4 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где каждый CDR независимо выбран из соответствующего CDR SARS-CoV-2 S300 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1.1 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1.2 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1.3 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1.4 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1.5 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1.6 mAb, SARS-CoV-2 S300-v1.7 mAb, или SARS-CoV-2 S300-v1.8 mAb SARS-CoV-2 S300-v1.9 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.1 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.2 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.3 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.4 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.5 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.6 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.7 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.8 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.9 mAb, SARS-CoV-2 S300-v2.10, SARS-CoV-2 S300-v2.11, SARS-CoV-2 S300-v3 mAb , SARS-CoV-2 S300-v3.1 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.2 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.3 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.4 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.5 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.6 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.7 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.8 mAb, SARS-CoV-2 S300-v3.9 mAb, SARS-CoV-2 S300-v10 mAb, SARS-CoV-2 S300-v11 mAb, SARS-CoV-2 S300-v12 mAb, SARS-CoV-2 S300-v13 mAb, SARS-S300-v14 mAb, SARS-CoV-2 S302 mAb, SARS-CoV-2 S303 mAb, SARS-CoV-2 S303-v1 mAb, SARS-CoV-2 S303-v2 mAb, SARS-CoV-2 S303-v3 mAb, SARS-CoV-2 S303-v4 mAb, SARS-CoV-2 S303-v5 mAb, SARS-CoV-2 S304 mAb, SARS-CoV-2 S306 mAb, SARS-CoV-2 S307 mAb, SARS-CoV-2 S308 mAb, SARS-CoV-2 S308-v1 mAb, SARS-CoV-2 S308-v2 mAb, SARS-CoV-2 S309 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.1 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.2 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.3 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.4 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.5 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.6 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.7 mAb, SARS-CoV-2 S309-v1.8 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.1 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.2 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.3 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.4 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.5 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.6 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.7 mAb, SARS-CoV-2 S309-v2.8 mAb, SARS-CoV-2 309-v2.9 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.1 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.2 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.3 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.4 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.5 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.6 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.7 mAb, SARS-CoV-2 S309-v3.8 mAb, SARS-CoV-2 S309-v9 mAb, SARS-CoV-2 S309-v10 mAb, SARS-CoV-2 S309-v11 mAb, SARS-CoV-2 S309-v12 mAb, SARS-CoV-2 S309-v13 mAb, SARS-CoV-2 S310 mAb, SARS-CoV-2 S311 mAb, SARS-CoV-2 S312 mAb, SARS-CoV-2 S315-v1 mAb, SARS-CoV-2 S315-v2 mAb, SARS-CoV-2 S315-v3 mAb, SARS-CoV-2 S315-v4 mAb, SARS-CoV-2 S315-v5 mAb, SARS-CoV-2 S315-v6 mAb, или SARS-CoV-2 S315-v7 mAb, как указано в таблице 2. То есть рассматриваются все комбинации CDR из mAb SARS-CoV-2 и их вариантных последовательностей, представленных в таблице 2.

Примерные антитела по настоящему изобретению включают антитело S309 и его сконструированные варианты. В частных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, выбранные из любой из аминокислотных последовательностей CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 (соответственно), представленных в таблице 1.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит: CDRH1, CDRH2 и CDRH3 аминокислотной последовательности VH, представленной в любой из SEQ ID NO:105, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 172, и 267; и CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:168 (т.е.в соответствии с любым способом нумерации или определения CDR, известным в данной области техники, таким как IMGT, Kabat, Chothia, AHo, North, Contact, CCG, EU или Martin (улучшенная Chothia)).

В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, имеющий по меньшей мере 85% идентичности (т.е. 85%, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) с аминокислотной последовательностью VH, представленной в таблице 1, и/или VL, имеющий по меньшей мере 85% идентичности (т.е.85%, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) с аминокислотной последовательностью VL, представленной в таблице 1. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью VH, представленной в таблице 1, и/или VL, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью VL, представленной в таблице 1. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью VH, представленной в таблице 1, и/или VL, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью VL, представленной в таблице 1. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, имеющий по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотной последовательностью VH, представленной в таблице 1, и/или VL, имеющий по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотной последовательностью VL, представленной в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность VH, выбранную из аминокислотных последовательностей VH, представленных в таблице 1, и аминокислотную последовательность VL, выбранную из аминокислотной последовательности VL, представленной в таблице 1.

Таблица 1. CDR (IMGT) и аминокислотные последовательности вариабельной области некоторых антител S309
CDRH1	GYPFTSYG (SEQ ID NO:106)
CDRH2	ISTYNGNT (SEQ ID NO:107); ISTYQGNT (SEQ ID NO: 121); ISTYNSNT (SEQ ID NO:122); ISTYNANT (SEQ ID NO:123); ISTYNQNT (SEQ ID NO:124); ISTYLGNT (SEQ ID NO:125); ISTYTGNT (SEQ ID NO:126)
CDRH3	ARDYTRGAWFGESLIGGFDN (SEQ ID NO:108); ARDYTRGAFFGESLIGGFDN (SEQ ID NO:127); ARDYTRGAYFGESLIGGFDN (SEQ ID NO:128)
VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:105) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYQGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:113) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNSNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:114) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNANTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:115) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNQNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:116) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYLGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:117) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYTGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:118) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAFFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:119) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAYFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:120) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:129) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYQGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:130) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYNSNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:131) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYNANTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:132) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYNQNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:133) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYLGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:134) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYTGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:135) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAFFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:136) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAYFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:137) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:138) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYQGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:139) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYNSNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:140) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYNANTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:141) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYNQNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:142) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYLGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:143) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYTGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:144) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAFFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:145) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGYISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAYFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:146) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGFISTYNANTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAFFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:172) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGX1 ISTYX 2 X 3 NTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAX 4 FGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS Где X1 представляет собой W, F или Y; X2 представляет собой N, Q, L или T; X3 представляет собой G, S, A или Q; X4 представляет собой W, F или Y
CDRL1	QTVSSTS (SEQ ID NO:169)
CDRL2	GAS (SEQ ID NO:170)
CDRL3	QQHDTSLT (SEQ ID NO:171)
VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVSSTSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHDTSLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:168)

В частных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит CDRH1, CDRH2 и CDRH3 согласно SEQ ID NO:106, 107 или 121 или 122 или 123 или 124 или 125 или 126, и 108 или 127 или 128, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 согласно SEQ ID NO:169-171, соответственно. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в: (a) SEQ ID NO:106, 121, 108, 169, 170 и 171, соответственно; (b) SEQ ID NO: 106, 121, 127, 169, 170 и 171, соответственно; (c) SEQ ID NO: 106, 121, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(d) SEQ ID NO: 106, 107, 108, 169, 170 и 171, соответственно; (e) SEQ ID NO: 106, 107, 127, 169, 170 и 171, соответственно; (f) SEQ ID NO: 106, 107, 128, 169, 170 и 171, соответственно; (g) SEQ ID NO: 106, 122, 108, 169, 170 и 171, соответственно; (h) SEQ ID NO: 106, 122, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(i) SEQ ID NO: 106, 122, 128, 169, 170 и 171, соответственно; (j) SEQ ID NO: 106, 123, 108, 169, 170 и 171, соответственно; (k) SEQ ID NO: 106, 123, 127, 169, 170 и 171, соответственно; (l) SEQ ID NO: 106, 123, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(m) SEQ ID NO: 106, 124, 108, 169, 170 и 171, соответственно; (n) SEQ ID NO: 106, 124, 127, 169, 170 и 171, соответственно; (o) SEQ ID NO: 106, 124, 128, 169, 170 и 171, соответственно; (p) SEQ ID NO: 106, 125, 108, 169, 170 и 171, соответственно; (q) SEQ ID NO: 106, 125, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(r) SEQ ID NO: 106, 125, 128, 169, 170 и 171, соответственно; (s) SEQ ID NO: 106, 126, 108, 169, 170 и 171, соответственно; (t) SEQ ID NO: 106, 126, 127, 169, 170 и 171, соответственно; или (u) SEQ ID NO: 106, 126, 128, 169, 170 и 171, соответственно.

В дополнительных вариантах осуществления VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:105, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 172, и 267, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Термин "CL" относится к "константной области легкой цепи иммуноглобулина" или "константной области легкой цепи", т.е. константной области из легкой цепи антитела. Термин "CH" относится к "константной области тяжелой цепи иммуноглобулина" или "константной области тяжелой цепи", которая дополнительно делится в зависимости от изотипа антитела на CH1, CH2 и CH3 (IgA, IgD, IgG) или домены CH1, CH2, CH3 и CH4 (IgE, IgM). Fc-область тяжелой цепи антитела описана далее в настоящем документе. В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит любую одну или более из CL, CH1, CH2 и CH3. В некоторых вариантах осуществления CL содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:174 или SEQ ID NO:193. В некоторых вариантах осуществления CH1-CH2-CH3 содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:173 или SEQ ID NO:175 или SEQ ID NO:265 или SEQ ID NO:266. Следует понимать, что, например, продукция в линии клеток млекопитающих может удалять один или более С-концевой лизин тяжелой цепи антитела (см., например, Liu и др. mAb 6(5): 1145-1154(2014)). Соответственно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, CH1-CH3, CH3 или полипептид Fc, где С-концевой остаток лизина присутствует или отсутствует; другими словами, они охватывают варианты осуществления, в которых С-концевой остаток тяжелой цепи, CH1-CH3 или полипептид Fc не является лизином, и варианты осуществления, где лизин представляет собой С-концевой остаток. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит множество антител и/или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов не содержит остаток лизина на С-конце тяжелой цепи, CH1-CH3 или полипептида Fc, и где одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов содержит остаток лизина на С-конце тяжелой цепи, CH1-CH3 или полипептида Fc.

"Fab" (антигенсвязывающий фрагмент) представляет собой часть антитела, которая связывается с антигенами и включает вариабельную область и CH1 тяжелой цепи, связанной с легкой цепью посредством межцепочечной дисульфидной связи. Каждый фрагмент Fab является одновалентным по отношению к связыванию антигена, то естьон имеет один антигенсвязывающий сайт. Лечение пепсином антитела дает один большой фрагмент F(ab')2, который примерно соответствует двум дисульфид-связанным Fab-фрагментам, обладающим двухвалентной антигенсвязывающей активностью и все еще способным к перекрестному связыванию антигена. Как Fab, так и F(ab’)2 являются примерами «антигенсвязывающих фрагментов». Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab наличием дополнительных нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH1, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем документе обозначает Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. F(ab')2-фрагменты антител первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, имеющих между собой шарнирные остатки цистеина. Известны также другие химические сочетания фрагментов антител.

Фрагменты Fab могут быть соединены, например, с помощью пептидного линкера, с образованием одноцепочечного Fab, также называемого в настоящем документе "scFab". В этих вариантах осуществления межцепочечная дисульфидная связь, которая присутствует в нативном Fab, может отсутствовать, и линкер полностью или частично служит для связывания или соединения фрагментов Fab в одной полипептидной цепи. Fab-фрагмент, полученный из тяжелой цепи (например, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из VH + CH1 или "Fd") и Fab-фрагмент, полученный из легкой цепи (например, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из VL + CL), могут быть связаны в любом расположении с образованием scFab. Например, scFab может быть расположен в направлении от N-конца к C-концу в соответствии с (Fab-фрагмент тяжелой цепи - линкер - Fab-фрагмент легкой цепи) или (Fab-фрагмент легкой цепи - линкер - Fab-фрагмент тяжелой цепи). Пептидные линкеры и примерные линкерные последовательности для применения в scFab более подробно обсуждаются в настоящем документе.

ScFab может содержать любую комбинацию последовательностей VH и VL или любую комбинацию последовательностей CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления scFab содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 105 или SEQ ID NO: 113, и последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 168. В некоторых вариантах осуществления изобретения scFab содержит последовательность CDRH1, представленную в SEQ ID NO: 106, последовательность CDRH2, представленную в SEQ ID NO: 107 или 121, последовательность CDRH3, представленную в SEQ ID NO: 108, последовательность CDRL1, представленную в SEQ ID NO: 169, последовательность CDRL2, представленную в SEQ ID NO: 170, и последовательность CDRL3, представленную в SEQ ID NO: 171. В некоторых вариантах осуществления scFab содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 218-219 или 226-227.

"Fv" представляет собой небольшой фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий сайт. Этот фрагмент обычно состоит из димера одного домена вариабельной области тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания.

"Одноцепочечный Fv", также сокращенно "sFv" или "scFv", представляют собой фрагменты антител, которые содержат домены антител V_H и V_L, соединенные в одну полипептидную цепь. В некоторых вариантах осуществления полипептид scFv содержит полипептидный линкер, расположенный между доменами V_H и V_L и связывающий их, что позволяет scFv сохранять или формировать желаемую структуру для связывания антигена. Такой пептидный линкер может быть включен в слитый полипептид с использованием стандартных методик, хорошо известных в данной области техники. Дополнительно или поочередно, Fv может иметь дисульфидную связь, образованную между VH и VL и стабилизирующим их. Обзор scFv см. в Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит scFv, содержащий домен VH, домен VL и пептидный линкер, связывающий домен VH с доменом VL. В частных вариантах осуществления scFv содержит домен VH, связанный с доменом VL пептидным линкером, который может находиться в ориентации VH-линкер-VL или в ориентации VL-линкер-VH. Любой scFv по настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, что С-концевой домен VL связан короткой пептидной последовательностью с N-концом домена VH или наоборот (т.е., (N)VL(C)-линкер-(N)VH(C) или (N)VH(C)-линкер-(N)VL(C). В качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления линкер может быть связан с N-концевой частью или концом домена VH, домена VL или обоими.

Последовательности пептидных линкеров могут быть выбраны, например, на основании: (1) их способности принимать гибкую расширенную конформацию; (2) их неспособности или отсутствия способности принимать вторичную структуру, которая может взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах и/или на молекуле-мишени; и/или (3) отсутствия или относительного отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могут взаимодействовать с полипептидами и/или молекулой-мишенью. Другие соображения, касающиеся конструкции линкера (например, длина), могут включать конформацию или диапазон конформаций, в которых VH и VL могут образовывать функциональный антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления пептидные линкерные последовательности содержат, например, остатки Gly, Asn и Ser. Другие близкие нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala, также могут применяться в линкерной последовательности. Другие аминокислотные последовательности, которые могут быть использованы в качестве линкера, включают те, которые описаны в Maratea и др., Gene 40:39 46 (1985); Murphy м др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); патент США № 4935233 и патенте США No. 4,751,180. Другие иллюстративные и неограничивающие примеры линкеров могут включать, например, Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (SEQ ID NO: 215) (Chaudhary и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990)) и Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 216) (Bird и др., Science 242:423-426 (1988)) и пентамер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 217), когда они присутствуют в одной итерации или повторяются от 1 до 5 или более раз или более; см., например, SEQ ID NO: 213. Может быть использован любой подходящий линкер, и, как правило, он может иметь длину около 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 15 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 аминокислот или менее чем около 200 аминокислот в длину и предпочтительно будет содержать гибкую структуру (может обеспечивать гибкость и пространство для конформационного движения между двумя областями, доменами, мотивами, фрагментами или модулями, соединенными линкером) и предпочтительно будет биологически инертным и/или иметь низкий риск иммуногенности у человека. Иллюстративные линкеры включают те, которые содержат или состоят из аминокислотной последовательности, изложенной в любой одной или более из SEQ ID NO: 206-217. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 75% (т.е. по меньшей мере около 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 206-217.

scFv может быть сконструирован с использованием любой комбинации последовательностей VH и VL или любой комбинации последовательностей CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 105 или SEQ ID NO: 113, и последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 168. В некоторых вариантах осуществления изобретения scFab содержит последовательность CDRH1, представленную в SEQ ID NO: 106, последовательность CDRH2, представленную в SEQ ID NO: 107 или 121, последовательность CDRH3, представленную в SEQ ID NO: 108, последовательность CDRL1, представленную в SEQ ID NO: 169, последовательность CDRL2, представленную в SEQ ID NO: 170, и последовательность CDRL3, представленную в SEQ ID NO: 171. В некоторых вариантах осуществления scFv может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 220-221 или SEQ ID NO: 228-229.

В некоторых вариантах осуществления изобретения линкерные последовательности не требуются; например, когда первый и второй полипептиды имеют несущественные N-концевые аминокислотные области, которые могут быть использованы для разделения функциональных доменов и предотвращения стерической интерференции.

Во время разработки антитела, ДНК в в локусах гена изменения (V), соединения (J), и разнообразия (D) может быть перестроена, и могут происходить вставки и/или делеции нуклеотидов в кодирующей последовательности. Соматические мутации могут быть кодированы полученной последовательностью и могут быть идентифицированы со ссылкой на соответствующую известную последовательность зародышевой линии. В некоторых контекстах соматические мутации, которые не являются критическими для необходимого свойства антитела (например, связывание с антигеном SARS-CoV-2) или которые придают нежелательное свойство антителу (например, повышенный риск иммуногенности у субъекта, которому вводят антитело), или и то, и другое, могут быть заменены соответствующей аминокислотой, кодируемой зародышевой линией, или другой аминокислотой, так что необходимое свойство антитела улучшается или поддерживается, а нежелательное свойство антитела уменьшается или нейтрализуется. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит по меньшей мере еще одну аминокислоту, кодируемую зародышевой линией в вариабельной области по сравнению с исходным антителом или антигенсвязывающим фрагментом, при условии, что исходное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более соматических мутаций. Аминокислотные последовательности вариабельной области и CDR примерных антител против SARS-CoV-2 по настоящему изобретению представлены в таблице 2 настоящего документа.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную модификацию (например, мутацию по типу замены) для устранения нежелательного риска окисления, дезамидирования и/или изомеризации.

В настоящем документе также предложены варианты антител, которые содержат одно или более аминокислотных изменений в вариабельной области (например, VH, VL, каркасной области или CDR) по сравнению с раскрытым в настоящем документе ("исходным") антителом, где вариантное антитело способно связываться с антигеном SARS-CoV-2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% (т.е.85%, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичности с аминокислотной последовательностью согласно любой из SEQ ID NO: 1, 9-15, 23, 24, 27, 28-46, 55, 63, 79, 87, 95, 103, 105, 113-120, 129-146, 155, 172, 176-178, 194, 196, 198, 200, 202 и 239, где вариация необязательно ограничена одной или более каркасными областями и/или вариация содержит одну или более замен аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; и/или (ii) VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% (т.е.85%, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичности с аминокислотной последовательностью согласно любой из SEQ ID NO: 5, 47-50, 59, 67, 71-72, 75, 76, 83, 91, 99, 109, 147-150, 159, 168, 182, 190, 234 и 243, где вариация необязательно ограничивается одной или более каркасными областями и/или вариация содержит одну или более замену аминокислоты, кодируемой зародышевой линией.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности VH и VL, которые кодируются или являются такими же, как аминокислотные последовательности VH и VL, которые кодируются:

(i) геном VH1-18 и геном VK3-20, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH1-18 и VK3-20, соответственно;

(ii) аллелем VH3-7 и аллелем VL3-25, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH3-7 и VL3-25, соответственно;

(iii) аллелем VH3-23 и аллелем VK1-5, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH3-23 и VK1-5, соответственно;

(iv) аллелем VH3-13 и аллелем VK1-39, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH3-13 и VK1-39, соответственно;

(v) аллелем VH1-18 и аллелем VK3-11, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH1-18 и VK3-11, соответственно; или

(vi) аллелем VH1-69 и аллелем VL2-23, соответственно, или которые кодируются полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с VH1-69 и VL2-23, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит или состоит из любой аминокислотной последовательности VH, представленной в таблице 2, и VL содержит или состоит из любой аминокислотной последовательности VL, приведенной в таблице 2. В частных вариантах осуществления VH и VL содержат или состоят из аминокислотных последовательностей согласно SEQ ID NO: (i) 1 и 5 или 234, соответственно; (ii) любой из 9-15 и 5 или 234, соответственно; (iii) 23 или 24 и 5 или 234, соответственно; (iv) 27 и 5 или 234, соответственно; (v) любой из 28-46 и 5 или 234, соответственно; (vi) 1 и любой из 47-50, соответственно; (vii) любой из 9-15 и любой из 47-50, соответственно; (viii) 23 или 24 и любой из 47-50, соответственно; (ix) 27 и любой из 47-50, соответственно; (x) любой из 28-46 и любой из 47-50, соответственно; (xi) 55 и 59, соответственно; (xii) 63 и 67, соответственно; (xiii) 63 и 71 или 72, соответственно; (xiv) 63 и 75 или 76, соответственно; (xv) 79 и 83, соответственно; (xvi) 87 и 91, соответственно; (xvii) 95 и 99, соответственно; (xviii) 103 и 99, соответственно; (xiv) 105 и 109 или 168, соответственно; (xx) любой из 113-120 и 109 или 168, соответственно; (xxi) 129 и 109 или 168, соответственно; (xxii) любой из 130-146 и 109 или 168, соответственно; (xxiii) 105 и любой из 147-150, соответственно; (xxiv) любой 113-120 и любой из 147-150, соответственно; (xxv) любой из 130-146 и любой из 147-150, соответственно; (xxvi) 155 и 159, соответственно; (xxvii) 172 и 168, соответственно; (xxviii) 176 или 177 и 5 или любой из 47-50, соответственно; (xxix) 178 и 182 или 190, соответственно (т.е. 178 и 182, соответственно, или 178 и 190, соответственно); (xxx) 194 и 182, соответственно; (xxxi) 196 и 182, соответственно; (xxxii) 198 и 182, соответственно; (xxxiii) 200 и 182, соответственно; (xxxiv) 202 и 182, соответственно; или (xxxv) 239 и 243, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антиген или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:79, и VL, содержащий или состоящую из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:83. В дополнительных вариантах осуществления антиген или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:79, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:83, и связывается с S-белком SARS-CoV-2 с K_D менее чем около 4,5×10^-9 M, менее чем около 5×10^-9 M, менее чем около 1×10^-10 M, менее чем около 5×10^-10 M, менее чем около 1×10^-11 M, менее чем около 5×10^-11 M, менее чем около 1×10^-12 M или менее чем около 5×10^-12 M. В дополнительных вариантах осуществления антиген или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 79, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 83 и способную нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 или вирус, псевдотипированный SARS-CoV-2, с IC50 от около 16 до около 20 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:105, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:105, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168, и связывается с S-белком SARS-CoV-2 с K_D менее чем около 4,5×10^-9 M, менее чем около 5×10^-9 M, менее чем около 1×10^-10 M, менее чем около 5×10^-10 M, менее чем около 1×10^-11 M, менее чем около 5×10^-11 M, менее чем около 1×10^-12 M или менее чем около 5×10^-12 M. В дополнительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:105, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168 и способную нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 или вирус, псевдотипированный SARS-CoV-2, с IC50 от около 0,3 до около 0,4 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:105, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168, и связывается с S-белком RBD SARS-CoV-2 с EC50 (полумаксимальная эффективная концентрация) от около 11 до около 25 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:113, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168, и связывается с S-белком RBD SARS-CoV-2 с EC50 от около 9 до около 23 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:129, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168, и связывается с S-белком RBD SARS-CoV-2 с EC50 от около 8 до около 22 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:119, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168, и связывается с S-белком RBD SARS-CoV-2 с EC50 от около 8 до около 22 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:172, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:168, и связывается с S-белком RBD SARS-CoV-2 с EC50 от около 7 до около 19 нг/мл.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению является моноспецифическим (например, связывается с одним эпитопом) или является полиспецифическим (например, связывается с несколькими эпитопами и/или молекулами-мишенями). Антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть сконструированы в различных форматах. Примерные форматы антител, описанные в Spiess и др., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015), и в Brinkmann и Kontermann, mAb 9(2): 182-212 (2017), форматы и способы их получения включены в настоящий документ посредством ссылки и включают, например, активаторы биспецифических Т-клеток (BiTE), DART, сборки "выступ-во-впадину" (KIH), сборки scFv-CH3-KIH, KIH антитела с общей легкой цепью, TandAbs, тройные тела, мини-тела TriBi, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab') 2-scFv2, четырехвалентные HCabs, интратела, CrossMabs, Fabs двойного действия (DAFs) (два в одном или четыре в одном), DutaMabs, DT-IGG, пары зарядов, Fab-arm Exchange, SEEDbodies, Triomabs, LZ-Y сборки, Fcabs, κλ-тела или ортотела Fabs, DVDgs (например, патент США № 8,258,268, форматы, которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылки), IgFv- IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, и DVI-IgG, так же так называемые, как и FIT-Ig (например, публикация РСТ № WO 2015/103072, форматы которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки), так называемые форматы WuxiBody (например, публикация РСТ № WO 2019/057122, форматы которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки), и так называемые форматы Ig In-Elbow-Insert (вставка в изгиб) (IEI-Ig; например, публикации PCT № WO 2019/024979 и WO 2019/025391, форматы которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки).

В некоторых вариантах осуществления указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит два или более доменов VH, два или более доменов VL или и то, и другое (т.е., два или более доменов VH и два или более доменов VL). В частных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент содержит формат (от N-конца к C-концу) VH-линкер-VL-линкер-VH-линкер-VL, где две последовательности VH могут быть одинаковыми или разными, и две последовательности VL могут быть одинаковыми или разными. Такие связанные scFv могут включать любую комбинацию доменов VH и VL, предназначенных для связывания с данной мишенью, и в форматах, содержащих два или более VH и/или два или более VL, могут быть связаны один, два или более различных эпитиопов или антигенов. Следует понимать, что форматы, включающие несколько антигенсвязывающих доменов, могут включать последовательности VH и/или VL в любой комбинации или ориентации. Например, антигенсвязывающий фрагмент может содержать формат VL-линкер-VH-линкер-VL-линкер-VH, VH-линкер-VL-линкер-VL-линкер-VH или VL-линкер-VH-линкер-VH-линкер-VL.

Моноспецифические или полиспецифические антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию последовательностей VH и VL и/или любую комбинацию последовательностей CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO:105 или SEQ ID NO:113, и последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 168. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность CDRH1, представленную в SEQ ID NO: 106, последовательность CDRH2, представленную в SEQ ID NO: 107 или 121, последовательность CDRH3, представленную в SEQ ID NO: 108, последовательность CDRL1, представленную в SEQ ID NO: 169, последовательность CDRL2, представленную в SEQ ID NO: 170, и последовательность CDRL3, представленную в SEQ ID NO: 171. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 222-225 или 230-233. Биспецифическое или полиспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может, в некоторых вариантах осуществления изобретения, содержать один, два или более антигенсвязывающих доменов (например, VH и VL) согласно настоящему описанию. Могут присутствовать два или более связывающих домена, которые связываются с одним и тем же или другим эпитопом SARS-CoV-2, и биспецифическое или полиспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем документе, могут, в некоторых вариантах осуществления, содержать дополнительный связывающий домен SARS-CoV-2 и/или могут содержать связывающий домен, который вообще связывается с другим антигеном или патогеном.

В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут быть полиспецифическими; например, биспецифическими, триспецифическими или т. п.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (i) первый VH и первый VL; и (ii) второй VH и второй VL, где первый VH и второй VH являются различными и каждый независимо содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% (т.е.85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1, 9-15, 23, 24, 27-46, 55, 63, 79, 87, 95, 103, 105, 113-120, 129-146, 155, 172, 176-178, 194, 196, 198, 200, 202 и 239, и где первый VL и второй VL являются различными, и каждая независимо содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% (т.е.85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 5, 47-50, 59, 67, 71, 72, 75, 76, 83, 91, 99, 109, 147-150, 159, 168, 182, 190, 234 и 243, и где первая VH и первая VL вместе образуют первый антигенсвязывающий сайт, и где второй VH и второй VL вместе образуют второй антигенсвязывающий сайт.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит полипептид Fc или его фрагмент. "Fc" содержит карбоксиконцевые части (т.е. домены IgG CH2 и CH3 ) обеих цепей антитела H, удерживаемых вместе дисульфидами. "Эффекторные функции" антитела относятся к биологической активности, относящейся к Fc-области (Fc-области нативной последовательности или Fc-области варианта аминокислотной последовательности) антитела, и варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов поверхности клетки (например, рецептора B-клеток); и активацию B-клеток. Как обсуждается в настоящем документе, модификации (например, аминокислотные замены) могут быть сделаны в Fc-домене с целью модификации (например, улучшения, уменьшения или удаления) одной или более функциональных групп Fc-содержащего полипептида (например, антитела по настоящему изобретению). Такие функции включают, например, связывание с Fc-рецептором (FcR), модуляцию периода полужизни антитела (например, путем связывания с FcRn), функцию ADCC, связывание с белком A, связывание с белком G и связывание с комплементом. Аминокислотные модификации, которые модифицируют (например, улучшают, уменьшают или удаляют) Fc-функции, включают, например, TT250Q/M428L, M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F, M428L/N434S, E233P/L234V/L235A/G236 + A327G/A330S/P331S, E333A, S239D/A330L/I332E, P257I/Q311, K326W/E333S, S239D/I332E/G236A, N297Q, K322A, S228P, L235E + E318A/K320A/K322A, L234A/L235A (также называемые в настоящем документе «LALA») и мутации L234A/L235A/P329G, которые обобщены и аннотированы в «Сконструированных Fc-областей», опубликованных InvenGo (2011) и доступны в Интернете по адресу invivogenPreview.com/DFre/review-Eng-Egene-Fegogen-in-in.pdf.utm_source=review&utm_medium=pdf&utm_campaign=review&utm_content=Engineered-Fc-Regions, и включены в настоящий документ посредством ссылки. Если из контекста не следует иное, аминокислотные остатки Fc пронумерованы в настоящем документе в соответствии с системой нумерации EU.

Например, для активации каскада комплемента белковый комплекс C1q может связываться по меньшей мере с двумя молекулами IgG1 или одной молекулой IgM, когда к антигенной мишени присоединена (Ward, E. S., и Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94). Burton, D. R., раскрыл (Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206), что область тяжелой цепи, содержащая аминокислотные остатки в положении 318 до 337, участвует в фиксации комплемента. Duncan, A. R., и Winter, G. (Nature 332 (1988) 738-740), используя сайт-специфический мутагенез, сообщили, что Glu318, Lys320 и Lys322 образуют сайт связывания с C1q. Роль остатков Glu318, Lys320 и Lys 322 в связывании C1q была подтверждена способностью короткого синтетического пептида, содержащего эти остатки, ингибировать опосредованный комплементом лизис.

