RU2828110C2

RU2828110C2 - Способ идентификации стрессового состояния и/или оценки уровня стрессовой реакции у субъекта

Info

Publication number: RU2828110C2
Application number: RU2021123708A
Authority: RU
Inventors: Ален ЛЕКЮР; Люк ТОМ; Ив Мерсье; Микаэль БРИАН
Original assignee: Адиссео Франс С.А.С.; Сантр Насьональ Де Ла Решерш Сьянтифик
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2024-10-07

Abstract

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки уровня стрессовой реакции у субъекта, включающий стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, в образце указанного субъекта. Технический результат заключается в возможности избежать зависимости от типа стрессогенного фактора и рассматриваемого биологического вида при проведении анализа. 8 ил., 4 табл., 4 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу идентификации стрессового состояния у субъекта, оценки уровня стрессовой реакции у субъекта, прогнозирования эффективности интервенционного решения у субъекта, мониторинга эффективности интервенционного решения у субъекта и/или идентификации интервенционного решения для субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов, выбранных из группы, состоящей из двадцати шести генов, в образце указанного субъекта, а также к набору, содержащему средства для амплификации и/или выявления экспрессии указанных генов, а также к его применениям.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Стресс принято определять, как предложено Гансом Селье в его фундаментальной работе 1956 г. «Стресс жизни» (издание: McGraw-Hill Book Company), как «состояние, проявляющееся в виде определенного синдрома, который состоит в неспецифично индуцированных изменениях внутри биологической системы». В частности, стресс представляет собой физиологическое состояние, при котором у индивидуумов, подвергающихся воздействию изменений биотических или абиотических факторов, называемых стрессогенными или провоцирующими факторами, в окружающей среде, инициируется ответ, направленный на поддержание гомеостаза. Эта стрессовая реакция сначала вызывает у этих индивидуумов поведенческие, биологические и физические изменения, которые, в конечном счете, приводят к толерантности и адаптации. В том случае, если адаптация происходит не полностью или неудачно, порог толерантности может быть превышен, что приводит в результате к измененным биологическим функциям. Неспособность индивидуума выдерживать стресс или справляться с провоцирующими факторами окружающей среды может приводить к множеству неблагоприятных последствий в диапазоне от дискомфорта до гибели.

В частности, в животноводстве идентифицирован широкий ряд абиотических стрессогенных факторов, таких как социальные взаимодействия или грубое обращение, традиционные методы ведения сельского хозяйства (например, кастрация, удаление рогов, подрезание зубов, подковка, скученность отъемного потомства), неправильное кормление, воздействие нежелательных климатических условий, работа и транспортировка. Воздействие стрессогенного фактора, происходящее в период выращивания, вероятно, влияет на сохранение благополучия, продуктивности и физиологического состояния животного. Для характеристики физиологического состояния животного традиционно используют показатели роста животного (такие как прирост массы тела, потребление корма, коэффициент конверсии корма, падеж и заболеваемость), но они не являются специфичными характеристиками стрессового состояния животного. Таким образом, существенное значение имеет возможность идентификации стрессового состояния у субъекта (человека или животного) путем применения чувствительных и робастных диагностических инструментов.

Ранее были предложены некоторые биомаркеры стресса среди циркулирующих гормонов (например, кортизола, адренокортикотропного гормона (АКТГ), адреналина, окситоцина, вазопрессина), продуктов катаболизма, таких как накопление окисленных липидов (например, малондиальдегида, изопростанов, гидропероксидов, окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), гексаноил-лизина) или накопление окисленных белков (например, нитротирозина, карбонилированных белков), воспалительных биомаркеров (например, пероксида водорода, миелопероксидазы), биомаркеров окисленных ДНК (например, 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина) или измерение активности внутриклеточных систем антиоксидантов (например, супероксиддисмутазы, пероксиредоксинов, тиоредоксинов, глутаредоксинов, глутатионпероксидаз, глутатиона). На основании этого также разработаны наборы, такие как диагностический набор Oxyscale (как описано в патенте EP2017623) или набор для постановки ПЦР панели генов окислительного стресса Oxidative stress RT² profiler PCR arrays производства компании QIAGEN, который основан на измерении экспрессии большого количества генов.

Также описаны различные гены, вовлеченные в конкретные клеточные модели стресса, но специалистам в данной области техники хорошо известно, что результаты, полученные in vitro, редко транслируются в результаты in vivo, и на основании этих исследований невозможно выяснить, какие из этих генов, если такие имеются, могут быть пригодны для идентификации стрессового состояния у субъекта (человека или животного).

В целом все эти биомаркеры характеризуются несколькими ограничениями, в частности, в связи с тем, что они часто являются транзиторными и специфичными для определенного типа стрессогенного фактора и/или рассматриваемого биологического вида. Действительно, эти биомаркеры могут быть с трудом перенесены с одного биологического вида на другой и/или с одного стрессового состояния на другое, а приемлемый универсальный биомаркер пока не идентифицирован.

