RU2831838C2

RU2831838C2 - Биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1BB и его применение

Info

Publication number: RU2831838C2
Application number: RU2022101086A
Authority: RU
Inventors: Хёджин ЧОН; Ерён ЁН; Кёнсу ПАК; Ынён ПАК; Ый-Чон ЧОН; Янсун ЛИ; Ынчжон КИМ; Ён-Гю СОН; Вончжун СОН; Сэвон АН; Донхун ЁМ; Чанму ЛИ; Чжонхён ХОН; Му Ён СОН; Ын-Чжон ЛИ; На Рэ ЛИ; Ён Бон ПАК; Тэван КИМ
Original assignee: Юхан Корпорейшн
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2024-12-16

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к биспецифическому антителу анти-4-1BB/анти-HER2. Также раскрыты фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело; полинуклеотид, кодирующий указанное антитело; вектор экспрессии, содержащий указанный полинуклеотид; клетка для получения указанного антитела. Раскрыто применение указанного антитела; способ получения указанного биспецифического антитела. Изобретение позволяет эффективно лечить рак с экспрессией EGFR. 9 н. и 13 з.п. ф-лы, 15 ил., 35 табл., 10 пр.

Description

Область техники

Предложено биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2, а также фармацевтическая композиция и способ лечения и/или предупреждения рака с его использованием.

Предшествующий уровень техники

Белок 4-1ВВ является членом суперсемейства TNF-рецепторов (TNFRSF) и представляет собой костимулирующую молекулу, которая экспрессируется после активации иммунных клеток, как врожденных, так и адаптивных иммунных клеток. 4-1ВВ играет важную роль в модуляции активности различных иммунных клеток. Агонисты 4-1ВВ усиливают пролиферацию и выживаемость иммунных клеток, секрецию цитокинов и цитолитическую активность CD8 Т-клеток. Многие другие исследования показали, что активация 4-1ВВ усиливает иммунный ответ для устранения опухолей у мышей. Следовательно, полагают, что 4-1ВВ является многообещающей молекулой-мишенью в иммунологии рака. Несмотря на свою противоопухолевую эффективность, антитело против 4-1ВВ вызывало тяжелую гепатотоксичность при клиническом применении.

Белок HER2 является членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) и участвует в различных механизмах, связанных с опухолями. HER2 представляет собой типичную рецепторную тирозинкиназу (RTK), присутствующую на поверхности клеток и тем самым индуцирующую пролиферацию и проникновение раковых клеток, ангиогенез и т.д.

Между тем, мультиспецифические антитела, нацеленные на два или более антигенов, разрабатываются в различных видах и формах, и ожидается, что они станут новым лекарственным антителом, обладающим превосходящими терапевтическими эффектами по сравнению с моноклональным антителом.

Следовательно, существует потребность в разработке мультиспецифического антитела, способного распознавать два разных антигена, один из которых присутствует на раковой клетке, а другой присутствует на другой клетке, такой как иммунная клетка, для более эффективной терапии рака.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

В одном воплощении предложено биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1ВВ, содержащее:

(1) антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве группировки, нацеленной на HER2, которая способна специфически распознавать и/или связываться с белком HER2; и

(2) антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве группировки, нацеленной на 4-1ВВ, которая способна специфически распознавать и/или связываться с белком 4-1ВВ.

В другом воплощении предложена фармацевтическая композиция, содержащая указанное биспецифическое антитело. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может быть использована для лечения и/или предупреждения рака и/или для усиления иммунного ответа.

В еще одном воплощении предложена фармацевтическая композиция для лечения и/или предупреждения рака и/или для усиления иммунного ответа, содержащая указанное биспецифическое антитело.

В еще одном воплощении предложен способ лечения и/или предупреждения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества биспецифического антитела или фармацевтической композиции. Способ может дополнительно включать стадию идентификации субъекта, нуждающегося в лечении и/или предупреждения рака, до стадии введения.

В еще одном воплощении предложен способ усиления иммунного ответа у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества биспецифического антитела или фармацевтической композиции. Способ может дополнительно включать стадию идентификации субъекта, нуждающегося в усилении иммунного ответа, до стадии введения.

В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела или фармацевтической композиции в лечении и/или предупреждении рака. В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения рака.

В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела или фармацевтической композиции в усилении иммунного ответа. В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела в изготовлении лекарственного средства для усиления иммунного ответа.

В одном воплощении предложен полинуклеотид, кодирующий указанное биспецифическое антитело.

В одном воплощении предложен рекомбинантный вектор, содержащий указанный полинуклеотид. Рекомбинантый вектор может быть использован в качестве вектора экспрессии полинуклеотида, кодирующего биспецифическое антитело.

В еще одном воплощении предложена клетка, содержащая полинуклеотид, кодирующий указанное биспецифическое антитело. Клетка может представлять собой рекомбинантную клетку, трансфицированную рекомбинантным вектором, содержащим указанный полинуклеотид.

В еще одном воплощении предложен способ получения биспецифического антитела, включающий экспрессию полинуклеотида в клетке. Стадия экспрессии полинуклеотида может быть осуществлена путем культивирования клетки, содержащей полинуклеотид (например, в рекомбинантном векторе), в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полинуклеотида.

Техническое решение

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, каждое из которых содержит антитело, специфичное к опухолеассоциированному антигену (ТАА; HER2), и антитело, специфичное к 4-1ВВ, и их применению. Эти биспецифические антитела активируют передачу сигналов 4-1ВВ и стимулируют сильный иммунный ответ клетки только в присутствии клеток, экспрессирующих HER2. В виду специфического HER2-опосредованного иммунного ответа ожидается гораздо более низкая токсичность для печени при использовании биспецифических антител по сравнению с моноклональным антителом 4-1ВВ.

Согласно настоящему изобретению предложено биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-lBB и его применения, где указанное биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1ВВ может содержать:

Далее настоящее изобретение описано более подробно.

Определения

Используемые здесь термины «состоящий из последовательности», «по существу состоящий из последовательности» или «содержащий последовательность» могут относиться к любому случаю, включающему последовательность, но не могут предназначаться для исключения случая, включающего дополнительную последовательность, отличную от указанной последовательности.

Используемый здесь термин «белок или полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO» и «ген или полинуклеотид, содержащий или состоящий из последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO» может относиться к белку (или полипептиду) или гену (или полинуклеотиду), который состоит в основном из указанной аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты или который имеет идентичность последовательности по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты с сохранением присущей ей активности и/или функции.

Используемый здесь термин «антитело» может охватывать различные широкие классы полипептидов, которые могут отличаться биохимически. Специалистам в данной области техники понятно, что тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε) с некоторыми подклассами среди них (например, γ1-γ4), а легкие цепи классифицируют либо как каппа, либо как лямбда (К, λ). Именно природа данной цепи определяет «класс» антитела как IgG, IgM, IgA, IgG или IgE, соответственно. Подклассы иммуноглобулинов (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 и т.д., хорошо охарактеризованы и, как известно, придают функциональную специализацию.

Интактное антитело включает две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, в которых каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидными связями. Антитело имеет константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи. Константная область тяжелой цепи относится к типу гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε), которые могут быть дополнительно классифицированы как гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3), гамма 4 (γ4), альфа 1 (α1) или альфа 2 (α2). Константная область легкой цепи относится к типу каппа (κ) или лямбда (λ).

Термин «тяжелая цепь» относится к полноразмерной тяжелой цепи или ее фрагменту, включая вариабельную область V_H, которая включает аминокислотные последовательности, достаточные для обеспечения специфичности к антигенам, и три константные области, C_H1, C_H2 и C_H3, и петлю. Термин «легкая цепь» относится к полноразмерной легкой цепи или ее фрагменту, включая вариабельную область V_L, которая включает аминокислотные последовательности, достаточные для обеспечения специфичности к антигенам, и константную область C_L.

Термин «область, определяющая комплементарность (CDR)» относится к аминокислотной последовательности, обнаруженной в гипервариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина. Тяжелая и легкая цепи могут соответственно включать три CDR (CDRH1, CDRH2 и CDRH3; и CDRL1, CDRL2 и CDRL3). CDR может предоставлять остатки, которые играют важную роль в связывании антител с антигенами или эпитопами. Термины «специфически связывающий» или «специфически распознаваемый» хорошо известны специалистам в данной области техники и указывают на то, что антитело и антиген специфически взаимодействуют друг с другом, что приводит к иммунологической активности.

В данном изобретении антитело может включать, без ограничения, поликлональное или моноклональное антитело; и/или человеческое, гуманизированное антитело, антитело животного происхождения (например, от мыши, кролика и т.д.), или химерные антитела (например, химерное антитело мыши-человека).

Антитело животного происхождения, полученное путем иммунизации животного желаемым антигеном, обычно может вызывать реакцию иммунного отторжения при введении человеку с лечебной целью, и для подавления такой реакции иммунного отторжения было разработано химерное антитело. Химерное антитело образуют путем замены константной области антитела животного происхождения, которая является причиной антиизотипического ответа, на константную область человеческого антитела с использованием методов генной инженерии. Химерное антитело имеет значительно улучшенный антиизотипический ответ по сравнению с антителами животного происхождения, но аминокислоты животного происхождения все еще присутствуют в его вариабельных областях и, таким образом, оно все еще содержит потенциальные побочные эффекты, возникающие в результате антиидиотипического ответа. Таким образом, гуманизированное антитело было разработано для уменьшения таких побочных эффектов. Его получают путем прививки CDR (областей, определяющих комплементарность), которые из вариабельных областей химерного антитела играют важную роль в связывании антигена с каркасом человеческого антитела.

Используемый здесь термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту, имеющему происхождение из полной структуры иммуноглобулина, включая часть, способную связываться с антигеном, такую как области CDR. Например, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' или F(ab')₂, но не ограничиваться ими. В настоящем изобретении антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой фрагмент, полученный из антитела, включающий по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность, например, выбранную из группы, состоящей из scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' и F(ab')2.

Из антигенсвязывающих фрагментов Fab представляет собой структуру, имеющую вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи, константную область легкой цепи и первую константную область (C_H1) тяжелой цепи, и он имеет один антиген-связывающий сайт.