Например, связывание FcR может быть опосредовано взаимодействием Fc-фрагмента (антитела) с Fc-рецепторами (FcR), которые представляют собой специализированные рецепторы клеточной поверхности на клетках, включая гемопоэтические клетки. Fc-рецепторы принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов и, как показано, опосредуют как удаление патогенов, покрытых антителами, путем фагоцитоза иммунных комплексов, так и лизис эритроцитов и различных других клеточных мишеней (например, опухолевых клеток), покрытых соответствующим антителом, посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC; Van de Winkel, J. G., и Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcR определяются их специфичностью для классов иммуноглобулинов; Fc-рецепторы для антител IgG называются FcγR, для IgE - FcεR, для IgA - FcαR и так далее, а неонатальные Fc-рецепторы называются FcRn. Связывание с Fc-рецептором описано, например, в Ravetch, J. V., и Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., и др., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; и Gessner, J. E., и др., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.

Перекрестное сшивание рецепторов Fc-доменом нативных антител IgG (FcγR) запускает широкий спектр эффекторных функций, включая фагоцитоз, антителозависимую клеточную цитотоксичность и высвобождение воспалительных медиаторов, а также клиренс иммунного комплекса и регуляцию продукции антител. В настоящем документе рассматриваются Fc-фрагменты, обеспечивающие перекрестное сшивание рецепторов (например, FcγR). У человека к настоящему времени были охарактеризованы три класса FcγR, которые представляют собой: (i) FcγRI (CD64), который связывает мономерный IgG с высокой аффинностью и экспрессируется на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах и эозинофилах; (ii) FcγRII (CD32), который связывает комплексный IgG со средним или низким сродством, широко экспрессируется, в частности, на лейкоцитах, который, как полагают, является центральным игроком в опосредованном антителом иммунитете, и который может быть разделен на FcγRIIA, FcγRIIB и FcγRIIC, которые выполняют различные функции в иммунной системе, но связываются с подобной низкой аффиностью с IgG-Fc, и эктодомены этих рецепторов являются высоко гомологичными; и (iii) FcγRIII (CD16), который связывает IgG со средним или низким сродством и был обнаружен в двух формах: FcγRIIIA, который был обнаружен на NK-клетках, макрофагах, эозинофилах и некоторых моноцитах и T-клетках, и, как полагают, опосредует ADCC и FcγRIIIB, который высоко экспрессируется на нейтрофилах.

FcγRIIA обнаружен во многих клетках, участвующих в уничтожении (например, макрофагах, моноцитах, нейтрофилах), и, по-видимому, способен активировать процесс уничтожения. FcγRIIB, по-видимому, играет роль в ингибирующих процессах и обнаруживается на В-клетках, макрофагах и на тучных клетках и эозинофилах. Важно отметить, что 75% всех FcγRIIB обнаружено в печени (Ganesan, L. P. и др., 2012: "FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes," Journal of Immunology 189: 4981-4988). FcγRIIB обильно экспрессируется на синусоидальном эндотелии печени, называемом LSEC, а в клетках Купфера в печени и LSEC являются основным местом клиренса малых иммунных комплексов (Ganesan, L. P. и др., 2012: FcγRIIb на синусоидальном эндотелии печени очищает малые иммунные комплексы. Journal of Immunology 189: 4981-4988).

В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в данном документе, и их антигенсвязывающие фрагменты содержат полипептид Fc или его фрагмент для связывания с FcγRIIb, в частности, область Fc, такую как, например, антитела IgG-типа. Кроме того, можно сконструировать Fc-фрагмент для усиления связывания FcγRIIB путем введения мутаций S267E и L328F, как описано Chu, S.Y. и др., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933. Таким образом, клиренс иммунных комплексов может быть увеличен (Chu, S., и др., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An Fc-Engineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcγRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts). В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты содержат сконструированный фрагмент Fc с мутациями S267E и L328F, в частности, как описано в Chu, S.Y. и др., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-edineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933.

На В-клетках FcγRIIB может функционировать для подавления дальнейшей продукции иммуноглобулина и переключения изотипа на, например, класс IgE. Считается, что на макрофагах FcγRIIB ингибирует фагоцитоз, опосредованный через FcγRIIA. На эозинофилах и тучных клетках В-форма может способствовать подавлению активации этих клеток посредством связывания IgE с отдельным рецептором.

Что касается связывания FcγRI, модификация в нативном IgG по меньшей мере одного из E233-G236, P238, D265, N297, A327 и P329 снижает связывание с FcγRI. Остатки IgG2 в положениях 233-236, замещенные в соответствующие положения IgG1 и IgG4, снижают связывание IgG1 и IgG4 с FcγRI в 10³ раза и устраняют моноцитарный ответ человека на сенсибилизированные антителами эритроциты (Armour, K. L., и др. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

Что касается связывания FcγRII, то обнаружено снижение связывания с FcγRIIA, например, для мутации IgG по меньшей мере одного из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 и K414.

Двумя аллельными формами FcγRIIA человека являются вариант "H131", который связывается с Fc IgG1 с высокой аффинностью, и вариант "R131", который связывается с Fc IgG1 с низкой аффинностью. См., например, Bruhns и др., Blood 113:3716-3725 (2009).

Что касается связывания FcγRIII, то обнаружено снижение связывания с FcγRIIIA, например, для мутации по меньшей мере одного из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 и D376. Картирование сайтов связывания на IgG1 человека для Fc-рецепторов, вышеупомянутые сайты мутации и способы измерения связывания с FcγRI и FcγRIIA описаны в Shields, R. L., и др., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

Двумя аллельными формами FcγRIIIA человека являются вариант "F158", который связывается с Fc IgG1 с низкой аффинностью, и вариант "V158", который связывается с Fc IgG1 с высокой аффинностью. См., например, Bruhns и др., Blood 113:3716-3725 (2009).

Что касается связывания с FcγRII, то две области нативного Fc IgG, по-видимому, участвуют во взаимодействии между FcγRII и IgG, а именно (i) нижний шарнирный сайт Fc IgG, в частности, аминокислотные остатки L, L, G, G (234 - 237, нумерация EU), и (ii) смежная область домена CH2 Fc IgG, в частности, петля и цепи в верхнем домене CH2, прилегающие к нижней шарнирной области, например, в области P331 (Wines, B.D., и др., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318). Кроме того, FcγRI, по-видимому, связывается с одним и тем же сайтом на Fc IgG, тогда как FcRn и белок A связываются с другим сайтом на Fc IgG, который, по-видимому, находится на границе раздела CH2-CH3 (Wines, B.D., и др., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318).

Также рассматриваются мутации, которые увеличивают аффинность связывания полипептида Fc или его фрагмента по настоящему изобретению с (т.е., одним или более) рецептором Fcγ (например, по сравнению с эталонным полипептидом Fc или его фрагментом или содержащим его, который не содержит мутацию (мутации); например, полипептидом Fc дикого типа или его фрагментом (например, того же изотипа, что и полипептид Fc или его фрагмент, который содержит мутацию или мутации) или полипептидом Fc или его фрагментом, который иным образом идентичен или по существу идентичен полипептиду Fc или его фрагменту, который содержит мутацию или мутации). См., например, Delillo и Ravetch, Cell 161(5):1035-1045 (2015) и Ahmed и др., J. Struc. Biol. 194(1):78 (2016), мутации Fc и методики которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут содержать полипептид Fc или его фрагмент, содержащий мутацию, выбранную из G236A; S239D; A330L; и I332E; или комбинацию, включающую любые две или более из них; например, S239D/I332E; S239D/A330L/I332E; G236A/S239D/I332E; G236A/A330L/I332E (также называемую в настоящем документе "GAALIE"); или G236A/S239D/A330L/I332E. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид Fc или его фрагмент не содержит S239D. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc или его фрагмент содержит S в положении 239.

В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc или его фрагмент может содержать или состоять по меньшей мере из части полипептида Fc или его фрагмента, которая участвует в связывании со связыванием FcRn. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc или его фрагмент содержит одну или более аминокислотных модификаций, которые улучшают аффинность связывания с (например, усиливают связывание с) FcRn (например, при рН около 6,0) и, таким образом, в некоторых вариантах осуществления продлеваютпериод полувыведения молекулы in vivo, содержащей полипептид Fc или его фрагмент (например, по сравнению с эталонным (например, дикого типа) полипептидом Fc или его фрагментом или антителом, которое в противном случае является таким же, но не содержит модификацию (модификации)). В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc или его фрагмент содержит или получен от Fc IgG, и мутация, продлевающая период полувыведения, включает одну любую одну или более из: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I Q311I; D376V; T307A; E380A (нумерация EU). В некоторых вариантах осуществления мутация, продлевающая период полувыведения, включает M428L/N434S (также называемая в данном документе "MLNS" или "LS"). В некоторых вариантах осуществления мутация, продлевающая период полувыведения, включает M252Y/S254T/T256E. В некоторых вариантах осуществления мутация, продлевающая период полувыведения, включает T250Q/M428L. В некоторых вариантах осуществления мутация, продлевающая период полувыведения, включает P257I/Q311I. В некоторых вариантах осуществления мутация, продлевающая период полувыведения, включает P257I/N434H. В некоторых вариантах осуществления мутация, продлевающая период полувыведения, включает D376V/N434H. В некоторых вариантах осуществления мутация, продлевающая период полувыведения, включает T307A/E380A/N434A.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент включает Fc-фрагмент, который содержит замены M428L/N434S. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент включает полипептид Fc или его фрагмент, который содержит замены мутаций G236A/A330L/I332E. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит (например, IgG) Fc-фрагмент, который содержит мутацию G236A, мутацию A330L и мутацию I332E (GAALIE) и не содержит мутацию S239D (например, содержит нативный S в положении 239). В частных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент включает полипептид Fc или его фрагмент, который содержит мутации по типу замены: M428L/N434S и G236A/A330L/I332E, и необязательно не содержит S239D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает полипептид Fc или его фрагмент, который содержит мутации по типу замены: M428L/N434S и G236A/S239D/A330L/I332E.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию, которая изменяет гликозилирование, где мутация, которая изменяет гликозилирование, включает N297A, N297Q или N297G, и/или антитело или антигенсвязывающий фрагмент частично или полностью агликозилировано и/или частично или полностью афукозилировано. Известны линии клеток-хозяев и способы получения частично или полностью агликозилированных или частично или полностью афукозилированных антител и антигенсвязывающих фрагментов (см., например, публикацию РСТ № WO 2016/181357; Suzuki и др. Clin. Cancer Res. 13(6):1875-82 (2007); Huang и др. MAbs 6:1-12 (2018)).

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент способны вызывать непрерывную защиту in vivo у субъекта, даже если у субъекта не могут быть обнаружены детектируемые уровни антитела или антигенсвязывающего фрагмента (то есть, если антитело или антигенсвязывающий фрагмент было удалено от субъекта после введения). Такая защита упоминается в настоящем документе как вакцинальный эффект. Не ограничиваясь теорией, полагают, что дендритные клетки могут интернализировать комплексы антитела и антигена и после этого индуцировать или способствовать эндогенному иммунному ответу против антигена. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более модификаций, таких как, например, мутации в Fc, содержащие G236A, A330L и I332E, которые способны активировать дендритные клетки, которые могут индуцировать, например, иммунитет Т-клеток к антигену.

В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит полипептид Fc или его фрагмент, включая CH2 (или его фрагмент, CH3 (или его фрагмент) или CH2 и CH3, где CH2, CH3 или оба могут быть любого изотипа и могут содержать аминокислотные замены или другие модификации по сравнению с соответствующим CH2 или CH3 дикого типа, соответственно. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc по настоящему изобретению содержит два полипептида CH2-CH3, которые ассоциируются с образованием димера.

В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент может быть моноклональным. Термин "моноклональное антитело" (mAb) в настоящем документе относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, то есть отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением возможных естественно присутствующих мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, поскольку они направлены против одной области детерминанты. Кроме того, по сравнению с препаратами поликлональных антител, содержащими различные антитела, направленные против различных эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена. Кроме специфичности, моноклональные антитела обладают преимуществом, заключающимся в том, что их можно синтезировать в виде, не загрязненном другими антителами. Определение «моноклональный» не следует толковать как требующий продуцирования антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, пригодные для применения в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью гибридомной методики, впервые описанной Kohler и др., Nature 256:495 (1975), или могут быть получены с использованием способов рекомбинантной ДНК в клетках бактерий, эукариотических животных или растений (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из библиотек фаговых антител с использованием методик, описанных в Clackson и др., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks и др., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), например. Моноклональные антитела также могут быть получены с использованием способов, описанных в публикации РСТ № WO 2004/076677A2.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению включают «химерные антитела», в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (см. патент США № 4,816,567; 5,530,101 и 7,498,415; и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Например, химерные антитела могут содержать человеческие и нечеловеческие остатки. Кроме того, химерные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорском антителе. Эти модификации сделаны для дополнительного улучшения характеристик антител. Для получения дополнительной информации см. Jones и др., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann и др., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992). Химерные антитела также включают приматизированные и гуманизированные антитела.

«Гуманизированное антитело» обычно считают антителом человека, которое содержит один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти аминокислотные остатки нечеловеческого происхождения обычно берут из вариабельного домена. Гуманизация может быть выполнена по методу Winter и сотрудников (Jones и др., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann и др., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen и др., Science, 239:1534-1536 (1988)), путем замены нечеловеческих вариабельных последовательностей на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4,816,567; 5,530,101 и 7,498,415), где по существу менее, чем интактный вариабельный домен человека, замещен соответствующей последовательностью из вида, не являющегося человеком. В некоторых случаях «гуманизированное» антитело представляет собой антитело, которое продуцируется нечеловеческой клеткой или клеткой животного, и содержит человеческие последовательности, например, домены H_C.

«Антитело человека» представляет собой антитело, содержащее только последовательности, которые присутствуют в антителе, продуцируемом человеком. Однако в данном контексте человеческие антитела могут содержать остатки или модификации, не обнаруженные в природном человеческом антителе (например, антителе, выделенном из человека), включая те модификации и варианты последовательностей, которые описаны в данном документе. Они, как правило, выполняются для дополнительного улучшения или повышения характеристик антител. В некоторых случаях антитела человека продуцируются трансгенными животными. Например, см. патент США № 5,770,429; 6,596,541 и 7,049,426.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению является химерным, гуманизированным или человеческим.

Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют любое из описанных в настоящем документе антител или их антигенсвязывающий фрагмент, или их часть (например, CDR, VH, VL, тяжелую цепь или легкую цепь). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке-хозяине. После того, как кодирующая последовательность известна или идентифицирована, оптимизация кодонов может быть выполнена с использованием известных методик и инструментов, например, с использованием инструмента GenScript® OptimiumGene™ или Gen Synthesis by GeneArt® (ThermoFisher); см. также Scholten и др., Clin. Immunol. 119:135, 2006). Кодон-оптимизированные последовательности включают последовательности, которые частично кодон-оптимизированы (то есть, один или множество кодонов оптимизированы для экспрессии в клетке-хозяине), и те, которые полностью кодон-оптимизированы.

Следует также понимать, что полинуклеотиды, кодирующие антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, могут обладать различными нуклеотидными последовательностями, при этом все еще кодируя одно и то же антитело или антигенсвязывающий фрагмент из-за, например, вырожденности генетического кода, сплайсинга и т. п.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 50% (т.е. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью полинуклеотидной последовательности согласно любой одной или более из SEQ ID NO:186-189, 191-192, 238, 247, 248-250, 254-255 и 257-262.

Следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержится в полинуклеотиде, который содержит другие последовательности и/или признаки, например, экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента в клетке-хозяине. Примерные признаки включают последовательность промотора, последовательность полиаденилирования, последовательность, которая кодирует сигнальный пептид (например, расположенный на N-конце экспрессированной тяжелой цепи антитела или легкой цепи), или тому подобное. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид дополнительно содержит полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% идентичности с, содержащей или состоящей из полинуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:251-253 и 263. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует сигнальный пептид (также называемый лидерной последовательностью), имеющий по меньшей мере 90% идентичности с, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 256 или SEQ ID NO: 264.

В любом из раскрытых в настоящем документе вариантов осуществления полинуклеотид может содержать дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК). В некоторых вариантах осуществления изобретения РНК включает матричную РНК (мРНК).

Также предложены векторы, где векторы содержат или включают полинуклеотид, описанный в настоящем документе (например, полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SARS-CoV-2). Вектор может содержать любой один или более из векторов, описанных в настоящем документе. В частных вариантах осуществления предложен вектор, который содержит конструкцию ДНК-плазмиды, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или их часть (например, так называемое "DMAb"; см., например, Muthumani и др., J Infect Dis. 214(3):369-378 (2016); Muthumani и др., Hum Vaccin Immunother 9:2253-2262 (2013)); Flingai и др., Sci Rep. 5:12616 (2015); и Elliott и др., NPJ Vaccines 18 (2017), где конструкции ДНК, кодирующие антитело, и родственные способы применения, включая введения того же самого, включены в настоящий документ в качестве ссылки).). В некоторых вариантах осуществления конструкция ДНК-плазмиды содержит одну открытую рамку считывания, кодирующую тяжелую цепь и легкую цепь (или VH и VL) антитела или антигенсвязывающего фрагмента, где последовательность, кодирующая тяжелую цепь, и последовательность, кодирующая легкую цепь, необязательно разделены полинуклеотидом, кодирующим сайт расщепления протеазой, и/или полинуклеотидом, кодирующим саморасщепляющийся пептид. В некоторых вариантах осуществления заместительные компоненты антитела или антигенсвязывающего фрагмента кодируются полинуклеотидом, содержащимся в одной плазмиде. В других вариантах осуществления заместительные компоненты антитела или антигенсвязывающего фрагмента кодируются полинуклеотидом, содержащимся в двух или более плазмидах (например, первая плазмида содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, VH или VH+CH, а вторая плазмида содержит полинуклеотид, кодирующий родственную легкую цепь, VL или VL+CL). В некоторых вариантах осуществления одна плазмида содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь из двух или более антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению. Иллюстративный вектор экспрессии представляет собой pVax1, доступный от Invitrogen®. ДНК-плазмида по настоящему изобретению может быть доставлена субъекту, например, с помощью электропорации (например, внутримышечной электропорации) или с соответствующим составом (например, гиалуронидазой). В некоторых вариантах осуществления вектор согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Сигнальный пептид может присутствовать или не присутствовать (например, может быть ферментативно отщеплен от) на зрелом антителе или антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 252 или SEQ ID NO: 263, и/или сигнальный пептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:256 или SEQ ID NO: 264. В некоторых вариантах осуществления вектор согласно настоящему изобретению содержит сигнальную последовательность полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность полиаденилирования содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 253.

В некоторых вариантах осуществления вектор согласно настоящему изобретению содержит промотор CMV. В некоторых вариантах осуществления промотор содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 251.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, экспрессирующей антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению; или содержащей или включающей вектор или полинуклеотид согласно настоящему изобретению.

Примеры таких клеток включают, но не ограничиваются ими, эукариотические клетки, например, дрожжевые клетки, клетки животных, клетки насекомых, клетки растений; и прокариотические клетки, включая E. coli. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки представляют собой клетки млекопитающих. В некоторых таких вариантах осуществления клетки представляют собой клеточную линию млекопитающих, такую как клетки CHO (например, клетки DHFR- CHO (Urlaub и др., PNAS 77:4216 (1980)), эмбриональные клетки почек человека (например, клетки HEK293T), клетки PER.C6, клетки Y0, клетки Sp2/0. Клетки NS0, клетки печени человека, например, клетки Hepa RG, клетки миеломы или клетки гибридомы. Другие примеры линий клеток-хозяев млекопитающих включают клетки Сертоли мыши (например, клетки TM4); линию CV1 почки обезьяны, трансформированную SV40 (COS-7); клетки почки новорожденного хомяка (BHK); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки почки обезьяны (CV1); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы Buffalo (BRL 3A); опухоль молочной железы мыши (MMT 060562); клетки TRI; клетки MRC 5; и клетки FS4. Линии клеток-хозяев млекопитающих, подходящие для продукции антител, также включают те, которые описаны, например, в Yazaki и Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003).

В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, такую как E. coli. Экспрессия пептидов в прокариотических клетках, таких как E. coli , хорошо известна (см., например, Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). Например, антитела можно продуцировать в бактериях, в частности, если гликозилирование и Fc-эффекторные функции не нужны. Экспрессию фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, в патенте США № 5,648,237; 5,789,199; и 5,840,523.

В частных вариантах осуществления клетка может быть трансфицирована вектором в соответствии с настоящим описанием с вектором экспрессии. Термин "трансфекция" относится к введению молекул нуклеиновых кислот, таких как молекулы ДНК или РНК (например, мРНК), в клетки, такие как эукариотические клетки. В контексте настоящего описания термин «трансфекция» охватывает любой известный специалисту способ введения молекул нуклеиновых кислот в клетки, например, в эукариотические клетки, в том числе в клетки млекопитающих. Такие способы включают, например, электропорацию, липофекцию, например, на основе катионных липидов и/или липосом, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию на основе наночастиц, трансфекцию на основе вируса или трансфекцию на основе катионных полимеров, таких как DEAE-декстран или полиэтиленимин и т.д. В некоторых вариантах осуществления введение является невирусным.

Кроме того, клетки-хозяева согласно настоящему изобретению могут быть стабильно или временно трансфицированы вектором согласно настоящему изобретению, например, для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению. В таких вариантах осуществления клетки могут быть стабильно трансфицированы вектором, как описано в настоящем документе. Альтернативно, клетки могут быть временно трансфицированы вектором в соответствии с настоящим изобретением, кодирующим антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе. В любом из раскрытых в данном документе вариантов осуществления полинуклеотид может быть гетерологичным клетке-хозяину.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, которые гетерологично экспрессируют антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Например, клетка может быть разновидностью, которая отличается от разновидности, из которой было полностью или частично получено антитело (например, клетки CHO, экспрессирующие человеческое антитело или сконструированное человеческое антитело). В некоторых вариантах осуществления тип клетки клетки-хозяина в природе не экспрессирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Кроме того, клетка-хозяин может вносить посттрансляционную модификацию (PTM; например, глизоцилирование или фукозилирование) антителу или антигенсвязывающему фрагменту, которое не присутствует в нативном состоянии антитела или антигенсвязывающего фрагмента (или в нативном состоянии исходного антитела, из которого было сконструировано или получено антитело или антигенсвязывающий фрагмент). Такой PTM может привести к функциональной разнице (например, пониженной иммуногенности). Соответственно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, продуцируемые клеткой-хозяином, как описано в настоящем документе, могут содержать одну или более посттрансляционных модификаций, которые отличаются от антитела (или исходного антитела) в его нативном состоянии (например, антитело человека, продуцируемое клеткой CHO, может содержать более посттрансляционную модификацию, которая отличается от антитела при выделении из человека и/или продуцируется нативной В-клеткой человека или плазматической клеткой).

Клетки насекомых, пригодные для экспрессии связывающего белка по настоящему изобретению, известны в данной области техники и включают, например, клетки Spodoptera frugipera Sf9, клетки Trichoplusia ni BTI-TN5B1-4 и клетки Spodoptera frugipera SfSWT01“Mimic™”. См., например, Palmberger и др., J. Biotechnol. 153(3-4):160-166 (2011). Выявлены многочисленные штаммы бакуловирусов, которые можно использовать в комбинации с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

Эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, также являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих белок, и включают грибки и штаммы дрожжей с «гуманизированными» путями гликозилирования, что приводит к получению антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См . Gerngross, Nat. Biotech.22:1409-1414 (2004); Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).

Растительные клетки также могут быть использованы в качестве хозяев для экспрессии связывающего белка согласно настоящему изобретению. Например, технология PLANTIBODIES™ (описана, например, в патенте США № 5,959,177; 6,040,498; 6,420,548; 7,125,978; и 6,417,429) используют трансгенные растения для получения антител.

В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин включает клетку млекопитающего. В частных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку СНО, клетку HEK293, клетку PER.C6, клетку Y0, клетку Sp2/0, клетку NS0, клетку печени человека, клетку миеломы или клетку гибридомы.

В родственном аспекте настоящее изобретение относится к способам получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, где способы включают культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях и в течение времени, достаточных для получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Способы, пригодные для выделения и очистки рекомбинантно полученных антител, например, могут включать получение супернатантов из подходящих систем клетки-хозяина/вектора, которые секретируют рекомбинантное антитело в культуральную среду, а затем концентрирование среды с использованием коммерчески доступного фильтра. После концентрирования концентрат может быть нанесен на одну подходящую матрицу очистки или на ряд подходящих матриц, таких как аффинная матрица или ионообменная смола. Для дополнительной очистки рекомбинантного полипептида можно использовать одну или более стадий обращенно-фазовой HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография). Эти способы очистки также могут быть использованы при выделении иммуногена из его природной среды. Способы крупномасштабной продукции одного или более выделенных/рекомбинантных антител, описанных в настоящем документе, включают периодическую культуру клеток, за которой наблюдали и контролировали для поддержания соответствующих условий культивирования. Очистку растворимых антител можно проводить в соответствии со способами, описанными в настоящем документе и известными в данной области техники, и которые соответствуют законам и рекомендациям отечественных и зарубежных регулирующих органов.

Композиции

В настоящем документе также предложены композиции, которые содержат любое одно или более из описанных в настоящем документе антител, антигенсвязывающих фрагментов, полинуклеотидов, векторов или клеток-хозяев, по отдельности или в любой комбинации, и могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель. Носители, эксципиенты и разбавители более подробно обсуждаются в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит множество антител и/или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов не содержит остаток лизина на С-конце тяжелой цепи, CH1-CH3 или полипептида Fc, и где одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов содержит остаток лизина на С-конце тяжелой цепи, CH1-CH3 или полипептида Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:265 или SEQ ID NO:266.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит два или более различных антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты для применения в комбинации, каждая независимо, имеют одну или более из следующих характеристик: нейтрализуют встречающиеся в природе варианты SARS-CoV-2; не конкурируют друг с другом за связывание со спайк-белком; связывают различные эпитопы спайк-белка; имеют сниженное образование устойчивости к SARS-CoV-2; в комбинации имеют сниженное образование устойчивости к SARS-CoV-2; эффективно нейтрализуют живой вирус SARS-CoV-2; проявляют аддитивные или синергетические эффекты на нейтрализацию живого вируса SARS-CoV-2 при использовании в комбинации; проявляют эффекторные функции; являются защитными в соответствующей модели (моделях) инфекции животного; способны продуцироваться в достаточных количествах для крупномасштабной продукции.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 79, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 83; и второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий, VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 105, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 168. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 80-82, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 84-86, соответственно, и второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 106-108, соответственно, и CDRL1 и CDRL3, или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 169-171, соответственно. В дополнительных вариантах осуществлений композиция способна нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 или вирус, псевдотипированный SARS-CoV-2, с IC50 от около 0,07 до около 0,08 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 178, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 182 или SEQ ID NO: 190; и второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 105, и VL, содержащий, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 168. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 179-181, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 183-185, соответственно, и второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 106-108, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 169-171, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит первый вектор, содержащий первую плазмиду, и второй вектор, содержащий вторую плазмиду, где первая плазмида содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, VH или VH+CH, а вторая плазмида содержит полинуклеотид, кодирующий родственную легкую цепь, VL или VL+CL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит полинуклеотид (например, мРНК), связанный с подходящим средством доставки или носителем. Примерные носители или носители для введения субъекту-человеку включают липид или липидное средство доставки, такой как липосома, твердая липидная наночастица, маслянистая суспензия, субмикронная липидная эмульсия, липидный микропузырь, обратная липидная мицелла, кохлеарная липосома, липидная микротрубочка, липидный микроцилиндр или липидная наночастица (LNP) или наноразмерная платформа (см., например, Li и др. Wilery Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 11(2):e1530 (2019)). Принципы, реагенты и методики конструирования подходящей мРНК и составления мРНК-LNP и доставки их описаны, например, в Pardi и др. (J Control Release 217345-351(2015)); Thess и др. (Mol Ther 23: 1456-1464 (2015)); Thran и др. (EMBO Mol Med 9(10):1434-1448 (2017); Kose и др. Sci. Immunol. 4 eaaw6647 (2019); и Sabnis и др. (Mol. Ther. 26: 1509-1519 (2018)), которые включают кэппинг, оптимизацию кодонов, нуклеозидную модификацию, очистку мРНК, включение мРНК в стабильные липидные наночастицы (например, ионизируемый катионный липид/фосфатидилхолин/холестерин/PEG-липид (PEG - полиэтиленгликоль); ионизируемый липид:дистеароил PC:холестерин:полиэтиленгликолевый липид (PC - фосфатидилхолин)) и подкожное, внутримышечное, внутрикожное, внутривенное, внутрибрюшинное и интратрахеальное введение, включены в настоящий документ посредством ссылки.

Способы и применения

В настоящем документе также предложены способы применения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или композиции по настоящему изобретению при диагностике SARS-CoV-2 (например, у субъекта-человека или в образце, полученном от субъекта-человека).

Способы диагностики (например, in vitro, ex vivo) могут включать приведение в контакт антитела, фрагмента антитела (например, антигенсвязывающего фрагмента) с образцом. Такие образцы могут быть выделены из субъекта, например, выделенный образец ткани, взятый, например, из носовых ходов, полостей пазух, слюнных желез, легких, печени, поджелудочной железы, почек, уха, глаза, плаценты, пищеварительного тракта, сердца, яичников, гипофиза, надпочечников, щитовидной железы, мозга, кожи или крови. Способы диагностики могут также включать обнаружение комплекса антиген/антитело, в частности, после приведения в контакт антитела или фрагмента антитела с образцом. Такой этап обнаружения может быть выполнен в ламинарном шкафе, то есть без какого-либо приведения в контакт с организмом человека или животного. Примеры способов обнаружения хорошо известны специалисту в данной области техники и включают, например, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), включая прямой, непрямой и многослойный ELISA.