В данном контексте авторы изобретения совершенно неожиданно обнаружили, что для преодоления этих проблем является пригодным выявление и/или количественное определение экспрессии по меньшей мере четырех генов, выбранных из перечня из двадцати шести генов. Эти гены представляют собой биомаркеры, которые не зависят от типа стрессогенных факторов и рассматриваемого биологического вида.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки (и/или количественного определения) уровня стрессовой реакции у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, в образце указанного субъекта.

В контексте настоящего изобретения:

- Термин «стресс» или «стрессовое состояние» в отношении к субъекту следует понимать как означающий физиологическое состояние, при котором у индивидуумов, подвергающихся воздействию изменений биотических или абиотических факторов, называемых стрессогенными факторами (или «стрессовыми факторами», или «провоцирующими факторами»), в окружающей среде, инициируется ответ, направленный на поддержание гомеостаза. Эта «стрессовая реакция» сначала вызывает у этих индивидуумов поведенческие, биологические и физические изменения, которые в конечном счете приводят к толерантности и адаптации. В том случае, если адаптация происходит не полностью или неудачно, порог толерантности может быть превышен, что приводит в результате к измененным биологическим функциям. Неспособность индивидуума выдерживать стресс или справляться с провоцирующими факторами окружающей среды может приводить к множеству неблагоприятных последствий в диапазоне от дискомфорта до гибели.

- «Оценка уровня стрессовой реакции» у субъекта выходит за рамки простой идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта; она может позволить классифицировать субъекты в соответствии с их уровнем стрессовой реакции и более конкретно разделить их между адаптированными и неадаптированными подгруппами. «Оценка уровня стрессовой реакции» у субъекта охватывает возможность «количественного определения уровня стрессовой реакции» у субъекта;

- «Адаптированного» субъекта определяют как субъекта, способного к установлению адекватного ответа на стресс после воздействия стрессогенного фактора; «неадаптированного» субъекта определяют как субъекта, неспособного к установлению адекватного ответа на стресс вследствие воздействия стрессогенного фактора.

- Термин «субъект» или «индивидуум» относится к человеку или животному;

- Термин «животное, относящееся к домашнему скоту» относится к домашним животным, выращиваемым в условиях сельского хозяйства для проведения работ и производства различных сырьевых товаров;

- «Домашние питомцы» или «свободные животные» относятся к животным, которых содержат дома как компаньонов (например, млекопитающим, таким как собаки и кошки, а также аквариумным рыбам, птицам вольерного или клеточного содержания);

- «Интервенционное решение» соответствует любому типу вмешательства (например, рациону, пищевой добавке, фармакологическому лечению, практике выращивания или модификации окружающих условий) по отношению к индивидууму, которое пригодно для ограничения воздействия стресса, и/или снижения уровня стрессовой реакции, и/или повышения толерантности к стрессу, и/или стимуляции адаптации индивидуума. «Перспективное интервенционное решение» соответствует вмешательству, которое подлежит тестированию, чтобы идентифицировать, является ли это интервенционное решение релевантным или нет;

- Ген представляет собой последовательность ДНК, которая кодирует молекулу белка. ДНК сначала конвертируется в РНК (мРНК) посредством транскрипции, а затем указанная РНК конвертируется в молекулу белка посредством трансляции. Таким образом, выявление и/или количественное определение экспрессии гена можно осуществлять на уровне мРНК или белка. В настоящем изобретении для удобства гены обозначены их названиями у человека (Homo sapiens), но должно быть понятно, что, если не указано иное, они охватывают все гомологи этих генов у других биологических видов и включают все возможные межиндивидуальные полиморфизмы;

- Экспрессию генов можно только выявлять (наличие/отсутствие соответствующих мРНК или белка) без обязательных каких-либо количественных измерений, либо ее можно количественно определять (т.е. экспрессию на уровне мРНК или белка определяют количественным образом). Количественное определение уровня экспрессии гена может позволить идентифицировать наличие или отсутствие стрессового состояния у субъекта и/или оценить уровень стрессовой реакции (и, возможно, количественно определить уровень стрессовой реакции) у субъекта.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки (и/или количественного определения) уровня стрессовой реакции у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми, по меньшей мере девяти, по меньшей мере десяти, по меньшей мере одиннадцати, по меньшей мере двенадцати, по меньшей мере тринадцати, по меньшей мере четырнадцати, по меньшей мере пятнадцати, по меньшей мере шестнадцати, по меньшей мере семнадцати, по меньшей мере восемнадцати, по меньшей мере девятнадцати, по меньшей мере двадцати, по меньшей мере двадцати одного, по меньшей мере двадцати двух, по меньшей мере двадцати трех, по меньшей мере двадцати четырех, по меньшей мере двадцати пяти, по меньшей мере двадцати шести генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, в образце указанного субъекта.

