RU2828991C1 - Способ выбора оптимальной дозы, при которой препарат проявляет максимальную антиоксидантную активность, для введения в конъюнктивальную полость при заболеваниях глаза - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и фармакологии, и может использоваться для выбора оптимальной дозы, при которой препарат проявляет максимальную антиоксидантную активность, для введения в конъюнктивальную полость при заболеваниях глаза в эксперименте. Забирают слезную жидкость с помощью фильтровальной бумаги, элюируют физиологическим раствором и центрифугируют. Готовят ряд растворов исследуемого препарата путем его последовательных разведений 0,05 М фосфатным буферным раствором рН 7,4 до концентраций от 0,015 до 14,54 мМ. Затем добавляют раствор исследуемого препарата к надосадочной жидкости в соотношении 1:1 и оценивают общую антиоксидантную активность при исследуемых концентрациях препарата хемилюминесцентным методом в модельной системе гемоглобин - перекись водорода - люминол. Выбирают оптимальную дозу, при которой препарат проявляет максимальную общую антиоксидантную активность. Изобретение обеспечивает получение объективных данных об антиоксидантном потенциале слезы и тестируемого препарата с выбором оптимальной дозы препарата с антиоксидантными свойствами для применения в виде глазных капель. 5 ил., 5 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и фармакологии, и может использоваться для выбора оптимальной дозы, при которой препарат проявляет максимальную антиоксидантную активность, для введения в конъюнктивальную полость при заболеваниях глаза.

Солнечное ультрафиолетовое излучение воздействует не только на поверхностные не защищенные пигментом структуры глаза, но и внутренние структуры вплоть до сетчатки. Внешние структуры также постоянно соприкасаются с кислородом воздуха и с вредными внешними воздействиями. Это приводит к повышенному образованию активных форм кислорода (АФК). Сетчатка, являясь метаболически очень активной тканью, в процессе обмена также образует большое количество АФК. Активные формы кислорода вступают в реакцию с ДНК, белками и клеточными мембранами, что приводит к повреждению клеток и тканей и является причиной многих глазных болезней. Поэтому для предотвращения окислительного стресса в глазу должен сохраняться высокий антиоксидантный потенциал. Практически при всех глазных патологиях эндогенных антиоксидантов не хватает для подавления окислительного стресса, что обусловливает необходимость применения антиоксидантов.

Известен способ того же назначения, при котором на основе анализа клинических признаков и исследования антиокислительной активности слезы пациентов оценивали эффект лечения катаракты путем введения в конъюнктивальную полость в течение длительного периода времени препарата визомитин с антиоксидантными свойствами (Еричев В.П., Козлова И.В., Рещикова B.C., Алексеев В.Н. и др. Клиническое исследование эффективности и безопасности препарата Визомитин®, глазные капли, у пациентов с возрастной катарактой, Национальный журнал глаукома 2016, Т. 15, №1, стр. 61-69). Недостатками такого подхода является оценка действия препарата по типу терапии ex Juvantibus, что требует длительного периода наблюдения с непредсказуемым результатом и без учета индивидуального состояния антиоксидантного статуса.

Задача предлагаемого способа состоит в разработке объективного количественного способа ex vivo подбора дозы препарата с антиоксидантными свойствами для введения в конъюнктивальную полость ex vivo.

Техническим результатом предлагаемого способа является получение объективных данных об антиоксидантом потенциале слезы и тестируемого препарата с выбором оптимальной дозы препарата с антиоксидантными свойствами для применении в виде глазных капель.

Технический результат достигается за счет выбора дозы препарата получение объективных данных об антиоксидантом потенциале слезы и тестируемого препарата с выбором оптимальной дозы препарата с антиоксидантными свойствами для применении в виде глазных капель.

Слеза является первой линией защиты глазных структур от действия ультрафиолета, кислорода воздуха и других вредных внешних воздействий, и эта защита обеспечивается большим содержанием в слезе эндогенных антиоксидантов. В слезе содержатся практически все известные эндогенные антиоксиданты, как ферментные, так и неферментные, некоторые в большем количестве, чем в других биологических жидкостях.