В настоящем документе также предложены способы лечения субъекта с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, или композиции, содержащей их, причем субъект имеет, как полагают, или подвержен риску инфицирования SARS-CoV-2. "Обработка", "лечение" или "облегчение" относится к медицинскому лечению заболевания, расстройства или состояния субъекта (например, человека или млекопитающего, не являющегося человеком, такого как примат, лошадь, кошка, собака, коза, мышь или крыса). Как правило, подходящую дозу или схему лечения, включающую антитело или композицию по настоящему изобретению, вводили в количестве, достаточном для получения терапевтического или профилактического эффекта. Терапевтический или профилактический/превентивный эффект включает улучшение клинического исхода; уменьшение или облегчение симптомов, связанных с заболеванием; уменьшение частоты возникновения симптомов; улучшение качества жизни; более длительный безрецидивный статус; уменьшение степени заболевания, стабилизацию состояния заболевания; задержку или предотвращение прогрессирования заболевания; ремиссию; выживаемость; продолжительную выживаемость; или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления терапевтический, профилактический/превентивный эффект включает уменьшение или предотвращение госпитализации прир лечении инфекции SARS-CoV-2 (т.е. статистически значимым образом). В некоторых вариантах осуществления терапевтический или профилактическоий/превентивный эффект включает сокращение продолжительности госпитализации при лечении инфекции SARS-CoV-2 (т.е. статистически значимым образом). В некоторых вариантах осуществления терапевтический или профилактический/превентивный эффект включает уменьшение или отмену потребности в респираторном вмешательстве, таком как интубация и/или применение респираторного устройства. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтический или профилактический/превентивный эффект включает реверсию патологии поздней стадии заболевания и/или снижение смертности.

«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» антитела, антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции согласно настоящему изобретению относится к количеству композиции или молекулы, достаточному для получения терапевтического эффекта, включая улучшение клинического исхода; уменьшение или облегчение симптомов, связанных с заболеванием; снижение частоты возникновения симптомов; улучшение качества жизни; более длительный безрецидивный статус; уменьшение степени заболевания, стабилизация состояния заболевания; задержку прогрессирования заболевания; ремиссию; выживаемость; или продолжительное выживание статистически значимым образом. Когда речь идет об отдельном активном ингредиенте, вводимом отдельно, терапевтически эффективное количество относится к эффектам этого ингредиента или клетки, экспрессирующей этот ингредиент отдельно. Когда речь идет о комбинации, терапевтически эффективное количество относится к объединенным количествам активных ингредиентов или комбинированного вспомогательного активного ингредиента с клеткой, экспрессирующей активный ингредиент, что приводит к терапевтическому эффекту, независимо от того, вводится ли оно серийно, последовательно или одновременно. Комбинация может содержать, например, два различных антитела, которые специфически связывают антиген SARS-CoV-2, который в некоторых вариантах осуществления может представлять собой один и тот же или другой антиген коронавируса Wuhan, и/или может содержать одинаковые или разные эпитопы.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предложены способы лечения инфекции SARS-CoV-2 у субъекта, где способы включают введение указанному субъекту эффективного количества антитела, антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции, как описано в настоящем документе.

Субъекты, которые могут быть подвергнуты лечению согласно настоящему изобретению, являются, в целом, субъектами людьми и другими приматами, такими как мартышки и обезьяны, для целей ветеринарной медицины. Другие модели организмов, такие как мыши и крысы, также могут быть подвергнуться лечению в соответствии с настоящим изобретением. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления субъект может быть субъектом человеком. Субъекты могут быть мужского или женского пола и могут быть любого подходящего возраста, включая младенцев, несовершеннолетних, подростков, взрослых и пожилых субъектов.

Считается, что ряд критериев способствует высокому риску тяжелых симптомов или смерти, связанных с инфекцией коронавируса SARS CoV-2. Они включают, но не ограничиваются этим, возраст, род занятий, общее состояние здоровья, ранее существовавшие состояния здоровья и привычки образа жизни. В некоторых вариантах осуществления субъект, получающий лечение в соответствии с настоящим изобретением, содержит один или более факторов риска.

В некоторых вариантах осуществления субъект человек, получающий лечение в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой младенца, ребенка, подростка, взрослого среднего возраста или пожилого человека. В некоторых вариантах осуществления субъект человек, получающий лечение в соответствии с настоящим изобретением, моложе 1 года, или ему от 1 до 5 лет, или ему от 5 до 125 лет (например, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 или 125 лет, включая любой и все возрасты в списке или между указанными возрастами). В некоторых вариантах осуществления возраст субъекта-человека, получающего лечение в соответствии с настоящим изобретением, составляет 0-19 лет, 20-44 года, 45-54 года, 55-64 года, 65-74 года, 75-84 года или 85 лет или старше. Особому риску, как полагают, подвергаются лица среднего и особенно пожилого возраста. В частных вариантах осуществления возраст субъекта-человека составляет 45-54 года, 55-64 года, 65-74 года, 75-84 года или 85 лет или старше. В некоторых вариантах осуществления субъектом человеком является мужчина. В некоторых вариантах осуществления субъект человек является женщина.

В некоторых вариантах осуществления субъект человек, получающий лечение в соответствии с настоящим изобретением, является резидентом дома престарелых или учреждения долгосрочного ухода, является работником хосписа, является медицинским работником или медицинским работником, является сотрудником скорой помощи, является членом семьи или другим человеком, находящемся в близком контакте с субъектом, у которого диагностирована или подозревается инфекция SARS-CoV-2, имеет избыточный вес или клинически ожирение, курит или курил, имеет или имел хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), является астматиком (например, имеет умеренную или тяжелую астму), имеет аутоиммунное заболевание или состояние (например, диабет) и/или имеет ослабленную или истощенную иммунную систему (например, в связи со СПИД/ВИЧ-инфекцией (СПИД - синдром инфекции иммунодефицита, ВИЧ - вирус иммунодефицита человека), раком, таким как рак крови, лимфодеплетирующей терапией, такой как химиотерапия, трансплантацей костного мозга или органа, или генетическим иммунным состояние), имеет хроническое заболевание печени, имеет сердечно-сосудистое заболевание, заболевание легких или дефект сердца, работает или иным образом проводит время в непосредственной близости с другими, например, на фабрике, в центре доставки, в больнице и т.п.

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, получающий лечение в соответствии с настоящим изобретением, получил вакцину против SARS-CoV-2, и вакцина была признана неэффективной, например, в результате поствакцинной инфекции или симптомов у субъекта, в результате клинического диагноза или научных или нормативных критериев.

В некоторых вариантах осуществления лечение осуществляли в качестве профилактики после контакта. В некоторых вариантах осуществления лечение осуществляли субъекту с заболеванием легкой или умеренной степени, который может находиться в амбулаторных условиях. В некоторых вариантах осуществлениях лечение осуществляли субъекту с заболеванием средней или тяжелой степени, например, требующим госпитализации.

Таким образом, типичные пути введения описанных в настоящем документе композиций включают, без ограничения, пероральный, местный, трансдермальный, ингаляционный, парентеральный, сублингвальный, буккальный, ректальный, вагинальный и интраназальный. Термин "парентеральный", как используется в настоящем документе, включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудинный инъекции или методики инфузий. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение путем, выбранным из перорального, внутривенного, парентерального, внутрижелудочного, внутриплеврального, внутрилегочного, внутриректального, интрадермального, внутрибрюшинного, внутриопухолевого, подкожного, местного, трансдермального, внутричерепного, интратекального, интраназального и внутримышечного введения. В частных вариантах осуществления способ включает пероральное введение субъекту антитела, антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции.

Фармацевтические композиции в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения составлены таким образом, чтобы обеспечить биодоступность содержащихся в ней активных ингредиентов при введении композиции пациенту. Композиции, которые будут вводит субъекту или пациенту, могут иметь форму одной или более единиц дозирования, где, например, таблетка может представлять собой единичную единицу дозирования, и контейнер описанного в настоящем документе антитела или антигенсвязывающего фрагмента в аэрозольной форме может содержать множество дозированных единиц. Реальные способы получения таких дозированных форм известны или очевидны специалистам в данной области; например, см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). Композиция, подлежащая введению, в любом случае будет содержать эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния, представляющего интерес, в соответствии с настоящим изобретением.

Композиция может быть в форме твердого вещества или жидкости. В некоторых вариантах осуществления носитель (носители) являются твердыми частицами, так что композиции находятся, например, в форме таблетки или порошка. Носитель (носители) может быть жидким (жидкими), так что композиции представляют собой, например, масло для полости рта, инъекционную жидкость или аэрозоль, который можно применять, например, при ингаляционном введении. Когда фармацевтическая композиция предназначена для перорального введения, она предпочтительно находится либо в твердой, либо в жидкой форме, где полутвердая, полужидкая, суспензионная и гелевая формы включены в формы, рассматриваемые в настоящем документе как твердые или жидкие.

В качестве твердой композиции для перорального введения фармацевтическая композиция может быть составлена в виде порошка, гранулы, прессованной таблетки, пилюли, капсулы, жевательной резинки, облатки или т. п. Такая твердая композиция обычно содержит один или более инертных разбавителей или съедобных носителей. Кроме того, могут присутствовать одно или более из следующих веществ: связующие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательные вещества, такие как крахмал, лактоза или декстрины, дезинтегрирующие агенты, такие как альгиновая кислота, альгинат натрия, примогель, кукурузный крахмал и т. п.; смазывающие вещества, такие как стеарат магния или стеротекс; скользящие агенты, такие как коллоидный диоксид кремния; подсластители, такие как сахароза или сахарин; ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор; и краситель. Когда композиция находится в форме капсулы, например, желатиновой капсулы, она может содержать, помимо веществ вышеуказанного типа, жидкий носитель, такой как полиэтиленгликоль или масло.

Композиция может быть в форме жидкости, например, эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии. Жидкость может быть предназначена для перорального введения или для доставки путем инъекции, в качестве двух примеров. Если они предназначены для перорального введения, предпочтительные композиции содержат в дополнение к настоящим соединениям один или более подсластителей, консервантов, красящих веществ/красителей и усилителей вкуса. В композицию, предназначенную для введения путем инъекции могут быть включены одно или более из поверхностно-активного вещества, консерванта, смачивающего агента, диспергирующего агента, суспендирующего агента, буфера, стабилизатора и изотонического агента.

Жидкие фармацевтические композиции, будь то растворы, суспензии или другие подобные формы, могут включать один или несколько из следующих адъювантов: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, физиологический раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, жирные масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить растворителем или суспендирующей средой, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты и агенты для достижения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральный препарат может быть включен в ампулы, одноразовые шприцы или флакон из стекло или пластика с несколькими дозами. Физиологический раствор является предпочтительным адъювантом. Инъецируемая фармацевтическая композиция, предпочтительно, является стерильной.

Жидкая композиция, предназначенная для парентерального или перорального введения, должна содержать количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем документе, таким образом, чтобы была получена подходящая дозировка. Как правило, это количество составляет по меньшей мере 0,01% от антитела или антигенсвязывающего фрагмента в композиции. Когда это предназначено для перорального введения, это количество может варьироваться от 0,1 до около 70% от массы композиции. Некоторые пероральные фармацевтические композиции содержат от около 4% до около 75% антитела или антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции и препараты согласно настоящему изобретению получали таким образом, что парентеральная единица дозирования содержит от 0,01 до 10% по массе антитела или антигенсвязывающего фрагмента перед разведением.

Композиция может быть предназначена для местного введения, и в этом случае носитель может подходящим образом содержать раствор, эмульсию, мазь или гелевую основу. Основа, например, может содержать одно или более из следующего: петролатум, ланолин, полиэтиленгликоли, пчелиный воск, минеральное масло, разбавители, такие как вода и спирт, и эмульгаторы и стабилизаторы. Загустители могут присутствовать в композиции для местного введения. Если композиция предназначена для трансдермального введения, она может включать трансдермальный пластырь или устройство для ионофореза. Фармацевтическая композиция может быть предназначена для ректального введения, в форме, например, суппозитория, который будет растворяться в прямой кишке и высвобождать лекарственное средство. Композиция для ректального введения может содержать маслянистую основу в качестве подходящего не раздражающего вспомогательного вещества. Такие основы включают, без ограничения, ланолин, масло какао и полиэтиленгликоль.

Композиция может содержать различные вещеста, которые модифицируют физическую форму твердой или жидкой единицы дозирования. Например, композиция может включать материалы, которые образуют оболочку покрытия вокруг активных ингредиентов. Вещества, которые образуют оболочку покрытия, обычно являются инертными и могут быть выбраны, например, из сахара, шеллака и других энтеросолюбильных покрывающих агентов. Альтернативно активные ингредиенты могут быть заключены в желатиновую капсулу. Композиция в твердой или жидкой форме может содержать агент, который связывается с антителом или антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему описанию и тем самым способствует доставке соединения. Подходящие агенты, которые могут действовать в этом качестве, включают моноклональные или поликлональные антитела, один или более белков или липосому. Композиция может состоять по существу из единиц дозирования, которые можно вводить в виде аэрозоля. Термин "аэрозоль" используется для обозначения различных систем, начиная с систем коллоидной природы и кончая системами, состоящими из упаковок под давлением. Доставка может осуществляться сжиженным или сжатым газом или с помощью подходящей насосной системы, которая дозирует активные ингредиенты. Аэрозоли могут доставляться в однофазных, двухфазных или трехфазных системах для доставки активного (активныых) ингредиента (ингридиентов). Доставка аэрозоля включает необходимый контейнер, активаторы, клапаны, субконтейнеры и т. п., которые вместе могут образовывать набор. Специалист в данной области техники без излишних экспериментов может определить предпочтительные аэрозоли.

Следует понимать, что композиции по настоящему изобретению также охватывают молекулы-носители для полинуклеотидов, как описано в настоящем документе (например, липидные наночастицы, платформы доставки в наноразмерном масштабе и т. п.).

Фармацевтические композиции могут быть получены с помощью методики, хорошо известной в данной области техники. Например, композиция, предназначенная для введения путем инъекции, может быть получена путем комбинирования композиции, которая содержит антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела, как описано в настоящем документе, и, необязательно, одну или более солей, буферов и/или стабилизаторов, со стерильной дистиллированной водой с образованием раствора. Поверхностно-активное вещество может быть добавлено для облегчения образования гомогенного раствора или суспензии. Поверхностно-активные вещества представляют собой соединения, которые нековалентно взаимодействуют с пептидной композицией таким образом, чтобы облегчить растворение или гомогенную суспензию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в водной системе доставки.

В целом, подходящая доза и схема лечения обеспечивают композицию (композиции) в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического и/или профилактического эффекта (такого, как описано в настоящем документе, включая улучшенный клинический исход (например, снижение частоты, продолжительности или тяжести диареи или связанного с ней обезвоживания, или воспаления, или более длительной безрецидивной и/или общей выживаемости, или уменьшение тяжести симптомов). Для профилактического применения доза должна быть достаточной для предотвращения, задержки возникновения или уменьшения тяжести заболевания, связанного с заболеванием или расстройством. Профилактический эффект композиций, вводимых в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, может быть определена путем выполнения доклинических (включая исследования на животных in vitro и in vivo) и клинических исследований и анализа данных, полученных из них, с помощью соответствующих статистических, биологических и клинических способов и методик, все из которых могут быть легко осуществлены специалистом в данной области техники.

Композиции вводили в эффективном количестве (например, для лечения инфекции SARS-CoV-2), которое будет варьироваться в зависимости от множества факторов, включая активность конкретного применяемого соединения; метаболическую стабильность и продолжительность действия соединения; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету субъекта; режим и время введения; скорость выведения; комбинацию лекарственного средства; тяжесть конкретного расстройства или состояния; и субъект, проходящий терапию. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при последующем введении лекарственных средств в соответствии с составами и способами согласно настоящему изобретению у субъектов будет наблюдаться снижение одного или более симптомов, связанных с заболеванием или расстройством, подлежащим лечению, на от около 10% до около 99% по сравнению с субъектами, получающими плацебо, или другими подходящими контрольными субъектами.

Как правило, терапевтически эффективная суточная доза антитела или антигенсвязывающего фрагмента составляет (для млекопитающего весом 70 кг) от около 0,001 мг/кг (т.е.0,07 мг) до около 100 мг/кг (т.е. 7,0 г); предпочтительно терапевтически эффективная доза составляет (для млекопитающего весом 70 кг) от около 0,01 мг/кг (т.е.0,7 мг) до около 50 мг/кг (т.е.3,5 г); более предпочтительно терапевтически эффективная доза составляет (для млекопитающего весом 70 кг) от около 1 мг/кг (т.е.70 мг) до около 25 мг/кг (т.е.1,75 г). Для полинуклеотидов, векторов, клеток-хозяев и связанных композиций по настоящему изобретению терапевтически эффективная доза может отличаться от дозы для антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления способ включает введение антитела, антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции субъекту в количестве 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз или более.

В некоторых вариантах осуществления способ включает введение антитела, антигенсвязывающего фрагмента или композиции субъекту множество раз, где второе или последовательное введение осуществляли через около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 24, около 48, около 74, около 96 часов или более после первого или предыдущего введения, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления способ включает введение антитела, антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции по меньшей мере один раз до инфицирования субъекта SARS-CoV-2.

Композиции, содержащие антитело, антигенсвязывающий фрагмент, полинуклеотид, вектор, клетку-хозяина или композицию по настоящему изобретению, также можно вводить одновременно, до или после введения одного или более других терапевтических средств. Такая комбинированная терапия может включать введение одной фармацевтической лекарственной формы, которая содержит соединение по изобретению и один или более дополнительных активных агентов, а также введение композиций, содержащих антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению и каждый активный агент в своей отдельной лекарственной форме. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, и другой активный агент можно вводить пациенту вместе в одной пероральной лекарственной композиции, такой как таблетка или капсула, или каждый агент вводили в отдельных пероральных лекарственных формах. Аналогичным образом, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, и другой активный агент могут быть введены субъекту вместе в одной парентеральной лекарственной композиции, такой как физиологический раствор или другой физиологически приемлемый раствор, или каждый агент может быть введен в отдельных парентеральных лекарственных формах. В тех случаях, когда используются отдельные лекарственные формы, композиции, содержащие антитело или антигенсвязывающий фрагмент и один или более дополнительных активных агентов, могут быть введены по существу в одно и то же время, то есть одновременно, или в разное время, то есть последовательно и в любом порядке; предполагается, что комбинированная терапия включает все эти схемы.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается комбинированная терапия, которая содержит одно или более антител к SARS-CoV-2 (или одну или более нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, векторов или композиций) по настоящему изобретению и один или более противовоспалительных средств и/или один или более противовирусных средств. В конкретных вариантах осуществления один или более противовоспалительных средств включает кортикостероид, такой как, например, дексаметазон, преднизон или т. п. В некоторых вариантах осуществления один или более противовоспалительных средств включает антагонист цитокина, такой как, например, антитело, которое связывается с IL6 (IL -интерлейкин) (таким как силтуксимаб), или с IL-6R (рецептор IL-6) (таким как тоцилизумаб), или с IL-1β, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, FGF (фактор роста фибробластов), G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), IFN-γ (интерферон γ), IP-10 (интерферон-γ-индуцируемый белок 10), MCP-1 (моноцитарный хемоатрактантный белок), MIP-1A (MIP -макрофагальный белок воспаления), MIP1-B, PDGR (тромбоцитарный фактор роста), TNF-α (фактор некроза опухоли α) или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). В некоторых вариантах осуществления применяли противовоспалительные средства, такие как руксолитиниб и/или анакинра. В некоторых вариантах осуществления один или более противовирусных средств содержат нуклеотидные аналоги или пролекарства нуклетидных аналогов, такие как, например, ремдесивир, софосбувир, ацикловир и зидовудин. В частных вариантах осуществления противовирусное средство включает лопинавир, ритонавир, фавипиравир или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия включает леронлимаб. Противовоспалительные средства для применения в комбинированной терапии по настоящему изобретению также включают нестероидные противовоспалительные средства (NSAID). Следует понимать, что в такой комбинированной терапии одно или более антител (или одна или более нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, векторов или композиций) и одно или более противовоспалительных средств и/или одно или более противовирусных средств могут быть введены в любом порядке и в любой последовательности или вместе.

В некоторых вариантах осуществления антитело (или одна или более нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, векторов или композиций) вводили субъекту, который ранее получал один или более противовоспалительных средств и/или один или более противовирусных средств. В некоторых вариантах осуществления один или более противовоспалительных средств и/или один или более противовирусных средств вводили субъекту, которому ранее вводили антитело (или одну или более нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, векторов или композиций).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается комбинированная терапия, которая содержит два или более антител против SARS-CoV-2 по настоящему изобретению. Способ может включать введение первого антитела субъекту, который получил второе антитело, или может включать введение двух или более антител вместе. Например, в частных вариантах осуществления предложен способ, который включает введение субъекту (а) первого антитела или антигенсвязывающего фрагмента, когда субъект получил второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент; (b) второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента, когда субъект получил первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент; или (с) первого антитела или антигенсвязывающего фрагмента и второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

В связанном аспекте предлагаются применения описанных в настоящем документе антител, антигенсвязывающих фрагментов, векторов, клеток-хозяев и композиций.

В некоторых вариантах осуществления предлагается антитело, антигенсвязывающий фрагмент, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин или композиция для применения в способе лечения инфекции SARS-CoV-2 у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело, антигенсвязывающий фрагмент или композиция для применения в способе изготовления или получения лекарственного средства для лечения инфекции SARS-CoV-2 у субъекта.

Настоящее изобретение также относится к следующим вариантам осуществления.

Вариант осуществления 1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1 (область 1, определяющая комплементарность тяжелой цепи), CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1 (область 1, определяющая комплементарность легкой цепи), CDRL2 и CDRL3, где:

(i) CDRH1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:106, 2, 56, 64, 80, 88, 96, 156, 179, 195 или 240, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией;

(ii) CDRH2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:121, 3, 16-22, 57, 65, 81, 89, 97, 107, 122-126, 157, 180, 197, 199 или 241, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией;

(iii) CDRH3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:108, 4, 25, 26, 58, 66, 82, 90, 98, 104, 127, 128, 158, 181, 201, 203 или 242, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией;

(iv) CDRL1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:169, 6, 51-54, 60, 68, 73, 74, 84, 92, 100, 110, 160, 183, 235 или 244, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией;

(v) CDRL2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:170, 7, 61, 69, 85, 93, 101, 111, 161, 184, 236 или 245, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; и/или

(vi) CDRL3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:171, 8, 62, 70, 77, 78, 86, 94, 102, 112, 151-154, 162, 185, 237 или 246, или ее варианта последовательности, содержащего одну, две или три аминокислотные замены, одна или более из которых необязательно представляет собой консервативную замену и/или является заменой аминокислоты, кодируемой зародышевой линией,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемом на клеточной поверхности клетки-хозяина, на вирионе SARS-CoV-2 или на обоих.

Вариант осуществления 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, способное нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 на модели инфекции in vitro и/или на животной модели инфекции in vivo и/или у человека.

Вариант осуществления 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1 или 2, содержащее аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:

(i) 106, 121, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(ii) 2-4 и 6-8 или 235-237, соответственно;

(iii) 2, любой из 16-22, 4 и 6-8 или 235-237, соответственно;

(iv) 2, 3, любой из 25-26 и 6-8 или 235-237, соответственно;

(v) 2-4, 51, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно;

(vi) 2-4, 52, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно;

(vii) 2-4, 53, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно;

(viii) 2-5, 54, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно;

(ix) 56-58 и 60-62 соответственно;

(x) 64-66 и 68-70 соответственно;

(xi) 64-66, 73 или 74, 69 и 70 соответственно;

(xii) 64-66, 68, 69 и 77 или 78 соответственно;

(xiii) 80-82 и 84-86 соответственно;

(xiv) 88-90 и 92-94, соответственно;

(xv) 96-98 и 101-102 соответственно;

(xvi) 96, 97, 104 и 100-102, соответственно;

(xvii) 106-108 и 169-171, соответственно;

(xviii) 106, любой из 121-126, 108 и 169-171, соответственно;

(xix) 106, 107, 127 или 128 и 169-171, соответственно;

(xx) 106, 107 или любой из 121-126, 108 и 169-171, соответственно;

(xxi) 156-158 и 160-162, соответственно;

(xxii) 106, 123, 127 и 169-171, соответственно;

(xxiii) 2, 17, 25, 6 или 235 или любой из 51-54, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно;

(xxiv) 2, 20, 25, 6 или 235 или любой из 51-54, 7 или 236 и 8 или 237, соответственно;

(xxv) 179-181 и 183-185, соответственно;

(xxvi) 195, 180, 181 и 183-185, соответственно;

(xxvii) 195, 197, 181 и 183-185 соответственно;

(xxviii) 195, 199, 181 и 183-185 соответственно;

(xxiv) 195, 197, 201 и 183-185, соответственно;

(xxx) 195, 197, 203 и 183-185 соответственно;

(xxxi) 195, 199, 201 и 183-185, соответственно;

(xxxii) 195, 199, 203 и 183-185 соответственно;

(xxxiii) 179, 180, 181 и 183-185, соответственно;

(xxxiv) 179, 197, 181 и 183-185, соответственно;

(xxxv) 179, 199, 181 и 183-185, соответственно;

(xxxvi) 179, 197, 201 и 183-185, соответственно;

(xxxvii) 179, 197, 203 и 183-185, соответственно;

(xxxviii) 179, 199, 201 и 183-185, соответственно;

(xxxix) 179, 199, 203 и 183-185, соответственно;

(xxxx) 179, 180, 201 и 183-185, соответственно;

(xxxxi) 179, 180, 203 и 183-185, соответственно; или

(xxxxii) 240-242 и 244-246, соответственно.

Вариант осуществления 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-3, содержащее:

(i) аминокислотную последовательность CDRH1, представленную в SEQ ID NO:106;

(ii) аминокислотную последовательность CDRH2, представленную в SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, или SEQ ID NO:126;

(iii) аминокислотную последовательность CDRH3, представленную в SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:127 или SEQ ID NO:128;

(iv) аминокислотную последовательность CDRL1, представленную в SEQ ID NO:169;

(v) аминокислотную последовательность CDRL2, представленную в SEQ ID NO:170; и

(vi) аминокислотную последовательность CDRL3, представленную в SEQ ID NO:171,

где, необязательно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в:

(a) SEQ ID NO:106, 121, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(b) SEQ ID NO:106, 121, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(c) SEQ ID NO:106, 121, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(d) SEQ ID NO:106, 107, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(e) SEQ ID NO:106, 107, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(f) SEQ ID NO:106, 107, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(g) SEQ ID NO:106, 122, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(h) SEQ ID NO:106, 122, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(i) SEQ ID NO:106, 122, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(j) SEQ ID NO:106, 123, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(k) SEQ ID NO:106, 123, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(l) SEQ ID NO:106, 123, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(m) SEQ ID NO:106, 124, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(n) SEQ ID NO:106, 124, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(o) SEQ ID NO:106, 124, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(p) SEQ ID NO:106, 125, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(q) SEQ ID NO:106, 125, 127, 169, 170 и 171, соответственно;

(r) SEQ ID NO:106, 125, 128, 169, 170 и 171, соответственно;

(s) SEQ ID NO:106, 126, 108, 169, 170 и 171, соответственно;

(t) SEQ ID NO:106, 126, 127, 169, 170 и 171, соответственно; или

(u) SEQ ID NO:106, 126, 128, 169, 170 и 171, соответственно.

Вариант осуществления 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность CDRH1, представленную в SEQ ID NO:106, аминокислотную последовательность CDRH2, представленную в SEQ ID NO:121, и аминокислотную последовательность CDRH3, представленную в SEQ ID NO:108, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность CDRL1, представленную в SEQ ID NO:169, аминокислотную последовательность CDRL2, представленную в SEQ ID NO:170, и аминокислотную последовательность CDRL3, представленную в SEQ ID NO:171,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемым на клеточной поверхности клетки-хозяина, на вирионе или на обоих.

Вариант осуществления 6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 5, способное нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 на модели инфекции in vitro и/или на животной модели инфекции in vivo и/или у человека.

Вариант осуществления 7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-6, содержащее:

(i) VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO:113, 1, 9-15, 23, 24, 27, 28-46, 55, 63, 79, 87, 95, 103, 105, 114-120, 129-146, 155, 172, 176-178, 194, 196, 198, 200, 202, 239 и 267, где изменение по сравнению с эталонной аминокислотной последовательностью VH, при его наличии, необязательно ограничено одной или более каркасными областями, и/или изменение содержит одну или более замен аминокислоты, кодируемой зародышевой линией; и/или

(ii) VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO:168, 5, 47-50, 59, 67, 71-72, 75, 76, 83, 91, 99, 109, 147-150, 159, 182, 190, 234 и 243, где изменение по сравнению с эталонной аминокислотной последовательностью VH, при его наличии, необязательно ограничено одной или более каркасными областями, и/или изменение содержит одну или более замен аминокислоты, кодируемой зародышевой линией.