Предпочтительно указанные по меньшей мере четыре гена (или по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать, по меньшей мере тринадцать, по меньшей мере четырнадцать, по меньшей мере пятнадцать, по меньшей мере шестнадцать, по меньшей мере семнадцать, по меньшей мере восемнадцать, по меньшей мере девятнадцать, по меньшей мере двадцать, по меньшей мере двадцать один, по меньшей мере двадцать два, по меньшей мере двадцать три, по меньшей мере двадцать четыре, по меньшей мере двадцать пять или по меньшей мере двадцать шесть генов) представляют собой различные гены, которые соответственно выбраны из каждого из приведенных ниже перечней 1-4:

- Перечень 1: Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, Col12a1, Gfpt2, Mgp, Thbs1, Tnc, Col1a1

- Перечень 2: Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, Mrc1, Serpinh1

- Перечень 3: Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, Lgals1, Cidea, Hmox1, Kctd12, Sh2b2, Slit3

- Перечень 4: Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, Col14a1, Efemp1, G0s2, Kera, Nes, Panx1, Runx1, Ankrd33b.

Перечень 1 состоит из четырех генов, являющихся консервативными между четырьмя моделями PN, CT, SN и PT (т.е. Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, «четыре наиболее консервативных гена»), и генов, являющихся консервативными между тремя моделями PT, PN и CT (Col12a1, Gfpt2, Mgp, Thbs1, Tnc, Col1a1 или «перечень 1A»). Перечень 2 состоит из четырех наиболее консервативных генов и генов, которые являются консервативными между тремя моделями PT, SN и CT (Mrc1, Serpinh1 или «перечень 2A»). Перечень 3 состоит из четырех наиболее консервативных генов и генов, которые являются консервативными между тремя моделями PT, PN и SN (Lgals1, Cidea, Hmox1, Kctd12, Sh2b2, Slit3 или «перечень 3A»). Перечень 4 состоит из четырех наиболее консервативных генов и генов, которые являются консервативными между тремя моделями CT, PN и SN (Col14a1, Efemp1, G0s2, Kera, Nes, Panx1, Runx1, Ankrd33b или «перечень 4A»).

Когда по меньшей мере четыре гена соответственно выбраны в каждом из перечней 1-4 выше, указанные по меньшей мере четыре гена включают по меньшей мере три гена, которые идентифицированы в каждой из моделей PN, CT, SN и PT соответственно.

Более предпочтительно настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки (и/или количественного определения) уровня стрессовой реакции у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех наиболее консервативных генов Anxa1, Anxa2, Chac1 и Postn в образце указанного субъекта. Еще более предпочтительно настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки (и/или количественного определения) уровня стрессовой реакции у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех наиболее консервативных генов Anxa1, Anxa2, Chac1 и Postn и:

- по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести из генов перечня 1A (Col12a1, Gfpt2, Mgp, Thbs1, Tnc, Col1a1);

- по меньшей мере одного, по меньшей мере двух из генов перечня 2A (Mrc1, Serpinh1);

- по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести из генов перечня 3A (Lgals1, Cidea, Hmox1, Kctd12, Sh2b2, Slit3); или

- по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми из генов перечня 4A (Col14a1, Efemp1, G0s2, Kera, Nes, Panx1, Runx1, Ankrd33b)

в образце указанного субъекта.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки (и/или количественного определения) уровня стрессовой реакции у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере всех генов перечня 1, по меньшей мере всех генов перечня 2, по меньшей мере всех генов перечня 3 или по меньшей мере всех генов перечня 4 в образце указанного субъекта. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки (и/или количественного определения) уровня стрессовой реакции у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере 26 генов Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc в образце указанного субъекта.

Также предпочтительно по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать, по меньшей мере тринадцать, по меньшей мере четырнадцать, по меньшей мере пятнадцать, по меньшей мере шестнадцать, по меньшей мере семнадцать, по меньшей мере восемнадцать, по меньшей мере девятнадцать, по меньшей мере двадцать, по меньшей мере двадцать один, по меньшей мере двадцать два, по меньшей мере двадцать три, по меньшей мере двадцать четыре, по меньшей мере двадцать пять или по меньшей мере двадцать шесть генов в описанном выше способе in vitro включают по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать, по меньшей мере тринадцать, по меньшей мере четырнадцать, по меньшей мере пятнадцать, по меньшей мере шестнадцать, по меньшей мере семнадцать, по меньшей мере восемнадцать, по меньшей мере девятнадцать, по меньшей мере двадцать, по меньшей мере двадцать один, по меньшей мере двадцать два гена выбраны из группы, состоящей из Anxa1, Anxa2, Chac1, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Slit3, Thbs1 и Tnc. Более предпочтительно они включают по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать, по меньшей мере тринадцать, по меньшей мере четырнадцать, по меньшей мере пятнадцать, по меньшей мере шестнадцать, по меньшей мере семнадцать, по меньшей мере восемнадцать генов, выбранных из группы, состоящей из Anxa1, Anxa2, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, Hmox1, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Slit3, Thbs1 и Tnc. Еще более предпочтительно они включают по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать, по меньшей мере тринадцать, по меньшей мере четырнадцать генов, выбранных из группы, состоящей из Anxa1, Anxa2, Col1a1, Col14a1, Efemp1, Lgals1, Mgp, Mrc1, Postn, Runx1, Serpinh1, Slit3, Thbs1 и Tnc. Еще более предпочтительно они включают по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять генов, выбранных из группы, состоящей из Anxa1, Anxa2, Col1a1, Col14a1, Efemp1, Lgals1, Mgp, Postn, Slit3 и Thbs1. Еще более предпочтительно они включают по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре гена, выбранных из группы, состоящей из Anxa2, Efemp1, Lgals1 и Postn.