Fab' отличается от Fab тем, что имеет шарнирную область, включающую один или более остатков цистеина на С-конце домена C_H1 тяжелой цепи. Антитело F(ab')₂образуют посредством дисульфидной связи остатков цистеина в шарнирной области Fab'.

Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, и рекомбинантный метод получения фрагмента Fv хорошо известен в соответствующей области техники. Двухцепочечный Fv может иметь структуру, в которой вариабельная область тяжелой цепи связана с вариабельной областью легкой цепи нековалентной связью, а одноцепочечный Fv (scFv) обычно может иметь димерную структуру, как в двухцепочечном Fv, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи ковалентно связаны через пептидный линкер или они непосредственно связаны друг с другом на С-конце.

Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием протеаз (например, целое антитело расщепляют папаином с получением Fab-фрагментов и расщепляют пепсином с получением F(ab')₂-фрагментов) и может быть получено методом генетической рекомбинации.

Иммуноглобулин (например, иммуноглобулин человека) или молекулы антител согласно настоящему изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY и др.), класса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgAl, IgA2 и др.), или подкласса молекулы иммуноглобулина.

В антителе или фрагменте антитела части (например, константные области), за исключением CDR или вариабельных областей, могут иметь происхождение из человеческого антитела и, в частности, они могут иметь происхождение из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или IgY, например, IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут быть химически или рекомбинантно синтезированными (не встречающимися в природе).

Группировка, нацеленная на 4-1ВВ

Биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1BB может содержать антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве группировки, нацеленной на 4-1ВВ.

Термин «4-1ВВ», который также называют CD137 или TNFRSF9 (представитель 9 суперсемейства рецепторов TNF), является членом суперсемейства рецепторов TNF (TNFRSF) и представляет собой костимулирующую молекулу, которая экспрессируется после активации иммунных клеток, как клеток врожденного, так и адаптивного иммунитета. 4-1ВВ играет важную роль в модуляции активности различных иммунных клеток. Как используют здесь, 4-1ВВ может происходить от млекопитающего, например, Homo sapiens (человек) (номер доступа NCBI NP_001552.2). Например, белок 4-1ВВ человека (NP_001552.2) может быть представлен аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 89), как показано ниже

В одном воплощении антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать:

CDR(область, определяющую комплементарность)-Н1 (H-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 3;

H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 5 или 6;

H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 или 11;

L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13;

L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 15; и

L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или 17.

Аминокислотные последовательности CDR антитела против 4-1 ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента проиллюстрированы в Таблице 1:

Например, антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать:

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; или

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, Н-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

В другом воплощении антитело против 4-1 ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 3, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 5 или 6, и H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 или 11; и вариабельную область легкой цепи, содержащую L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или 17.

В другом воплощении антитело против 4-1 ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29; и вариабельную область легкой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34 или 88.

Аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела против 4-1ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента проиллюстрированы в Таблице 2:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88.

Аминокислотные последовательности каркасных областей вариабельных областей антитела против 4-1ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента проиллюстрированы в Таблице 3:

В другом воплощении антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать тяжелую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 или 61; и легкую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62, 63 или 64.

тяжелую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 или 61; и легкую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62;

тяжелую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 или 61; и легкую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63; или

тяжелую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 или 61; и легкую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64.

В другом воплощении антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), содержащий:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 3, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 5 или 6, и H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 или 11; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или 17,

где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть связаны друг с другом в любом порядке непосредственно (т.е. без линкера) или через пептидный линкер.

Например, анти-4-1ВВ scFv может содержать:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34 или 88,

где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть связаны друг с другом в любом порядке непосредственно или через пептидный линкер.

Например, анти-4-1ВВ scFv может содержать:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28 или 29; и вариабельную область легкой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28 или 29; и вариабельную область легкой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34; или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28 или 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88,

В настоящем изобретении scFv анти-4-1ВВ содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в любом порядке. Например, scFv анти-4-1ВВ может содержать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в направлении от N-конца к С-концу. Альтернативно, scFv анти-4-1ВВ может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в направлении от N-конца к С-концу.

Группировка, нацеленная на HER2

Биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1ВВ может содержать антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве группировки, нацеленной на HER2.

«HER2 (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека)» кодируется геном ERBB2 и является членом рецептора эпидермального фактора роста (EGFR/ErbB). Известно, что HER2 играет важную роль в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток. В частности, при связывании с внеклеточными факторами роста он имеет сильную тенденцию к сборке в гомо- и/или гетеродимеры вместе с другими рецепторами HER, что приводит к активации нескольких форм пути передачи сигнала, и индуцирует апоптоз, выживание или пролиферацию клеток. Например, белок HER2 может представлять собой полипептиды, депонированные под номерами доступа в GenBank NP_004439.2, NP_001005862.1 и др., которые кодируются последовательностями нуклеотидов (мРНК), депонированными под номерами доступа в GenBank NM 004448.4, NM_001005862.3 и др., соответственно.

В одном воплощении антитело против HER2 может быть выбрано из группы, состоящей из трастузумаба, пертузумаба и трастузумаба эмтанзина (T-DM1).

Антигенсвязывающая область антитела против HER2, распознающего HER2 в качестве антигена, может представлять собой scFv, (scFv)2, Fab, Fab' или F(ab')2 антитела против HER2, выбранного из группы, состоящей из трастузумаба, пертузумаба и трастузумаба эмтанзина (T-DM1).

Антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий 6 CDR трастузумаба, пертузумаба или трастузумаба эмтанзина (T-DM1).

В одном воплощении антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой трастузумаб или его антигенсвязывающий фрагмент или его вариант.

Например, антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать:

H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70. Аминокислотные последовательности CDR антитела против HER2 или его антигенсвязывающего фрагмента проиллюстрированы в Таблице 4:

В другом воплощении антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, и H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и вариабельную область легкой цепи, содержащую L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70.

В другом воплощении антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72.

Аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела против HER2 или его антигенсвязывающего фрагмента проиллюстрированы в Таблице 5:

В другом воплощении антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать тяжелую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 73 или 74; и легкую цепь, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 75.

В другом воплощении антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), содержащий:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, и H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть связаны друг с другом в любом порядке непосредственно (т.е. без линкера) или через пептидный линкер.

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую или по существу состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72,

В настоящем изобретении scFv анти-HER2 содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в любом порядке. Например, scFv анти-HER2 может содержать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в направлении от N-конца к С-концу. Альтернативно, scFv анти-HER2 может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в направлении от N-конца к С-концу.

Биспецифическое антитело

В настоящем изобретении предложено биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1 ВВ, содержащее:

Биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1ВВ может активировать передачу сигналов 4-1ВВ только при перекрестном связывании опухолевыми клетками, экспрессирующими HER2. Кроме того, антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащиеся в биспецифическом антителе, могут характеризоваться локализацией и/или активацией только в микроокружении опухоли (ТМЕ) и/или значительным снижением гепатотоксичности по сравнению с существующими в настоящее время антителами против 4-1ВВ, с сохранением эффективности по усилению иммунного ответа и/или лечению опухоли.

В одном воплощении биспецифическое антитело может представлять собой полноразмерное антитело против HER2 и антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv) антитела против 4-1ВВ, где антигенсвязывающий фрагмент антитела против 4-1ВВ может быть связан с N-концом, С-концом или обоими из них полноразмерного антитела против HER2, непосредственно или через пептидный линкер. В другом воплощении биспецифическое антитело может представлять собой полноразмерное антитело против 4-1ВВ и антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv) антитела против HER2, где антигенсвязывающий фрагмент антитела против HER2 может быть связан с N-концом, С-концом или обоими из них полноразмерного антитела против 4-1ВВ, непосредственно или через пептидный линкер.

В одном воплощении scFv, содержащийся в биспецифическом антителе, может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в любом порядке. Например, scFv, содержащийся в биспецифическом антителе, может содержать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в направлении от N-конца к С-концу и, возможно, пептидный линкер между ними, или альтернативно, scFv, содержащийся в биспецифическом антителе, может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в направлении от N-конца к С-концу и, возможно, пептидный линкер между ними.

Когда биспецифическое антитело содержит полноразмерное антитело против HER2 и scFv антитела против 4-1ВВ, биспецифическое антитело может содержать:

(1) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: тяжелую цепь антитела против HER2,

возможно, пептидный линкер (первый пептидный линкер), и scFv антитела против 4-1ВВ; и

(2) второй полипептид, содержащий легкую цепь антитела против HER2,

где scFv антитела против 4-1ВВ может содержать в направлении от N-конца к С-концу:

вариабельную область легкой цепи антитела против 4-1ВВ, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и вариабельную область тяжелой цепи антитела против 4-1ВВ.

Альтернативно, биспецифическое антитело может содержать:

(1) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: scFv антитела против 4-1ВВ, возможно, пептидный линкер (первый пептидный линкер), и тяжелую цепь антитела против HER2; и

(2) второй полипептид, содержащий легкую цепь антитела против HER2, где scFv антитела против 4-1ВВ может содержать в направлении от N-конца к С-концу:

вариабельную область легкой цепи антитела против 4-1ВВ, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и вариабельную область тяжелой цепи антитела против 4-1ВВ. Альтернативно, биспецифическое антитело может содержать:

(1) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: тяжелую цепь антитела против HER2, возможно, пептидный линкер (первый пептидный линкер), и scFv антитела против 4-1ВВ; и

вариабельную область тяжелой цепи антитела против 4-1ВВ, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и вариабельную область легкой цепи антитела против 4-1ВВ. Альтернативно, биспецифическое антитело может содержать:

вариабельную область тяжелой цепи антитела против 4-1ВВ, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и вариабельную область легкой цепи антитела против 4-1ВВ.

Когда биспецифическое антитело содержит полноразмерное антитело против 4-1ВВ и scFv антитела против HER2, биспецифическое антитело может содержать:

(1) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: тяжелую цепь антитела против 4-1ВВ, возможно, пептидный линкер (первый пептидный линкер), и scFv антитела против HER2; и

(2) второй полипептид, содержащий легкую цепь антитела против 4-1ВВ, где scFv антитела против HER2 может содержать в направлении от N-конца к С-концу:

вариабельную область легкой цепи антитела против HER2, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и вариабельную область тяжелой цепи антитела против HER2.