Вариант осуществления 8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществлений 1-7, где VH содержит или состоит из любой аминокислотной последовательности VH, представленной в Таблице 2, и где VL содержит или состоит из любой аминокислотной последовательности VL, представленной в Таблице 2, где, необязательно, VH и VL содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:

(i) 113 и 168, соответственно;

(ii) 1 и 5 или 234, соответственно;

(iii) любой из 9-15 и 5 или 234, соответственно;

(iv) 23 или 24 и 5 или 234, соответственно;

(v) 27 и 5 или 234, соответственно;

(vi) любой из 28-46 и 5 или 234, соответственно;

(vii) 1 и любой из 47-50, соответственно;

(viii) любой из 9-15 и любой из 47-50, соответственно;

(ix) 23 или 24 и любой из 47-50, соответственно;

(x) 27 и любой из 47-50, соответственно;

(xi) любой из 28-46 и любой из 47-50, соответственно;

(xii) 55 и 59, соответственно;

(xiii) 63 и 67, соответственно;

(xiv) 63 и 71 или 72, соответственно;

(xv) 63 и 75 или 76, соответственно;

(xvi) 79 и 83, соответственно;

(xvii) 87 и 91, соответственно;

(xviii) 95 и 99, соответственно;

(xix) 103 и 99, соответственно;

(xx) 105 и 168, соответственно;

(xxi) любой из 114-120 или 267 и 168, соответственно;

(xxii) 129 и 168, соответственно;

(xxiii) любой из 130-146 и 168, соответственно;

(xxiv) 105 и любой из 147-150, соответственно;

(xxv) любой из 113-120 и любой из 147-150, соответственно;

(xxvi) любой из 130-146 и любой из 147-150, соответственно;

(xxvii) 155 и 159, соответственно;

(xxviii) 172 и 168, соответственно;

(xxix) 176 или 177 и 5 или 234 или любой из 47-50, соответственно;

(xxx) 178 и 182 или 190, соответственно;

(xxxi) 194 и 182 соответственно;

(xxxii) 196 и 182, соответственно;

(xxxiii) 198 и 182, соответственно;

(xxxiv) 200 и 182, соответственно;

(xxxv) 202 и 182, соответственно; или

(xxxvi) 239 и 243, соответственно.

Вариант осуществления 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), где VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), где VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:105, 114-120, 129-146, 172 и 267, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), где VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:79, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:83.

Вариант осуществления 12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:80-82, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:84-86, соответственно,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемым на клеточной поверхности клетки-хозяина, на вирионе SARS-CoV-2 или на обоих.

Вариант осуществления 13. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), где VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:105, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:106-108, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:169-171, соответственно,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемым на клеточной поверхности клетки-хозяина, на вирионе SARS-CoV-2 или на обоих.

Вариант осуществления 15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), где VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:178, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:182 или SEQ ID NO:190.

Вариант осуществления 16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:179-181, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:183-185, соответственно,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемым на клеточной поверхности клетки-хозяина, на вирионе SARS-CoV-2 или на обоих.

Вариант осуществления 17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-16, которое:

(i) распознает эпитоп в мотиве связывания рецептора (RBM) ACE2 (SEQ ID NO:167) SARS-CoV-2;

(ii) способно блокировать взаимодействие между SARS-CoV-2 (например, RBM SARS-CoV-2) и ACE2;

(ii) способно связываться с S-белком SARS-CoV-2 с большей авидностью, чем с S-белком коронавируса SARS;

(iii) распознает эпитоп, который сохраняется в ACE2 RBM SARS-CoV-2 и в ACE2 RBM коронавируса SARS;

(vi) обладает перекрестной реактивностью в отношении SARS-CoV-2 и коронавируса SARS;

(vii) распознает эпитоп в поверхностном гликопротеине SARS-CoV-2, который не входит в RBM ACE2,

или

(viii) любая комбинация (i)-(vii).

Вариант осуществления 18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-17, способное ингибировать взаимодействие между SARS-CoV-2 и любым одним или более из DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1.

Вариант осуществления 19. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-18, способное ингибировать взаимодействие между SARS-CoV-2 и любым одним или более из: DC-SIGN; L-SIGN; SIGLEC-1; CD22; CD33; CLEC4M, SIGLEC-16; SIGLEC-15; SIGLEC-14; SIGLEC-12; SIGLEC-11; SIGLEC-10; SIGLEC-9; SIGLEC-8; SIGLEC-7; SIGLEC-6; SIGLEC-5 или любой их комбинации.

Вариант осуществления 20. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-19, которое представляет собой изотип IgG, IgA, IgM, IgE или IgD.

Вариант осуществления 21. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-20, которое представляет собой изотип IgG, выбранный из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Вариант осуществления 22. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-21, которое является человеческим, гуманизированными или химерными.

Вариант осуществления 23. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-22, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент включает антитело человека, моноклональное антитело, очищенное антитело, одноцепочечное антитело, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv или scFab.

Вариант осуществления 24. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 23, где scFab содержит:

(i) аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:218-219 и 226-227;

(ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:168, и VH, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 105 или SEQ ID NO:113; или

(iii) CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 106, CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:107 или 121, CDRH3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:108, CDRL1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:169, CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:170, и CDRL3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:171.

Вариант осуществления 25. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 23, где scFv содержит:

(i) аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:220-221 или 228-229;

(ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:168, и VH, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 105 или SEQ ID NO:113; или

(iii) CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:106, CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:107 или 121, CDRH3, содержащкю аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:108, CDRL1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:169, CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:170, и CDRL3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:171.

Вариант осуществления 26. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 25, где scFv содержит более одного домена VH и более одного домена VL.

Вариант осуществления 27. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 26, где scFv содержит:

(i) аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:222-225 или SEQ ID NO:230-233;

(ii) два домена VL, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:168, и два домена VH, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:105 или SEQ ID NO:113; или

(iii) два домена VL, каждый из которых содержит CDRL1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:169, CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:170, и CDRL3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:171, и два домена VH, каждый из которых содержит CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:106, CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:107 или 121, CDRH3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:108.

Вариант осуществления 28. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-27, где что антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой полиспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент.

Вариант осуществления 29. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 28, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент.

Вариант осуществления 30. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 28 или 29, содержащее:

(i) первый VH и первый VL; и

(ii) второй VH и второй VL,

где первый VH и второй VH являются различными, и каждый независимо содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO:113, 1, 9-15, 23, 24, 27-46, 55, 63, 79, 87, 95, 103, 105, 114-120, 129-146, 155, 172, 176-178, 194, 196, 198, 200, 202, 239 и 267,

где первый VL и второй VL являются различными, и каждый независимо содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO:168, 5, 47-50, 59, 67, 71, 72, 75, 76, 83, 91, 99, 109, 147-150, 159, 182, 190, 234 и 243;

и где первый VH и первый VL вместе образуют первый антигенсвязывающий сайт, и где второй VH и второй VL вместе образуют второй антигенсвязывающий сайт.

Вариант осуществления 31. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-30, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит полипептид Fc или его фрагмент.

Вариант осуществления 32. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 31, где полипептид Fc или его фрагмент содержит:

(i) мутацию, усиливающую связывание с FcRn по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутацию; и/или

(ii) мутацию, усиливающую связывание с FcγR по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутации.

Вариант осуществления 33. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 32, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I; Q311I; D376V; T307A; E380A или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 34. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 32 или 33, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает:

(i) M428L/N434S;

(ii) M252Y/S254T/T256E;

(iii) T250Q/M428L;

(iv) P257I/Q311I;

(v) P257I/N434H;

(vi) D376V/N434H;

(vii) T307A/E380A/N434A или

(viii) любую комбинацию (i)-(vii).

Вариант осуществления 35. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из варианту осуществления 32-34, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает M428L/N434S.

Вариант осуществления 36. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 32-35, где мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает S239D; I332E; A330L; G236A или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 37. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 32-36, где мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает:

(i) S239D/I332E;

(ii) S239D/A330L/I332E;

(iii) G236A/S239D/I332E или

(iv) G236A/A330L/I332E.

Вариант осуществления 38. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-37:

которое содержит мутацию, которая изменяет гликозилирование, где мутация, которая изменяет гликозилирование, включает N297A, N297Q или N297G; и/или

которое является агликозилированным и/или афукозилированным.

Вариант осуществления 39. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 31-38, где полипептид Fc содержит мутацию L234A и мутацию L235A.

Вариант осуществления 40. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с S-белком SARS-CoV-2, как измерено с помощью биослойной интерферометрии.

Вариант осуществления 41. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 40, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с S-белком SARS-CoV-2 с KD (константа диссоциации) менее чем около 4,5×10^-9 M, например, менее чем 4,5×10^-9 M.

Вариант осуществления 42. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 40 или 41, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с S-белком SARS-CoV-2 с KD менее чем около 1,0×10^-10 M, например, менее чем 1,0×10^-10 M.

Вариант осуществления 43. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 40-42, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с S-белком SARS-CoV-2 с KD менее чем около 1,0×10^-11 M, например, менее чем 1,0×10^-11 M.

Вариант осуществления 44. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 40-43, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с S-белком SARS-CoV-2 с KD менее чем около 1×10^-12 M, например, менее чем 1×10^-12 M.

Вариант осуществления 45. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-44, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 и/или нейтрализовать инфекцию клетки-мишени с IC50 от около 16 до около 20 мкг/мл.

Вариант осуществления 46. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-45, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 и/или нейтрализовать инфекцию клетки-мишени с IC50 от около 0,3 до около 0,4 мкг/мл или от около 3 до около 4 нМ.

Вариант осуществления 47. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-46, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно индуцировать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) против клетки-мишени, инфицированной SARS-CoV-2.

Вариант осуществления 48. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 40-47, где Fab антитела или антигенсвязывающего фрагмента способен связываться с S-белком SARS-CoV-2 с KD 2,0×10-9 или менее, 1,9×10^-9 или менее или 1,8×10^-9 или менее.

Вариант осуществления 49. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-48, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 и не конкурирует с человеческим ACE2 за связывание с S-белком SARS-CoV-2,

где, необязательно, нейтрализация включает нейтрализацию инфекции на модели инфекции in vitro.

Вариант осуществления 50. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-49, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 с IC50 3,0 нМ, 3,1 нМ, 3,2 нМ, 3,3 нМ, 3,4 нМ, 3,5 нМ, 3,6 нМ, 3,7 нМ, 3,8 нМ, 3,9 нМ или 4,0 нМ.

Вариант осуществления 51. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-50, где индуцирование ADCC включает активацию естественной клетки-киллера, которая содержит вариант V158 FcγRIIIa, естественной клетки-киллера, которая содержит вариант F158 FcγRIIIa, или и то, и другое.

Вариант осуществления 52. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-51, где ADCP включает вовлечение FcγRIIa и/или FcγRIIIa, экспрессируемых на поверхности фагоцитарной клетки, такой как моноцит, макрофаг или дендритная клетка.

Вариант осуществления 53. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из вариантов осуществления 1-52, где, необязательно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно ингибировать взаимодействие между SARS-CoV-2 и любым одним или более из DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1.

Вариант осуществления 54. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с антителом S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) и/или антителом S303 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), где, необязательно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно ингибировать взаимодействие между SARS-CoV-2 и любым одним или более из DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1.

Вариант осуществления 55. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с антителом S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:81) и/или антителом S315 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID NO:182).

Вариант осуществления 56. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-55, способное связываться с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2, когда поверхностный гликопротеин SARS-CoV-2 содержится в префузионном тримере.

Вариант осуществления 57. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-56, способное связываться с рецептор-связывающим доменом (RBD) поверхностного гликопротеина SARS-CoV-2, когда RBD гликозилирован и/или дегликозилирован, где связывание определяют с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), где необязательно:

(1) SPR проводят с использованием прибора Biacore T200 с использованием кинетического подхода с одним циклом, дополнительно необязательно с 3-минутным периодом введения и 20-минутным периодом диссоциации;

(2) антитело или антигенсвязывающий фрагмент захватывают на поверхности;

(3) RBD присутствует в концентрации, составляющей 0,8 нМ, 3,1 нМ, 12,5 нМ, 50 нМ или 200 нМ;

(4) антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с гликозилированным RBD с KD, составляющей около 2,0 нМ, около 1,9 нМ, около 1,8 нМ, около 1,7 нМ, около 1,6 нМ, около 1,5 нМ, около 1,4 нМ, около 1,3 нМ, около 1,2 нМ, около 1,1 нМ, около 1,0 нМ, около 0,9 нМ, около 0,8 нМ, около 0,7 нМ, около 0,6 нМ, около 0,5 нМ, около 0,4 нМ или около 0,3 нМ, или с KD, составляющей 0,4±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,45±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,5±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,6±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,7±0,05 нМ, или с KD, составляющей 1,7±0,05 нМ; и/или

(5) антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с дегликозилированным RBD с KD, составляющей около 37,0 нМ, около 8,0 нМ, около 2,0 нМ, около 1,9 нМ, около 1,8 нМ, около 1,7 нМ, около 1,6 нМ, около 1,5 нМ, около 1,4 нМ, около 1,3 нМ, около 1,2 нМ, около 1,1 нМ, около 1,0 нМ или около 0,9 нМ, или с KD, составляющей 37,0±0,05 нМ, или с KD, составляющей 8,0±0,05 нМ, или с KD, составляющей 1,0±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,9±0,05 нМ, или с KD, составляющей 1,3±0,05 нМ, или с KD, составляющей 1,8±0,05 нМ, или с KD, составляющей 1,7±0,05 нМ.

Вариант осуществления 58. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-57, способное нейтрализовать инфекцию, вызванную SARS-CoV-2, в клетке легкого человека, где, необязательно, клетка легкого человека включает клетку Calu-3 (клеточная линия рака легкого человека), где, дополнительно, необязательно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет IC50 нейтрализации, составляющую около 97 нг/мл.

Вариант осуществления 59. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-58, способное связываться с компонентом комплемента C1q человека, где необязательно связывание с C1q определяют с помощью биослойной интерферометрии (BLI), такой как с использованием прибора Octet.

Вариант осуществления 60. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-59, способное ингибировать слияние клеток, опосредованное поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2.

Вариант осуществления 61. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-60, которое не вызывает опосредованного антителом усиления репликации SARS-CoV-2 в мононуклеарной клетке периферической крови (PBMC), или дендритной клетке, полученных от донора человека.

Вариант осуществления 62. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-61, содержащее:

(i) CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:173 или 175; и/или

(ii) CL, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:174 или SEQ ID NO:193.

Вариант осуществления 63. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность области, определяющей комплементарность (CDR) H1, представленную в SEQ ID NO:106, аминокислотную последовательность CDRH2, представленную в SEQ ID NO:121, и аминокислотную последовательность CDRH3, представленную в SEQ ID NO:108, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность CDRL1, представленную в SEQ ID NO:169, аминокислотную последовательность CDRL2, представленную в SEQ ID NO:170, и аминокислотную последовательность CDRL3, представленную в SEQ ID NO:171,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемым на клеточной поверхности клетки-хозяина, на вирионе SARS-CoV-2 или на обоих.

Вариант осуществления 64. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из варианту осуществления 1-63, способное связываться с поверхностным гликопротеином (S):

(i) SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (SEQ ID NO:165);

ii) SARS-CoV-2 B.1.1.7;

iii) SARS-CoV-2 B.1.351;

(iv) SARS-CoV-2, содержащего любую одну или более из следующих мутаций по типу замены относительно SEQ ID NO:165: N501Y; S477N; N439K; L452R; E484K; Y453F; A520S; K417N; K417V; S494P; N501T; S477R; V367F; P384L; A522S; A522V; V382L; P330S; T478I; S477I; P479S; или

(v) любой комбинации (i)-(iv).

Вариант осуществления 65. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 63 или 64, способное нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2:

(i) на модели инфекции in vitro;

(ii) на животной модели инфекции in vivo;

(iii) у человека; или

(iv) любой комбинацией (i)-(iii).

Вариант осуществления 66. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-65, где:

(i) VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и/или

(ii) VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 67. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-66, где:

(i) VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и/или

(ii) VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 68. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-67, где:

(i) VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и/или

(ii) VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 69. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-68, где:

(i) VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и/или

(ii) VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 70. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-69, способное ингибировать взаимодействие между:

(i) SARS-CoV-2 и человеческой DC-SIGN;

(ii) SARS-CoV-2 и человеческой L-SIGN;

(iii) SARS-CoV-2 и человеческим SIGLEC-1; или

(iv) любой комбинацией (i)-(iii).

Вариант осуществления 71. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-70, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент включает антитело человека, моноклональное антитело, очищенное антитело, одноцепочечное антитело, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv или scFab.

Вариант осуществления 72. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-71, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит полипептид Fc или его фрагмент.

Вариант осуществления 73. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-72, которое представляет собой изотип IgG, IgA, IgM, IgE или IgD.

Вариант осуществления 74. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 72 или 73, где полипептид Fc или его фрагмент содержит:

(i) мутацию, которая усиливает связывание с FcRn по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутацию; и/или

(ii) мутацию, которая усиливает связывание с FcγR по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутацию.

Вариант осуществления 75. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 74, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает:

(i) M428L/N434S;

(ii) M252Y/S254T/T256E;

(iii) T250Q/M428L;

(iv) P257I/Q311I;

(v) P257I/N434H;

(vi) D376V/N434H;

(vii) T307A/E380A/N434A или

(viii) любую комбинацию (i)-(vii).

Вариант осуществления 76. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 75, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает M428L/N434S.

Вариант осуществления 77. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 74-76, где мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает S239D, I332E, A330L, G236A или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 78. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 74, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает:

(i) S239D/I332E;

(ii) S239D/A330L/I332E;

(iii) G236A/S239D/I332E; или

(iv) G236A/A330L/I332E.

Вариант осуществления 79. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 63-78, дополнительно содержащее CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:265 или 266.

Вариант осуществления 80. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), где VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 81. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 80, способное нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2:

(i) на модели инфекции in vitro;

(ii) на животной модели инфекции in vivo;

(iii) у человека; или

(iv) любой комбинации (i)-(iii).

Вариант осуществления 82. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 80 или 81, способное ингибировать взаимодействие между:

i) SARS-CoV-2 и человеческой DC-SIGN;

ii) SARS-CoV-2 и человеческой L-SIGN;

iii) SARS-CoV-2 и человеческим SIGLEC-1; или

(iv) любой комбинацией (i)-(iii).

Вариант осуществления 83. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 80-82, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит полипептид Fc или его фрагмент.

Вариант осуществления 84. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 80-83, которое представляет собой изотип IgG, IgA, IgM, IgE или IgD.

Вариант осуществления 85. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из варианту осуществления 83 или 84, где полипептид Fc или его фрагмент содержит:

(i) мутацию, которая усиливает связывание с FcRn по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутацию; и/или

(ii) мутацию, которая усиливает связывание с FcγR по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутацию.

Вариант осуществления 86. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 85, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает:

(i) M428L/N434S;

(ii) M252Y/S254T/T256E;

(iii) T250Q/M428L;

(iv) P257I/Q311I;

(v) P257I/N434H;

(vi) D376V/N434H;

(vii) T307A/E380A/N434A или

(viii) любую комбинацию (i)-(vii).

Вариант осуществления 87. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 86, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает M428L/N434S.

Вариант осуществления 88. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 85-87, где мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает S239D, I332E, A330L, G236A или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 89. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 88, где мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает:

(i) S239D/I332E;

(ii) S239D/A330L/I332E;

(iii) G236A/S239D/I332E или

(iv) G236A/A330L/I332E.

Вариант осуществления 90. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 80-89, дополнительно содержащее CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:265 или 266.

Вариант осуществления 91. Выделенное антитело, которое содержит:

(i) тяжелую цепь, содержащую (i)(1) VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и (i)(2) CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:173; и

(ii) легкую цепь, содержащую (ii)(1) VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 168, и (ii)(2) CL, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:174.

Вариант осуществления 92. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2 и ингибировать взаимодействие между SARS-CoV-2 и человеческой DC-SIGN, человеческой L-SIGN, человеческим SIGLEC-1 или любой их комбинацией.

Вариант осуществления 93. Выделенное антитело, которое содержит:

(i) тяжелую цепь, содержащую (i)(1) VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и (i)(2) CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:175; и

(ii) легкую цепь, содержащую (ii)(1) VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 168, и (ii)(2) CL, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:174.

Вариант осуществления 94. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность области, определяющей комплементарность (CDR) H1, представленную в SEQ ID NO:106, аминокислотную последовательность CDRH2, представленную в SEQ ID NO:121, и аминокислотную последовательность CDRH3, представленную в SEQ ID NO:108, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность CDRL1, представленную в SEQ ID NO:169, аминокислотную последовательность CDRL2, представленную в SEQ ID NO:170, и аминокислотную последовательность CDRL3, представленную в SEQ ID NO:171,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с поверхностным гликопротеином (S) SARS-CoV-2, экспрессируемым на клеточной поверхности клетки-хозяина, на вирионе SARS-CoV-2 или на обоих.

Вариант осуществления 95. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 94, способное нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2:

(i) на модели инфекции in vitro;

(ii) на животной модели инфекции in vivo;

(iii) у человека; или

(iv) любой комбинации (i)-(iii).

Вариант осуществления 96. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 94 или 95, где:

(i) VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и/или

(ii) VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 97. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-96, где VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 98. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-97, которое:

(i) способно связываться с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с большей авидностью, чем с S-белком коронавируса SARS;

(ii) обладает перекрестной реактивностью в отношении SARS-CoV-2 и коронавируса SARS;

(iii) распознает эпитоп в поверхностном гликопротеине SARS-CoV-2, который не входит в RBM ACE2; или

(iv) любая комбинация (i)-(iii).

Вариант осуществления 99. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-98, которое представляет собой изотип IgG, IgA, IgM, IgE или IgD и предпочтительно представляет собой изотип IgG, выбранный из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Вариант осуществления 100. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-99:

(i) которое является человеческим, гуманизированным или химерным;

(ii) где антитело или антигенсвязывающий фрагмент включает антитело человека, моноклональное антитело, очищенное антитело, одноцепочечное антитело, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv или scFab; и/или

(iii) где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой полиспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где, необязательно, антигенсвязывающий фрагмент представляет собой биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент.

Вариант осуществления 101. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-100, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит полипептид Fc или его фрагмент.

Вариант осуществления 102. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 101, где полипептид Fc или его фрагмент содержит:

(1) мутацию, усиливающую связывание с FcRn по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутацию, где необязательно мутация, усиливающаяет связывание с FcRn, включает M428L, N434S, N434H, N434A, N434S, M252Y, S254T, T256E, T250Q, P257I, Q311I, D376V, T307A, E380A или любую их комбинацию, где дополнительно необязательно мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает: (i) M428L/N434S; (ii) M252Y/S254T/T256E; (iii) T250Q/M428L; (iv) P257I/Q311I; (v) P257I/N434H; (vi) D376V/N434H; (vii) T307A/E380A/N434A; или (viii) любую комбинацию (i)-(vii) и/или

(2) мутацию, усиливающую связывание с FcγR по сравнению с эталонным полипептидом Fc, который не содержит мутацию, где необязательно мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает S239D, I332E, A330L, G236A или любую их комбинацию, где дополнительно необязательно, мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает: (i) S239D/I332E; (ii) S239D/A330L/I332E; (iii) G236A/S239D/I332E; или (iv) G236A/A330L/I332E.

Вариант осуществления 103. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 102, где мутация, усиливающая связывание с FcRn, включает M428L/N434S, и/или мутация, усиливающая связывание с FcγR, включает G236A/A330L/I332E.

Вариант осуществления 104. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-103, содержащее:

(i) CH1-CH3, имеющую 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:173 или 175; и/или

(ii) CL, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:174.

Вариант осуществления 105. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-104, которое содержит мутацию, изменяющую гликозилирование антитела или антигенсвязывающего фрагмента, где мутация, изменяющая гликозилирование антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включает N297A, N297Q или N297G, и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент является агликозилированным и/или афукозилированным.

Вариант осуществления 106. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 94-105, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с KD менее чем около 4,5×10^-9 М, менее чем около 5×10^-9 М, менее чем около 1×10^-10 М, менее чем около 5×10^-10 М, менее чем около 1×10^-11 М, менее чем около 5×10^-11 М или менее чем около 1×10^-12 М, как измерено с помощью биослойной интерферометрии, где необязательно антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с KD менее чем 1×10^-12 М, как измерено с помощью биослойной интерферометрии (например, путем иммобилизации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента на сенсорах и погружения сенсоров в лунки, содержащие различные концентрации SARS-CoV-2 или RBD, регистрируя кинетику связывания антитела во время фазы ассоциации, после чего сенсоры погружаются в буфер, не наблюдая отделяя кинетики антитела SARS-CoV-2 или RD во время фазы диссоциации.Биосенсоры белка A (Pall ForteBio) можно использовать для иммобилизации рекомбинантных антител при 2,7 мкг/мл в течение 1 минуты, после этапа гидратации в течение 10 минут с помощью буфера для кинетического анализа (KB; 0,01% BSA (бычий сывороточный альбумин) без эндотоксинов, 0,002^ Tween-20 (твин), 0,005% NaN3 в PBS). Кривые ассоциации могут быть зарегестрированы в течение 5 минут путем инкубации сенсоров, покрытых антителами, с различными концентрациями RBD SARS-CoV-1 (Sino Biological) или RBD SARS-CoV-2 (полученный собственными силами в клетках Expi-CHO; остатки 331-550 спйк-белка из BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947). Исследованная концентрация SARS-CoV-2 или RBD может составлять 10 мкг/мл, затем серийно разбавлятьтся 1:2,5 . Диссоциацию можно зарегистрировать в течение 9 минут, перемещая сенсоры в лунки, содержащие KB. Аффинности, представленные значениями KD, могут быть рассчитаны с использованием глобальной модели соответствия (Octet). Использовалось оборудование Octet Red96 (ForteBio).

Вариант осуществления 107. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-106, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно индуцировать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) против клетки-мишени, инфицированной SARS-CoV-2,

где необязательно индуцирующая ADCC включает активацию естественной клетки-киллера, которая содержит вариант FcγRIIIa V158, естественной клетки-киллера, которая содержит вариант FcγRIIIa F158, или и то и другое, и/или индуцирующая ADCP включает вовлечение FcγRIIa, экспрессируемого на поверхности фагоцитарной клетки, такой как моноцит, макрофаг или дендритная клетка.

Вариант осуществления 108. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-107, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, и Fab способен связываться с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с KD 2,0×10^-9 M или менее, 1,9×10^-9 M или менее или 1,8×10^-9 M или менее, как измерено с помощью биослойной интерферометрии.

Вариант осуществления 109. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-108, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 и не конкурирует с человеческим ACE2 за связывание с S-белком SARS-CoV-2.

Вариант осуществления 110. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из вариантов осуществления 94-109.

Вариант осуществления 111. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-110, способное связываться с поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2, когда поверхностный гликопротеин SARS-CoV-2 содержится в префузионном тримере.

Вариант осуществления 112. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-111, способное связываться с рецептор-связывающим доменом (RBD) поверхностного гликопротеина SARS-CoV-2, когда RBD гликозилирован и/или дегликозилирован, где связывание определяют с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), где необязательно:

(1) SPR проводят с использованием прибора Biacore T200 с использованием кинетического подхода с одним циклом, дополнительно необязательно с 3-минутным периодом введения и 20-минутным периодом диссоциации;

(2) антитело или антигенсвязывающий фрагмент захватывают на поверхности;

(3) RBD присутствует в концентрации, составляющей 0,8 нМ, 3,1 нМ, 12,5 нМ, 50 нМ или 200 нМ;

(4) антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с гликозилированым RBD с KD, составляющей около 0,6 нМ, около 0,5 нМ, около 0,4 нМ или около 0,3 нМ, или с KD, составляющей 0,3±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,4±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,45±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,5±0,05 нМ, или с KD, составляющей 0,6±0,05 нМ; и/или

(5) антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с дегликозилированным RBD с KD, составляющей около 1,6 нМ, около 1,5 нМ, около 1,4 нМ, около 1,3 нМ, около 1,2 нМ, около 1,1 нМ, около 1,0.

Вариант осуществления 113. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-112, способное нейтрализовать инфекцию, вызванную SARS-CoV-2, в клетке легкого человека, где, необязательно, клетка легкого человека включает клетку Calu-3, где, дополнительно, необязательно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет IC50 нейтрализации, составляющую около 97 нг/мл.

Вариант осуществления 114. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-113, способное связываться с компонентом комплемента C1q человека, где необязательно связывание с C1q определяют с помощью биослойной интерферометрии (BLI), такой как с использованием прибора Octet.

Вариант осуществления 115. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-114, способное ингибировать слияние клеток, опосредованное поверхностным гликопротеином SARS-CoV-2.

Вариант осуществления 116. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-115, которое не вызывает опосредованного антителом усиления репликации SARS-CoV-2 в мононуклеарной клетке периферической крови (PBMC) или дендритной клетке, полученной от донора человека.

Вариант осуществления 117. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-116, способное ингибировать взаимодействие между:

i) SARS-CoV-2 и человеческой DC-SIGN;

ii) SARS-CoV-2 и человеческой L-SIGN;

iii) SARS-CoV-2 и человеческим SIGLEC-1; или

(iv) любой комбинацией (i)-(iii).

Вариант осуществления 118. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-117, способное связываться с поверхностным гликопротеином:

(i) SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (SEQ ID NO:165);

(ii) SARS-CoV-2 B.1.1.7;

(iii) SARS-CoV-2 B.1.351;

(iv) SARS-CoV-2, содержащего любую одну или более из следующих мутаций по типу замены относительно SEQ ID NO:165: N501Y; S477N; N439K; L452R; E484K; Y453F; A520S; K417N; K417V; S494P; N501T; S477R; V367F; P384L; A522S; A522V; V382L; P330S; T478I; S477I; P479S; или

(v) любой комбинации (i)-(iv).

Вариант осуществления 119. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-118, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способно нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 с IC50 3,0 нМ, 3,1 нМ, 3,2 нМ, 3,3 нМ, 3,4 нМ, 3,5 нМ, 3,6 нМ, 3,7 нМ, 3,8 нМ, 3,9 нМ или 4,0 нМ.

Вариант осуществления 120. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-119, содержащее:

(i) тяжелую цепь, содержащую (i)(1) VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и (i)(2) CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:173; и

(ii) легкую цепь, содержащую (ii)(1) VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 168, и (ii)(2) CL, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:174.

Вариант осуществления 121. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-120, содержащее:

(i) тяжелую цепь, содержащую (i)(1) VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и (i)(2) CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:175; и

(ii) легкую цепь, содержащую (ii)(1) VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 168, и (ii)(2) CL, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:174.

Вариант осуществления 122. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 94-121, содержащее CH1-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:265 или 266.

Вариант осуществления 123. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-122 или кодирующий VH, тяжелую цепь, VL и/или легкую цепь антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

Вариант осуществления 124. Выделенный полинуклеотид по варианту осуществления 123, где полинуклеотид содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК), где РНК необязательно включает матричную РНК (мРНК).