Способ, как описано выше, пригоден для идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния и/или для оценки (и/или для количественного определения) уровня стрессовой реакции у субъекта любого типа (человека или животного). Предпочтительно указанный субъект представляет собой животное и, в частности, животное, относящееся к домашнему скоту, или свободное животное. Более предпочтительно указанный субъект представляет собой животное, выбранное из группы, состоящей из крупного рогатого скота (например, коров), овечьих (например, овец), козьих (например, коз), домашней птицы (например, цыплят, бройлеров, кур, индеек, уток, гусей), свиных (например, свиней), лошадиных (например, пони, лошадей, жеребят), зайцеобразных (например, кроликов, зайцев), рыб (например, лососей, форели) и других видов аквакультуры (например, креветок).

Способ, как описано выше, пригоден для идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния и/или для оценки (и/или для количественного определения) уровня стрессовой реакции, где указанное стрессовое состояние является результатом воздействия на субъект (человека или животного) стрессогенного или провоцирующего фактора любого типа. Предпочтительно указанное стрессовое состояние включает компонент окислительного стресса. Более предпочтительно указанное стрессовое состояние является результатом воздействия на субъект:

- провоцирующего фактора, связанного с питанием (например, несбалансированного рациона в отношении уровня белка или калорийности, рациона, загрязненного ксенобиотиками, подобными микотоксинам, или другими загрязняющими веществами, рациона, богатого непитательными факторами, рациона, богатого окисленным жиром, рациона, богатого клетчаткой и т.д.), который может вызывать воспалительный ответ или заболевание,

- провоцирующего фактора, связанного с условиями окружающей среды (например, теплового провоцирующего фактора, высокой относительной влажности, высокого уровня диоксида углерода, влажного помета и т.д.), который может вызывать воспалительный ответ или заболевание,

- физического провоцирующего фактора (например, провоцирующего фактора, связанного с физическими манипуляциями по поимке животного, и/или стресса, вызванного транспортировкой животного), который может вызывать воспалительный ответ или заболевание, и/или

- санитарного провоцирующего фактора (например, в связи с присутствием бактериального патогена, вируса или паразита), который может вызывать воспалительный ответ или заболевание.

Образец может представлять собой биологический образец любого типа. В частности, указанный образец может быть выбран из группы, состоящей из мышечной ткани (предпочтительно из скелетной мышечной ткани), ткани молочной железы, ткани печени, жировой ткани, кожи, лимфоидной ткани, плацентарной ткани, ткани желудочно-кишечного тракта (например, ткани подвздошной кишки), ткани половых путей, ткани центральной нервной системы, спинного мозга, ганглия тройничного нерва, мочи, фекалий, перьев, слез, спермы, семенной жидкости, спинномозговой жидкости, мокроты, бронхоальвеолярной лаважной жидкости, желудочного секрета, слюны, сыворотки крови, плазмы крови и крови. Образец может быть свежим или архивным (например, замороженный образец, фиксированный в формалине образец или фиксированный, заключенный в парафин образец). В частности, биологический образец может представлять собой биологическую жидкость, предпочтительно выбранную из крови, плазмы крови, сыворотки крови, слюны и мочи. Он также может представлять собой клетки любого типа, экстрагированные из образца крови, такие как мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), субпопуляции B-клеток, очищенные моноциты или нейтрофилы.

Выявление и/или количественное определение экспрессии генов можно осуществлять на уровне мРНК или на уровне белка способами, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Предпочтительно используют мультиплексные методы, позволяющие выявить и/или определить количественно экспрессию нескольких генов одновременно.

Способы выявления и/или количественного определения экспрессии гена на уровне мРНК можно выполнять непосредственно на мРНК или косвенно (например, после стадии конверсии мРНК в кДНК и/или стадии амплификации). Все эти способы включают в качестве первой стадии выделение РНК (и более конкретно мРНК) из образца способами, хорошо известными специалисту в данной области техники (см., например, Ausubel et al. (1997), Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons, Rupp and Locker (1987), Lab Invest. 56:A67, или De Andrés et al. (1995), BioTechniques 18:42044). В частности, выделение РНК можно выполнять с помощью набора для очистки, серии буферных растворов и протеазы от коммерческих производителей, таких как Qiagen, в соответствии с инструкциями производителя. Способы выявления и/или количественного определения экспрессии гена на уровне мРНК описаны, например, в Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 и в Relier G. H. et al., DNA Probes, 2^nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 and 6, p.173-249, и включают:

- Способы амплификации, которые позволяют создавать несколько копий целевого нуклеотидного фрагмента под действием фермента(-ов). Такие способы амплификации хорошо известны специалисту в данной области техники и включают ПЦР (полимеразную цепную реакцию), систему Fluidigm BioMark™, ЛЦР (лигазную цепную реакцию; см., например, патент US 5,494,810), РЦР (репарационную цепную реакцию), 3SR (самоподдерживающуюся репликацию последовательностей) в соответствии с заявкой на патент WO-A-90/06995, NASBA (амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот), TMA (транскрипционно-опосредованную амплификацию) в соответствии с патентом US-A-5,399,491 и LAMP (изотермическую амплификацию с формированием петель) в соответствии с патентом US6410278. В частности, когда используемым способом амплификации является ПЦР, более предпочтительно будет использована ОТ-ПЦР (ПЦР в сочетании с обратной транскрипцией, которая включает стадию обратного транскрибирования мРНК в кДНК) и более предпочтительно ОТ-кПЦР (количественная ОТ-ПЦР);

- Способы гибридизации и, в частности, микроматричные способы, систему NanoString nCounter®, способы Нозерн-блоттинга или способы гибридизации in situ, такие как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) (Parker & Barnes (1999), Methods in Molecular Biology 106:247-283), и

- Способы секвенирования (и, в частности, высокопроизводительное секвенирование).

Примеры способов выявления и/или количественного определения экспрессии гена на уровне белка могут быть выбраны из иммуноферментного анализа (ИФА), Вестерн-блоттинга, иммуногистохимии, проточной цитометрии и протеомики. Термин «протеом» определяют как всю совокупность белков, присутствующих в образце в определенный момент времени. Протеомика включает среди прочего исследование глобальных изменений экспрессии белка в образце (также называют «экспрессионной протеомикой»). Протеомика, как правило, включает следующие стадии: (1) выделение отдельных белков в образце методом двумерного гель-электрофореза (2D Э-ПААГ); (2) идентификацию отдельных белков, выделенных из геля, например, методом масс-спектрометрии или N-концевого секвенирования, и (3) анализ данных с использованием биоинформатики.

Особенно предпочтительно выявлять и/или количественно определять экспрессию внеклеточных белков, которые секретируются и могут быть выявлены неинвазивными методами, например, в крови, плазме крови, сыворотке крови, моче или перьях. Более предпочтительно он пригоден для отбора белков, обнаруживаемых во внеклеточном матриксе, таких как белки, кодируемые следующими генами: Anxa1, Anxa2, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, Kera, Lgals1, Mgp, Nes, Postn, Slit3, Thbs1 и Tnc; более предпочтительно белков, кодируемых следующими генами: Anxa1, Anxa2, Efemp1, Kera, Lgals1, Mgp, Nes, Postn, Slit3, Thbs1 и Tnc. Еще более предпочтительно он пригоден для выбора белков, которые, по литературным данным, уже были выявлены в крови или моче, таких как белки, кодируемые следующими генами: Anxa2, Efemp1, Lgals1, Mgp, Postn, Slit3 и Thbs1.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу in vitro, как описано выше, включающему стадию сравнения уровня экспрессии гена в указанном образце указанного субъекта (исследуемом образце) для каждого из по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми, по меньшей мере девяти, по меньшей мере десяти, по меньшей мере одиннадцати, по меньшей мере двенадцати, по меньшей мере тринадцати, по меньшей мере четырнадцати, по меньшей мере пятнадцати, по меньшей мере шестнадцати, по меньшей мере семнадцати, по меньшей мере восемнадцати, по меньшей мере девятнадцати, по меньшей мере двадцати, по меньшей мере двадцати одного, по меньшей мере двадцати двух, по меньшей мере двадцати трех, по меньшей мере двадцати четырех, по меньшей мере двадцати пяти или по меньшей мере двадцати шести генов, описанных выше, с референтным значением или с уровнем экспрессии гена в референтном образце. Более предпочтительно указанное референтное значение соответствует контрольному значению, или указанный референтный образец соответствует образцу от контрольного субъекта (т.е. субъекта, не подвергавшегося воздействию стрессогенного фактора), а статистически значимое различие между уровнем экспрессии гена в испытуемом образце и референтным значением или уровнем экспрессии гена в референтном образце указывает на стрессовое состояние у субъекта.

Для анализа данных можно использовать широкий ряд алгоритмов, известных специалисту в данной области техники. Примером такого алгоритма является система классификации на основе балльной оценки, описанная в примере 4. Другие неограничивающие примеры алгоритмов включают алгоритмы структурной и синтаксической системы статистической классификации и методы построения индекса риска, в которых используются признаки распознавания структуры, включая хорошо разработанные методики, такие как, среди прочего, метод главных компонент (PCA), метод вращения факторов, логистическую регрессию (LogReg), линейный дискриминантный анализ (LDA), эйджен-генный линейный дискриминантный анализ (ELDA), метод опорных векторов (SVM), модель случайного леса (RF), дерево рекурсивного секционирования (RPART), а также другие родственные методики классификации на основе дерева решений, сжатый центроидный анализ (SC), метод K-ближайшего соседа, бустинг-анализ, деревья решений, нейронные сети, байесовские сети и скрытые марковские модели, метод линейной регрессии или линейные алгоритмы классификации, метод нелинейной регрессии или нелинейные алгоритмы классификации, дисперсионный анализ (ANOVA), иерархический анализ или алгоритмы кластеризации; иерархические алгоритмы, в которых используются деревья решений; ядерные машинные алгоритмы, такие как, среди прочего, ядерный алгоритм частичных наименьших квадратов, ядерные алгоритмы аппроксимации с преследованием, ядерные алгоритмы дискриминантного анализа Фишера или ядерные алгоритмы метода главных компонент.