Из антиоксидантных ферментов в слезе выявлены супероксиддисмутаза, а данные по другим антиоксидантным ферментам противоречивы в связи с применением различных методов их определения (Tyulina VV, Senin II. Method for Collection of Tear Fluid for Evaluation Its Antioxidant Properties. Bull Exp Biol Med. 2023 Aug;175(4):492-496). В слезе содержится большое количество гликопротеина лактоферрин, обладающего антиоксидантной активностью. Из низкомолекулярных антиоксидантов в слезе человека на аскорбиновую кислоту и мочевую кислоту приходится ~ 50% общей антиоксидантной активности (Chen Y, Mehta G, Vasiliou V. Antioxidant defenses in the ocular surface. Ocul Surf. 2009 Oct;7(4):176-85. doi: 10.1016/s1542-0124(12)70185-4).

Большое разнообразие антиоксидантов, присутствующих в слезной жидкости, синергизм и антагонизм их взаимодействия с экзогенными антиоксидантами, а также специфичность в отношении определенных форм АФК создают трудности в применении антиоксидантной терапии и в поиске новых препаратов антиоксидантного действия для применения в виде глазных капель. Определение влияния антиоксидантной терапии на антиоксидантный статус in vivo является не только сложной процедурой, но на результаты оказывает большое влияние сама процедура повторного забора слезы. Определение антиоксидантной активности лекарственных препаратов в системах in vitro не отражает взаимодействия с эндогенной оксидантной и антиоксидантной системами. Поэтому определение антиоксидантного потенциала препаратов, добавленных к уже собранной слезе в норме или при офтальмопатологии (исследование ex vivo) может дать наиболее объективное представление об антиоксидантом потенциале при применении в виде глазных капель и подобрать необходимые дозировки. Учитывая многообразие форм АФК и компонентов антиоксидантной защиты важно найти интегральные показатели, характеризующие активность антиоксидантных систем в целом, т.е. определить общую антиоксидантную активность (ОАА). Системы для определения ОАА веществ чаще всего состоят из двух компонентов: инициатора окисления и субстрата окисления. Торможение антиоксидантами СРО в данных системах оценивается путем определения промежуточных или конечных продуктов окисления с помощью хроматографических, спектрофотометрических, хемилюминесцентных и других методов. Для оценки влияния лекарственных препаратов на ОАА слезной жидкости нами был выбран метод измерения антиокислительной активности в модельной системе гемоглобин - перекись водорода - люминол (Hb- H2O2-Лм), (Изменение антиокислительной активности слезной жидкости при экспериментальной ожоговой болезни глаз / О.В. Гулидова [и др.] // Бюлл. экспер. биол. и медицины. - 1999. - Т. 128, №11. - С. 571-574.). Метод позволяет оценивать общую антиокислительную активность к двум наиболее агрессивным радикалам - гидроксил радикалу (НО•) и супероксиданиону (O2-.), которые определяют интенсивность повреждающего действия окислительного стресса. Гидроксил радикал обладает очень высоким редокс-потенциалом и может разрушать практически любое органическое вещество биологического происхождения. Токсичность супероксиданиона определяется его способностью вызывать окисление ненасыщенных жирных кислот, белков и нуклеиновых кислот, кроме того, его токсичность увеличивается за счет вторичных реакций, ведущих к образованию гидроксидных радикалов (ОН.) и синглетного кислорода (*O2), пероксинитрита. Регистрацию кинетики ХЛ проводили с помошью хемилюминометра "Биотокс-7" (АНО "Инженерный Центр - Экология", Москва). Метод отличается простотой и высокой воспроизводимостью, для анализа необходимо небольшое количество биологического материала, слезы требуется 10 мкл. Он позволяет количественно оценивать ОАА различных веществ (фармакологических препаратов) и биологического материала (слезная жидкость), изучать влияние исследуемых веществ на ОАА биоматериала ex vivo. Преимущества предлагаемой тест системы состоят в том, что она позволяет учитывать влияние эндогенных факторов, входящих в контакт с препаратом, что позволяет правильно подобрать дозу и определить режим применения препарата.