Вариант осуществления 125. Выделенный полинуклеотид по варианту осуществления 123 или 124, который является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке-хозяине.

Вариант осуществления 126. Выделенный полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-125, содержащий полинуклеотид, имеющий по меньшей мере 50% идентичности с полинуклеотидной последовательностью, представленной в любой одной или более из SEQ ID NO:186-189, 191-192, 238, 247, 248-255 и 257-262.

Вариант осуществления 127. Выделенный полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-126, содержащий полинуклеотидную последовательность, представленную в любой одной или более из SEQ ID NO:249, 250 и 257-262.

Вариант осуществления 128. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-127.

Вариант осуществления 129. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-127 и/или вектор по варианту осуществления 128, где полинуклеотид является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину.

Вариант осуществления 130. В-клетка человека, содержащая полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-129, где полинуклеотид является гетерологичным по отношению к В-клетке человека и/или где В-клетка человека является иммортализованной.

Вариант осуществления 131. Композиция, содержащая

(i) антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-122;

(ii) полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-127;

(iii) рекомбинантный вектор по варианту осуществления 128;

(iv) клетку-хозяина по варианту осyществления п. 129; и/или

(v) В-клетку человека по варианту осуществление 130

и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или разбавитель.

Вариант осуществления 132. Композиция по варианту осуществления 131, содержащая два или более антитела или антигенсвязывающих фрагментов по любому из вариантов осуществления 1-122.

Вариант осуществления 133. Композиция по варианту осуществления 132, содержащая:

(i) первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:79, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:83; и

(ii) второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:105, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 134. Композиция по варианту осуществления 132, содержащая:

(i) первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:80-82, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:84-86, соответственно, и

(ii) второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:106-108, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:169-171, соответственно.

Вариант осуществления 135. Композиция по варианту осуществления 132, содержащая:

(i) первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:178, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:182 или SEQ ID NO:190; и

(ii) второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:105, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:168.

Вариант осуществления 136. Композиция по варианту осуществления 135, содержащая:

(i) первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:179-181, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:183-185, соответственно; и

(ii) второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:106-108, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:169-171, соответственно.

Вариант осуществления 137. Композиция по варианту осуществления 132, содержащая:

(i) первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:178, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:182 или SEQ ID NO:190; и

(ii) второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:63, и VL, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:67, любой из SEQ ID NO:71-71 или любой из SEQ ID NO:75-76.

Вариант осуществления 138. Композиция по варианту осуществления 132, содержащая:

(i) первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:179-181, соответственно, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:183-185, соответственно; и

(ii) второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:64-66, соответственно, CDRL1 содержит или состоит из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:73 или SEQ ID NO:74, CDRL2 содержит или состоит из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:69, и CDRL3 содержит или состоит из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:77 или SEQ ID NO:78.

Вариант осуществления 139. Композиция, содержащая (i) антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 8 или 9 и (ii) антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 10 или 11, где композиция способна нейтрализовать инфекцию SARS-CoV-2 с IC50 от около 0,07 до около 0,08 мкг/мл.

Вариант осуществления 140. Композиция, содержащая полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-127, инкапсулированный в молекулу-носитель, где молекула-носитель необязательно включает липид, носитель, полученный из липида, такой как липосома, твердая липидная наночастица, маслянистая суспензия, субмикронная липидная эмульсия, липидный микропузырь, обратная липидная мицелла, кохлеарная липосома, липидная микротрубочка, липидный микроцилиндр, липидная наночастица (LNP) или наноразмерная платформа.

Вариант осуществления 141. Способ лечения инфекции SARS-CoV-2 у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества:

(i) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-122;

(ii) полинуклеотида по любому из вариантов осуществления 123-127;

(iii) рекомбинантного вектора по варианту осуществления 128;

(iv) клетки-хозяина по варианту осyществления п. 129;

(v) В-клетки человека по варианту осуществлениея 130 и/или

(vi) композиции по любому из вариантов осуществления 131-140.

Вариант осуществления 142. Способ ингибирования инфекции SARS-CoV-2 у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества:

(i) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-122;

(ii) полинуклеотида по любому из вариантов осуществления 123-127;

(iii) рекомбинантного вектора по варианту осуществления 128;

(iv) клетки-хозяина по варианту осyществления п. 129;

(v) В-клетки человека по варианту осуществлениея 130 и/или

(vi) композиции по любому из вариантов осуществления 131-140.

Вариант осуществления 143. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-122, полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-127, рекомбинантный вектор по варианту осуществления 128, клетка-хозяин по варианту осуществления 129, В-клетка человека по вариантов осуществления 130 и/или композиция по любому из вариантов осуществления 131-140 для применения в способе лечения инфекции SARS-CoV-2 у субъекта.

Вариант осуществления 144. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-122, полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-127, рекомбинантный вектор по варианту осуществления 128, клетка-хозяин по варианту осуществления 129, В-клетка человека по варианту осуществления 130 и/или композиция по любому из вариантов осуществления 131-140 для применения в способе ингибирования инфекции SARS-CoV-2 у субъекта.

Вариант осуществления 145. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-122, полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 123-127, рекомбинантный вектор по варианту осуществления 128, клетка-хозяин по варианту осуществления 129, В-клетка человека по варианту осуществления 130 и/или композиция по любому из вариантов осуществления 131-140 в получении лекарственного средства для лечения инфекции SARS-CoV-2 у субъекта.

Вариант осуществления 146. Способ диагностики инфекции SARS-CoV-2 in vitro, включающий:

(i) приведение в контакт образца, полученного от субъекта, с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из вариантов осуществления 1-122 и

(ii) обнаружение комплекса, содержащего антиген и антитело или содержащего антиген и антигенсвязывающий фрагмент.

Вариант осуществления 147. Способ по варианту осуществления 146, где образец содержит кровь, выделенную из субъекта.

Вариант осуществления 148. Комбинация или композиция, содержащая:

(i) антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее

(i)(a) аминокислотную последовательность CDRH1 GYPFTSYG, аминокислотную последовательность CDRH2 ISTYNGNT или ISTYQGNT, аминокислотную последовательность CDRH3 ARDYTRGAWFGESLIGGFDN; аминокислотную последовательность CDRL1 или QTVSSTS, аминокислотную последовательность CDRL2 GAS и аминокислотную последовательность CDRL3 QHDTSLT; или

(i)(b) аминокислотную последовательность VH, содержащую или состоящую из QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS

или содержащую или состоящую из QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYQGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSS,

и аминокислотную последовательность VL, содержащую или состоящую из EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVSSTSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHDTSLTFGGGTKVEIK;

и

(ii) антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее

(ii)(a) аминокислотные последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO:79 и 83, соответственно;

(ii)(b) аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:80-82 и 84-86, соответственно;

(ii)(c) аминокислотные последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO:178, или 194, или 196, или 198, или 200, или 202 и 182 или 190, соответственно; или

(ii)(d) аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:179 или 195, 180, или 197, или 199, 181, 201 или 203 и 183-185, соответственно.

Вариант осуществления 149. Способ предотвращения, или лечения, или нейтрализации коронавирусной инфекции у субъекта, включающий введение субъекту комбинации или композиции по варианту осуществления 148, где, необязательно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент (i) и антитело или антигенсвязывающий фрагмент (ii) вводят параллельно, одновременно или последовательно.

Вариант осуществления 150. Способ предотвращения, или лечения, или нейтрализации коронавирусной инфекции у субъекта, включающий введение субъекту, который получил первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:

(a) аминокислотные последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO:79 и 83, соответственно; или

(b) аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:80-82 и 84-86, соответственно;

и второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащего:

(a) аминокислотную последовательность VH, представленную в SEQ ID NO:105 или 113 и аминокислотную последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 168; или

(b) аминокислоты CDRH1, CDRH2 и CDRH3, представленные в SEQ ID NO: 106-108, соответственно, или SEQ ID NO:106, 121 и 108, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:169-171, соответственно.

Вариант осуществления 151. Способ предотвращения, или лечения, или нейтрализации коронавирусной инфекции у субъекта, включающий введение субъекту, который получил первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:

(a) аминокислотную последовательность VH, представленную в SEQ ID NO:105 или 113 и аминокислотную последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 168; или

(b) аминокислоты CDRH1, CDRH2 и CDRH3, представленные в SEQ ID NO: 106-108, соответственно, или SEQ ID NO:106, 121 и 108, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:169-171, соответственно;

и второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащеего:

(a) аминокислотные последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO:79 и 83, соответственно; или

(b) аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:80-82 и 84-86, соответственно.

Вариант осуществления 152. Способ предотвращения, или лечения, или нейтрализации коронавирусной инфекции у субъекта, включающий введение субъекту, который получил первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:

(a) аминокислотные последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO:178, или 194, или 196, или 198, или 200, или 202 и 182 или 190, соответственно; или

(b) аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:179, или 195, 180, или 197, или 199, 181, 201 или 203 и 183-185, соответственно.

и второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащего:

(a) аминокислотную последовательность VH, представленную в SEQ ID NO:105 или 113 и аминокислотную последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 168; или

(b) аминокислоты CDRH1, CDRH2 и CDRH3, представленные в SEQ ID NO: 106-108, соответственно, или SEQ ID NO:106, 121 и 108, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:169-171, соответственно.

Вариант осуществления 153. Способ предотвращения, или лечения, или нейтрализации коронавирусной инфекции у субъекта, включающий введение субъекту, который получил первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:

(a) аминокислотную последовательность VH, представленную в SEQ ID NO:105 или 113 и аминокислотную последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 168; или

(b) аминокислоты CDRH1, CDRH2 и CDRH3, представленные в SEQ ID NO: 106-108, соответственно, или SEQ ID NO:106, 121 и 108, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:169-171, соответственно;

и второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащеего:

(a) аминокислотные последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO:178, или 194, или 196, или 198, или 200, или 202 и 182 или 190, соответственно; или

(b) аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO:179 или 195, 180, или 197, или 199, 181, 201 или 203 и 183-185, соответственно.

Примеры

Пример 1

Моноклональные антитела человека, которые связывают спайк-белок SARS-CoV-2

В-клетки донора с предыдущей инфекцией SARS-CoV отсортировали и иммортализовали EBV (вирус Эпштейна-Барра) и подвергали скринингу в 384-луночных планшетах (способ, описанный в европейском патенте EP1597280B1, который включен в настоящий документ посредством ссылки).

Через две недели после иммортализации супернатанты иммортализованных В-клеток тестировали на связывание антитела со спайк-белком SARS-CoV-2 ("S") с помощью способа проточной цитометрии. Вкратце, клетки ExpiCHO трансфицировали S-белком SARS-CoV-2 (штамм BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019) или пустой плазмидой в качестве отрицательного контроля. Были идентифицированы четырнадцать моноклональных антител, которые связывают SARS-CoV-2 S, и были названы как SARS-CoV-2 S300 через SARS-CoV-2 S312 и SARS-CoV-2 S315 соответственно. Данные связывания для SARS-CoV-2 S300 через SARS-CoV-2 S310 показаны на фиг. 4A и 4B (на этих фигурах антитела обозначены как «S300»-«S310» соответственно). Графики, демонстрирующие положительное связывание, обозначены рамками.

Аминокислотные последовательности 3 областей, определяющих комплементарность тяжелой цепи (CDR) и легкой цепи (L) CDR3 некоторых из этих антител, наряду с процентной идентичностью последовательностей гена вариабельной области зародышевой линии (IMGT; imgt.org), представлены в таблице 3.

Пример 2

Связывание антител с RBD SARS-CoV-2 с использованием Octet

Биосенсоры стрепавидина (Pall ForteBio) использовали для иммобилизации антитела к Strep Tag II при 3 мкг/мл (клон 5A9F9, биотин, LabForce AG, Muttenz CH) после этапа гидратации в течение 10 минут с кинетическим буфером (KB; 0,01% BSA без эндотоксинов, 0,002^ Tween-20, 0,005% NaN3 в PBS). Затем RBD SARS-CoV-2 с Strep Tag II (полученный собственными силами) загружали в течение 6 мин в концентрации 4 мкг/мл в KB. Антитела из супернатанта В-клеток оставляли ассоциироваться в течение 1620 секунд (27 минут). Для наблюдения за диссоциацией сенсоры перемещали из раствора антитела в KB и контролировали диссоциацию антител.

"S303" mAb содержит аминокислотные последовательности S303-v1 VH и VL, представленные в таблице 2 (SEQ ID NO:63 и 67, соответственно). "S309" mAb содержит аминокислотные последовательности S309-v1 VH и S309-v13 VL, представленные в таблице 2 (SEQ ID NO: 105 и 168, соответственно). Аллели, кодирующие SEQ ID NO:109 и 147-150 из B-клетки S309, определяли как непродуктивные; SEQ ID NO:168 представляет собой продуктивный аллель.

Сравнение кривых связывания для мАт S303 и S309 с RBD SARS-CoV-2 (фиг. 1A и 1B) указывает на то, что S303 имеет как более высокую скорость ассоциации, так и более высокую скорость диссоциации, чем S309, что позволяет предположить, что S309 может связываться с RBD SARS-CoV-2 с более высокой аффинностью.

Пример 3

Оценка связывания антител с RBD SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1 с использованием Octet

Если контекст явно не указывает на иное (например, что антитела присутствовали в супернатанте В-клеток или использовали фрагмент Fab антитела), антитела по настоящему изобретению описаны в этом и последующих примерах как рекомбинантно экспрессированные IgG1 человека, в некоторых случаях с аминокислотными мутациями в Fc, как описано в настоящем документе.

Аффинность связывания трех перекрестно-реактивных рекомбинантных антител к SARS-CoV/SARS-CoV-2 (S303 rIgG1, S304 rIgG1, S309 rIgG1) и двух специфических антител к SARS-CoV-1 (S109 rIgG1, S230 rIgG1) исследовали с помощью биослойной интерферометрии (BLI) с использованием Octet. Аффинность измеряли путем иммобилизации антитела на сенсорах и сенсорах погружения в лунки, содержащие различные концентрации RBD.

Кинетику связывания антитела с RBD регистрировали во время фазы ассоциации, после чего датчики погружали в буфер без антитела для наблюдения кинетики отделения антитела от RBD во время фазы диссоциации. Кратко, биосенсоры белка A (Pall ForteBio) использовали для иммобилизации рекомбинантных антител при 2,7 мкг/мл в течение 1 минуты, после этапа гидратации в течение 10 минут с помощью буфера для кинетического анализа (KB; 0,01% BSA без эндотоксинов, 0,002^ Tween-20, 0,005% NaN3 в PBS). Кривые ассоциации регестрировали в течение 5 минут путем инкубации сенсоров, покрытых антителами, с различными концентрациями RBD SARS-CoV-1 (Sino Biological) или RBD SARS-CoV-2 (полученный собственными силами в клетках Expi-CHO; остатки 331-550 спайк-белка из BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947). Самая высокая протестированная концентрация RBD составляла 10 мкг/мл, затем серийно разбавляли 1:2,5 с. Диссоциацию регистрировали в течение 9 минут, перемещая сенсоры в лунки, содержащие KB. Аффинности, представленные значениями KD, рассчитывали с использованием глобальной модели соответствия (Octet). Использовали оборудование Octet Red96 (ForteBio).

На фиг. 6A-6E показаны кривые ассоциации и диссоциации для антител с использованием наивысшей испытанной концентрации RBD (10 мкг/мл). Переключение с раствора RBD на буфер индицируется вертикальной пунктирной линией. Тестировали три перекрестно-реактивных антитела (S303 rIgG1, S304 rIgG1 (VH с SEQ ID NO:79, VL с SEQ ID NO:73), S309 rIgG1 (VH с SEQ ID NO:105, VL с SEQ ID NO:168) и два специфических антитела к SARS-CoV-1 (S230 и S109). Все антитела продемонстрировали сильное связывание с RBD SARS-CoV-1. S230 и S109 не связывались с RBD SARS-CoV-2. Связывание S303 rIgG1, S304 rIgG1 и S309 rIGg1 с RBD SARS-CoV-2 находилось в диапазоне от наномолярного до субпикомолярного, причем S309 rIgG1 демонстрировал наивысшую аффинность. Значения KD указаны под графиками на фиг. 6A-6E. Значения KD представляют собой оценки (KD составляет менее 1,0×10^-12M), если связывание антител очень сильное, а диссоциация медленная. Точное значение KD для S309 rIgG1 не может быть измерено с помощью этого анализа, поскольку диссоциация была слишком медленной.

Пример 4

Нейтрализация инфекции SARS-CoV-2

Некомпетентные к репликации вирусы, псевдотипированные геном SARS-CoV-2 (изолят BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019; кат. № MN908947), была получена с использованием способов, описанных ранее (Temperton NJ, и др. (2005) Longitudinally profiling neutralizing antibody response to SARS coronavirus with pseudotypes. Emerg Infect Dis 11(3):411-416). Вкратце, клетки HEK293T/17 котрансфицировали S-экспрессирующей плазмидой S-клеточного SARS-CoV-2 (phCMV1, Genlantis) и вектором комплементарного репортерного гена вирусного генома pNL4-3. Luc+E-R+. Для измерения нейтрализации вирионов, кодирующих люциферазу, псевдотипированных S-белком SARS-CoV-2, как описано ранее, использовали одноцикловый анализ инфекционности (Temperton NJ, и др. (2007) A sensitive retroviral pseudotype assay for influenza H5N1-neutralizing antibodies. Influenza Other Respi Viruses 1(3):105-112.). Вкратце, соответствующие разведения супернатантов культуры, содержащих вирион, предварительно инкубировали при 37°С в течение 1 часа с антителами в различных концентрациях, а затем смеси вируса и mAb добавляли к клеткам Vero E6, которые были посеяны за день до инфекции. Затем клетки лизировали реагентом Steady-Glo (Promega, E2520), и относительные единицы люминесценции (RLU) в клеточных лизатах определяли на микропланшетном ридере с люминометром (Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader; Biotek). Снижение инфективности определяли путем сравнения RLU в присутствии и отсутствии антитела и выражали в процентах нейтрализации.

Антитела S300-v1 (VH: SEQ ID NO:1; VL: SEQ ID NO:5), S301, S302, S303-v1 (VH SEQ ID NO:63; VL SEQ ID NO:67), S304 (VH SEQ ID NO:79; VL SEQ ID NO:83), S306 (VH SEQ ID NO:87; VL SEQ ID NO:91), S307 (VH SEQ ID NO:239; VL SEQ ID NO:243), S308-v1, S309 (содержащая последовательность VH S309-v1, представленную в SEQ ID NO: 105, и последовательность VL S309-v13, представленную в SEQ ID NO: 168) и S310 тестировали на эффект нейтрализации (таблица 4, фиг. 2A). Антитела SARS-CoV-2 S300-v1 и SARS-CoV-2 S309 нейтрализовали инфекцию SARS-CoV-2 (фиг. 2A и 2B).

Таблица 4. Процент нейтрализации инфекции антителами (серия титрования)
Разведение	S300	S301	S302	S303	S304	S306	S307	S308	S309	S310
2	93	-31	-47	6	-21	-19	36	-46	65	-4
6	94	10	6	5	25	15	5	19	11	-15
18	75	21	-16	2	-22	-9	2	32	-29	-15
54	-41	7	-60	12	7	6	32	16	14	-6

Дополнительные анализы нейтрализации проводили с использованием плазмы от выживших пациентов после SARS CoV-1 и антител SARS-CoV-2 S309, S311, S312, S303-v1 (rIgG1), S304 (rIgG1), S306 (rIgG1), S310 (rIgG1) и S315 (фиг. 3A-3I). На фиг. 3А показана нейтрализующая активность донорской плазмы SARS-CoV. На фиг. 3B-3D и 3I показана нейтрализующая активность супернатанта из В-клеток, продуцирующих S309, S311, S312 и S315, соответственно. На фиг. 3E-3H показана нейтрализующая активность рекомбинантного антитела в различных концентрациях. Используя этот анализ, супернатант, содержащий антитело S309, S311, S312 или S315, нейтрализует инфекцию SARS-CoV-2.

Дополнительные анализы нейтрализации проводили с использованием антител S303, S304, S306, S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), S310 и S315. На фиг. 13 показана нейтрализующая активность этих антител в различных концентрациях против MLV, псевдотипированного SARS-CoV-2. В качестве клеток-мишеней использовали DBT-клетки, стабильно трансфицированные ACE2 (DBT-ACE2). На фиг. 34 показана нейтрализующая активность против MLV, псевдотипированного SARS-CoV-1 этими антителами в различных концентрациях. Дополнительные данные нейтрализации для S304, S309, S304 + S309, S315 и S315 + S309 показаны на фиг. 36 и 37.

Пример 5

Нейтрализация инфекции SARS-CoV-2

Оценивали нейтрализующую активность двух кросс-нейтрализующих антител SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, S304 rIgG1 и S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) rIgG1, против вирусов, псевдотипированных SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2pp).

Использовали вирус мышиного лейкоза (MLV), псевдотипированный спайк-белком SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2pp). В качестве клеток-мишеней использовали DBT-клетки, стабильно трансфицированные ACE2 (DBT-ACE2). SARS-CoV-2pp активировали трипсином TPCK (тозилфенилаланилхлорметилкетон) в концентрации 10 мкг/мл. Активированный SARS-CoV-2pp добавляли к серии разведений антител (начиная с конечной концентрации 50 мкг/мл на антитело, 3-кратное разведение). Антитела тестировали в концентрациях от 50 мкг/мл до 0,02 мкг/мл. Для комбинации S304 rIgG1 и S309 rIgG1 начальные концентрации составляли 50 мкг/мл для каждого антитела, то есть общая начальная концентрация антитела составляла 100 мкг/мл. Клетки DBT-ACE2 добавляли к смесям антитело-вирус и инкубировали в течение 48 часов. Люминесценцию измеряли после аспирации супернатанта клеточной культуры и добавления устойчивого субстрата GLO (Promega).

В этом анализе S309 rIgG1 демонстрировал нейтрализацию IC50 инфекции 0,37 мкг/мл, а S304 rIgG1 демонстрировал IC50 приблизительно 17 мкг/мл. Комбинация этих двух антител продемонстрировала IC50 0,077 мкг/мл. См. фиг. 7 и таблицу 5.

Таблица 5. IC50 (мкг/мл) антител
	S309	S304	S304 + S309
IC50	0,3707	~16,95	0,07704

Дальнейшие анализы нейтрализации проводили с использованием той же процедуры для рекомбинантных моноклональных антител S309 и S315, по отдельности и в комбинации. В этом анализе S309 демонстрировал IC50 1,091 мкг/мл, а S315 демонстрировал IC50 25,1 мкг/мл. Комбинация обоих этих антител демонстрировала IC50 0,3047 мкг/мл. См. фиг. 23 и таблицу 6.

Таблица 6. IC50 (мкг/мл) антител и комбинации антител
	S309 + S315	S309	S315
IC50	0,3047	1,091	25,10

Пример 6

Реактивность человеческих моноклональных антител против SARS-CoV и SARS-CoV-2

Реактивность дополнительных человеческих mAb "S311" и "S312" против субъедицы S1 спайк-белка и RBD белка SARS-CoV и SARS-CoV-2 оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

96-луночные планшеты покрывали субъединицей S1 рекомбинантного спайк-белка SARS-CoV-2 (Sino Biological), RBD SARS-CoV-2 (Sino Biological или полученный собственными силами; остатки 331-550 спайка-белка из BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947), субъединицей S1 рекомбинантного спайк-белка SARS-CoV Spike S1 (Sino Biological) или SARS-CoV RBD (Sino Biological).

Лунки промывали и блокировали PBS+1%BSA в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали с серийно разведенными mAb в течение 1 часа при комнатной температуре. Связанные mAb обнаруживали путем инкубации конъюгированных с щелочной фосфатазой козьих антител против IgG человека (Southern Biotechnology: 2040-04) в течение 1 часа при комнатной температуре и проявляли с помощью 1 мг/мл п-нитрофенилфосфатного субстрата в 0,1 М глициновом буфере (pH 10,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Значения оптической плотности (OD) измеряли при длине волны 405 нм в ридере ELISA (спектрофотометр Powerwave 340/96, BioTek).

Результаты показаны на фиг. 5A (SARS-CoV-2 S311) и фиг. 5B (SARS-CoV-2 S312).

Дальнейшие анализы проводили для исследования реактивности вариантов антител, сконструированных из S300, S305 или S307 к RBD SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1, используя ту же процедуру, описанную выше в этом примере. Результаты показаны на фиг. 38A-38D. Антитело "S300 V4-rIgG1", как показано на фиг. 38C, содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VL (Vκ), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:234. Антитело "S307 V3-rIgG1", как показано на фиг. 38D, содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 239, и VL (Vκ), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:243.

Пример 7

Нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью S309 и S315

Определяли нейтрализующую активность рекомбинантных антител S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) rIgG1-MLNS и S315 rIgG1-MLNS против вирусов, псевдотипированных SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2pp). Эти рекомбинантные антитела содержали мутации M428L и N434S в домене Fc (см., например, Zalevsky и др., Nat. Biotechnol. 28(2):157-159 (2010); эта комбинация мутаций Fc также упоминается как "MLNS" или "LS" в настоящем описании, в том числе на фигурах).

Использовали вирус мышиного лейкоза (MLV), псевдотипированный спайк-белком SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2pp). В качестве клеток-мишеней использовали DBT-клетки, стабильно трансфицированные ACE2 (DBT-ACE2). SARS-CoV-2pp активировали трипсином TPCK в концентрации 10 мкг/мл. Активированный SARS-CoV-2pp добавляли к серии разведений тестируемого антитела. Клетки DBT-ACE2 добавляли к смесям антитело-вирус и инкубировали в течение 48 часов. Люминесценцию измеряли после аспирации супернатанта клеточной культуры и добавления устойчивого субстрата GLO (Promega). Сигнал люциферазы инфицированных клеток использовали для расчета процента нейтрализации по сравнению с контролем без антител.

S309 rIgG1 MLNS ("S309-rIgG1-LS" на фиг. 9) демонстрировало IC50 нейтрализации инфекции, составляющей приблизительно 3,9 нМ, а S315 rIgG1 MLNS ("S315-rIgG1-LSv1" на фиг. 9) демонстрировало IC50, составляющей приблизительно 111,7 мМ. См. фиг. 9.

Нейтрализующую активность S309-rFab сравнивали с активностью полноразмерного S309 rIgG1 MLNS ("S309-rIgG1-LS" на фиг. 10). Полноразмерное S309 rIgG-LS демонстрировало IC50 3,821 нМ, в то время как S309-rFab демонстрировало IC50 3,532 нМ. См. фиг. 10.

Пример 8

Реактивность антител против RBD SARS-CoV-1, RBD SARS-CoV-2 и эктодоменов различных коронавирусов

Реактивность моноклональных антител против RBD SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 и спайк-белков SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, OC43 и MERS коронавируса изучали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). 384-луночные неглубокие планшеты для твердофазного ELISA покрывали стабилизированным префузионным тримером спайк-белка SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, OC43 или MERS в концентрации 1 мкг/мл, или RBD SARS-CoV-2 (полученный собстивенными силами; остатки 331-550 спайк-белка BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947) в концентрации 10 мкг/мл, или RBD SARS-CoV-1 (Sino Biological) в концентрации 1 мкг/мл.

Лунки промывали и блокировали PBS+1% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали с серийно разведенными антителами в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Антитела тестировали в диапазоне концентраций от 5 до 0,00028 мкг/мл. Планшеты промывали и выявляли связанные антитела путем инкубации конъюгированного с щелочной фосфатазой козьего антитела против IgG человека (Southern Biotechnology: 2040-04) в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим развитием цвета с использованием 1 мг/мл п-нитрофенилфосфатного субстрата (Sigma-Aldrich 71768) в 0,1 М глициновом буфере (pH 10,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность (OD) измеряли при длине волны 405 нм в ридере ELISA (спектрофотометр Powerwave 340/96, BioTek).

Результаты анализа ELISA показаны на фиг. 8A-8K и 18A-18J. Рекомбинантные антитела, некоторые из которых несут мутации Fc MLNS, показаны с rIgG1.

Пример 9

Связывание антител с о спайк-белком SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2

Клетки ExpiCHO трансфицировали phCMV1-SARS-CoV-2-S, SARS-spike_pcDNA.3 (штамм SARS) или пустой phCMV1 с использованием Expifectamine CHO Enhancer. Через два дня после трансфекции клетки собирали для иммуноокрашивания антителами. Для обнаружения использовали меченное Alexa647 вторичное антитело против Fc IgG человека. Связывание моноклонального антитела с трансфицированными клетками анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием клеточного анализатора ZE5 (Biorard) и программного обеспечения FlowJo (TreeStar). Положительное связывание определяли дифференциальным окрашиванием трансфектантов CoV-S по сравнению с имитацией трансфектантов. Антитело S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168) исследовали с помощью проточной цитометрии в концентрации 10 мкг/мл на способность окрашивать клетки ExpiCHO, экспрессирующие S-белок SARS-CoV-1 или SARS-CoV-2. Сложенные гистограммы графиков проточной цитометрии демонстрируют дозозависимое связывание антитела S309 с S-белком SARS-CoV или SARS-CoV-2. Результаты приведены на фиг. 11.

Связывание моноклональных антител S303, S304, S306, S309, S310, S315, S110, S124, S230 и S109 (все экспрессировались как rIgG1) с S-белком SARS-CoV-1 и S-белком SARS-CoV-2 измеряли с помощью проточной цитометрии. Результаты показаны на фиг. 12A, 12B, 40A и 40B. Восемь из тестируемых антител продемонстрировали значения EC50 в диапазоне от 1,4 нг/мл до 6100 нг/мл для связывания S-белка SARS-CoV-2 и от 0,8 нг/мл до 254 нг/мл для связывания S-белка SARS-CoV-1.

Дополнительные анализы связывания с использованием той же процедуры проводили для S309 и четырех сконструированных вариантов S309, несущих различные мутации в VH (N55Q, W50F, W105F или W50F + G56A + W105F). Результаты приведены на фиг. 27. Значения EC50 для каждого антитела, протестированного в этих анализах, показаны в таблице 7; номера, заключенные в скобки в столбце «Антитело» в таблице 7, соответствуют обозначениям на фиг. 27.