Индивидуумы, у которых идентифицировано стрессовое состояние и/или высокий уровень стрессовой реакции, могут предпочтительно получать интервенционные решения. Таким образом, описанный выше способ может также включать стадию обеспечения указанного индивидуума интервенционным решением, которое предпочтительно представляет собой решение о питании, более предпочтительно выбранное из группы, состоящей из антиоксидантов и, в частности, витаминов (например, витамина E), аминокислот (например, метионина, селенметионина), микроэлементов и пробиотиков.

Настоящее изобретение также относится к способу in vitro прогнозирования эффективности интервенционного решения у субъекта, мониторинга эффективности интервенционного решения у субъекта и/или идентификации эффективности интервенционного решения для субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми, по меньшей мере девяти, по меньшей мере десяти, по меньшей мере одиннадцати, по меньшей мере двенадцати, по меньшей мере тринадцати, по меньшей мере четырнадцати, по меньшей мере пятнадцати, по меньшей мере шестнадцати, по меньшей мере семнадцати, по меньшей мере восемнадцати, по меньшей мере девятнадцати, по меньшей мере двадцати, по меньшей мере двадцати одного, по меньшей мере двадцати двух, по меньшей мере двадцати трех, по меньшей мере двадцати четырех, по меньшей мере двадцати пяти, по меньшей мере двадцати шести генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, в образце указанного субъекта.

В частности, настоящее изобретение также относится к способу in vitro прогнозирования эффективности интервенционного решения у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, в образце указанного субъекта. Предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как предыдущие, описанные выше варианты осуществления.

Настоящее изобретение также относится к способу in vitro мониторинга эффективности интервенционного решения у субъекта, включающему стадию выявления экспрессии и/или количественного определения, после того как указанный субъект получил интервенционное решение, уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, в образце указанного субъекта. Предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как предыдущие, описанные выше варианты осуществления.

Настоящее изобретение также пригодно для скрининга перспективных интервенционных решений для обнаружения новых или оптимальных интервенционных решений. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу in vitro идентификации интервенционного решения, включающему стадию обеспечения субъекта перспективным интервенционным решением и стадию сравнения экспрессии и/или уровня экспрессии между образцами указанного субъекта, до и после того как указанный субъект получил перспективное интервенционное решение, по меньшей мере четырех генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc. Предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как предыдущие, описанные выше варианты осуществления.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для амплификации и/или выявления экспрессии по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми, по меньшей мере девяти, по меньшей мере десяти, по меньшей мере одиннадцати, по меньшей мере двенадцати, по меньшей мере тринадцати, по меньшей мере четырнадцати, по меньшей мере пятнадцати, по меньшей мере шестнадцати, по меньшей мере семнадцати, по меньшей мере восемнадцати, по меньшей мере девятнадцати, по меньшей мере двадцати, по меньшей мере двадцати одного, по меньшей мере двадцати двух, по меньшей мере двадцати трех, по меньшей мере двадцати четырех, по меньшей мере двадцати пяти, по меньшей мере двадцати шести генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc. Предпочтительные варианты осуществления (в частности, предпочтительные перечни генов) являются такими же, как описано выше.

Предпочтительно указанный набор содержит средства для амплификации и/или выявления экспрессии всего максимум 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 генов (включая целевые гены и возможно также гены «домашнего хозяйства»). Действительно, указанный набор может содержать средства для амплификации и/или выявления экспрессии не только генов, выбранных из перечня двадцати шести генов, как описано выше, но также других представляющих интерес генов (в совокупности «целевых генов») и/или генов «домашнего хозяйства».

Средства для амплификации хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, например, праймеры, пригодные для выполнения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймер представляет собой нуклеотидный фрагмент (обычно от 5 до 100 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов), который может специфично гибридизоваться с участком целевой нуклеотидной последовательности и в определенных условиях может действовать как точка инициации синтеза (например, в присутствии нуклеотидов и ДНК-полимеразы и т.п., и при подходящих значениях температуры и pH). В настоящем изобретении целевая нуклеотидная последовательность должна представлять собой нуклеотидный фрагмент, содержащийся внутри мРНК или кДНК гена в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, используют пары праймеров (состоящие из двух праймеров).

Набор для ПЦР может также содержать другие реагенты, пригодные для выполнения реакции ПЦР, в частности полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), такие как обратные транскриптазы, полимеразы (например, Taq полимераза), нуклеотиды, буферные растворы и зонды (см. ниже).