(1) первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу: scFv антитела против HER2, возможно, пептидный линкер (первый пептидный линкер), и тяжелую цепь антитела против 4-1ВВ; и

вариабельную область легкой цепи антитела против HER2, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и вариабельную область тяжелой цепи антитела против HER2. Альтернативно, биспецифическое антитело может содержать:

вариабельную область тяжелой цепи антитела против HER2, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и

вариабельную область легкой цепи антитела против HER2.

вариабельную область тяжелой цепи антитела против HER2, возможно, пептидный линкер (второй пептидный линкер), и вариабельную область легкой цепи антитела против HER2.

Первый пептидный линкер и второй пептидный линкер могут независимо присутствовать или отсутствовать в биспецифическом антителе, быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

В другом воплощении как группировка, нацеленная на HER2, так и группировка, нацеленная на 4-1ВВ, содержащиеся в биспецифическом антителе, могут представлять собой полноразмерное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR тяжелой цепи, CDR легкой цепи или их комбинацию, которые связаны с друг с другом непосредственно или через пептидный линкер.

Учитывая, что каждое из антител может связываться как с 4-1ВВ (например, с 4-1ВВ человека), так и с HER2 (например, с HER2 человека), последовательности CDR или последовательности V_H (вариабельная область тяжелой цепи) и V_L (вариабельная область легкой цепи), как раскрыто здесь, можно «смешивать и сопоставлять» для создания других связывающих биспецифических молекул анти-HER2/анти-4-1BB.

Пептидный линкер

Для высокой чистоты антитела биспецифическое антитело может содержать пептидный линкер между тяжелой цепью и scFv в первом полипептиде (первый пептидный линкер) и/или между вариабельными областями тяжелой и легкой цепи в scFv (второй пептидный линкер).

Используемый здесь термин «пептидный линкер» может относиться к олигопептиду, включающему от 1 до 100 аминокислот, в частности от 2 до 50 аминокислот, каждая из которых может быть любой аминокислотой без каких-либо ограничений. Любой обычный пептидный линкер можно использовать с соответствующей модификацией или без нее для достижения конкретных целей. В конкретном воплощении пептидный линкер может содержать, например, остатки Gly, Asn и/или Ser, и/или содержать нейтральные аминокислоты, такие как Thr и/или Ala. Аминокислотные последовательности, подходящие для пептидного линкера, могут быть известны в релевантной области техники. Длина пептидного линкера может быть должным образом определена в таком пределе, что функции полипептида и/или scFv не будут затронуты. Например, пептидный линкер может быть образован путем включения в общей сложности от примерно 1 до примерно 100 аминокислот, от примерно 2 до примерно 50 аминокислот или от примерно 5 до примерно 25 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) аминокислот, каждая из которых независимо выбрана из группы, состоящей из Gly, Asn, Ser, Thr и Ala. В одном воплощении пептидный линкер может быть представлен как (G_mS_l)_n (m, l и n представляют собой количества «G», «S» и «(G_mS₁)», соответственно, и независимо выбраны из целых чисел от примерно 1 до примерно 10, в частности, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). В одном воплощении пептидный линкер может представлять собой аминокислоты (GGGGS)2, (GGGGS)3, (GGGGS)4 или (GS)9, но не ограничиваться ими.

Медицинское применение

Предложено медицинское применение биспецифического антитела для усиления иммуного ответа и/или лечения и/или предупреждения рака.

Более конкретно, в одном воплощении предложена фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело в качестве активного ингредиента. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может быть использована для усиления иммунного ответа и/или для лечения и/или предупреждения рака.

В еще одном воплощении предложена фармацевтическая композиция для лечения и/или предупреждения рака, содержащая биспецифическое антитело в качестве активного ингредиента.

В еще одном воплощении предложен способ лечения и/или предупреждения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества биспецифического антитела или фармацевтической композиции. Способ может дополнительно включать стадию идентификации субъекта, нуждающегося в лечении и/или предупреждении рака, до стадии введения.

В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела или фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения рака. В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения рака.

В некоторых воплощениях рак может характеризоваться экспрессией HER2 или сверхэкспрессией HER2 (в сравнении с нормой).

В еще одном воплощении предложена фармацевтическая композиция для усиления иммунного ответа, содержащая биспецифическое антитело в качестве активного ингредиента.

В еще одном воплощении предложен способ усиления иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества биспецифического антитела или фармацевтической композиции. Способ может дополнительно включать стадию идентификации субъекта, нуждающегося в усилении иммунного ответа, до стадии введения.

В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела или фармацевтической композиции для усиления иммунного ответа. В еще одном воплощении предложено применение биспецифического антитела в изготовлении лекарственного средства для усиления иммунного ответа.

В некоторых воплощениях биспецифическое антитело или фармацевтическая композиция могут усиливать иммунный ответ при условии присутствия HER2. Например, в способе усиления иммунного ответа субъект может иметь клетку, экспрессирующую HER2 или сверхэкспрессирующую HER2 (например, раковую клетку, экспрессирующую HER2 или сверхэкспрессирующую HER2).

Рак, который необходимо предупреждать и/или лечить с помощью биспецифического антитела или фармацевтической композиции, может быть ассоциирован с 4-1ВВ и/или HER2, особенно рак с экспрессией HER2 или сверхэкспрессией HER2. Рак может быть выбран из солидных видов раков и рака крови. Рак может представлять собой, без ограничения, один или более выбранных из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки, рака желудка, рака легкого (например плоскоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого), перитонеальной карциномы, рака кожи, плоскоклеточного рака, меланомы кожи или глазного яблока, рака прямой кишки, рака околоанального отверстия, рака пищевода, опухоли тонкой кишки, рака эндокринной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, гепатомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатоцеллюлярной аденомы, рака толстой кишки, рака эндометрия или рака матки, опухоли слюнной железы, рака почки, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака головы и шеи, рака головного мозга, рака желчевыводящих путей, рака желчного пузыря и тому подобного. Рак может быть первичным раком или метастатическим раком.

Используемый здесь термин «предупреждение и/или лечение рака» может относиться к гибели раковых клеток, ингибированию пролиферации раковых клеток, облегчению симптомов, ассоциированных с раком, ингибированию метастазирования рака и т.д.

Используемый здесь термин «усиление иммунного ответа» может относиться к активации сигнала 4-1ВВ, усилению любого иммунного ответа, ассоциированного с 4-1ВВ, такого как 4-1ВВ-индуцированная активация сигнала (например, 4-1ВВ-индуцированная активация сигнала NF-kB, увеличение высвобождения цитокина, уничтожение клетки-мишени иммунными клетками, такими как Т-клетки, и т.п., но не ограничиваясь ими). В некоторых воплощениях усиление иммунного ответа с помощью биспецифического антитела, предложенного в данном изобретении, может происходить в присутствии HER2.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент в дополнение к биспецифическому антителу в качестве активного ингредиента. Фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент могут быть любыми, выбранными из тех, которые обычно используют для приготовления препаратов антител. Например, фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой один или более носителей, выбранных из группы, состоящей из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, крахмала, аравийской камеди, фосфата кальция, альгинатов, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропа, метилцеллюлозы, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния и минерального масла, но не ограничиваются ими.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из смазывающего вещества, смачивающего агента, подсластителя, усилителя вкуса, эмульгатора, суспендирующего агента, консерванта и т.п.

Биспецифическое антитело или фармацевтическая композиция могут быть введены субъекту перорально или парентерально. Парентеральное введение может быть внутривенной инъекцией, подкожной инъекцией, мышечной инъекцией, внутрибрюшинной инъекцией, эндотелиальным введением, местным введением, интраназальным введением, внутрилегочным введением или ректальным введением. Поскольку пероральное введение приводит к перевариванию белков или пептидов, активный ингредиент в композициях для перорального введения должен быть покрыт или приготовлен с возможностью предотвращения переваривания в желудке. Кроме того, композиции можно вводить с помощью опционного устройства, которое позволяет доставлять активный ингредиент к клеткам-мишеням (например, к раковым клеткам).

Используемый здесь термин «фармацевтически эффективное количество» может относиться к количеству, при котором активный ингредиент, биспецифическое антитело, может оказывать фармацевтически значимое действие при предупреждении или лечении рака. Фармацевтически эффективное количество биспецифического антитела или подходящая дозировка фармацевтической композиции, обозначенная количеством биспецифического антитела, может быть назначена различными способами в зависимости от различных факторов, таких как возраст, масса тела, пол, патологические состояния, диеты, скорость выведения и/или реакция чувствительности пациента, типы составов, время введения, путь введения, способ введения и т.п.Например, фармацевтически эффективное количество биспецифического антитела или подходящая дозировка фармацевтической композиции может находиться в диапазоне от примерно 0,001 до примерно 1000 мг (количество биспецифического антитела)/кг (массы тела), примерно от 0,01 до примерно 100 мг/кг или от 0,1 до 50 мг/кг в сутки для взрослого человека.

Субъект, которому вводят биспецифическое антитело или фармацевтическую композицию, может быть субъектом, выбранным из млекопитающих, например, людей, обезьян, крыс, мышей, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, крупного рогатого скота, коров и т.д., или представлять собой клетку или ткань, полученные из них, но не ограничиваясь этим, и это может быть клетка, пораженная раком.

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом в виде стандартной или многодозовой лекарственной формы способом, который может быть легко осуществлен специалистом в соответствующей области техники. Лекарственная форма может представлять собой раствор в масле или водной среде, суспензию, сироп, эмульгирующий раствор, экстракт, порошок, гранулы, таблетку или капсулу и может дополнительно включать диспергирующий или стабилизирующий агент.