Таблица 7
Антитело	VH SEQ ID NO:	VL SEQ ID NO:	EC50 (нг/мл) - эксперимент 1	EC50 (нг/мл) - эксперимент 2
S309 WT ("11")	105	168	23,1	11,5
S309 N55Q ("12")	113	168	22,3	9,6
S309 W50F ("13")	129	168	21,8	8,9
S309 W105F ("14")	119	168	21,4	8,4
S309 W50F-G56A-W105F ("15")	172	168	18,8	7,8

Дополнительные анализы связывания с использованием той же процедуры проводили с использованием антител S303, S304, S306, S309, S310, S315 и сравнительных антител S109, S110, S124 и S230. Результаты показаны на фиг. 33A и 42A (связывание с S-белком SARS-CoV-2) и 33B и 42B (связывание с S-белком SARS-CoV-1). MFI: средняя интенсивность флуоресценции, измеренная с помощью проточной цитометрии.

Такой же анализ проводили с использованием рекомбинантных антител S300 и S307. Результаты для антитела S300-rIgG1, которое содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VL (Vκ), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:234, показаны на фиг. 39A. Результаты для антитела S307-rIgG1, которое содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 239, и VL (Vκ), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24, показаны на фиг. 39B.

Пример 10

Связывание антител S309, S303, S304 и S315 с RBD SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1

Аффинность рекомбинантных антител S309, S303, S304 и S315 к RBD CoV-1 и CoV-2 проверяли с помощью биослойной интерферометрии (BLI; Octet). Вкратце, His-меченную RBD SARS-CoV-1 или SARS-CoV-2 загружали в концентрации 3 мкг/мл в кинетическом буфере (KB) в течение 15 минут на биосенсоры против HIS (HIS2) (Molecular Devices, ForteBio). Ассоциацию полноразмерных антител проводили в KB при 15 мкг/мл в течение 5 минут. Ассоциацию Fab-фрагментов проводили в KB при 5 мкг/мл в течение 5 минут. Диссоциацию в KB измеряли в течение 10 минут. Аффинности, представленные значениями KD, рассчитывали с использованием глобальной модели соответствия (Octet). Использовали оборудование Octet Red96 (ForteBio).

На фиг. 14A-14D показаны кривые ассоциации и диссоциации для S309, S303, S304 и S315, соответственно. Каждое из этих антител связывается с RBD SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1 с аффинностью от наномолярной до субпикомолярной. На фиг. 20A и 20B показаны кривые ассоциации и диссоциации для IgG S309 и Fab S309, соответственно. На этих фигурах вертикальной пунктирной линией обозначен переход от раствора антитела (или Fab) к буферу.

Пример 11

Связывание S309 IgG и S309 Fab с тримером эктодомена S-белка SARS-CoV-2 и RBD

Определение аффинности и авидности IgG1 и Fab-фрагмента: биотинилированный RBD SARS-CoV-2 (полученный собственными силами; аминокислотные остатки 331-550 спайк-белка из BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947, биотинилированный EZ-Link NHS-PEG4-Biotin от ThermoFisher) и биотинилированный SARS-CoV-2 2P S с avi-меткой загружали при 7,5 мкг/мл в кинетическом буфере (KB; 0,01% BSA без эндотоксинов, 0,002% Tween-20, 0,005% NaN3 в PBS) в течение 8 минут на биосенсоры стрептавидина (Molecular Devices, ForteBio). Ассоциацию IgG1 и Fab с мишенью проводили в KB при 100, 33, 11, 3,6, 1,2 нМ в течение 5 минут. Диссоциацию в KB измеряли в течение 10 минут. Значения KD рассчитывали с использованием глобальной модели соответствия 1:1 (Octet).

Результаты показаны на фиг. 41A и 41B. В этом анализе IgG S309 связывался с RBD SARS-CoV-2 и с тримером S-эктодомена с субпикомолярной и пикомолярной авидностью, соответственно. S309 Fab, связанный как с RBD SARS-CoV-2, так и с тримером S-эктодомена с наномолярной и субнаномолярной аффинностью.

Пример 12

Конкурентное связывание антител с RBD SARS-CoV-1 или SARS-CoV-2

Конкурентное связывание пар моноклональных антител с RBD SARS-CoV-1 или RBD SARS-CoV-2 измеряли для идентификации соответствующих сайтов связывания антител.

Биосенсоры стрепавидина (Pall ForteBio) использовали для иммобилизации антитела к Strep Tag II при 3 мкг/мл (клон 5A9F9, биотин, LabForce AG, Muttenz CH) после этапа гидратации в течение 10 минут с кинетическим буфером (KB; 0,01% BSA без эндотоксинов, 0,002^ Tween-20, 0,005% NaN3 в PBS). Затем RBD SARS-CoV-1 или SARS-CoV-2 со Strep Tag II (полученный собственными силами) загружали на 6 минут в концентрации 4 мкг/мл в KB. Первому антителу давали ассоциироваться в течение определенного периода времени, а затем второму антителу давали ассоциироваться в течение 7 минут (420 секунд). На фиг. 15A показана конкуренция пар антител за связывание с RBD SARS-CoV-1. На фиг. 15B показана конкуренция пар антител за связывание с RBD SARS-CoV-2. Пунктирные вертикальные линии на фиг. 15A и 15B указывают на переход от первого антитела, указанного слева от матрицы, ко второму антителу, указанному в верхней части матрицы. Используя эти и другие данные, были идентифицированы четыре антигенные области или сайта (I-IV на фиг. 15A и 15B).

Пример 13

Интерференция с RBD: связывание ACE2 человека

Измеряли способность антител препятствовать связыванию RBD с человеческим ACE2. ACE2-His (Bio-Techne AG) загружали в течение 30 минут при 5 мкг/мл в кинетическом буфере (KB) на биосенсоры анти-HIS (HIS2) (молекулярные устройства-ForteBio) Fc кроличьего RBD SARS-CoV-1 или Fc мышиного RBD SARS-CoV-2 (Sino Biological Europe GmbH) при 1 мкг/мл ассоциировали в течение 15 минут после предварительной инкубации с антителом или без антитела при 30 мкг/мл в течение 30 минут. Диссоциацию контролировали в течение 5 минут. На фиг. 16 показаны данные, полученные с использованием антитела S309 или S230. На фиг. 19А и 19В показаны данные, полученные с использованием антител S304, S303 или S230 (фиг. 19А) или RBD и антитела S315 (фиг. 19В). Вертикальная пунктирная линия на каждой из фиг. 16, 19A и 19B указывает на начало загрузки RBD с антителом или без антитела.

Пример 14

Эффекторная функция антител

Опосредованная естественными киллерами (NK) антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) может способствовать контролю вируса путем уничтожения инфицированных клеток, презентирующих вирусный белок на своей поверхности. Чтобы исследовать способность антител использовать эту функцию, ADCC исследовали in vitro с использованием человеческих NK-клеток (выделенных из свежей крови здоровых доноров с использованием набора MACSxpress NK Isolation Kit (Miltenyi Biotec, кат. № 130-098-185)) в качестве эффекторных клеток и трансфицированных S-белком SARS-CoV-2 клеток ExpiCHO в качестве клеток-мишеней. Клетки-мишени инкубировали с различными количествами антитела и через 10 минут инкубировали с первичными NK-клетками человека в качестве эффекторных клеток при соотношении мишень:эффектор 9:1. Антителозависимое уничтожение клеток измеряли с использованием анализа высвобождения LDH (лактатдегидрогеназа) (набор для обнаружения цитотоксичности (LDH) (Roche; кат. № 11644793001)) после 4 часов инкубации при 37°C.

Макрофагальный или дендритный клеточно-опосредованный антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) также может способствовать контролю вируса путем очистки инфицированных клеток и потенциальной стимуляции Т-клеточного ответа презентацией вирусного антигена. ADCP тестировали с использованием мононуклеарных клеток периферической крови в качестве фагоцитов и ExpiCHO, трансфицированных S-белком SARS-CoV-2, флуоресцентно меченным набором флуоресцентных клеточных линкеров PKH67 (Sigma Aldrich, кат. № MINI67) в качестве клеток-мишеней. Клетки-мишени инкубировали с различными количествами антител в течение 10 минут с последующей инкубацией с PBMC человека, выделенными из здоровых доноров, которые были флуоресцентно мечены Cell Trace Violet (Invitrogen, кат. № C34557) при соотношении эффектор:мишень 20:1. После инкубации в течение ночи при 37°С клетки окрашивали антителом против CD14-APC человека (BD Pharmingen, кат. № 561708, клон M5E2) для окрашивания фагоцитарных клеток. Антитело-опосредованный фагоцитоз определяли с помощью проточной цитометрии, измеряя % моноцитов, которые были положительными на флуоресценцию PKH67.

Были протестированы антитела S309 (VH SEQ ID NO:105; VL SEQ ID NO:168), S304, S306, S315, S230 и комбинация S309 и S304.

На фиг. 17A показана функция ADCC антител с использованием первичных NK-эффекторных клеток и экспрессирующих S-белок SARS-CoV-2 ExpiCHO в качестве клеток-мишеней. Значения показывают среднее значение ±SD (стандартное отклонение) повторных измерений. На фиг. 17B показана функция ADCP антител с использованием PBMC в качестве фагоцитарных клеток и экспрессирующих S-белок ExpiCHO, меченных PKF67, в качестве клеток-мишеней. Значения показывают среднее значение ±SD (стандартное отклонение) повторных измерений.

Варианты Fc S309 тестировали на ADCC. S309-LS включает мутации Fc M428L и N434S. S309-GRLR включает мутацию Fc G236R/L328R, которая демонстрирует минимальное связывание с FcγR. S309-LS-GAALIE включает мутации Fc MLNS и GAALIE (G236A/A330L/I332E). Результаты приведены на фиг. 45.

Антитела S303, S304, S306, S309, S315 и комбинацию S309 и S315 анализировали на функцию ADCC и ADCP. На фиг. 24A показана ADCC антител с использованием первичных NK-эффекторных клеток и экспрессирующих S-белок SARS-CoV- или SARS-CoV-2 ExpiCHO в качестве клеток-мишеней. График на фиг. 24A иллюстрирует процент уничтожения, определенный для одного репрезентативного донора, гомозиготного по высокоаффинному FcγRIIIa (значения показывают среднее ±SD). На фиг. 24В показана площадь под кривой (AUC) для ответов клеток доноров, гомозиготных по высокоаффинному варианту FcγRIIIa 158V (VV), по сравнению с клетками доноров, гетерозиготными по 158V (FV) или гомозиготными по низкоаффинному варианту 158F (FF) (среднее ±SD). На фиг. 25A показан ADCP с использованием PBMC в качестве фагоцитарных клеток и экспрессирующих S-белок SARS-CoV-2 ExpiCHO, меченых PKH67 в качестве клеток-мишеней для одного репрезентативного донора. % ADCP указывает на процент моноцитов, положительных на PKH67. На фиг. 25B показана площадь под кривой (AUC) на ответы нескольких доноров.

Пример 15

Реактивность антител к клеточному лизату клеток, инфицированных SARS-CoV-2

Измеряли реактивность антител S304, S306, S309 и S310 против клеточного лизата клеток VeroE6, инфицированных SARS-CoV-2. На фиг. 21A показана реактивность антител, измеренная с помощью непрямого ELISA S-белка против T×100-экстрагированного лизата клеток VeroE6, инфицированных SARS-CoV-2. На фиг. 21В показана реактивность антител, измеренная с помощью непрямого ELISA S-белка против экстрагированного SDS (денатурированного) лизата клеток VeroE6, инфицированных SARS-CoV-2. На фигуре 21C показана реактивность сыворотки выздоравливающего человека от SARS-CoV-1, измеренная с помощью непрямого ELISA S-белка против экстрагированного T×100 или SDS лизата клеток VeroE6, инфицированных SARS-CoV-2.

Пример 16

Нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью антител S304 и S309 в отдельности или в комбинации

Нейтрализацию инфекции SARS-CoV-2 с помощью моноклональных антител S304 и S309 оценивали с помощью анализа живого вируса SARS-CoV-2. Анализ нейтрализации живого вируса количественно определяет количество инфицированных клеток путем окрашивания вирусного нуклеопротеина (NP) с NP-специфической поликлональной сывороткой кролика. Ингибирование оценивали путем измерения экспрессии NP через 24 и 45 часов после инфицирования. Иммуноферментный анализ (EIA) использовали для количественного определения уровня инфекции для каждого тестируемого разведения антител.

Данные показаны на фиг. 22A-22D. Нейтрализацию проводили в течение одного часа при комнатной температуре при указанных концентрациях антител с использованием клеток Vero E6 в монослое в 96-луночных планшетах. Лунки инфицировали 100 TCID50 вируса. Через 24 или 45 часов монослои фиксировали и окрашивали для ингибирования экспрессии NP. В сочетании S304 и S309 демонстрировали синергетическое усиление нейтрализации.

Пример 17

Получение варианта rIgG антител S309

Рекомбинантные антитела IgG1 получали с использованием последовательностей VH и VL антитела S309. В этом примере антитела называют "S309-11", "S309-12", "S309-13", "S309-14" и "S309-15", соответственно.

"S309-11" содержит последовательность VH дикого типа (SEQ ID NO: 105) и последовательность VL дикого типа (SEQ ID NO: 168) S309. "S309-12" содержит мутацию N55Q в CDRH2, обеспечивающую последовательность варианта VH (SEQ ID NO: 113) и последовательность VL дикого типа (SEQ ID NO: 168) S309. "S309-13" содержит мутацию W50F в VH (SEQ ID NO: 129) и последовательность VL дикого типа (SEQ ID NO: 168) S309. "S309-14" содержит последовательность варианта W105F VH (SEQ ID NO: 119) и последовательность VL дикого типа (SEQ ID NO: 168) S309. "S309-15" содержит вариант W50F/G56A/W105F VH (SEQ ID NO: 172) и последовательность VL дикого типа S309 (SEQ ID NO: 168). Рекомбинантное антитело S309 (S309-11) и каждый из четырех вариантов S309-12 - S309-15 получали путем временной трансфекции и экспрессии плазмидного вектора, кодирующего рекомбинантное антитело, в клетках HD 293F (GenScript). Плазмидный вектор, кодирующий антитела S309, также кодирует сигнальный пептид, как указано в SEQ ID NO:252. Этот сигнальный пептид обеспечивал превосходную продукцию антител по сравнению с другими протестированными сигнальными пептидами. Данные не показаны. Клетки собирали на 4 день, а экспрессию IgG подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и анализа титра белка А.

Пример 18

Связывание S309 rIgG и вариантов с RBD SARS-CoV-2

Связывание рекомбинантного моноклонального антитела S309 и четырех вариантов S309, описанных в Примере 17 (S309-12 - S309-15), с RBD измеряли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Эксперименты SPR проводили с использованием прибора Biacore T200 с использованием кинетического подхода с одним циклом. Антитело, экспрессируемое как IgG, захватывали на поверхности и вводили возрастающие концентрации очищенного RBD SARS-CoV-2 гликозилированной или дегликозилированной формы. SPR проводили с использованием сенсорного чипа с ковалентно иммобилизованным Fc против человека (GE). Использовали буфер 10 мМ HEPES с pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% моющего средства P20. Анализы проводили при 25°C. Рекомбинантные антитела разбавляли из супернатанта до приблизительно 2 мкг/мл. Концентрации RBD составляли 0,8 нМ, 3,1 нМ, 12,5 нМ, 50 нМ и/или 200 нМ. Гликозилированную RBD получали путем экспрессии в клетках HEK293 и очищали с использованием одностадийной Ni-аффинной очистки. Дегликозилированный RBD получали путем экспрессии полученной внутренними силами в клетках Expi293, выращенных в присутствии кифунензина, очистки с использованием одностадийной Ni-аффинной очистки и обработки эндогликозидазой H. Кинетические анализы с одним циклом проводили с 3-минутными инъекциями и 20-минутными периодами диссоциации. Кинетику ассоциации и диссоциации контролировали и подгоняли к модели связывания для определения аффинности. Результаты показаны на фиг. 30A-30F и в таблице 8.

Таблица 8
Cупернатант mAb	Гликозилированный RBD			Дегликозилированный RBD
S309 WT или вариант	KD	Ka (1/Мс)	Kd (1/с)	KD	Ka (1/Мс)	Kd (1/с)
S309-11 (WT)	0,50 нМ	10,0e4	5,0e-5	0,91 нМ	3,0e5	2,8e-4
Репликация S309-11 (WT)	0,68 нМ	9,5e4	6,5e-5	0,98 нМ	2,9e5	2,9e-4
S309-12 (N55Q)	0,46 нМ	9,2e4	4,2e-5	1,3 нМ	2,7e5	3,6e-4
S309-13 (W50F)	0,51 нМ	9,9e4	5,0e-5	1,8 нМ	3,0e5	5,3e-4
S309-14 (W105F)	0,38 нМ	1,0e5	3,9e-5	7,9 нМ	9,8e5	7,7e-3
S309-15 (W50F/G56A/W105F)	1,7 нМ	9,9e4	1,6e-4	более 10 нМ	расчетный Kd с подгонкой до стабильного состояния

Связывание с дегликозилированным RBD измеряли в двух разных анализах SPR с использованием разных параметров. В эксперименте 1 использовали 10-минутные инъекции и серию концентраций RBD из 4-кратных разведений от 100 нМ. В эксперименте 2 использовали 3-минутные инъекции и серию концентраций 4-кратных разведений от 200 нМ, как описано выше. Результаты приведены в таблице 9. Результаты эксперимента 1 для S309-15 также показаны на фиг. 30F, два верхних графика.

Таблица 9
Cупернатант mAb	Эсперимент №1:			Эксперимент №2:
S309 WT или вариант	KD	Ka (1/Мс)	Kd (1/с)	KD	Ka (1/Мс)	Kd (1/с)
S309-11 (WT)	0,83 нМ	3,0e5	2,5e-4	0,91 нМ	3,0e5	2,8e-4
Репликация S309-11 (WT)	0,91 нМ	3,0e5	2,7e-4	0,98 нМ	2,9e5	2,9e-4
S309-12 (N55Q)	1,2 нМ	2,7e5	3,2e-4	1,3 нМ	2,7e5	3,6e-4
S309-13 (W50F)	1,7 нМ	2,8e5	4,6e-4	1,8 нМ	3,0e5	5,3e-4
S309-14 (W105F)	14 нМ	Подгонка до стабильного состояния		7,9 нМ	9,8e5	7,7e-3
S309-15 (W50F/G56A/W105F)	37 нМ	Подгонка до стабильного состояния		Подгонка до стабильного состояния невозможна

Связывание рекомбинантного антитела S309 и четырех сконструированных вариантов с RBD измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием той же процедуры, описанной выше, за исключением использования очищенных рекомбинантных антител, а не супернатанта клеточной культуры. Результаты показаны в таблице 10.

Таблица 10
	Гликозилированный RBD			Дегликозилированный RBD
S309 WT или вариант VH	KD	Ka (1/Мс)	Kd (1/с)	KD	Ka (1/Мс)	Kd (1/с)
S309-11 (WT)	0,26 нМ	9,3e4	2,4e-5	0,67 нМ	3,4e5	2,3e-4
S309-12 (N55Q)	0,39 нМ	8,5e4	3,3e-5	1,1 нМ	3,1e5	3,2e-4
S309-13 (W50F)	0,39 нМ	9,2e4	3,6e-5	1,4 нМ	3,5e5	4,9e-4
S309-14 (W105F)	0,35 нМ	9,6e5	3,4e-5	5,1 нМ	1,5e6	7,9e-3
S309-15 (W50F/G56A/W105F)	1,6 нМ	9,4e4	1,5e-4	более 10 нМ	расчетный Kd с подгонкой до стабильного состояния
S309 G56A	0,54 нМ	9,3e4	5,1e-5	0,70 нМ	3,4e5	2,4e-4

Пример 19

Нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью антител S309

Нейтрализующую активность S309 и четырех сконструированных вариантов S309, описанных в примерах 17 и 18 ("S309-12" - "S309-15"), определяли с использованием системы репортерного псевдотипирования люциферазы на основе VSV (Kerafast). Псевдотипированные частицы VSV и антитело смешивали в DMEM и оставляли для инкубации в течение 30 минут при 37°С. Затем инфицирующей смеси давали инкубироваться с клетками Vero E6 в течение 1 часа при 37°С с последующим добавлением DMEM с Pen-Strep и 10% FBS (инфицирующая смесь не удалялась). Клетки инкубировали при 37°С в течение 18-24 часов. Люциферазу измеряли с помощью планшетного ридера Ensight (Perkin Elmer) после добавления реагента Bio-Glo (Promega). Результаты приведены на фиг. 28. На фиг. 28 варианты 11 - 15 соответствуют S309-11 - S309-15 соответственно. Расчетные значения EC50, основанные на этом эксперименте, приведены в таблице 11.

Таблица 11
Антитело	EC50 (нг/мл)
S309-11 (WT VH)	109
S309-12 (N55Q VH)	103
S309-13 (W50F VH)	97
S309-14 (W105F VH)	65
S309-15 (W50F/G56A/W105F VH)	53

Пример 20

Антителозависимая активация FcγRIIIa или FcγRIIa человека

Исследовали антителозависимую активацию FcγRIIIa или FcγRIIa человека. Клетки ExpiCHO временно трансфицировали SARS-CoV-2 (BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019) и инкубировали с титрованными концентрациями антитела в течение 10 минут. Затем клетки ExpiCHO инкубировали с клетками Jurkat, экспрессирующими FcγRIIIa или FcγRIIa на своей поверхности, и стабильно трансфицировали геном люциферазы, управляемым NFAT (Promega, кат. № G9798 и G7018) при соотношении эффектор-мишень 6:1 для FcγRIIIa и 5:1 для FcγRIIa. Активация FcγR человека в этом биологическом анализе приводит к NFAT-опосредованной экспрессии репортерного гена люциферазы. Люминесценцию измеряли после 21 часа инкубации при 37 °С с 5% CO₂, используя реагент для анализа люциферазы Bio-Glo-TM в соответствии с инструкциями производителя. Были проанализированы антитела S303, S304, S306, S309, S315 и комбинация S309 и S315, а также сравнительное антитело S230. Результаты показаны на фиг. 31 и 32.

Пример 21

Анализ последовательностей S-гликопротеина SARS-CoV-2

Анализ последовательностей S-гликопротеина 2229 изолятов SARS-CoV-2 показал, что на S-эктодомене SARS-CoV-2 произошло несколько мутаций с переменной частотой. На фиг. 35A показаны варианты спайк-белка, встречающиеся с частотой n более 1 в виде сфер, отображаемых в закрытой и открытой форме полного тримерного спайк-эктодомена. RBD и другие домены спайк-белка показаны как указано. Показано 40 мутаций (из 2229 в общей сложности). Из-за отсутствия детализации в структурах PDB в RBD выделен только остаток 367 (n представляет собой 8), а остатки 476 (n представляет собой 7) и 483 (n представляет собой 17) не выделены. На фиг. 35B показано распространение вариантов спайк-гликопротеинов по аминокислотам. Каждая точка является отдельным вариантом. Показаны местоположения домена A и RBD. Варианты, соответствующие пороговому значению частоты 0,1%, являются такими, как указано.

Дальнейший анализ последовательностей S-гликопротеина проводили с использованием 11 839 изолятов SARS-CoV-2. На фиг. 43 показаны варианты, поддерживаемые по меньшей мере двумя последовательностями (распространенность более 0,01%), визуализируемыми в виде указанных сфер, отображаемых в закрытой (слева) и открытой (справа) форме полного тримерного эктодомена спайка. Каждая точка является отдельным вариантом. На фиг. 43 показаны варианты спайк-белка, подтверждаемые по меньшей мере двумя последовательностями, как указано, сферами, отображенными в закрытой (слева) и открытой (справа) форме полного тримерного спайк-эктодомена. RBD и другие домены спайк-белка показаны как указано. Показаны 171 вариант (из 11 839 проанализированных последовательностей спайк-белка). Варианты помечаются, если их распространенность превышает 1% (только D614G) или если они находятся в пределах RBD. Также указывается местоположение консервации N343.

Пример 22

Конкуренция антитела S309 с антителами, выделенными от пациентов с SARS-CoV-2

Моноклональные антитела человека, выделенные у пациентов, которые выздоровели от инфекции SARS-CoV-2, тестировали на перекрывающиеся сайты связывания RBD с антителом S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:113). Анализы конкуренции проводили с использованием Octet (прибор: Octet Red96, ForteBio). Анти-HIS сенсоры (BIOSENSOR ANTI-PENTA-HIS (HIS1K)1*1ST) использовали для иммобилизации полученного собственными силами His-меченого RBD SARS-CoV-2 (остатки 331-550 спайк-белка из BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947) в концентрации 3 мкг/мл. Антитела ассоциировали в течение 6 мин при 15 мкг/мл. Все белки разбавляли в кинетическом буфере (KB). Затем конкурирующие антитела ассоциировали в той же концентрации в течение дополнительных 6 минут. Было показано, что два антитела конкурируют с S309 за связывание с RBD, но, в отличие от S309, они не нейтрализуют SARS-CoV-2. Данные не показаны.

Пример 23

Выбор устойчивости к SARS-CoV-2 против моноклонального антитела S309-12-MLNS

Для изучения отбора устойчивости, SARS CoV-2 пассировали в течение более одного месяца в присутствии клеток Vero E6 и фиксированных концентраций антитела S309 N55Q MLNS GAALIE (VH с SEQ ID NO:113 и VL с SEQ ID NO:168, с мутациями G236A, A330L, I332E, M428L и N434S в Fc). Экспериментальная схема проиллюстрирована на фиг. 44А. Детали инфекции и непрерывного культивирования вирусов обобщены на фиг. 44В. Цитопатогенный эффект (CPE) оценивали путем визуального осмотра планшетов. Даже при отсутствии CPE титры вирусов оценивали с помощью анализа на бляшкообразование с наложением метилцеллюлозы. Результаты приведены на фиг. 44C. Признаков вирусного прорыва в лунках, обработанных антителами, не наблюдалось даже при минимальной тестируемой концентрации антител. Данные являются репрезентативными для лунок в трех повторностях.

Пример 24

Нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 клеток легких человека Calu-3 с помощью антитела S309

Антитело S309 N55Q MLNS (VH с SEQ ID NO:113 и VL с SEQ ID NO:168, с мутациями M428L и N434S в Fc) тестировали на его способность нейтрализовать живую инфекцию SARS-CoV-2 клеток легких человека Calu-3 (которые являются положительными для трансмембранной протеазы TMPRSS2) и клеток VeroE6 с использованием анализа нанолюциферазы. Результаты, включая рассчитанные значения IC50, показаны на фиг. 46.

Пример 25

Нейтрализация инфекции SARS-CoV-2 с помощью антитела S309

Антитело S309 тестировали на его способность нейтрализовать живую инфекцию вируса SARS-CoV-2 с помощью анализа нанолюциферазы и анализа IFA. Вкратце, клетки Vero E6 инфицировали живым вирусом люциферазы SARS-CoV-2 в течение шести часов. Данные собирали с использованием трех различных концентраций антител: 1, 0,1 и 0,01 MOI. Результаты анализа нанолюциферазы показаны на фиг. 47. Результаты анализа IFA показаны на фиг. 48A (репрезентативные лунки, подсчитанные в IFA) и 48B (количественные данные с использованием цитирования 5). Рассчитанные значения IC50 для каждого MOI показаны в полях под графиком на фиг. 47 и 48B. Примечательно, что в данном формате инфекции не наблюдалось скоплений инфекции (или очагов).

Пример 26

Нейтрализация живой инфекции SARS-CoV-2 с помощью антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE

Антитела S309 N55Q MLNS (также называемые в настоящем документе S309 N55Q LS, содержащие мутации Fc M428L/N434S) и S309 N55Q MLNS GAALIE (также называемые в настоящем документе S309 N55Q LS GAALIE, содержащие мутации Fc G236A, A330L, I332E, M428L и N434S) анализировали на способность нейтрализовать инфекцию живым вирусом SARS-CoV-2. Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Результаты приведены на фиг. 49. Рассчитанная EC50 для S309 N55Q MLNS составляла 100,1 нг/мл. Рассчитанная EC50 для S309 N55Q MLNS GAALIE составляла 78,3 нг/мл.

Пример 27

Нейтрализация вируса, псевдотипированного SARS-CoV-2 с помощью антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE

Протестировали нейтрализацию вируса, псевдотипированного SARS-CoV-2 с помощью антител S309 N55Q MLNS (также называемыми в настоящем документе S309 N55Q LS) и S309 N55Q MLNS GAALIE (также называемым в настоящем документе S309 N55Q MLNS GAALIE). Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Псевдотипированный вирус представлял собой VSV, псевдотипированый спайк-белком SARS-CoV-2. Результаты показаны на фиг. 50A (S309 N55Q MLNS) и фиг. 50B (S309 N55Q MLNS GAALIE). Рассчитанное значение EC50 для S309 N55Q MLNS составляло 24,06 нг/мл. Рассчитанное значение EC50 для S309 N55Q MLNS GAALIE составило 22,09 нг/мл.

Пример 28

Связывание антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE с RBD SARS-CoV-2

Связывание антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE с RBD SARS-CoV-2 измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Результаты показаны на фиг. 51A (S309 N55Q MLNS) и фиг. 51B (S309 N55Q MLNS GAALIE).

Пример 29

Связывание антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE со спайк-белком SARS-CoV-2

Связывание антител S309 N55Q MLNS (также называемых в настоящем документе S309 N55Q LS) и S309 N55Q MLNS GAALIE (также называемых в настоящем документе S309 N55Q LS GAALIE) с SARS-CoV-2, со спайк-белком SARS-CoV-2 измеряли с помощью проточной цитометрии. Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Результаты показаны на фиг. 51A (S309 N55Q MLNS) и фиг. 51B (S309 N55Q MLNS GAALIE). Данные выражены в виде процента клеток, идентифицированных как положительные на связывание антител.