Средства для выявления экспрессии генов также хорошо известны специалистам в данной области техники и включают:

- средства для выявления экспрессии генов на уровне мРНК, такие как зонды. Зонды представляют собой фрагменты ДНК или РНК переменной длины (обычно от 5 до 500 нуклеотидов в длину), который может специфично гибридизоваться с участком целевой нуклеотидной последовательности в определенных условиях, и который является меченным детектируемой меткой (такой как флуоресцентная, радиоактивная, ферментативная метка или метка для любой другой системы детектирования), что, таким образом, позволяет выявить целевую нуклеотидную последовательность. В настоящем изобретении целевая нуклеотидная последовательность должна представлять собой нуклеотидный фрагмент, содержащийся внутри мРНК или кДНК гена в соответствии с настоящим изобретением;

- средства для выявления экспрессии гена на уровне белка, такие как антитела и другие типы связывающих молекул или связывающих веществ (например, фрагменты антител, такие как Fab, scFv или аффитела, нанотела, DARP-ины, антикалины - см., например, Vazquez-Lombardi et al (2015), Drug Discovery Today, 20(10), p.1271-1283).

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению средств для амплификации и/или выявления экспрессии по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми, по меньшей мере девяти, по меньшей мере десяти, по меньшей мере одиннадцати, по меньшей мере двенадцати, по меньшей мере тринадцати, по меньшей мере четырнадцати, по меньшей мере пятнадцати, по меньшей мере шестнадцати, по меньшей мере семнадцати, по меньшей мере восемнадцати, по меньшей мере девятнадцати, по меньшей мере двадцати, по меньшей мере двадцати одного, по меньшей мере двадцати двух, по меньшей мере двадцати трех, по меньшей мере двадцати четырех, по меньшей мере двадцати пяти, по меньшей мере двадцати шести генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, или набора, как описано выше, для идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния, и/или для оценки (и/или количественного определения) уровня стрессовой реакции, и/или для прогнозирования эффективности интервенционного решения, и/или для мониторинга эффективности интервенционного решения у субъекта, и/или для идентификации или сравнения интервенционного решения. Предпочтительные варианты осуществления (в частности, предпочтительные перечни генов) являются такими же, как описано ранее.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1: График многомерного масштабирования (MDS) различных образцов, проанализированных для каждой модели стресса: (A) цыплята/стресс, связанный с питанием (модель PN); (B) свиньи/тепловой и воспалительный стресс (модель CT); (C) мыши/стресс, вызванный физической нагрузкой (модель SN), и (D) цыплята/тепловой стресс (модель PT). Точки соответствуют контролю (ctrl), адаптированным (adapt) и неадаптированным (una) группам животных.

Фиг.2: Диаграмма Венна всех генов с дифференциальной экспрессией (DE) в четырех моделях стресса. На этом графическом представлении показано, что четыре гена дифференциально экспрессируются в по меньшей мере одном сравнении для каждой модели. Этот перечень был расширен до 26 генов путем учета генов, консервативных в по меньшей мере трех из четырех моделей. mPN-h (мРНК-гены модели PN с использованием номенклатуры генов человека), mPT-h (мРНК-гены модели PT с использованием номенклатуры генов человека), mCT-h (мРНК-гены модели CT с использованием номенклатуры генов человека), mSN-h (мРНК-гены модели SN с использованием номенклатуры генов человека). Эта диаграмма была построена с помощью веб-инструмента Venny 2.1.0 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/).

Фиг.3: Профиль дифференциальной экспрессии для каждого из 26 консервативных генов в каждом сравнении для четырех моделей. Каждой вертикальной линией представлено изменение экспрессии гена, выраженное как log2 кратности изменения, между двумя состояниями: адаптированным по сравнению с контролем (AvsC), неадаптированным по сравнению с контролем (NAvsC) и неадаптированным по сравнению с адаптированным (NAvsA). Сплошной черной линией указан нулевой уровень log2 кратности изменения, соответствующий отсутствию дифференциальной экспрессии. Наблюдали, что большинство генов проявляют конвергентный профиль экспрессии во всех видах сравнений и моделей.

Фиг.4: Представление 26 белков, кодируемых 26 консервативными генами, в виде сети переплетенных нитей. Края, имеющие интенсивность цвета на уровне серого, представляют уровень доверительной области для каждого взаимодействия, при этом более темные линии соответствуют более высокому доверительному баллу. Значение p статистической значимости, полученное из этой сети, составляло 3,21*e^-10.

Фиг.5: Представление в виде лепестковой диаграммы балльной оценки стресса (вертикальная ось), балльной оценки адаптации (ось справа) и балльной оценки неадаптации (ось слева), полученной в результате компьютерной обработки выборки дифференциально экспрессируемых генов (слева: двадцать шесть генов; справа: четыре наиболее консервативных гена) в группах животных, подвергавшихся стрессовому воздействию (сверху: модели PN животных в условиях неадаптации (NA); снизу: цыплята, подвергавшиеся стрессовому воздействию, вызванному паракватом).