Способ осуществляют следующим образом.

Забирают слезную жидкость с помощью фильтровальной бумаги, элюируют физиологическим раствором, центрифугируют, в надосадочную жидкость добавляют исследуемый препарат в различных концентрациях в соотношении с надосадочной жидкостью 1:1. Оценивают общую антиоксидантную активность при разных концентрациях препарата хемилюминесцентным методом в модельной системе гемоглобин - перекись водорода - люминол и выбирают оптимальную дозу, при которой препарат проявляет максимальную антиоксидантную активность.

Сначала исследования были проведены в эксперименте на кроликах. Взятие слезы у кролика осуществлялось следующим образом: в нижний конъюнктивальный мешок каждого глаза помещали кружки из фильтровальной бумаги диаметром 5 мм на 5 минут. Пропитавшиеся слезной жидкостью кружки извлекали и элюировали компоненты слезы физиологическим раствором в соотношении 50 мкл на 1 кружок, как это принято. Таким образом получали слезную жидкость, разбавленную в 10 раз, центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин, надосадочную жидкость использовали для анализа. В глазу кролика, как и человека, в норме находится до 10 мкл слезы. Объем капли составляет в среднем 50 мкл, но большая часть раствора немедленно оттекает в носовую полость по носослезному каналу, поэтому в глазу остается не более 10 мкл препарата. Исходя из этого соотношение раствора антиоксиданта и элюата слезы во всех экспериментах было одинаковым: 30 мкл раствора + 30 мкл элюата. Поэтому для оценки влияния антиоксиданта на ОАА слезы раствор исследуемого вещества соединяли в кювете прибора в соотношении 1:1 и измеряли ОАА полученной смеси. Концентрацию тестируемого препарата варьировали для достижения оптимального результата в пределах, которых она может достигать в слезе пациента при закапывании.

При проведении клинических испытаний слезу у пациентов забирали из обоих глаз утром до всех манипуляций с помощью стерильной фильтровальной бумаги (шириной 5 мм), которую закладывали за нижнее веко (как при проведении теста Ширмера). Компоненты слезной жидкости элюировали физиологическим раствором и проводили определение ОАА по выше указанному способу. Для построения калибровочной кривой использовали антиоксидант тролокс. Кинетику хемилюминесценции регистрировали с помощью хемилюминометра "Биотокс-7 ("АНО "Инженерный центр - Экология", Россия). Измеряемыми параметрами были: длительность латентного периода хемилюминесценции, характеризующая ОАА в основном по отношению к гидроксильному радикалу; максимальная интенсивность хемилюминесценции, характеризующая ОАА в основном по отношению к супероксид-анион радикалу. Антиокислительную активность выражали в мкМ тролокса.

Оценка влияния тиоктовой кислоты на ОАА слезы кролика in vitro

Пример 1.

Определение зависимости ОАА слезы здорового кролика в присутствии тиоктовой кислоты от концентрации последней. В качестве маточного раствора использовали аптечный препарат Тиоктовой кислоты 0,145 М. Путем последовательных разведений 0,05 М фосфатным буферным раствором рН7,4 из него готовили ряд растворов тиоктовой кислоты с концентрациями 0,09, 0,18, 0,36, 0,73, 1,45, и 7,27 мМ.

В модельной системе гемоглобин-Н₂О₂-люминол определяли ОАА слезы кролика без добавления тиоктовой кислоты, ОАА всех приготовленных разведений тиоктовой кислоты, и затем последовательно для всех приготовленных разведений в смеси со слезой кролика 1:1.