Пример 30

Связывание антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE с рецепторами Fcγ человека

Связывание антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE с рецепторами Fcγ человека анализировали с использованием SPR. Измеряли связывание с FcγRIIa (как низкоаффинными аллелями R131, так и высокоаффинными аллелями H131), FcγRIIIa (как низкоаффинными аллелями F158, так и высокоаффинными аллелями V158) и FCγRIIb. Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:168.

Реагент Biotin CAPture (модифицированный стрептавидин) вводили во все проточные ячейки чипа сенсора CAP, закрепленного в Biacore T200 (Cytiva). Биотинилированные Fc-рецепторы в концентрации 1 мкг/мл вводили через одну проточную кювету со скоростью 10 мкл/мин в течение 60 секунд (один рецептор на проточную кювету), при этом одна проточная кювета резервировалась в качестве эталонной поверхности. Антитело в концентрации 100 мкг/мл (разведенное в HBS-EP+) вводили во все проточные ячейки в течение 200 секунд с использованием скорости потока 30 мкл/мин, и проводили мониторинг ассоциации. Диссоциацию контролировали еще в течение 200 секунд после инъекции. Данные собирали при 10 Гц. После каждого измерения связывания вводили реагент CAP Regeneration для подготовки поверхности к новому циклу. Эксперименты проводили при 25°C, образцы перед инъекцией выдерживали при 15°C в приборе. Результаты показаны на фиг. 53 (где мутация MLNS обозначена как "LS" в ключе фигуры).

Пример 31

Связывание антител S309 MLNS, S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE с компонентом комплемента C1q

Связывание антител S309 MLNS (также называемых в настоящем документе S309 LS), S309 N55Q MLNS (также называемых в настоящем документе S309 N55Q LS) и S309 N55Q MLNS GAALIE (также называемых в настоящем документе S309 N55Q LS GAALIE) с компонентом комплемента C1q измеряли с помощью биослойной интерферометрии (BLI) на приборе Octet. S309 MLNS содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:105, и VL, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:168.

Античеловеческие Fab (CH1-специфичные) сенсоры использовали для захвата антитела при 10 мкг/мл в течение 10 минут. Затем сенсоры, нагруженные IgG, подвергали воздействию кинетического буфера, содержащего 3 мкг/мл очищенного человеческого C1q, в течение 4 минут с последующей стадией диссоциации в том же буфере в течение дополнительных 4 минут. Профили ассоциации и диссоциации измеряли в режиме реального времени как изменения интерференционной картины. Результаты приведены на фиг. 54.

Пример 32

Активация Fc гамма-рецепторов человека in vitro антителами S309 MLNS, S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE

Способность антител S309 MLNS, S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE вызывать антителозависимую активацию рецепторов Fcγ человека анализировали in vitro. S309 MLNS содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:105, и VL, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:168.

Каждый из S309 MLNS (также называемый в настоящем документе S309 LS), S309 N55Q MLNS (также называемый в настоящем документе S309 N55Q LS), S309 N55Q MLNS GAALIE (также называемый в настоящем документе S309 N55Q LS GAALIE) и контрольное антитело S309-GRLR серийно разводили в 6 раз в буфере для анализа от 10 000 нг/мл до 0,006 нг/мл. Девятиточечные серийные разведения антитела инкубировали с 12 500 (для FcγRIIIa и FcγRIIb) или 10000 (для FcγRIIa) клеток CHO со спайк-белком CoV-2 на 96-луночную планшетную лунку в белом планшете с плоским дном в течение 15 минут при комнатной температуре. Эффекторные клетки Jurkat, экспрессирующие указанные FcγR и стабильно трансфицированные геном люциферазы, управляемым NFAT, размораживали, разбавляли в буфере для анализа и добавляли в планшет при соотношении эффекторных и целевых клеток 6:1 для FcRγIIIa и FcγRIIb или 5:1 для FcγRIIa. Контрольные лунки были включены для измерения независимой от антитела активации (содержащей клетки-мишени и эффекторные клетки, но не содержащей антитела) и фоновой люминесценции планшета (лунки, содержащие только аналитический буфер). Планшеты инкубировали в течение 18 часов при 37°C с 5% CO₂. Активация FcγR человека в этом биологическом анализе приводит к NFAT-опосредованной экспрессии репортерного гена люциферазы. Люминесценцию измеряли с помощью люминометра после добавления реагента для анализа люциферазы Bio-Glo™ в соответствии с инструкциями производителя. Результаты приведены на фиг. 55.

Пример 33

Эффекторная функция антител S309 MLNS, S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE

Антитела S309 MLNS (также называемые в настоящем документе как S309 LS), S309 N55Q MLNS (также называемые в настоящем документе как S309 N55Q LS) и S309 N55Q MLNS GAALIE (также называемые в настоящем документе как S309 N55Q LS GAALIE) анализировали на их способность стимулировать антитело-зависимую от NK-клеток клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и моноцитарно-опосредованный антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) против клеток, экспрессирующих спайк-белок CoV-2.

S309 MLNS содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:105, и VL, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:168. Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:168.

ADCC измеряли in vitro путем экспонирования свежевыделенных NK-клеток человека от двух генотипированных доноров, экспрессирующих гомозиготный низкоаффинный (F/F158) или высокоаффинный (V/V158) FcγRIIIa, к антителу, предварительно инкубированному с клетками со спайк-белком CHO-CoV-2, и измерения высвобождения LDH в качестве считывания в соответствии с инструкциями производителя (набор для обнаружения цитотоксичности (LDH), Roche) после 4 часов инкубации при 37°C. Вкратце, планшеты центрифугировали в течение 4 минут при 400 x g, и 35 мкл супернатанта переносили в плоский 384-луночный планшет. Готовили реагент LDH и добавляли 35 мкл в каждую лунку. Используя кинетический протокол, поглощение при 490 нм и 650 нм измеряли один раз каждые 2 минуты в течение 8 минут, и в качестве результата использовали наклон кинетической кривой. Процент специфического лизиса определяли с помощью следующей формулы: (специфическое высвобождение - спонтанное высвобождение)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение) ×100. Результаты приведены на фиг. 56.

Способность антител S309 MLNS, S309 N55Q MLNS, S309 N55Q MLNS GAALIE и контрольного антитела S309-GRLR стимулировать ADCP первичными моноцитами CD14+ измеряли in vitro путем воздействия свежевыделенными PBMC человека (мечеными cell trace violet) на CHO клетки, экспрессирующие спайк-белок CoV-2 (мечеными набором флуоресцентных клеточных линкеров PKH67 (Sigma Aldrich)), которые предварительно инкубировали с антителом. Последовательные разведения mAb (серийно разведенных в 5 раз от 5000 нг/мл до 0,32 нг/мл в RPMI-1640 (PPMI - Онкологический институт имени Розуэлла Парка) + L-глутамин с добавлением 10% Hyclone FBS + 2x анти-анти (антибиотик-антимикотик)) инкубировали с 10 000 клеток CHO со спайк-белком CoV-2 на лунку 96-луночного полипропиленового планшета в течение 10 минут. Первичные PBMC были флуоресцентно мечены Cell Trace Violet в соответствии с инструкциями производителя. Затем смеси клеток-мишеней и антител инкубировали с мечеными PBMC в соотношении эффектор/мишень 16:1. Активность ADCP измеряли после инкубации в течение ночи путем мечения популяции моноцитов для CD14 и измерения процента Cell trace violet⁺ PKH67⁺ среди моноцитов CD14⁺ с помощью проточной цитометрии. Результаты приведены на фиг. 57.

Пример 34

Влияние антитела S309 на слияние клеток, опосредованное спайк-белком SARS-CoV-2

Влияние антитела S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) на слияние, опосредованное спайк-белком SARS-CoV-2, тестировали с использованием клеток, сконструированных для сверхэкспрессии спайк-белка на поверхности клетки. Добавление S309 к этим клеточным культурам ингибировало слияние клетка-клетка. Результаты показаны на фиг. 58A (микрофотографии) и 58B (количественные данные).

Пример 35

Влияние антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE на репликацию SARS-CoV-2

Влияние антител S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE на репликацию SARS-CoV-2 испытывали в клетках VeroE6, PBMC и дендритных клетках. Каждый из S309 N55Q MLNS и S309 N55Q MLNS GAALIE содержит VH, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и VL, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:168.

Вирус SARS-CoV-2 инкубировали в течение одного часа с S309 N55Q MLNS или S309 N55Q MLNS GAALIE. Затем смесь вирус/антитело добавляли к высеянным на планшет клеткам VeroE6, PBMC или дендритным клеткам, полученным из моноцитов (MoDC). После инкубации клеток со смесью вирус/антитело в течение одного часа при 37°С, клетки промывали и инкубировали в течение еще 72 часов в свежей среде. Затем супернатант из культивируемых клеток анализировали на бляшкообразующие единицы (FFU). Супернатант разбавляли 1:5 и добавляли к клеткам VeroE6. Через один час при 37°С клетки VeroE6 накладывали метилцеллюлозой. Через 24 часа дальнейшей инкубации культуры клеток VeroE6 окрашивали на нуклеопротеин SARS-CoV-2. Результаты приведены на фиг. 59. Данные для антитела S309 N55Q MLNS показаны на верхнем графике. Данные для антитела S309 N55Q MLNS GAALIE показаны на нижнем графике. Эти 72-часовые данные репликации являются репрезентативными для результатов через 24 и 48 часов.

Пример 36

Материалы и методы

Скрининг на основе проточной цитометрии для связывания с S-белком CoV, экспрессируемым на клетках млекопитающих

Клетки ExpiCHO трансфицировали S-белком SARS-CoV-2, SARS-CoV и MERS-CoV или пустой плазмидой в качестве отрицательного контроля. Затем моноклональные антитела тестировали с помощью проточной цитометрии в концентрации 10 мкг/мл на их способность окрашивать клетки ExpiCHO, экспрессирующие S-белок 2019-nCoV, SARS-CoV, MERS-CoV или имитационная клетка трансфектант.

Временная экспрессия рекомбинантного белка SARS-CoV-2

Полноразмерный ген S штамма SARS-CoV-2 (2019-nCoV-S) изолята BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019 (кат. № MN908947) был кодон-оптимизирован для экспрессии клеток человека и клонирован в вектор экспрессии phCMV1 (Genlantis). Клетки Expi-CHO временно трансфицировали phCMV1-SARS-CoV-2-S, phCMV1-MERS-CoV-S (London1/2012), SARS-spike_pcDNA.3 (штамм SARS) или пустой phCMV1 (имитация) с использованием Expifectamine CHO Enhancer. Через два дня после трансфекции клетки собирали, фиксировали или фиксировали и пермеабилизировали сапонином для иммуноокрашивания панелью моноклональных антител, реагирующих на рецептор-связывающий домен (RBD) SARS-CoV. Для обнаружения использовали меченное Alexa647 вторичное антитело против Fc IgG человека. Связывание антитела с трансфицированными клетками анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием клеточного анализатора ZE5 (Biorard) и программного обеспечения FlowJo (TreeStar). Положительное связывание определяли дифференциальным окрашиванием CoV-S трансфектантов по сравнению с имитационными трансфектантами.

Эксперименты по конкурированию с использованием Octet (BLI, биослойная интерферометрия)

Если в настоящем документе не указано иное, для иммобилизации S1 субъединцы белка SARS-CoV (Sino Biological Europe GmbH) использовали анти-His сенсоры (BIOSENSOR ANTI-PENTA-HIS (HIS1K)). Сенсоры гидратировали в течение 10 мин кинетическим буфером (KB; 0,01% BSA без эндотоксинов, 0,002^ Tween-20, 0,005% NaN3 в PBS). Затем субъединицу S1 белка SARS-CoV загружали в течение 8 мин в концентрации 10 мкг/мл в KB. Антитела ассоциировали в течение 6 мин при 15 мкг/мл для полноразмерных mAb nCoV-10 и nCov-6 mAb или 5 мкг/мл для Fab nCoV-4 и в последующем эксперименте, включающем nCoV-1 все при 10 мкг/мл. Затем конкурирующие антитела ассоциировали в той же концентрации в течение дополнительных 6 минут.

Эксперименты по конкурированию с использованием Octet (BLI, биослойная интерферометрия)

Для экспериментов по конкурированию ACE2, ACE2-His (Bio-Techne AG) загружали в течение 30 минут при 5 мкг/мл в KB на анти-HIS биосенсоры (HIS2) (Molecular Devices-ForteBio). SARS-CoV-1 RBD-rabbitFc или SARS-CoV-2 RBD-mouseFc (Sino Biological Europe GmbH) в концентрации 1 мкг/мл ассоциировали в течение 15 минут после предварительной инкубации с антителом или без антитела (30 мкг/мл, 30 минут). Диссоциацию контролировали в течение 5 минут.

Определение аффинности с использованием Octet (BLI, биослойная интерферометрия)

Для определения K_D полноразмерных антител использовали биосенсоры белка A (Pall ForteBio) для иммобилизации рекомбинантных антител при 2,7 мкг/мл в течение 1 минуты после этапа гидратации в течение 10 минут с помощью кинетического буфера. Кривые ассоциации регистрировали в течение 5 минут путем инкубации сенсоров, покрытых антителами, с различной концентрацией RBD SARS-CoV-1 (Sino Biological) или RBD SARS-CoV-2 (полученный собственными силами; остатки 331-550 спайк-белка BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, кат. № MN908947). Самая высокая протестированная концентрация RBD составляла 10 мкг/мл, затем серийно разбавляли 1:2,5 с. Диссоциацию регистрировали в течение 9 минут, перемещая сенсоры в лунки, содержащие KB. Значения K_D рассчитывали с использованием глобальной модели соответствия (Octet). Использовали оборудование Octet Red96 (ForteBio).

Для определения K_D полноразмерных антител по сравнению с Fab-фрагментами His-меченные RBD SARS-CoV-1 или SARS-CoV-2 загружали в концентрации 3 мкг/мл в KB в течение 15 минут на анти-HIS биосенсоры (HIS2) (Molecular Devices, ForteBio). Ассоциацию полноразмерного антитела и Fab проводили в KB при 15 мкг/мл и 5 мкг/мл соответственно в течение 5 минут. Диссоциацию в KB измеряли в течение 10 минут.

Связывание ELISA

Реактивность mAb с субъединицей S1 спайк-белка SARS-CoV (штамм WH20) определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Вкратце, 96-луночные планшеты покрывали 3 мкг/мл субъединицы S1 рекомбинантного спайк-белка SARS-CoV (Sino. Biological). Лунки промывали и блокировали PBS+1%BSA в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали с серийно разведенными mAb в течение 1 часа при комнатной температуре. Связанные mAb обнаруживали путем инкубации конъюгированных с щелочной фосфатазой козьих антител против IgG человека (Southern Biotechnology: 2040-04) в течение 1 часа при комнатной температуре и проявляли с помощью 1 мг/мл п-нитрофенилфосфатного субстрата в 0,1 М глициновом буфере (pH 10,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность (OD) измеряли при длине волны 405 нм в ридере ELISA (спектрофотометр Powerwave 340/96, BioTek).

Анализ нейтрализации

Если не указано иное, использовали вирус мышиного лейкоза (MLV), псевдотипированный спайк-белком SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2pp) или спайк-белком SARS-CoV-1 (SARS-CoV-1pp). В качестве клеток-мишеней использовали DBT-клетки, стабильно трансфицированные ACE2 (DBT-ACE2). SARS-CoV-2pp или SARS-CoV-1pp активировали трипсином TPCK в концентрации 10 мкг/мл. Активированный SARS-CoV-2pp или SARS-CoV-1pp добавляли к серии разведений антител (начиная с конечной концентрации 50 мкг/мл на антитело, 3-кратное разведение). Клетки DBT-ACE2 добавляли к смесям антитело-вирус и инкубировали в течение 48 часов. Люминесценцию измеряли после аспирации супернатанта клеточной культуры и добавления устойчивого субстрата GLO (Promega).

Если не указано иное, в анализах нейтрализации псевдотипированных частиц используется система псевдотипирования репортеров люциферазы на основе VSV (Kerafast). Псевдотипированные частицы VSV и антитело смешивали в DMEM и оставляли инкубироваться в течение 30 минут при 37°C. Инфекционную смесь затем инкубировали с клетками Vero E6 в течение 1 часа при 37°C с последующим добавлением DMEM с Pen-Strep и 10% FBS (инфекционная смесь не удаляется). Клетки инкубировали при 37°C в течение 18-24 часов. Люциферазу измеряли с помощью планшетного ридера Ensight (Perkin Elmer) после добавления реагента Bio-Glo (Promega).

SPR кинетического подхода с одним циклом

Эксперименты SPR проводили с использованием прибора Biacore T200 с использованием кинетического подхода с одним циклом. S309 IgG захватывали на поверхности и вводили возрастающие концентрации очищенного RBD SARS-CoV-2 гликозилированного или дегликозилированного. Кинетику ассоциации и диссоциации контролировали и подгоняли к модели связывания для определения аффинности.

Экспрессия рекомбинантных антител

Рекомбинантные антитела экспрессировали в клетках ExpiCHO, временно котрансфицированных плазмидами, экспрессирующими тяжелую и легкую цепи, как описано ранее. (Stettler и др. (2016) Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science, 353(6301), 823-826) Моноклональные антитела S303, S304, S306, S309, S310 и S315 экспрессировали в виде антител rIgG-MLNS. Мутация MLNS обеспечивает более длительный период полувыведения in vivo. (Zalevsky и др. (2010) Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nature Biotechnology, 28(2), 157-159)

Выравнивание последовательностей

Геномные последовательности SARS-CoV-2 были загружены из GISAID 29 марта 2020 г. с использованием фильтров «полный (более 29 000 п.н. (пар нуклеотидов))» и «исключение с низким охватом». Последовательности летучих мышей и панголина удаляли с получением последовательностей только для человека. ORF (открытая рамка считывания) спайк-белка локализовали путем выполнения выравнивания генома эталонного белка (YP_009724390.1) с GeneWise2. Неполные совпадения и ORF, содержащие вставку/делецию, были сохранены и включены в последующий анализ. Нуклеотидные последовательности транслировали in silico с использованием seqkit. Удаляли последовательности с более чем 10% неопределенных аминокислот (из-за распознавания N оснований). Выравнивание нескольких последовательностей проводили с использованием MAFFT. Варианты определяли путем сравнения выровненных последовательностей (n сосавляет 2229) с эталонной последовательностью с использованием R/Bioconductor Package Biostrings. Аналогичную стратегию использовали для извлечения и трансляции последовательностей спайк-белка из геномов SARS-CoV, полученных из ViPR (критерии поиска: коронавирус, связанный с SARS, полноразмерные геномы, хозяин-человек, депонированный до декабря 2019 года, чтобы исключить SARS-CoV-2, n составляет 53). Исходные последовательности генома SARS-CoV содержали все основные опубликованные штаммы, такие как Urbani, Tor2, TW1, P2, Frankfurt1 и другие. Последовательности панголина, показанные в Tsan-Yuk Lam и др., были получены из GISAID. Последовательности летучих мышей из трех кладов сарбековирусов, как показано в Lu и др. (Lancet 2020), были получены из Genbank. Последовательности циветы и енотовидной собаки аналогичным образом были получены из Genbank.

Пример 37

ACE2-независимый механизм нейтрализации SARS-CoV2 с помощью антитела S309

В следующих экспериментах антитело S309 (VH с SEQ ID NO:105, VL с SEQ ID NO:168) экспрессировали в виде рекомбинантного IgG1 с мутациями Fc M428L и N434S. Исследовали влияние сверхэкспрессии ACE2 на нейтрализацию инфекции спомощью антитела S309. Клетки Vero E6 или Vero E6-TMPRSS2 инфицировали SARS-CoV-2 (изолят USA-WA1/2020) при MOI 0,01 в присутствии S309 (10 мкг/мл). Клетки фиксировали через 24 часа после инфицирования, вирусный нуклеокапсидный белок подвергали иммуноокрашиванию и количественному определению. Окрашивание нуклеокапсида практически отсутствовало в клетках, обработанных антителами. S309 имело IC50 (нг/мл) в клетках Vero E6, составляла 65, и в клетках Vero E6-TMPRSS2, составляла 91 (данные не показаны).

Панель из 7 клеточных линий (HeLa, 293T (wt), Vero E6, Huh7, 293T ACE2, MRC 5-ACE2-TMPRSS2, A549-ACE2-TMPRSS2 клон 5, A549-ACE2-TMPRSS2 клон 10) была инфицирована SARS-CoV-2-Nluc или VSV, псевдотипированным спайк-белком SARS-CoV-2 в присутствии S309. Сигнал люциферазы определяли количественно через 24 часа после инфицирования. Максимальные значения нейтрализации S309 были такими, как показано в таблице 12.

Таблица 12. Максимальные значения нейтрализации с помощью S309
Тип клетки	Вирус/псевдотип
	SARS-CoV-2-Nluc	Псевдотипированный VSV
Vero E6	более 99 %	более 99 %
Vero E6-TMPRSS2	более 99 %	96%
Huh7	98%	78%
293T ACE2	26%	34%
MRC5-ACE2-TMPRSS2	87%	45%
A549-ACE2-TMPRSS2 клон 5	89%	65%
A549-ACE2-TMPRSS2 клон 10	81%	42%

Связывание очищенного, меченного флуоресцентной меткой спайк-белка SARS-CoV-2 с этими клеточными линиями количественно определяли с помощью проточной цитометрии. Клетки HeLa и 239T WT имели самые низкие значения MFI, за которыми следовали клетки Huh7 и VeroE6. Клетки 293T ACE2 (максимальная нейтрализация), MRC 5-ACE2-TMPRSS2 (третье по величине значение нейтрализации), клон 5 A549-ACE2-TMPRSS2 (четвертое по величине значение нейтрализации) и клон 10 A549-ACE2-TMPRSS2 (второе по величине значение нейтрализации) имели более высокие значения MFI. Был определен корреляционный анализ между максимальным потенциалом нейтрализации связывания с добавкой S309; значения корреляции Spearman S309 составили: r составляет -0,94 для обеих вирусных моделей. p составляет 0,017.

Чтобы дополнительно охарактеризовать клеточные линии, чувствительные к SARS-CoV-2, семь клеточных линий, описанных выше, инкубировали с очищенным, флуоресцентно меченным спайк-белком SARS-CoV-2 или белком RBD, и связывание белка количественно определяли с помощью проточной цитометрии. В порядке убывания MFI клеточные линии представляли собой: A549-ACE2-TMPRSS2 клон 10; 293T ACE2; MRC 5-ACE2-TMPRSS2; A549-ACE2-TMPRSS2 клон 5; Vero E6; Huh7; 293T (wt); и HeLa.

Отобранные лектины и опубликованные кандидаты в рецепторы были проверены с использованием клеток HEK293T, инфицированных вирусами VSV, псевдотипированными SARS-CoV-2. ACE2, DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1 дали самые высокие сигналы. ACE2 обеспечивал сигнал приблизительно 10⁵ относительных люминесцентных единиц (RLU), а DC-SIGN, SIGLEC-1 и L-SIGN имели сигналы приблизительно 10⁴ RLU. Все остальные протестированные лектины/кандидаты дали сигналы приблизительно 10²-10³ RLU.

Клетки HEK 293T, HeLa и MRC5 временно трансдуцировали для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC1 или ACE2 и инфицировали вирусами VSV, псевдотириванными SARS-CoV-2. Неинфицированные клетки и нетрансдуцированные клетки были включены в качестве контролей. В клетках HEK293T ACE2, DC-SIGN, SIGLEC-1 и L-SIGN обеспечивали значительное усиление инфекции. В клетках HeLa и MRC5 только ACE2 усиливал инфекцию.

Стабильные клеточные линии HEK293T, сверхэкспрессирующие DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2, инфицировали аутентичным SARS-CoV-2 (MOI 0,1), фиксировали и иммуноокрашивали через 24 часа для нуклеопротеина SARS-CoV-2. В качестве контролей использовали клетки дикого типа (инфицированные и неинфицированные). Усиленное окрашивание наблюдалось в клетках, сверхэкспрессирующих DC-SIGN, L-SIGN или SIGLEC-1, и окрашивание было значительно увеличено в клетках, сверхэкспрессирующих ACE2.

Стабильные клеточные линии инфицировали SARS-CoV-2-Nluc, а уровни люциферазы определяли количественно через 24 часа. В порядке возрастания RLU: неинфицированные (около 10²-10³ RLU); исходные 293T (около 10⁴ RLU); DC-SIGN (около 10⁵ RLU); L-SIGN (около 10⁵ RLU); SIGLEC-1 (около 10⁵-10⁶ RLU ); ACE2 (более 10⁷ RLU).

Стабильные клеточные линии инкубировали с различными концентрациями анти-SIGLEC1 mAb (клон 7-239) и инфицировали SARS-CoV-2-Nluc. Инфекция в процентах от необработанных клеток оставалась близкой к превышению 100% в клетках 293T, экспрессирующих DC-SIGN, L-SIGN или ACE2, но упала ниже 50% (0,2 мкг/мл анти-SIGLEC) до уровня, близкого к 0 (1 мкг/мл или 5 мкг/мл анти-SIGLEC) в клетках 293T, экспрессирующих SIGLEC-1.

Уровни экспрессии отдельных потенциальных кандидатов корецептора SARS-CoV-2 в одной клетке определяли в различных типах клеток легкого, полученных из Human Lung Cell Atlas (Атлас клеток легких человека) (nature.com/articles/s41586-020-2922-4). DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1 экспрессируются в различных типах клеток в легком на уровнях, аналогичных или даже выше, чем ACE2.

Связывание антител, нацеленных на DC-/L-SIGN, DC-SIGN, SIGLEC1 или ACE2 на клетках HEK293T, стабильно сверхэкспрессирующих соответствующий рецептор связывания, анализировали с помощью проточной цитометрии и иммунофлуоресцентного анализа. Клетки HEK 293T, сверхэкспрессирующие соответствующие рецепторы связывания, инфицировали VSV, псевдотипированным спайк-белком дикого типа или мутантным спайк-белком SARS-COV-2 линии B1.1.7. Люминесценцию анализировали на следующий день после инфицирования. Инфекция была усилена в клетках, экспрессирующих рецепторы связывания. Инфекция с помощью VSV, псевдотипированного любым спайк-белком, была аналогичной для каждой испытуемой группы. Клетки, экспрессирующие ACE2, давали самый высокий сигнал люминесценции.

Клетки Vero E6, дифференцированные in vitro moDC или PBMC инфицировали SARS-CoV-2 с MOI 0,01. Через 24 часа после инфицирования клетки фиксировали, иммуноокрашивали на вирусный нуклеокапсидный белок и количественно определяли инфицированные клетки. Только клетки VeroE6 показали инфекцию (около 7% клеток). Супернатант инфицированных клеток брали через 24, 48 и 72 часа и количественно определяли титр инфекционного вируса с помощью анализа FFU на клетках Vero E6.

Были оценены основные типы клеток с обнаруживаемым геномом SARS-CoV-2 в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и мокроте пациентов с тяжелым течением COVID-19. Был построен график t-SNE, и было определено количество каждого типа клеток SARS-CoV-2+ (всего n составляет 3085 клеток от 8 субъектов в публикации Ren и др. Cell 2021). Типы клеток включали T-клетки, NK-клетки, клетки плазмы, нейтрофилы, макрофаги, реснитчатые клетки, плоскоклеточные и секреторные. Экспрессию ACE2, DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 и их комбинаций оценивали для каждого типа клеток.

Количество транскриптов ACE2, DC-SIGN (CD209), L-SIGN (CLEC4M), SIGLEC1 коррелировали с количеством РНК SARS-CoV-2 в макрофагах и секреторных клетках. Корреляция была основана на подсчетах (до преобразования логарифма), от Ren и др. Cell 2021).

Репрезентативные данные, демонстрирующие экспрессию рецепторов в стабильных клеточных линиях HEK293T, показаны на фиг. 60. Клеточные линии генерировали для сверхэкспрессии DC-SIGN, L-SIGN или ACE2 путем трансдукции клеток HEK293T лентивирусом, кодирующим трансген, и проводили иммунофлуоресцентные анализы для оценки экспрессии трансгена.

Репрезентативные данные, демонстрирующие способность псевдотипированного вируса VSV, экспрессирующего S-белок SARS-CoV-2 с репортером люциферазы, инфицировать клетки HEK293T (с использованием люминесцентного анализа), показаны на фиг. 61; экспрессия DC-SIGN или L-SIGN увеличивала уровни инфекции псевдотипированного вируса более чем в 10 раз по сравнению с инфекцией клеток HEK293T WT, и экспрессия ACE2 увеличивала уровни инфекции пседотипированным вирусом более чем в 100 раз по сравнению с инфекцией клеток HEK293T WT.

Нейтрализующую активность примерного mAb S309 против пседотипированного вируса VSV оценивали в сконструированных клетках HEK293T. Данные показаны на фиг. 62; S309 полностью нейтрализовало инфекцию с помощью DC-SIGN и L-SIGN и, в меньшей степени, ACE2.

Способность живого SARS-CoV-2 с репортером люциферазы инфицировать клетки HEK293T исследовали с помощью люминесцентного анализа. Данные показаны на фиг. 63; экспрессия DC-SIGN или L-SIGN увеличивала уровни инфекции живым вирусом более чем в 3 раза по сравнению с инфекцией клеток HEK293T WT, и экспрессия ACE2 увеличивала уровни инфекции живым вирусом более чем в 100 раз по сравнению с инфекцией клеток HEK293T WT.

Нейтрализующую активность mAb S309 против пседотипированного вируса VSV оценивали в сконструированных клетках HEK293T. Данные показаны на фиг. 64; S309 полностью нейтрализовало инфекцию с помощью DC-SIGN и L-SIGN и, в меньшей степени, нейтрализовало заражение через ACE2.

Были проведены эксперименты для изучения того, может ли антитело S309 нейтрализовать проникновение SARS-CoV-2 через SIGLEC-1. Вкратце, стабильные клеточные линии HEK293T создавали, как описано выше, для сверхэкспрессии DC-SIGN/L-SIGN, DC-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2. Данные экспрессии показаны на фиг. 65. Как показано на фиг. 66; экспрессия DC-SIGN, L-SIGN или SIGLEC увеличивала уровни инфекции живым вирусом более чем в 10 раз по сравнению с инфекцией клеток HEK293T WT, и экспрессия ACE2 увеличивала уровни инфекции псевдотипированным вирусом более чем в 100 раз по сравнению с инфекцией клеток HEK293T WT. Как показано на фиг. 67, S309 полностью нейтрализовало инфекцию через DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1.