Полинуклеотид, рекомбинантный вектор и препарат антител

В одном воплощении предложен полинуклеотид, кодирующий биспецифическое антитело. Например, полипептид может содержать первый полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела против HER2, как описано здесь, и scFv антитела против 4-1ВВ, как описано здесь, которые связаны непосредственно или через пептидный линкер; и второй полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела против HER2. Альтернативно, полипептид может содержать первый полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела против 4-1ВВ, как описано здесь, и scFv антитела против HER2, как описано здесь, которые связаны непосредственно или через пептидный линкер; и второй полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела анти-4-1ВВ.

В еще одном воплощении предложен рекомбинантный вектор, содержащий указанный полинуклеотид. Например, рекомбинантный вектор может содержать первый полинуклеотид и второй полинуклеотид вместе в одном векторе или по отдельности в двух векторах. В еще одном воплощении предложена рекомбинантная клетка, содержащая первый полинуклеотид и второй полинуклеотид. Например, рекомбинантная клетка может представлять собой клетку, трансфицированную указанным рекомбинантным вектором.

В еще одном воплощении предложен способ получения биспецифического антитела, включающий экспрессию полинуклеотида, например первого полинуклеотида и второго полинуклеотида, в клетке. Стадия экспрессии полинуклеотида может быть осуществлена путем культивирования клетки, содержащей полинуклеотид (например, в рекомбинантном векторе), в условиях, обеспечивающих экспрессию полинуклеотида.

Способ может дополнительно включать выделение и/или очистку антитела против 4-1ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента из клеточной культуры после стадии экспрессии или культивирования.

Термин «вектор» относится к средствам для экспрессии гена-мишени в клетке-хозяине, как показано на примере плазмидного вектора, космидного вектора и вирусного вектора, такого как бактериофаговый вектор, аденовирусный вектор, ретровирусный вектор и вектор на основе аденоассоциированного вируса. Рекомбинантный вектор может быть сконструирован из плазмид, часто используемых в данной области техники (например, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX виды, pET виды и pUC19), фагов (например, λgt4λB, |L-Charon, λΔz1 и M13) или комбинированных вирусов (например, SV40, и т.д).

В рекомбинантном векторе полинуклеотид может быть функционально связан с промотором. Термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между интересующей нуклеотидной последовательностью и регуляторной последовательностью экспрессии (например, промоторной последовательностью). Будучи «функционально связанным», регуляторный элемент может контролировать транскрипцию и/или трансляцию интересующего нуклеотида.

Рекомбинантный вектор обычно может быть сконструирован как клонирующий вектор или экспрессионный вектор. Для рекомбинантных экспрессионных векторов можно использовать вектор, обычно доступный в соответствующей области техники для экспрессии чужеродного белка в растительных, животных или микробных клетках. Для конструирования рекомбинантных векторов можно использовать различные способы, хорошо известные в данной области техники.

Для использования в хозяевах, таких как прокариотические или эукариотические клетки, рекомбинантный вектор может быть сконструирован соответствующим образом. Например, когда вектор конструируют как экспрессионный вектор для использования в прокариотическом хозяине, вектор обычно включает сильный промотор для транскрипции (например, промотор pLκλ, промотор CMV, промотор trp, промотор , промотор tac, промотор Т7 и т.д.), сайт связывания рибосом для инициации трансляции и последовательности терминации транскрипции/трансляции. С другой стороны, экспрессионный вектор для использования в эукариотическом хозяине включает точку начала репликации, способную функционировать в эукариотической клетке, такую как точка начала репликации f1, точка начала репликации SV40, точка начала репликации рМВ1, точка начала репликации адено, точка начала репликации AAV и точка начала репликации BBV, но не ограничиваясь этим. Кроме того, экспрессионный вектор обычно включает промотор, имеющий происхождение из геномов клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса, промотор вируса осповакцины 7.5 K, промотор SV40, промотор цитомегаловируса и промотор tk HSV), а также последовательность полиаденилирования в качестве последовательности терминации транскрипции.

Рекомбинантную клетку можно получить путем введения рекомбинантного вектора в подходящую клетку-хозяина. При условии, что это обеспечивает последовательное клонирование и экспрессию рекомбинантного вектора стабильным образом, в настоящем изобретении можно использовать любую клетку-хозяина, известную в данной области техники. Примеры прокариотических клеток-хозяев, доступных для настоящего изобретения, могут быть выбраны из Е. coli, Bacillus spp.таких как Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis, и штаммов энтеробактерий, таких как Salmonella typhimurium, Serratia marcescens и различные виды Pseudomonas. Эукариотические клетки-хозяева, которые можно использовать для трансформации, могут быть выбраны, помимо прочего, из Saccharomyce cerevisiae, клеток насекомых и клеток животных, таких как Sp2/0, СНО (яичники китайского хомячка) K1, СНО DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3Т3, RIN и MDCK.

Полинуклеотид или рекомбинантный вектор, несущий его, можно вводить (трансфицировать) в клетку-хозяина с использованием метода, хорошо известного в соответствующей области техники. Например, эту трансфекцию можно проводить с использованием CaCl2 или метода электропорации, когда клетка-хозяин является прокариотической. Для эукариотических клеток-хозяев генетическая интродукция может быть достигнута с использованием, без ограничения, микроинъекции, преципитации фосфатом кальция, электропорации, липосом-опосредованной трансфекции или бомбардировки частицами.

Для отбора трансформированной клетки-хозяина можно воспользоваться преимуществом фенотипа, связанного с маркером селекции, в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Например, когда маркером селекции является ген, придающий устойчивость к определенному антибиотику, клетки-хозяева можно выращивать в присутствии данного антибиотика в среде для отбора интересующего трансформанта.

В еще одном воплощении предложен способ получения биспецифического антитела, включающий стадию экспрессии полинуклеотида или рекомбинантного вектора в клетке-хозяине. В одном воплощении способ получения может включать культивирование рекомбинантной клетки, содержащей полинуклеотид или рекомбинантный вектор, и, возможно, выделение и/или очистку антитела из культуральной среды.

Полезные эффекты

Описание графических материалов

На Фиг. 1а представлен график, показывающий активности связывания антигена (4-1ВВ человека), проявляемые антителами против 4-1ВВ, измеренные посредством ELISA.

На Фиг. 1b представлен график, показывающий активности связывания клеток, проявляемые антителами против 4-1ВВ, измеренные посредством ELISA.

На Фиг. 2а представлен график, показывающий активности связывания антигена (HER2 человека), проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB, измеренные посредством ELISA.

На Фиг. 2b представлен график, показывающий активности связывания антигена (HER2 человека), проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB, измеренные посредством ELISA.

На Фиг. 3а представлен график, показывающий активности связывания антигена (4-1ВВ человека), проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB, измеренные посредством ELISA.

На Фиг. 3b представлен график, показывающий активности связывания антигена (4-1ВВ человека), проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ, измеренные посредством ELISA.

На Фиг. 4а представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в клеточной линии NCI-N87 (клетки с высокой экспрессией HER2).

На Фиг. 4b представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в клеточной линии MDA-MB-231 (HER2-негативные клетки).

На Фиг. 5а представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в HER2-экспрессирующей клеточной линии NCI-N87.

На Фиг. 5b представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в HER2-экспрессирующей клеточной линии Calu-3.

На Фиг. 5 с представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1 ВВ в HER2-экспрессирующей клеточной линии НСС1954.

На Фиг. 5d представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в HER2-экспрессирующей клеточной линии ЛМТ1.

На Фиг. 5е представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в HER2-экспрессирующей клеточной линии ZR-75-1.

На Фиг. 5f представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB в не экспрессирующей HER2 клеточной линии А431.

На Фиг. 5g представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB в не экспрессирующей HER2 клеточной линии MCF-7.

На Фиг. 5h представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB в не экспрессирующей HER2 клеточной линии MDA-MB231.

На Фиг. 5i представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в не экспрессирующей HER2 клеточной линии ВхРС-3.

На Фиг. 6а представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1ВВ в HER2-экспрессирующей клеточной линии Calu-3.

На Фиг. 6b представлен график, показывающий уровень активации сигнала 4-1ВВ биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB в HER2-экспрессирующей клеточной линии НСС1954.

На Фиг. 7 представлен график, показывающий корреляцию между HER2 sABC и 4-1ВВ-индуцированной передачей сигнала NF-kB биспецифическим антителом анти-HER2/анти-4-lBB в разных клеточных линиях.

На Фиг. 8a-8d представлены графики, показывающие уровень IFN-гамма, высвобождаемого HER2-экспрессирующими клетками НСС1954, обработанными биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB.

На Фиг. 9a-9d представлены графики, показывающие % выживаемости HER2-экспрессирующих клеток НСС1954, обработанных биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB.

На Фиг. 10 представлен график, показывающий in vivo противоопухолевые активности, проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB, у привитых hPBMC мышей, несущих НСС1954.

На Фиг. 11 представлен график, показывающий число маркер-положительных клеток лимфоцитов у привитых hPBMC мышей, несущих НСС1954, которых лечили биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB.

На Фиг. 12 представлен график, показывающий in vivo противоопухолевые активности, проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB, у мышей с нокаутом 4-1ВВ, несущих опухоль HER2/MC38 человека.

На Фиг. 13 представлен график, показывающий in vivo противоопухолевые активности, проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB, у мышей, которых лечили биспецифическим антителом анти-HER2/анти-4-1BB и повторно заражали опухолевыми клетками HER2/MC38 человека и опухолевыми клетками В16 F10.

На Фиг. 14 представлен график, показывающий эффекты антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), проявляемые биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB.

На Фиг. 15а представлен график, показывающий результаты FcγRIIb-зависимого биоанализа 4-1ВВ для биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1BB.

На Фиг. 15b представлен график, показывающий результаты FcγRIIb-независимого биоанализа 4-1ВВ для биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1BB.

Осуществление изобретения

Далее настоящее изобретение будет подробно описано на примерах. Следующие примеры предназначены только для иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения изобретения.