Состав реакционной смеси:

Полученные результаты демонстрируют Таблица 1. ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы кролика 1:1 по отношению к гидроксильному радикалу (мкМ тролокса), Фиг. 1. Зависимость ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы кролика по отношению к гидроксильному радикалу от концентрации тиоктовой кислоты (мкМ тролокса), Таблица 2. ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы кролика 1:1 по отношению к супероксид-анион радикалу (% ингибирования окисления). Фиг. 2. Зависимость ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы кролика по отношению к супероксид-анион радикалу от концентрации тиоктовой кислоты (% подавления окисления в модельной системе).

Тиоктовая кислота в водном растворе не обладает ОАА по отношению к гидроксильному радикалу, однако при добавлении ее к слезе кролика in vitro происходило значительное увеличение ОАА слезы. При концентрации тиоктовой кислоты 1,45 мМ увеличение достигало 30%, а при концентрации 7,27 мМ составило 64%. В данном случае имеет место синергическое действие вводимого антиоксиданта и собственных антиоксидантов слезы.

ОАА слезы здорового кролика по отношению к супероксид-анион радикалу была достаточно высокой, поэтому добавление антиоксиданта быстро повышало ее до максимально возможного уровня. При концентрации тиоктовой кислоты 7,27 мМ смесь полностью подавляла процесс окисления люминола в модельной системе.

Таким образом, использование тиоктовой кислоты при концентрации 1,45 мМ в виде инсталляций является оптимальной дозой, вызывающей максимальное увеличение ОАА слезы кролика.

Пример 2.

Определение зависимости ОАА слезы кролика с хирургической травмой конъюнктивы (иссечение части бульбарной конъюнктивы с последующим закрытием дефекта собственной конъюнктивой) от концентрации добавленной in vitro тиоктовой кислоты.

В качестве маточного раствора использовали аптечный препарат Тиоктовой кислоты 0,145 М. Путем последовательных разведений 0,05 М фосфатным буферным раствором рН7,4 из него готовили растворы тиоктовой кислоты с концентрациями 0,15, 1,45 и 14,54 мМ.

В модельной системе гемоглобин-H₂O₂-люминол определяли АОА слезы кролика без добавления тиоктовой кислоты и затем последовательно для всех приготовленных разведений в смеси со слезой кролика 1:1.

Состав реакционной смеси:

Результаты представлены в Табл. 3. ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы кролика 1:1 in vitro, Фиг. 3. Зависимость ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы кролика с хирургической травмой конъюнктивы по отношению к гидроксильному радикалу от концентрации тиоктовой кислоты (мкМ тролокса), Фиг. 4. Зависимость ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы кролика с хирургической травмой конъюнктивы по отношению к супероксид-анион радикалу от концентрации тиоктовой кислоты (% подавления окисления в модельной системе).

Если у здорового кролика тиоктовая кислота повышала ОАА по отношению к гидроксильному радикалу на 66% в концентрации 7,27 мМ, то у кролика с хирургической травмой конъюнктивы повышение на 64% достигалось только при концентрации тиоктовой кислоты 14,54 мМ. Это говорит о наличии дефицита антиоксидантов даже при неосложненном заживлении раны конъюнктивы, так как любой раневой процесс сопровождается более или менее выраженным окислительным стрессом.

ОАА слезы по отношению к супероксид-анион радикалу у кролика с хирургической травмой конъюнктивы была ниже, чем у здорового (59% против 77%), поэтому действие антиоксиданта было более заметно. Если у здорового животного тиоктовая кислота, добавленная к слезе, полностью подавляла процесс окисления люминола в модельной системе при концентрации 7,27 мМ, то у кролика с травмой конъюнктивы для этого требовалась концентрация 14,54 мМ.

Таким образом, использование тиоктовой кислоты в виде инсталляций приводит к увеличению ОАА слезы как здорового кролика, так и при наличии окислительного стресса (например, при повреждении передней поверхности глаза). В этом случае ОАА слезы кролика снижается, поэтому оптимальная доза антиоксиданта должна быть повышена до концентрации 14,54 мМ, то есть в 2 раза больше по сравнению с концентрацией, достаточной для достижения того же эффекта у здорового животного.