Экспрессию DC-SIGN (CD209) и других белков рецепторов клеточной поверхности, включая SIGLEC-1 и другие SIGLEC, определяли на различных типах клеток. Данные обобщены на фиг. 68A и 68B.

Были проведены дальнейшие эксперименты для исследования функции (функций) DC-SIGN, L-SIGN и SIGLEC-1 при инфекции SARS-CoV-2. В одном наборе экспериментов клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2, инфицировали живым Nluc SARS-CoV-2 при трех различных множествах инфекций (MOI): 0,01, 0,1 и 1). Инфекцию определяли с использованием относительных люминесцентных единиц и сравнивали с инфекцией в клетках HEK293T (исходных). Данные показаны на фиг. 69. При наименьшем тестируемом MOI наблюдалось увеличение инфекции в клетках, экспрессирующих DC-SIGN, L-SIGN или SIGLEC. На самом высоком тестируемом MOI, инфекция не была дополнительно усилена по сравнению с исходной экспрессией DC-SIGN, L-SIGN или SIGLEC. Эти данные показывают, что тсходные клетки 293T восприимчивы к инфекции SARS-CoV-2 и L-SIGN, DC-SIGN и SIGLEC-1 усиливают уровни инфекции, но не функционируют как первичные рецепторы инфекции.

В другом наборе экспериментов клетки 293T, клетки HeLa и клетки MRC5 временно трансдуцировали лентивирусом, кодирующим DC-SIGN, L-SIGN, SIGLEC-1 или ACE2, и инфицировали псевдотипированным вирусом VSV через три дня после трансдукции. Данные показаны на фиг. 70. В то время как клетки 293T показали низкий уровень восприимчивости (по сравнению с неинфицированными и нетрансдуцированными), клетки HeLa и MRC5 были полностью устойчивы к вирусу. Низкий уровень инфекции в клетках 293T может быть увеличен путем экспрессии L-SIGN, DC-SIGN или SIGLEC-1, что соответствует роли этих белков, а также факторов связывания. Клетки HeLa и MRC5 оставались устойчивыми к инфекции даже после экспрессии L-SIGN, DC-SIGN или SIGLEC-1 и становились восприимчивыми только после экспрессии ACE2. Эти данные показывают, что L-SIGN, DC-SIGN и SIGLEC-1 не являются первичными рецепторами для SARS-CoV-2.

Пример 38

Эффективность in vivo антитела S309

Эффективность S309 исследовали на сирийских хомяках. Эта животная модель представляет собой на сегодняшний день наиболее релевантную модель инфекции SARS-CoV-2, которая не требовала чрезмерной экспрессии in vivo ACE2 для поддержания продуктивной инфекции и заболевания. Профилактическое введение S309 индуцировало дозозависимую защиту от инфекции SARS-CoV-2 и повреждения тканей у хомяков, что продемонстрировали уровни вирусной РНК, вирусная нагрузка, а также гистопатологическая оценка легких (фиг. 73A-7C). Эти данные показывают, что плохая и неполная нейтрализация проникновения S309 in vitro при использовании клеток, сверхэкспрессирующих ACE2, не нарушала in vivo эффективность mAb, не имеющих RBM.

S309, несущее мутацию N297A, имеет сниженную способность запускать эффекторные функции вследствие снижения взаимодействия с рецепторами Fcγ. Это было дополнительно подтверждено снижением связывания варианта S309-N297A с моноцитами хомяка в селезенке. Эффективность in vivo, измеренная с помощью mAb N297A, аналогична или просто немного уступает S309 wt, что указывает на то, что нейтрализующая способность mAb преобладает над его способностью выполнять эффекторную функцию в этих условиях. Концентрация S309 в сыворотке, необходимая для снижения вирусной РНК в легком на 90%, составляла 9 мкг/мл, фиг. 73D.

Пример 39

Активность антител против вариантов SARS-CoV-2

Появился ряд вариантов SARS-CoV-2, при этом в конце 2020 года было зарегистрировано увеличение числа случаев инфицирования вариантами. Мотив связывания рецептора (RBM), по-видимому, является особенно изменчив в отношении к мутации. Заметные появляющиеся варианты наблюдались в Шотландии, Великобритании, Южной Африке, Калифорнии, Колумбусе и у норок в Дании, и сообщалось, что некоторые мутации обеспечивают ускользание от антител или нейтрализацию сыворотки. Эксперименты проводили для оценки способности антител S309 нейтрализовать варианты. S309 N55Q MLNS (VH: SEQ ID NO:113; VL: SEQ ID NO:168; с мутациями Fc M428L и N434S) тестировали против SARS-CoV-2, с панелью из 20 наиболее часто встречающихся мутаций варианта RBD SARS-CoV-2, как определено с помощью считывания последовательности. Антитела REGN10933 и REGN10987 (Hansen и др., Science 369(6506):1010-1014; eabd0827-0810 (2020) и PDB 6XDG (rcsb.org/structure/6XDG)) были включены для сравнения. Результаты обобщены в Таблице 13.

Y означает менее чем трехкратное снижение нейтрализации живого вируса или псевдотипированного вируса;

N означает более чем трехкратное снижение нейтрализации живого вируса или псевдотипированного вируса;

P представляет собой нейтрализацию антителом прогнозируется из-за того, что вариантная аминокислота находится вне эпитопа;

? означает неизвестно.

Таблица 13. Сводка результатов нейтрализации с помощью антител против вариантов коронавируса SARS CoV-2
Вариант мутации	S309 N55Q MLNS	REGN10933	REGN10987
N501Y (британский, южноафриканский и бразильский мутант)	Y	Y	Y
S477N	Y	Y	Y
N439K (шотландский мутант)	Y	Y	N
L452R (калифорнийский мутант)	Y	P	P
E484K (южноафриканский и бразильский мутант)	Y	N	Y
Y453F (мутант норки)	Y	N	N (уменьшение в 4 раза)
A520S	Y	Y	Y
K417N (южноафриканский мутант)	Y (K417N/V)	N	Y (K417N/E/V)
S494P	Y	N	P
S477R	P	?	P
V367F	Y	Y	Y
P384L	Y	P	P
A522S	Y	P	P
A522V	Y	P	P
V382L	Y	P	P
N501T	Y	P	P
P330S	Y	P	P
T478I	Y	?	P
S477I	Y	?	P
P479S	Y	P	P

Y означает менее чем трехкратное снижение нейтрализации живого вируса или псевдотипированного вируса;

N означает более чем трехкратное снижение нейтрализации живого вируса или псевдотипированного вируса;

P представляет собой нейтрализацию антителом прогнозируется из-за того, что вариантная аминокислота находится вне эпитопа;

? означает неизвестно.

Общее количество секвенированных мутантов SARS-CoV-2, которые, как известно, ускользают от антител (по состоянию на 29 января 2021 г.), составляло: S309 N55Q MLNS = 29; REGN10987 = 10425; REGN10933 = 3621.

Связывание антител S309 с вариантом RBD SARS-CoV-2 оценивали с помощью BLI. Оценивали S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) с Fc дикого типа и S309 N55Q (VH: SEQ ID NO:113; VL: SEQ ID NO:168), несущие мутации Fc MLNS или MLNS + GAALIE. REGN10987 и REGN10933 были включены в качестве сравнения. Вкратце, антитела разбавляли в кинетическом буфере при 3 мкг/мл и загружали на сенсоры белка А в течение 75 секунд. После короткого этапа уравновешивания в кинетическом буфере загруженные сенсоры перемещали в лунки, содержащие варианты RBD, при 5 мкг/мл в кинетическом буфере и фиксировали ассоциацию в течение 3 минут. Диссоциацию комплекса проводили в кинетическом буфере в течение 3 минут. Данные показаны на фиг. 71A-71B; "WT" = Wuhan-Hu-1 с D614G; "Тройной мутант" в нижнем ряду = Wuhan-Hu-1 с D614G и добавлены южноафриканский вариант B.1.351 с мутациями RBD K417N, E484K и N501Y. Другие мутации, присутствующие в южноафриканском варианте B.1.351, не присутствовали в тестируемом RBD «SA».

Нейтрализацию с помощью антител S309 против вариантов SARS-CoV-2 оценивали с использованием псевдотипированного вируса MLV и клеток-мишеней Vero-E6, экспрессирующих TMPRSS2. Оценивали S309 (VH: SEQ ID NO:105; VL: SEQ ID NO:168) с Fc дикого типа и S309 N55Q (VH: SEQ ID NO:113; VL: SEQ ID NO:168), несущие мутации Fc MLNS или MLNS + GAALIE. Также оценивали REGN10987, REGN10933 и комбинацию REGN10987 + REGN10933. Данные показаны на фиг. 72. "WT" означает Wuhan-Hu-1; "UK" означает SARS-CoV-2 вариант B.1.1.7; и "SA" означает вариант B.1.351.

Различные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, можно объединять, получая дополнительные варианты осуществления. Все патенты США, публикации патентных заявок США, патентные заявки США, иностранные патенты, иностранные патентные заявки и непатентные публикации, указанные в настоящем описании и/или перечисленные информационном листе заявки, включая патентную заявку США 62/981,984, поданную 26 февраля, 2020, патентную заявку США 62/982,661, поданную 27 февраля, 2020, патентную заявку США 62/987,298, поданную 9 марта, 2020, патентную заявку США 62/989,522, поданную 13 марта, 2020, патентную заявку США 62/990,369, поданную 16 марта, 2020, патентную заявку США 62/992,082, поданную 19 марта, 2020, патентную заявку США 62/994,235, поданную 24 марта, 2020, патентную заявку США 63/001,204, поданную 27 марта, 2020, патентную заявку США 63/003,214, поданную 31 марта, 2020, патентную заявку США 63/005,206, поданную 3 апреля, 2020, патентную заявку США 63/010,589, поданную 15 апреля, 2020, патентную заявку США 63/011,971, поданную 17 апреля, 2020, патентную заявку США 63/014,024, поданную 22 апреля, 2020, патентную заявку США 63/023,788, поданную 12 мая, 2020, патентную заявку США 63/025,133, поданную 14 мая, 2020, патентную заявку США 63/039,813, поданную 16 июня, 2020, патентную заявку США 63/043,653, поданную 24 июня, 2020, патентную заявку США 63/050,331, поданную 10 июля, 2020, и патентную заявку США 63/052,810, поданную 16 июля, 2020, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Аспекты вариантов осуществления может быть модифицировано, если необходимо использовать концепции различных патентов, заявок и публикаций для обеспечения еще нескольких дополниительных вариантов осуществления.

В настоящий вариант осуществления можно вносить указанные и другие изменения в свете вышеприведенного подробного описания. В целом, термины, используемые в следующей формуле изобретения, не должны толковаться как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в описании и формуле изобретения, но должны толковаться как включающие все возможные варианты осуществления вместе с полным объемом эквивалентов, на которые распространяется такая формула изобретения. Соответственно, формула изобретения не ограничена описанием.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Intervet International BV

<120> Поливалентная векторная вакцина HVT

<130> 24912

<160> 6

<170> Patentln version 3.5

<210> 1

<211> 5498

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Объединенная единственная кассета экспрессии

<220>

<221> промотор

<222> (1} .. (1391)

<223> промотор-энхансер немедленно-раннего гена 1 цитомегаловируса мыши

<220>

<221> ген

<222> (1423) .. (2781}

<223> IВDV штамм F 52/70, VP2 ген

<220>

<221> терминатор

<222> (2812) .. (3021}

<223> SV40 полиА сигнал + терминатор

<220>

<221> промотор <222> (3160) .. (3520}

<223> коровый промотор немедленно-раннего гена 1 цитомегаловируса человека

<220>

<221> ген

<222> (3545) .. (5206)

<223> NDV Clone 30 F-ген

<220>

<221> терминатор

<222> (5218) .. (5498)

<223> терминатор гена hCMV IE

<400> 1

аасtссgссс gttttatgас tagаассaat agtttttaat gссaaatgса сtgaaatсс 60

ctaatttgca aagccaaacg ccccctatgt gagtaatacg gggacttttt acccaatttc 120

ccaagcggaa agccccctaa tacactcata tggcatatga atcagcacgg tcatgcactc 180

taatggcggc ccatagggac tttccacata gggggcgttc accatttccc agcatagggg 240

tggtgactca atggccttta. cccaagtaca ttgggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt 300

tttcccatta ctggcaagca cactgagtca aatgggactt tccactgggt tttgcccaag 360

tacattgggt caatgggagg tgagccaatg ggaaaaaccc attgctgcca agtacactga 420

ctcaataggg actttccaat gggtttttcc attgttggca agcatataag gtcaatgtgg 480

gtgagtcaat agggactttc cattgtattc tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga 540

atcaacagga aagtcccatt ggagccaagt acactgcgtc aatagggact ttccattggg 600

ttttgcccag tacataaggt caatagggga tgagtcaatg ggaaaaaccc attggagcca 660

agtacactga ctcaataggg actttccatt gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg 720

gggtgagtca acaggaaagt cccattggag ccaagtacat tgagtcaata gggactttcc 780

aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt tttcccatta 840

ctggcacgta tactgagtca ttagggactt tccaatgggt tttgcccagt acataaggtc 900

aataggggtg aatcaacagg aaagtcccat tggagccaag tacactgagt caatagggac 960

tttссattgg gttttgсссa gtасaaaagg tсaatagggg gtgagtсaat gggtttttсс 1020

cattattggc acgtacataa ggtcaatagg ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt 1080

aattaaaacg ccatgtactt tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa 1140

cgtgaccttt aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc 1200

aatacacgtc aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc ggttttcccc 1260

tggaaattcc atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga 1320

ggcgcgacca gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcagagct 1380

cctcgctgca ggcggccgct ctagaactcg tcgatcgcag cgatgacaaa cctgcaagat 1440

caaacccaac agattgttcc gttcatacgg agccttctga tgccaacaac cggaccggcg 1500

tccattccgg acgacaccct ggagaagcac actctcaggt cagagacctc gacctacaat 1560

ttgactgtgg gggacacagg gtcagggcta attgtctttt tccctggatt ccctggctca 1620

attgtgggtg ctcactacac actgcaaagc aatgggaact acaagttcga tcagatgctc 1680

ctgactgccc agaacctacc ggccagctac aactactgca gactagtgag tcggagtctc 1740

acagtgaggt caagcacact ccctggtggc gtttatgcac taaacggcac cataaacgcc 1800

gtgaccttcc aaggaagcct gagtgaactg acagatgtta gctacaatgg gttgatgtct 1860

gcaacagcca acatcaacga caaaattggg aatgtcctgg taggggaagg ggtcactgtc 1920

ctcagcctac ccacatcata tgatcttggg tatgtgaggc ttggtgaccc cattcccgct 1980

atagggcttg acccaaaaat ggtagctaca tgcgacagca gtgacaggcc cagagtctac 2040

accataactg cagccgatga ttaccaattc tcatcacagt accaaccagg tggggtaaca 2100

atcacactgt tctcagccaa cattgatgct atcacaagcc tcagcattgg gggagagctc 2160

gtgtttcaaa caagcgtcca aggccttgta ctgggcgcca ccatctacct tataggcttt 2220

gatgggactg cggtaatcac cagagctgta gccgcagata atgggctgac ggccggcacc 2280

gacaatctta tgccattcaa tcttgtcatt ccaaccaatg agataaccca gccaatcaca 2340

tccatcaaac tggagatagt gacctccaaa agtggtggtc aggcaaggga tcagatgtca 2400

tggtcggcaa gtgggagcct agcagtgacg atccatggtg gcaactatcc aggggccctc 2460

cgtcccgtca cactagtagc ctacgaaaga gtggcaacag gatccgtcgt tacggtcgct 2520

ggggtgagta acttcgagct gattccaaat cctgaactag caaagaacct ggttacagaa 2580

tacggccgat ttgacccagg agccatgaac tacacaaaat tgatactgag tgagagggac 2640

cgtcttggca tcaagaccgt ctggccaaca agggagtaca ctgattttcg tgagtacttc 2700

atggaggtgg ccgacctcaa ctctcccctg aagattgcag gagcatttgg cttcaaagac 2760

ataatccggg ctataaggag gtaagcttga tctagagcgg ccgcggggat ccagacatga 2820

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 2880

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 2940

ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 3000

ttteggateс tctagagtcg acaattattt catttaataa catatagccc aaagacctct 3060

atgaacattt agtttcccgt atactcaacg gcgcgtgtac acacaagggc gaattccaca 3120

gtggatatca agcttaatta agtaccgagc tcgaattggc gcgccaggtc aattccctgg 3180

cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat etaegtatta 3240

gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagegg 3300

tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 3360

caccaaaatc aaegggaett tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 3420

ggeggtagge gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 3480

atcgcctgga. gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggcgcgccgg 3540

atccatgggc cccagacctt ctaccaagaa cccagtacct atgatgctga ctgtccgagt 3600

cgcgctggta ctgagttgca tctgtccggc aaactccatt gatggcaggc ctcttgcggc 3660

tgcaggaatt gtggttacag gagacaaagc cgtcaacata tacacctcat cccagacagg 3720

atcaatcata gttaagctcc tcccgaatct gcccaaggat aaggaggcat gtgegaaage 3780

ccccttggat gcatacaaca ggacattgac cactttgctc accccccttg gtgactctat 3840

ccgtaggata caagagtctg tgactacatc tggagggggg agacaggggc gccttatagg 3900

cgccattatt ggcggtgtgg ctcttggggt tgcaactgcc gcacaaataa cagcggccgc 3960

agctctgata caagccaaac aaaatgctgc caacatcctc cgacttaaag agagcattgc 4020

cgcaaccaat gaggctgtgc atgaggtcac tgacggatta tcgcaactag cagtggcagt 4080

tgggaagatg cagcagtttg ttaatgacca atttaataaa acagctcagg aattagactg 4140

catcaaaatt gcacagcaag ttggtgtaga gctcaacctg tacctaaccg aattgactac 4200

agtattcgga ccacaaatca cttcacctgc tttaaacaag ctgactattc aggcacttta 4260

caatctagct ggtggaaata. tggattactt attgactaag ttaggtgtag ggaacaatca 4320

actcagctca ttaatcggta gcggcttaat caccggtaac cctattctat acgactcaca 4380

gactcaactc ttgggtatac aggtaactct accttcagtc gggaacctaa ataatatgeg 4440

tgccacctac ttggaaacct tatccgtaag cacaaccagg ggatttgcct cggcacttgt 4500

cccaaaagtg gtgacacagg tcggttctgt gatagaagaa cttgacacct catactgtat 4560

agaaactgac ttagatttat attgtacaag aatagtaacg ttccctatgt cccctggtat 4620

ttattcctgc ttgageggea ataegtegge ctgtatgtac tcaaagaccg aaggcgcact 4680

tactacacca tacatgacta. tcaaaggttc agtcatcgcc aactgcaaga tgacaacatg 4740

tagatgtgta aaccccccgg gtatcatatc gcaaaactat ggagaagccg tgtctctaat 4800

agataaacaa teatgeaatg ttttatcctt aggegggata actttaaggc tcagtgggga 4860

attcgatgta acttatcaga agaatatctc aatacaagat tctcaagtaa taataacagg 4920

caatcttgat atctcaactg agcttgggaa tgtcaacaac tcgatcagta atgctttgaa 4980

taagttagag gaaagcaaca gaaaactaga caaagtcaat gtcaaactga ctagcacatc 5040

tgctctcatt ассtatateg ttttgactat catatctctt gtttttggta tacttagccc 5100

gattctagca tgctacctaa tgtacaagca aaaggcgcaa caaaagacct tattatggct 5160

tgggaataat actctagatc agatgagagc cactacaaaa atgtgaggat ctctcgagga 5220

attctagate ccacgtcact attgtatact ctatattata ctctatgtta tactctgtaa 5280

tcctactcaa taaacgtgtc acgcctgtga aaccgtacta agtctcccgt gtcttcttat 5340

caccatcagg tgacatcctc gcccaggctg tcaatcatgc cggtatcgat tccagtagca 5400

ccggccccac gctgacaacc cactcttgca gcgttagcag cgcccctctt aacaagccga 5460

cccccaccag cgtcgcggtt actaacactc ctctcccc 5498

<210> 2

<211> 2459

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательн

<220>

<223> Кассета экспрессии 3

<220>

<221> промотор

<222> (20) .. (701)

<223> промотор гена PRV gВ, увеличенный

<220>

<221> ген

<222> (713) . . (2395)

<223> ген AIV НА Н9, синтетический, кодон-оптимизированный

<220>

<221> терминатор

<222> (2404) .. (2458)

<223> терминатор гена FHV1 Us9

<400> 2

agcttaatta aggcgcgcca gatctcgctg ctgcacacgt acgtggcggt ggccgccggg 60

ttccgcgcac ggcgcgcgtt ctgcgaggcc gccgcgcgcg cgggcaccgt cgtggacgag 120

cgcgagacgg getgettega cgcgcacagc ttcatgaagg ccacggtgca gcgccacccc 180

gtggacgccg cgctcctccc ggcgctcacg cacaagttct tcgagctcgt caacgggccg 240

ctcttcgcgc acgacacgca. cgccttcgcc cagtccccca acacggcgct ctactttgcg 300

gtggagaacg tgggcctcct gccgcacctg aaggaggagc tggcgcgctt catggtggcc 360

cgcgattggt gcgtcagtga gttccgcggc ttctaccgct tccagacggc cggcgtaacc 420

gccacccagc ggcaggcctg gcgatatatc cgcgagctgg tgctggcggt tgcagtcttc 480

aggtccgtct tccactgcgg ggacgtcgag gtcctccgcg eggategсtt cgccggacgc 540

gacgggctgt acctgaccta cgaggcgtct tgccccgctg gtggcggtct ttggcgcggg 600

ссссgсgggс atсggсссgg gсассасggс ggtgсtggсс tсggасgtсt ttggссtgсt 660

ccacaccacg ctgctgctgc gcggggcgcc gtcgcgctag agatctaaag ccatggagac 720

catctccctg atgactatcc tgctcgtcgt gaccacctcc aacgccgaca agatttgcat 780

cggtcaccag tccaccaact ctaccgagac cgtggacacc ctgaccgaga ctaacgtccc 840

tgtcacccac gccaaggagc tgctgcacac tgagcacaac ggaatgctct gcgctaccaa 900

cctcggtcac ccactcatcc tggacacctg cactatcgag ggtctcatct acggcaaccc 960

сtсttgсgас сtgсtссtgg gaggtсgtga gtggtссtас atсgtсgagс gtссttссgс 1020

tgtgaacggc acttgctacc ccggtaacgt ggagaacctc gaggagctcc gtactctctt 1080

ctcctcttcc tccagctacc agcgtatcca aatcttcccc gacacgatct ggaacgtgac 1140

ctacaccggt acctccaagt cctgcagcga ctctttctac cgcaacatgc gctggctgac 1200

ccagaagaac ggactgtacc ctgtgcagga cgctcagtac accaacaacc gcggaaagga 1260

catcctgttc gtctggggta. tccaccaccc tcccactgac accgctcaga ccaacctgta 1320

cactcgcacc gacactacca ctagcgtcac taccgagaac ctggaccgca ctttcaagcc 1380

actgatcggt cctcgtcctc tggtgaacgg tctgatcggc aggatcaact actactggag 1440

cgtgctcaag cccggacaga ctctgagggt gcgtagcaac ggcaacctga tcgccccttg 1500

gttcggtcac gtgctgtctg gagagtctca cggacgtatc ctgaagaccg acctgaactc 1560

cggtaactgc gtggtccagt gccagactga gaagggtggc ctcaactcca ctctgccctt 1620

ccacaacatc tccaagtacg ccttcggcac ctgccccaag tacatcggtg tgaagtccct 1680

gaagctcgct atcggactgc gtaacgtccc tgctaggtcc agcaggggtc tgttcggcgc 1740

tatcgctggt ttcatcgagg gtggatggcc tggtctggtg gctggttggt acggcttcca 1800

gcactctaac gaccagggtg tcggaatggc cgctgaccgt gactctactc agaaggccgt 1860

cgacaagatc acctccaagg tgaacaacat cgtcgacaag atgaacaagc agtacgagat 1920

catcgaccac gagttctccg aggtggagac tcgcctcaac atgatcaaca acaagatcga 1980

cgaccagatc caggacgtct gggcttacaa cgctgagctc ctggtgctcc tcgagaacca 2040

gaagactctg gacgagcacg acgccaacgt caacaacctc tacaacaagg tgaagcgtgc 2100

cctgggctcc aacgctatgg aggacggcaa gggttgcttc gagctctacc acaagtgcga 2160

cgaccagtgc atggagacca tcaggaacgg gacctacaac cgccgtaagt acaaggagga 2220

gagcaggctg gagcgtcaga agatcgaggg cgtcaagctg gagtctgagg gcacctacaa 2280

gatcctgact atctactcca ccgtcgcctc tagcctcgtg ctcgctatgg gcttcgctgc 2340

cttcctgttc tgggccatgt ccaacggttc ctgccgttgc aacatctgca tctaattaat 2400

taacaataaa catagcatac gttatgacat ggtctaccgc gtcttatatg gggacgaca 2459

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Гepпeсвиpус индеек

<220>

<221> праймер

<222> (1) . . (19)

<223> направляющая РНК для вставки UL40-41

<400> 3

acctaaagta cacgtgaatc

20

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Герпесвирус индеек

<220>

<221> праймер

<222> (1)..(20)

<223> направляющая РНК для вставки UL44-45

<400> 4

асatсgggас gtасatсatg

20

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Герпесвирус индеек

<220>

<221> праймер

<222> (1) . . (20)

<223> направляющая РНК для вставки UL47-48

<4О0> 5

tggcggttас aatttссасg

20

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Герпесвирус индеек

<220>

<221> праймер

<222> (1) . . (20)

<223> направляющая РНК для вставки UL54-LORF4

<400> 6

ttagatttcc ggacagcctg

20

<---

Claims (30)

1. Рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT) для получения вакцины для предотвращения или снижения заражения MDV, IBDV, NDV и/или AIV или ассоциированных с ними признаков заболевания у домашней птицы, экспрессирующий ген вирусного белка 2 (VP2) вируса инфекционного бурсита (IBDV) и ген слитого белка (F) вируса болезни Ньюкасла (NDV) из первой и второй кассет экспрессии, которые вставлены в уникальную малую (Us) область генома указанного rHVT, отличающийся тем, что первая и вторая кассеты экспрессии обе встроены в ген Us2, и тем, что указанный rHVT также экспрессирует ген гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа (AIV) из третьей кассеты экспрессии, которая встроена в уникальную длинную (UL) область генома указанного rHVT либо между генами UL40 и UL41, либо между генами UL44 и UL45.

2. rHVT по п. 1, отличающийся тем, что ген VP2 IBDV экспрессируется из первой кассеты экспрессии, содержащей, в направлении от 5' к 3' и в следующем порядке:

а. промотор немедленно-раннего гена 1 цитомегаловируса мыши (mCMV-IE1),

b. ген VP2 IBDV, и

с. терминатор транскрипции,

и где промотор и терминатор указанной кассеты экспрессии функционально связаны с геном VP2.

3. rHVT по п. 1 или 2, отличающийся тем, что ген F NDV экспрессируется из второй кассеты экспрессии, содержащей, в направлении от 5' к 3' и в следующем порядке:

а. промотор немедленно-раннего гена 1 цитомегаловируса человека (hCMV-IE1),

b. ген белка NDV F, и

с. терминатор транскрипции,

и где промотор и терминатор указанной кассеты экспрессии функционально связаны с геном F.

4. rHVT по пп. 1-3, отличающийся тем, что первая и вторая кассеты экспрессии объединены в одну кассету экспрессии.

5. rHVT по п. 4, отличающийся тем, что комбинированная единственная кассета экспрессии встроена в ген Us2.

6. rHVT по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что ген НА AIV экспрессируется из третьей кассеты экспрессии, содержащей, в направлении от 5' к 3' и в следующем порядке:

а. промотор гена гликопротеина B (gB) из вируса герпеса млекопитающих,

b. ген белка НА AIV, и

с. терминатор транскрипции,

и где промотор и терминатор указанной кассеты экспрессии функционально связаны с геном НА.

7. rHVT по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что ген белка НА AIV кодирует белок НА серотипа, выбранного из Н5, Н7 и Н9.

8. Птичья клетка-хозяин для получения вакцины для предотвращения или снижения заражения MDV, IBDV, NDV и/или AIV или ассоциированных с ними признаков заболевания у домашней птицы, содержащая rHVT по любому из пп. 1-7.

9. Вакцина для предотвращения или снижения заражения MDV, IBDV, NDV и/или AIV или ассоциированных с ними признаков заболевания у домашней птицы, содержащая иммунологически эффективное количество rHVT по любому из пп. 1-7 и/или клетки-хозяина по п. 8, и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Вакцина по п. 9, содержащая по меньшей мере один дополнительный иммуноактивный компонент.

11. Способ получения вакцины для домашней птицы по п. 9 или 10, включающий стадии:

а. инфицирования клеток-хозяев in vitro rHVT по любому из пп. 1-9,

b. сбор инфицированных клеток-хозяев, и

с. смешивание собранных инфицированных клеток-хозяев с фармацевтически приемлемым носителем.

12. Применение rHVT по любому из пп. 1-7, клетки-хозяина по п. 8 или любой их комбинации для получения вакцины для домашней птицы.

13. Применение вакцины по п. 9 или 10 для профилактики или уменьшения инфекции MDV, IBDV NDV и/или AIV или связанных с ними признаков заболевания.

14. Способ профилактики или уменьшения заражения MDV, IBDV NDV и/или AIV или связанных с ними признаков заболевания, включающий введение вакцины по любому из пп. 9 или 10 домашней птице.

15. Способ вакцинации домашней птицы для профилактики или уменьшения заражения MDV, IBDV NDV и/или AIV или связанных с ними признаков заболевания, включающий стадию инокуляции указанной домашней птицы вакциной по п. 9 или 10.