Пример 1. Антитела против 4-1ВВ

1.1 Получение полноразмерных человеческих моноклинальных антител против 4-1ВВ

Полноразмерные человеческие моноклональные антитела против 4-1ВВ в форме полноразмерного IgG подвергали скринингу с помощью фаговой библиотеки путем пэннинга иммунопробирок против 4-1ВВ. Для пэннинга фаговой библиотеки (полученной от KBio Health и CUREBIO) против молекул-мишеней в общей сложности было проведено четыре раунда пэннинга с использованием иммунопробирок с покрытием 4-1ВВ (номер доступа NCBI NP_001552.2).

Бактериальные колонии после 3 раундов пэннинга выращивали в SB-карбенициллине (Biomatik, №по каталогу A2311-5g) в 96-луночном планшете с глубокими лунками до мутности, после чего в каждую лунку добавляли 10¹¹ БОЕ (бляшкообразующих единиц) хелперного фага VCSM13 (K-Bio Health). После инкубации в течение 1 ч при 37°С при осторожном встряхивании (80 об/мин) добавляли 70 мкг/мл канамицина и клетки культивировали в течение ночи при 30°С с встряхиванием при 200 об/мин.

На следующие сутки планшеты центрифугировали и супернатанты, содержащие фаги, добавляли в планшеты для ELISA, покрытые антигеном 4-1ВВ, блокированные 3% (об./об.) BSA (бычий сывороточный альбумин) в PBST (забуференный фосфатом солевой раствор с Tween 20). После 1 ч инкубации при комнатной температуре планшеты трижды промывали PBST и добавляли антитело против М13 (Sino Biological, № по каталогу 11973-ММ05). Планшеты инкубировали в течение 1 ч, трижды промывали PBST и измеряли активность связывания с использованием тетраметилбензидина (ТМВ).

4-1ВВ-специфические связывающие вещества амплифицировали для секвенирования плазмидной ДНК. Последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (VL и VH) анализировали для идентификации уникальных последовательностей и определения разнообразия последовательностей, как показано в Таблицах с 6 по 13 (подчеркнуты: CDR1, CDR2 и CDR3, по порядку). Антитело против 4-1ВВ, обозначенное как BMUR (урелумаб BMS, патент США №7288638), использовано для сравнения агонистической активности в следующих примерах.

1.2. Получение scFv антител против 4-1ВВ

scFv антител против 4-1ВВ со структурой (N')-VL-линкер-VH-(C') получали с использованием вариабельных областей полноразмерных человеческих моноклональных антител против 4-1ВВ, показанных в Таблицах с 6 по 13 Примера 1.1, где аминокислотный остаток «G» в положении 44 вариабельной области тяжелой цепи заменен на «С», и аминокислотный остаток «G» в положении 103 вариабельной области легкой цепи заменен на «С». Такая замена аминокислоты с «G» на «С» в scFv может способствовать увеличению стабильности биспецифических антител, содержащих scFv в качестве одной специфичной к мишени группировки. Аминокислотные последовательности полученных scFv антитела против 4-1 ВВ проиллюстрированы в следующих Таблицах с 14 по 19, в то время как специалисты в данной области техники могут применять изменения или модификации аминокислотных последовательностей в следующих воплощениях для достижения конкретных целей, включая применение различных типов пептидных линкеров, таких как (GGGGS)2, (GGGGS)3, (GGGGS)4 или (GS)9.

1.3. Антигенсвязывающая способность антител против 4-1ВВ (форма полноразмерного IgG) к 4-1ВВ человека

(1) Активность связывания антигена, измеренная с помощью ELISA

Для оценки антигенсвязывающей активности антитела-кандидаты, полученные в Примере 1.1, подвергали тесту ELISA. Вкратце, планшеты для микротитрования покрывали белком 4-1BB-Fc человека (Sino Biological) в концентрации 0,1 мкг/мл в PBS, 100 мкл/лунку при 4°С в течение ночи, а затем блокировали 100 мкл/лунку 5% (об./об). BSA. В каждую лунку вносили пятикратные разведения гуманизированных антител (1А10, 1А12 и АВ41), начиная с 10 мкг/мл, и инкубировали в течение 1-2 часов при комнатной температуре (КТ). Планшеты промывали PBS/Tween и затем инкубировали с козьим антителом против IgG человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (Thermo) в течение 1 часа при КТ. После промывки планшеты проявляли субстратом ТМВ и анализировали на спектрофотометре при оптической плотности (OD) 450-630 нм.

Полученные результаты показаны на Фиг. 1а. Как показано на Фиг. 1а, все протестированные антитела против 4-1ВВ показали способность связывания с 4-1ВВ.

(2) Активность связывания клеток, измеренная с помощью FACS

Для оценки активности связывания клеток антитела-кандидаты анализировали на их связывание с экспрессированным 4-1ВВ млекопитающих с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Вкратце, клеточную линию GloResponse™ NFκB-luc2/4-1BB Jurkat (Promega; 3×10⁵ клеток), которая представляет собой клетки Jurkat, экспрессирующие 4-1ВВ на своей поверхности, инкубировали с антителами (1А10 и 1А12; каждое по 10 мкг/мл). После промывки буфером FACS (1% (об./об.) BSA в PBS) в каждую лунку добавляли FITC-антитело против IgG человека (Sigma, F9512, концентрация: 2,0 мг/мл) и инкубировали при 4°С в течение 1 часа. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) FITC оценивали с помощью FACSCalibur (BD Biosciences).

Полученные результаты показаны на Фиг. 1b. Как показано на Фиг. 1b, все протестированные антитела против 4-1ВВ демонстрируют способность связываться с 4-1ВВ, экспрессируемым на клеточной поверхности, и могут эффективно связываться с 4-1ВВ, экспрессируемым на клетках млекопитающих.

Пример 2. Получение антител против HER2

В качестве группировки, нацеленной на HER2, для биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1BB использовали трастузумаб (Genentech; далее обозначен как "HER2(WT)", номер доступа в DrugBank DB00072; моноклональное антитело IgG1 Kappa человека) или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как scFv.

Последовательности HER2(WT) приведены в следующей Таблице 20.

Константная область антитела против HER2, содержащаяся в биспецифическом антителе, может быть модифицирована путем введения более чем одной мутации или изменения в IgG1 человека, причем одно из репрезентативных воплощений HER2(NA или N297A) проиллюстрировано в Таблице 20 ниже:

Пример 3. Получение биспецифических антител анти-НЕК2/анти-4-1ВВ

Различные биспецифические антитела-кандидаты анти-HER2/анти-4-1ВВ были приготовлены в формате полноразмерного IgG(антитело против HER2)-scFv(антитело против 4-1ВВ) или в виде полноразмерного IgC(антитело против 4-1BB)-scFv(антитело против HER2). В этом примере клоны анти-HER2 IgG и 4-1ВВ scFv, полученные в Примере 2 и Примере 1.2, соответственно, были выбраны в качестве примера для получения биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1ВВ в форме слияния IgG-scFv (фрагмент scFv антитела одного антигена подвергнут слиянию с С-концом IgG другого антигена). В случае присутствия HER2 в полноразмерной части IgG использовали IgG1 с ADCC-редуцированным мутантным остовом (мутация N297A; Cancer Cell, vol. 19, issue 1, pp.101-113 и т.д.), а в случае присутствия 4-1ВВ в полноразмерной части IgG использовали IgG4.

Сегмент ДНК 1, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела IgG биспецифического антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ, встраивали в pcDNA 3.4 (Invitrogen, А14697; плазмида 1), а сегмент ДНК 2, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела IgG биспецифического антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ, встраивали в pcDNA 3.4 (Invitrogen, А14697; плазмида 2). После этого сегмент ДНК 3, кодирующий scFv, подвергали слиянию с частью сегмента ДНК 1, соответствующей С-концу Fc-области антитела IgG, встроенного в плазмиду 1, с использованием сегмента ДНК 4, кодирующего линкерный пептид длиной 15 аминокислот, состоящих из (GGGGS)3, или с использованием сегмента ДНК 5, кодирующего линкерный пептид длиной 18 аминокислот, состоящих из (GS)9, для конструирования векторов для экспрессии биспецифических антител. Кроме того, для стабилизации scFv, как описано в Примере 1.2, была применена дополнительная модификация для создания дисульфидного мостика слияния VL103-VH44 (VL103: VL, имеющая G→C мутацию в положении 103; VH 44: VH, имеющая G→C мутацию в положении 44) с С-концом легкой цепи и С-концом тяжелой цепи, соответственно.

Для полученных биспецифических антител последовательности тяжелых цепей, легких цепей, scFvs и ДНК-сегментов, использованные при получении нескольких репрезентативных биспецифических антител, проиллюстрированы в Таблицах с 21 по 29. Одна или более точечных мутаций в аминокислотной последовательности могут быть использованы в антителах, представленных ниже, с целью повышения стабильности и активности, снижения иммуногенности и т.д.

Пример 4. Тестирование аффинности связывания биспецифических антител (BsAbs)

4.1. Связывание с HER2 человека

Аффинность связывания биспецифических антител с HER2 определяли методом ELISA со ссылкой на Пример 1.3(1). Вкратце, 96-луночные планшеты для микротитрования (Nunc-Immuno Plates, NUNC) покрывали белком HER2-His человека (Sino Biological, 10004-Н08Н) в концентрации 1 мкг/мл в PBS, 100 мкл/лунку при 4°С в течение ночи, а затем блокировали с использованием блокирующего буфера (200 мкл/лунку 1% (об./об) BSA (бычий сывороточный альбумин) (Gibco, 30063572)) в PBS) в течение 2 часов при 37°С. В каждую лунку вносили серийные разведения (начиная с 0,1 мкМ) биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1ВВ, полученных в Примере 3, и антитела против HER2 (HER2(NA)) в качестве контроля и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали PBS/0,05% Tween20 и затем инкубировали с Fab-антителом, конъюгированным с HRP (Pierce, 31414) в течение 1 часа при 37°С. После промывки планшеты проявляли субстратом ТМВ (тетраметилбензидин, Sigma, Т0440) и анализировали на спектрофотометре при OD 450-650 нм.

Полученные результаты показаны на Фиг. 2а и 2b. Как показано на Фиг. 2а и 2b, все протестированные биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1 ВВ могли связываться с белками HER2 человека с высокой аффинностью, подобно контрольному антителу против HER2 (NA).