Оценка влияния тиоктовой кислоты на ОАА слезы человека in vitro.

Пример 3.

Определение зависимости ОАА слезы человека в присутствии тиоктовой кислоты от концентрации последней.

Слезу забирали с помощью полосок фильтровальной бумаги по описанной выше методике. Для сравнения была взята слеза здорового человека и пациента с миопией высокой степени через 1 месяц после выполнения малой склеропластики на одном глазу.

В качестве маточного раствора использовали аптечный препарат Тиоктовой кислоты 0,145 М. Путем последовательных разведений 0,05 М фосфатным буферным раствором рН7,4 из него готовили ряд растворов тиоктовой кислоты с концентрациями 0,015, 0,15 и 1,45 мМ.

В модельной системе гемоглобин-Н₂О₂-люминол определяли АОА слезы человека без добавления тиоктовой кислоты, и затем последовательно для всех приготовленных ее разведений в смеси со слезой человека 1:1.

Состав реакционной смеси:

Результаты представлены в Табл. 4. ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы человека 1:1 по отношению к гидроксильному радикалу (мкМ тролокса)

Как видно из таблицы, ОАА слезы здорового человека по отношению к гидроксильному радикалу превосходит таковую пациента с миопией высокой степени в 10 раз.

Тиоктовая кислота, не обладающая ОАА по отношению к гидроксильному радикалу, слабо влияла на этот вид ОАА слезы как здорового человека, так и пациента.

Таблица 5. ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы человека 1:1 по отношению к супероксид-анион радикалу (% ингибирования окисления).

Фиг. 5. Зависимость ОАА смеси тиоктовой кислоты и слезы человека по отношению к супероксид-анион радикалу от концентрации тиоктовой кислоты (% подавления окисления в модельной системе).

У пациента с миопией высокой степени ОАА слезы по отношению к супероксид-аниону также оказалась ниже, чем у здорового человека на 35%. Влияние тиоктовой кислоты на этот показатель у пациента было более заметным, чем у здорового человека. Уже в концентрации 1,45 мМ тиоктовая кислота увеличивала ОАА слезы пациента до 93%, что соответствует уровню здорового человека. Оперированный и парный глаз по данному показателю не различались.

Использование тиоктовой кислоты в виде инсталляций приводит к увеличению ОАА слезы человека по отношению к супероксид-аниону. Максимальный антиоксидантный эффект наиболее заметен у пациента с миопией при концентрации тиоктовой кислоты 1,45 мМ. Данный препарат может быть применен в виде инсталляций в конъюнктивальную полость в составе комплексной терапии для борьбы с окислительным стрессом.

Таким образом, предложенный способ позволяет выявлять ex vivo оптимальную дозу, при которой препарат проявляет максимальную общую антиоксидантную активность для введения в конъюнктивальную полость при заболеваниях глаза. Способ может быть использован для обоснования режима применения известных и разработке новых глазных лекарственных препаратов для антиоксидантной терапии.

Claims (1)

1. Способ выбора оптимальной дозы, при которой препарат проявляет максимальную общую антиоксидантную активность, для введения в конъюнктивальную полость в эксперименте, отличающийся тем, что забирают слезную жидкость с помощью фильтровальной бумаги, элюируют физиологическим раствором, центрифугируют, готовят ряд растворов исследуемого препарата путем его последовательных разведений 0,05 М фосфатным буферным раствором рН 7,4 до концентраций от 0,015 до 14,54 мМ, добавляют раствор исследуемого препарата к надосадочной жидкости в соотношении 1:1, оценивают общую антиоксидантную активность при исследуемых концентрациях препарата хемилюминесцентным методом в модельной системе гемоглобин - перекись водорода - люминол и выбирают оптимальную дозу, при которой препарат проявляет максимальную общую антиоксидантную активность.