4.2. Связывание с 4-1ВВ человека

Аффинность связывания биспецифических антител с 4-1ВВ определяли методом ELISA со ссылкой на Пример 1.3(1). Вкратце, 96-луночные планшеты для микротитрования (Nunc-Immuno Plates, NUNC) покрывали белком 4-1BB-His человека (Sino Biological, 10041-Н08Н) в концентрации 1 мкг/мл в PBS, 100 мкл/лунку при 4°С в течение ночи, а затем блокировали с использованием блокирующего буфера (200 мкл/лунку 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) (Gibco, 30063572)) в PBS) в течение 2 часов при 37°С. В каждую лунку вносили серийные разведения (начиная с 0,1 мкМ) биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1BB, полученных в Примере 3, и антитела против HER2 (HER2(NA)) в качестве контроля и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали PBS/0,05% Tween20 и затем инкубировали с Fab-антителом, конъюгированным с HRP (Pierce, 31414) в течение 1 часа при 37°С. После промывки планшеты проявляли субстратом ТМВ и анализировали на спектрофотометре при OD 450-650 нм.

Полученные результаты показаны на Фиг. 3а и 3b. Как показано на Фиг. 3а и 3b, все протестированные биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB могли связываться с белком 4-1ВВ человека с высокой аффинностью, в то время как антитело против HER2 не связывается с белком 4-1ВВ человека.

Результаты из Фиг. 2а, 2b, 3а и 3 и выражены в количественной форме и представлены в следующей Таблице 30:

Как показано в Таблице 30, все протестированные биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ могут связываться как с белком HER2 человека, так и с белком 4-1ВВ человека с высокой аффинностью.

4.3. Связывание с различными клетками, экспрессирующими на поверхности HER2 человека

Аффинности связывания биспецифических антител с различными клетками, экспрессирующими HER2 на своей поверхности, определяли с помощью анализа FACS со ссылкой на Пример 1.3(2).

Использовали различные линии опухолевых клеток, как перечислено в Таблице 31. После отделения каждой клеточной линии и промывки в PBS количество клеток подсчитывали и устанавливали как 2×10⁵ клеток/200 мкл буфера FACS, а затем обрабатывали антителами против HER2 или биспецифическими антителами анти-HER2/анти-4-1BB в концентрации 10 мкг/мл, и их подвергали взаимодействию при 4°С в течение 1 часа. По окончании взаимодействия клетки промывали буфером FACS, а затем FITC-меченое антитело, специфичное к константной области (Fc) (конъюгат FITC козьего IgG против человека, Fc-специфичное, Sigma, F9512, концентрация: 2,0 мг/мл) суспендировали в 2 мкл/2×10⁵ клеток/100 мкл FACS-буфера и подвергали взаимодействию при 4°С в течение 1 часа. По окончании взаимодействия клетки промывали буфером FACS, анализировали на приборе FACSCalibur. Группу отрицательного контроля обрабатывали только FITC-меченым антителом, специфичным к константной области (Fc). Чтобы сравнить степени экспрессии HER2 среди линий раковых клеток, значение результата для сдвига пика в экспериментальной группе делили на результат для сдвига пика в группе отрицательного контроля (отношение средней интенсивности флуоресценции = MFI:MFI тестируемого антитела/MFI 2-го Ab).

Полученные результаты представлены в следующей Таблице 31:

Как показано в Таблице 31, все протестированные биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ могут связываться с поверхностью клеток, экспрессирующих белки HER2 человека.

Пример 5. Аффинность связывания BsAbs с 4-1ВВ (SPR)

В данном эксперименте SPR биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB подвергали индивидуальной иммобилизации на проточных кюветах 2, 3 и 4, сохраняя проточную кювету 1 в качестве эталона, на сенсорном чипе Biocore® Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare, BR100530), на котором было иммобилизовано антитело против Fab человека (GE Healthcare, 28958325) путем аминного сочетания. Рекомбинантный белок 4-1ВВ человека (ACROBiosystems, 41В-Н5227) пропускали через этот чип в концентрациях 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 и 0,78 нМ при 30 мкл/мин в течение 300 секунд, с последующей фазой диссоциации продолжительностью 400 секунд. Регенерацию проводили с использованием 10 мМ глицин-HCl (рН 2,0) (GE Healthcare, BR100355).

Полученные результаты представлены в следующей Таблице 32:

Как показано в Таблице 32, протестированные биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB показали высокую аффинность связывания с 4-1ВВ. Пример 6. Активация сигнала 4-1ВВ

6.1. BsAbs в сравнении с моноспецифическими антителами

В этом примере для измерения активации сигнала 4-1ВВ в качестве эффекторной клетки использовали клеточную линию GloResponse™ NFκB-luc2/4-1BB Jurkat (Promega), генетически модифицированную для стабильной экспрессии 4-1ВВ человека и люциферазы по ходу транскрипции ответного элемента, и раковые клетки, экспрессирующие или не экспрессирующие HER2, использовали в качестве клеток-мишеней. Вкратце, в качестве клеток-мишеней NCI-N87 (экспрессирующие HER2; 2,5×10⁴ клеток) или MDA-MB-231 (не экспрессирующие HER2; 2,5×10⁴ клеток) помещали в 96-луночный планшет для анализа и культивировали в течение ночи. В день анализа в планшет добавляли тестируемые биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ (Пример 3) и эффекторные клетки Jurkat (2,5×10⁴ клеток). После инкубации в течение 6 часов добавляли реагент Bio-Glo™ (Promega) и измеряли люминесценцию с помощью устройства для считывания микропланшетов.

Полученные результаты показаны в прилагаемых Фиг. 4а (клеточная линия NCI-N87) и 4b (клеточная линия MDA-MB-231). На Фиг. 4а и 4b, BMUR (BMS's Urelumab, патент США №7288638) означает антитело против 4-1ВВ, используемое для сравнения агонистической активности. Как показано на Фиг. 4а и 4b, биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB приводят к сильной активации сигнала 4-1ВВ только при совместном культивировании с клетками с высокой экспрессией HER2. Поперечно-сшитые с Fc моноклональные антитела против 4-1ВВ показали минимальную активность.

6.2. Активация 4-1ВВ в различных HER2-экспрессирующих клетках (I)

В этом примере для измерения активации сигнала 4-1ВВ в качестве эффекторной клетки использовали клеточную линию GloResponse™ NFκB-luc2/4-1BB Jurkat (Promega), генетически модифицированную для стабильной экспрессии 4-1ВВ человека и люциферазы по ходу транскрипции ответного элемента, и раковые клетки, экспрессирующие или не экспрессирующие HER2, использовали в качестве клеток-мишеней. Вкратце, в качестве клеток-мишеней HER2-экспрессирующие (NCI-N87, Calu-3, НСС1954, JIMT1, ZR-75-1) или не экспрессирующие HER2 (MDA-MB231, MCF-7, А431, ВхРС-3) раковые клетки (каждая по 2,5×10⁴ клеток/лунка) помещали в 96-луночный планшет для анализа и культивировали в течение ночи. В день анализа в планшет добавляли тестируемые биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB (Пример 3; 15 нМ, 4-кратное разведение; или 20 нМ, 5-кратное разведение; или 100 нМ, 5-кратное разведение) и эффекторные клетки Jurkat (2,5×10⁴ клеток/лунка). После 6 часов инкубации добавляли реагент Bio-Glo™ и измеряли люминесценцию с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

Полученные результаты показаны на Фиг. 5a-5i. Как показано на Фиг. 5a-5i, биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB приводят к сильной активации сигнала 4-1ВВ только при совместном культивировании с HER2-экспрессирцующими клетками.

6.3. Активация 4-1ВВ в различных HER2-экспрессирующих клетках (II)

В этом примере для измерения активации сигнала 4-1ВВ в качестве эффекторной клетки использовали клеточную линию GloResponse™ NFκB-luc2/4-1BB Jurkat (Promega), генетически модифицированную для стабильной экспрессии 4-1ВВ человека и люциферазы по ходу транскрипции ответного элемента. Вкратце, HER2-экспрессирующие клетки-мишени (Calu-3 или НСС1954; 2,5×10⁴ клеток/лунка) помещали в 96-луночный планшет для анализа и культивировали в течение ночи. В день анализа в планшет добавляли тестируемые биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ (Пример 3; 20 нМ, 5-кратное разведение; или 133 нМ, 6-кратное разведение) и эффекторные клетки Jurkat (2,5×10⁴ клеток/лунка). После 6 часов инкубации добавляли реагент Bio-Glo™ и измеряли люминесценцию с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

Полученные результаты показаны на Фиг. 6а и 6b. Как показано на Фиг. 6а и 6b, все протестированные биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB приводят к сильной активации сигнала 4-1ВВ только при совместном культивировании с клетками с высокой экспрессией HER2.

6.4. Количественная оценка HER2

Уровень экспрессии HER2 на клеточной поверхности количественно определяли на различных линиях раковых клеток с использованием набора для количественной оценки QIFIKIT (Dako) в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, клетки окрашивали немеченым мышиным моноклональным антителом против HER2 (R&D systems) или очищенным изотопическим контрольным мышиным IgG2b (R&D systems) в насыщающей концентрации. После промывки окрашенные клетки и калибровочные шарики из набора одновременно метили одним и тем же FITC-конъюгированным козьим антимышиным вторичным антителом IgG из набора. Меченые клетки и калибровочные шарики анализировали на проточном цитометре. Линейную регрессию выполняли с использованием значений MFI от калибровочных шариков. ABC (антителосвязывающая способность) экстраполировали из этой линии регрессии и sABC (специфическая ABC) определяли путем вычитания ABC изотипического контрольного антитела из ABC антитела против HER2.

Полученные результаты представлены в Таблице 33.

Как показано в Таблице 33, были определены sABC для 9 раковых клеточных линий.

6.5. Корреляция между HER2 sABC и 4-1ВВ-индуцированной передачей сигнала NF-kB

Уровни HER2, измеренные в Примере 6.4, нормализовали по уровням HER2, экспрессированным НСС1954. Уровни активации 4-1ВВ биспецифическим антителом определяли как максимальный уровень кратности изменения по сравнению с контролем в люциферазном репортерном анализе 4-1ВВ NF-kB в Примере 6.2. Общая площадь указывает на доверительный интервал для линейной подгонки.

Полученные результаты показаны на Фиг. 7. Как показано на Фиг. 7, активация 4-1ВВ биспецифическим антителом анти-HER2/анти-4-1ВВ показала строгую корреляцию с экспрессией HER2 на клеточной поверхности.

Пример 7. Т-клеточный иммунный ответ

7.1. Эффект в отношении высвобождения цитокинов

Для тестирования способности биспецифических антител стимулировать ответ мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) измеряли концентрацию IFN-гамма в супернатанте. РВМС человека совместно культивировали с раковыми клетками НСС1954, экспрессирующими HER2, в присутствии антитела против CD3 человека (BioLegend, 5 мкг/мл) и биспецифических антител (Пример 3; 3 мкг/мл, 4-кратное разведение), подлежащих тестированию. После культивирования во влажной камере с 5% СО₂ при 37°С в течение 72 часов измеряли концентрацию IFN-гамма в супернатанте с использованием набора Human IFN-gamma Quantikine Kit (R&D system, SIF50).

Полученные результаты показаны на Фиг. 8a-8d. Как показано на Фиг. 8a-8d, все протестированные биспецифические антитела вызывали высвобождение цитокина в большей степени по сравнению с комбинацией каждого моноклонального антитела в присутствии клеток с высокой экспрессией HER2.

7.2. Эффект в отношении роста клетки-мишени

Для тестирования способности биспецифических антител к ответу стимулированных РВМС человека использовали анализ лизиса клеток-мишеней. РВМС человека совместно культивировали с раковыми клетками НСС1954, экспрессирующими HER2, в присутствии антитела против CD3 человека (BioLegend, 5 мкг/мл) и биспецифических антител (Пример 3; 3 мкг/мл, 4-кратное разведение), подлежащих тестированию. После культивирования во влажной камере с 5% СО₂ при 37°С в течение 72 часов измеряли выживаемость НСС1954 с использованием набора для подсчета клеток kit-8 (Dojindo, CK04-20).

Полученные результаты показаны на Фиг. 9а-9d. Как показано на Фиг. 9a-9d, все протестированные биспецифические антитела продемонстрировали превосходящую активность в отношении гибели раковых клеток в сравнении с комбинацией каждого моноспецифического антитела в присутствии клеток с высокой экспрессией HER2.

Пример 8. In vivo противоопухолевая эффективность у привитых hPBMC мышей, несущих НСС1954

8.1 Противоопухолевая активность

Для тестирования in vivo противоопухолевой эффективности биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1ВВ использовали РВМС-гуманизированных мышей NSG. Мышам NSG в возрасте 7 недель внутривенно вводили 1×10⁷ клеток РВМС человека, и раковые клетки НСС1954 (1×10⁷ клеток/мышь в растворе PBS:Matrigel 1:1) инокулировали в правый бок мышей. Гуманизированных мышей, несущих НСС1954, распределяли в каждую тестируемую группу (n=12/группа) на 2-ые сутки после имплантации опухоли. Мышам внутривенно вводили контрольное антитело человека IgG1, антитело против 4-1ВВ или биспецифическое антитело анти-HER2/анти-4-1BB два раза в неделю в дозах 10 мг/кг или 7,5 мг/кг в течение 4 недель. Антитела инъецировали два раза в неделю и размер опухоли измеряли цифровым штангенциркулем.

Полученные результаты показаны на Фиг. 10. Как показано на Фиг. 10, все протестированные биспецифические антитела показали превосходящую противоопухолевую активность по сравнению с эталонным антителом против 4-1ВВ (урелумаб, BMS), а также контрольным антителом.

8.2. Анализ опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL)

Для оценки TIL, фиксированные формалином и залитые парафином срезы опухолевой ткани от привитых hPBMC мышей, несущих НСС1954, подвергали иммуноокрашиванию антителом против hCD45 (маркер лейкоцитов человека, Cell Signaling Technology), антителом против hCD4 (маркер хелперных Т-лимфоцитов человека, Cell Signaling Technology), антителом против hCD8 (маркер цитотоксических Т-лимфоцитов человека, Cell Signaling Technology) и антителом против hCD16 (маркер естественных клеток-киллеров человека, Cell Signaling Technology). Иммуногистохимический метод выполняли с использованием авидин-биотинового набора для обнаружения (Vector Laboratories) для измерения каждой маркер-положительной клетки. Вкратце, срезы опухолевой ткани, фиксированные формалином и залитые парафином, депарафинизировали и регидратировали. Выделение антигена из регидратированных срезов ткани проводили путем помещения срезов в ЭДТА-буфер (рН 9,0). После промывки фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубации с блокирующим раствором в течение 30 мин срезы инкубировали с первичными антителами при 4°С в течение ночи. Для иммуноокрашивания использовали набор Vectastain Elite ABC (Vector Lab) и протокол, предоставленный производителем. Затем срезы докрашивали гематоксилином, дегидратировали, используя спирты и ксилол, и заливали Permount.

Полученный результат показан на Фиг. 11. Как показано на Фиг. 11, биспецифические антитела Her2x41-ВВ эффективно усиливали инфильтрацию иммунных клеток, включая CD45+ клетки, CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки и NK-клетки, в опухолевые ткани по сравнению с BMUR (урелумаб).

Пример 9. In vivo противоопухолевая эффективность у мышей с нокаутом 4-1ВВ

9.1. Противоопухолевая активность

In vivo противоопухолевую эффективность биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1BB оценивали на мышах с нокаутом 4-1ВВ, несущих опухоль HER2/MC38 человека (Biocytogen). Мышей с опухолью распределяли в каждую тестируемую группу (n=5/группа) на 4-ые сутки после имплантации опухоли в зависимости от объема опухоли (приблизительно 80 мм³). Антитело IgG1 человека, трастузумаб (антитело против HER2) и биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ (HER2(WT)x1A10 М12, HER2(NA)x1A10 М12) вводили мышам внутрибрюшинно два раза в неделю в дозе 10 мг/кг или 7,5 мкг/кг в течение 4 недель. Размер опухоли измеряли цифровым штангенциркулем.

Полученные результаты показаны на Фиг. 12. Как показано на Фиг. 12, биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1ВВ продемонстрировали превосходящую противоопухолевую эффективность по сравнению с трастузумабом в отношении опухоли человека HER2/MC38. В частности, все мыши, которых лечили HER2(WT)x1A10 M12, вылечились.

9.2. Оценка эффекта в отношении опухолеспецифических Т-клеток памяти Мышей, вылеченных с использованием HER2(WT)x1A10 М12, повторно заражали опухолевыми клетками человека HER2/MC38 (Biocytogen) и опухолевыми клетками В16 F10 (АТСС) в обе боковые поверхности на 63-и сутки после инъекции опухоли. Мышам не вводили какое-либо лекарственное средство в течение периода исследования с повторным заражением. Размер опухоли измеряли цифровым штангенциркулем.

Полученные результаты показаны на Фиг. 13. Как показано на Фиг. 13, никакого развития опухоли HER2/MC38 человека не наблюдалось, в то время как опухоль В16 F10 росла у мышей, которых лечили HER2(WT)x1A10 M12.

Пример 10. Антителозависимая клеточная цитотоксическая (ADCC) активность (NA структура против WT)

10.1. ADCC, опосредованная NK-клетками

В этом примере в качестве эффекторных клеток использовали CD56+ NK-клетки, полученные из периферической крови человека, а в качестве клеток-мишеней использовали клетки НСС1954, меченные CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific), экспрессирующие HER2. Клетки совместно культивировали при соотношении эффектор:мишень 5:1 с 50 нМ биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1BB (Пример 3) при 37°С.Через 4 часа клетки окрашивали Fixable Viability Dye (eBioscience™) и затем долю погибших клеток-мишеней анализировали с помощью проточной цитометрии.

Полученные результаты показаны на Фиг. 14. Как показано на Фиг. 14, тип IgG1 (WT) биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1BB показал выраженный ADCC-эффект, опосредованный NK-клетками.

10.2. Активация сигнала 4-1ВВ, зависимая от вовлечения FcγRIIb

В этом примере клетки СНО-K1, экспрессирующие FcγRIIb (Promega), помещали в 96-луночный планшет для анализа и культивировали в течение ночи. В день анализа клетки Jurkat/4-1BB (Promega) помещали в 96-луночный планшет.Клетки инкубировали с титрованием биспецифических антител анти-HER2/анти-4-1ВВ в присутствии (FcγRIIb-зависимых) или в отсутствие (FcγRIIb-независимых) клеток СНО-K1, экспрессирующих FcγRIIb (Promega). Через 6 часов индукции добавляли реагент для анализа люциферазы Bio-Glo™ и определяли люминесценцию с помощью люминометра SpectraMax L (Molecular Devices). Анализ четырехпараметрической логистической кривой был выполнен с помощью программного обеспечения GraphPad Prism®.

Полученные результаты представлены в следующих Таблицах 34 (FcγRIIb-зависимый биоанализ 4-1ВВ) и 35 (FcγRIIb-независимый биоанализ 4-1ВВ) и на Фиг. 15а (FcγRIIb-зависимый биоанализ 4-1ВВ) и 15b (FcγRIIb-независимый биоанализ 4-1ВВ).

Как показано в Таблицах 34 и 35 и на Фиг. 15а и 15b, группа, получавшая лечение урелумабом, показала 13,5-кратную разницу в максимальном RLU и 2,2-кратную разницу в ЕС₅₀ в зависимости от присутствия клеток FcγRIIb СНО-K1. Четыре биспецифических антитела анти-HER2/анти-4-1BB показали очень низкий RLU по сравнению с урелумабом независимо от присутствия или отсутствия клеток FcγRIIb СНО-K1. Эти данные показали, что все протестированные биспецифические антитела анти-HER2/анти-4-1BB обладают потенциальными преимуществами по сравнению с урелумабом, который в клинических исследованиях проявлял тяжелую токсичность (NCT00309023, NCT00612664, NCT014712210).

Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитируемые в данном документе, включены в данное описание в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и специально указана для включения в качестве ссылки и изложена здесь полностью.

Использование терминов в единственном числе, а также терминов «по меньшей мере один» и «один или более» и аналогичных ссылок в контексте описания изобретения (особенно в контексте прилагаемой формулы изобретения) следует истолковывать как охватывающие как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или явно не противоречит контексту. Использование термина «по меньшей мере один» (или «один или более»), за которым следует список из одного или более элементов (например, «по меньшей мере один из А и В»), следует понимать как означающий один элемент, выбранный из перечисленных элементов (А или В) или любую комбинацию двух или более перечисленных элементов (А и В), если иное не указано в настоящем документе или явно не противоречит контексту. Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неисчерпывающие термины (т.е. означающие «содержащий, но не ограничивающийся»), если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в настоящем документе предназначено лишь для использования в качестве сокращенного метода ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, если иное не указано в настоящем документе, и каждое отдельное значение включено в данное описание, как если бы оно было приведено индивидуально в настоящем документе. Все способы, описанные в настоящем документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любого и всех примеров или иллюстративной формулировки (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено только для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакая формулировка в описании не должна толковаться как указывающая на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.

Здесь описаны предпочтительные воплощения настоящего изобретения, включая наилучший способ осуществления изобретения, известный изобретателям. Вариации этих предпочтительных воплощений могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения вышеприведенного описания. Авторы изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие вариации по мере необходимости, и авторы изобретения полагают, что изобретение может быть осуществлено иначе, чем конкретно описано здесь. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты объектов, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено применимым законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в настоящем документе или иным образом явно не противоречит контексту.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ABL Bio Inc.

YUHAN CORPORATION

<120> ANTI-HER2/ANTI-4-1BB BISPECIFIC ANTIBODY AND USE THEREOF

<130> OPP20202723KR

<150> 62/878,951

<151> 2019-07-26

<150> 63/024,608

<151> 2020-05-14

<160> 89

<170> koPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR1 антитела против 4-1BB

<400> 1

Ser Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 2

Gly Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 3

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 4

Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 5

Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 6

Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 7

Asp Gly Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 8

Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 9

Asp Ala Gln Arg Gln Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 10

His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser Ser Ala Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Gly

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 11

Ser Phe Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 12

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 13

Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 14

Ala Asp Ser His Arg Pro Ser

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 15

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 16

Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 17

Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 18

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_вариабельная область тяжелой цепи антитела

против 4-1ВВ (1A10)

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (1A10 M4, 1A10 M12)

<400> 19

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (1A10 M11, 1A10 M13)

<400> 20

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Gln Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (1A12)

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser Ser Ala Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 22

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (1A12M1)

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser Ser Ala Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (AB41)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ile Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Gly Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное 1A10)

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное 1A10 M4, 1A10 M12)

<400> 25

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное 1A10 M11, 1A10 M13)

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Gln Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное 1A12)

<400> 27

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser Ser Ala Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 28

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное 1A12M1)

<400> 28

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser Ser Ala Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное AB41)

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ile Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Gly Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_вариабельная область легкой цепи антитела

против 4-1ВВ (1A10, 1A10 M4, 1A10 M11, 1A12)

<400> 30

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Arg

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 31

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (1A10 M12, 1A10 M13, 1A12M1)

<400> 31

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 32

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (AB41)

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 33

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное 1A10, 1A10 M4, 1A10 M11, 1A12)

<400> 33

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Arg

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное 1A10 M12, 1A10 M13, 1A12M1)

<400> 34

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 35

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 36

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ile Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 37

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 38

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 38

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 39

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 40

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 41

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 41

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 42

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 42

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 43

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 43

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 44

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 44

Arg Ala Thr Leu Thr Gly Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_H-FR4 антитела против 4-1ВВ

<400> 45

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 46

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 46

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Arg

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys

20

<210> 47

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 47

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys

20

<210> 48

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR1 антитела против 4-1ВВ

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 49

Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR2 антитела против 4-1ВВ

<400> 50

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1 5 10 15

<210> 51

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 51

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 52

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR3 антитела против 4-1ВВ

<400> 52

Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR4 антитела против 4-1ВВ

<400> 53

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR4 антитела против 4-1ВВ

<400> 54

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 55

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_L-FR4 антитела против 4-1ВВ

<400> 55

Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 56

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_тяжелая цепь антитела против 4-1ВВ

<400> 56

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 57

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 57

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 58

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 58

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Gln Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 59

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 59

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser Ser Ala Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 60

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 60

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser Ser Ala Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 61

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 61

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ile Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Gly Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 62

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_легкая цепь антитела против 4-1ВВ

<400> 62

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Arg

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 63

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 63

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 64

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 64

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR1 антитела против HER2

<400> 65

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 66

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR2 антитела против HER2

<400> 66

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 67

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_H-CDR3 антитела против HER2

<400> 67

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR1 антитела против HER2

<400> 68

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR2 антитела против HER2

<400> 69

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cинтетическая_L-CDR3 антитела против HER2

<400> 70

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 71

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_вариабельная область тяжелой цепи

антитела против HER2

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 72

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_вариабельная область легкой цепи

антитела против HER2

<400> 72

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 73

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_тяжелая цепь антитела против HER2

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 74

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_тяжелая цепь антитела против HER2 (N297A)

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 75

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_легкая цепь антитела против HER2

<400> 75

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 76

<211> 716

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая_тяжелая цепь биспецифического антитела

(HER2(NA)x1A10)

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly

465 470 475 480

Arg Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn

485 490 495

Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

500 505 510

Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

515 520 525

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

530 535 540

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser

545 550 555 560

Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

565 570 575

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

580 585 590

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

595 600 605

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

610 615 620

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu

625 630 635 640

Glu Trp Val Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala

645 650 655

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

660 665 670

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

675 680 685

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp

690 695 700

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710 715

<210> 77

<211> 719

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (NA)x1A10 GSLH)

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Arg Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gln Arg Asn Ser Met Arg

690 695 700

Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710 715

<210> 78

<211> 719

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (NA)x1A10 M4)

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Arg Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg

690 695 700

Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710 715

<210> 79

<211> 719

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (NA)x1A10 M12)

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg

690 695 700

Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710 715

<210> 80

<211> 722

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (NA)x1A12)

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly

465 470 475 480

Arg Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn

485 490 495

Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

500 505 510

Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

515 520 525

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

530 535 540

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser

545 550 555 560

Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

565 570 575

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

580 585 590

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

595 600 605

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

610 615 620

Ser Gly Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu

625 630 635 640

Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala

645 650 655

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

660 665 670

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val

675 680 685

Tyr Tyr Cys Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr Lys Ser Ser

690 695 700

Ser Ala Tyr Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

705 710 715 720

Ser Ser

<210> 81

<211> 725

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (NA)x1A12 GSLH)

<400> 81

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Arg Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr

690 695 700

Lys Ser Ser Ser Ala Tyr Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu

705 710 715 720

Val Thr Val Ser Ser

725

<210> 82

<211> 725

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (NA)x1A12 M1)

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr

690 695 700

Lys Ser Ser Ser Ala Tyr Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu

705 710 715 720

Val Thr Val Ser Ser

725

<210> 83

<211> 719

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (WT)x1A10 M12)

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg

690 695 700

Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710 715

<210> 84

<211> 725

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

(HER2 (WT)x1A12)

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Gly Gly Gln Lys Pro Thr Thr

690 695 700

Lys Ser Ser Ser Ala Tyr Gly Met Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu

705 710 715 720

Val Thr Val Ser Ser

725

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетический_пептидный линкер

<400> 85

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 86

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетический_пептидный линкер

<400> 86

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 87

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетический_пептидный линкер

<400> 87

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 88

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

против 4-1ВВ (мутированное AB41)

<400> 88

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 89

<211> 255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетический_4-1BB человека (NP_001552.2)

<400> 89

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<---

Claims

1. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2, содержащее:

(a) антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент и

(б) антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент,

где антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(1) H-CDR1 (область, определяющую комплементарность), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

(2) H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

(3) H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

(4) H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; или

(5) H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

и где антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(1) H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70.

2. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, где антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33;

(2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или 31, или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или 34;

(3) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или 31;

(4) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; или

(5) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, или

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88.

3. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, где антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(1) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62;

(2) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62 или 63;

(3) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62 или 63;

(4) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; или

(5) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

4. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, где антитело против 4-1ВВ или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой анти-4-1ВВ scFv указанного антитела против 4-1ВВ.

5. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 4, где анти-4-1ВВ scFv дополнительно содержит пептидный линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи.

6. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, где антитело против HER2 представляет собой трастузумаб или трастузумаб эмтанзин (T-DM1).

7. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, где антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72.

8. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, где антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73 или 74; и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75.

9. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, где антитело против HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет анти-HER2 scFv указанного антитела против HER2.

10. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 9, где анти-HER2 scFv дополнительно содержит пептидный линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи.

11. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, содержащее

полноразмерную форму антитела против HER2 и

scFv антитела против 4-1BB.

12. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, содержащее

полноразмерную форму антитела против 4-1BB и

scFv антитела против HER2.

13. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, содержащее:

полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84; и

полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75.

14. Биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по п. 1, содержащее:

полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; и

15. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака с экспрессией HER2, содержащая биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по любому из пп. 1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Фармацевтическая композиция для усиления иммунного ответа, содержащая биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по любому из пп. 1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Применение биспецифического антитела анти-4-1ВВ/анти-HER2 по любому из пп. 1-14 для лечения или предупреждения рака с экспрессией HER2.

18. Применение биспецифического антитела анти-4-1ВВ/анти-HER2 по любому из пп. 1-14 для усиления иммунного ответа.

19. Полинуклеотид, кодирующий биспецифическое антитело анти-4-1ВВ/анти-HER2 по любому из пп. 1-14.

20. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 19.

21. Рекомбинантная клетка для получения биспецифического антитела по любому из пп. 1-14, содержащая полинуклеотид по п. 19.

22. Способ получения биспецифического антитела анти-4-1ВВ/анти-HER2 по любому из пп. 1-14, включающий экспрессию полинуклеотида по п. 19 в клетке.