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами не исчерпывающим образом. Данные примеры предназначены только для цели иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1: Идентификация двадцати шести консервативных генов, пригодных для идентификации стрессового состояния у субъекта

Материалы и методы

- Конструирование модели стресса

На основании предыдущих исследований было выбрано и сконструировано четыре модели стресса, в которых три биологических вида подвергали четырем стрессогенным факторам: (i) Цыплят подвергали тепловой провокации (Loyau et al. (2016) BMC Genomics, 17: 329); (ii) Свиней подвергали провокации теплом и воспалением (Campos et al. (2014), The Veterinary Journal, 200, 404-409); (iii) Цыплят подвергали провокации, связанной с питанием; (iv) Мышей подвергали провокации физической нагрузкой (Rederstorff et al. (2011), PLoS ONE, 6(8): e23094).

Кратко, в модели цыплята/тепловой стресс (PT модель) куриные яйца держали при 37,8°C и относительной влажности 56% в течение всего периода инкубации или инкубировали при 39,5°C и относительной влажности 65% в течение 12 ч/24 ч от E7 до E16 дней эмбрионального развития включительно. После вылупления цыплят-самцов переносили в отдельный курятник и выращивали с 0-го по 32-й день. Температуру снижали с 33°C на 0-й день до 21°C на 25-й день, а затем держали при 21°C. На 34-й день контрольную группу цыплят и группу, подвергнутую температурным манипуляциям, подвергали воздействию 32°C в течение 5 ч. В качестве контрольной группы использовали животных, не подвергнутых тепловой провокации во время эмбрионального развития и выращенных в стандартных условиях. Температуру тела измеряли в ходе тепловой провокации и на 35-й день, после возврата к 21°C. Для анализа экспрессии генов животных, лучше перенесших тепло на уровне эмбриональной тепловой акклиматизации, отбирали в группу с низкой температурой тела (адаптированную) и сравнивали с неадаптированной и контрольной группами, у которых температура тела была повышена. Их умерщвляли и выделяли грудные мышцы, подвергали их мгновенной заморозке и хранили при -80°C до дальнейшего анализа.

В отношении модели свиньи/тепловой и воспалительный стресс (CT модель) 77-дневных свиней держали при постоянной температуре 24°C в течение 14-дневного периода адаптации, затем делили на две группы, где в одной группе животных держали в условиях нейтральной температуры (24°C), а в другой группе животных подвергали воздействию высокой температуры в течение 17 дней. В высокотемпературной группе температуру в помещении поддерживали при 24°C в течение 5 дней, затем постепенно повышали до 30°C. Начиная с 8-го дня периода тепловой провокации, свиньям вводили пять инъекций липополисахарида (ЛПС) из E.coli на 8, 10, 12, 14, 16 дни периода теплового стресса. Свиней взвешивали по отдельности в начале и в конце периода эксперимента и регистрировали ректальную температуру. Всех животных подвергали эвтаназии через 24 часа после последней инъекции ЛПС. Для анализа экспрессии генов животных, подвергнутых стрессу, у которых присутствовали самые большие отклонения массы тела по сравнению с контрольной группой, назначали в неадаптированную группу, а животных, подвергнутых экспериментальной обработке, но с массой тела, сходной с массой тела контрольной группы, назначали в адаптированную группу. Квалификация этих двух групп, на которые воздействовали стрессогенным фактором, была дополнительно валидирована на основании анализов плазмы крови, в которых оценивали гормональный ответ и состояние окислительного стресса.

Модель цыплята/стресс, связанный с питанием (PN модель), заключалась в том, что цыплят кормили двумя различными рационами с добавлением низкой (17%) или обычной (22%) концентрации сырого белка. На первые две недели жизни цыплят помещали на стандартный стартерный рацион на основе кукурузы и сои (22% СП/3000 ккал/кг), чтобы обеспечить нормальное развитие. С 15-го дня цыплят подвергали эксперименту на изоэнергетическом рационе с низким или высоким содержанием белка до 6-недельного возраста. У 24 птиц для каждого условия кормления брали образцы крови и тканей. Для оценки различия гормонального и окислительного статуса между экспериментальными рационами в период роста измеряли концентрации кортикостерола, йодтиронина T3-T4, активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП) и глутатиона в плазме крови. Кроме того, до и после эксперимента регистрировали массу тела животных. На основании прироста массы тела и показателей окисления ответы подвергнутых стрессу животных были в высокой степени вариабельными, некоторые из них были ближе к референтным значениям контрольной группы, а другие значимо отличались. Чтобы учесть эту вариабельность, авторы изобретения определили две подгруппы подвергнутых стрессу животных: адаптированные животные (коэффициент конверсии корма близок к значениям у контрольных животных) и неадаптированные животные (коэффициент конверсии корма значимо отличался от значений у контрольных животных). На 6-й неделе отбирали образцы грудных мышц и хранили при -80°C до дальнейшего анализа.

Для модели мыши/стресс, вызванный физической нагрузкой (SN модель), мышей, трансгенных по гену Selenon-/- (KO/KO), или гетерозиготных мышей (KO/дикий тип (ДТ)) 8-12-месячного возраста подвергали тесту форсированного плавания. В этом исследовании каждую из 15 мышей KO/KO и 9 мышей KO/ДТ заставляли плавать в течение шести минут ежедневно в течение двух месяцев. На основании способности плавать и показателей массы тела в когорте KO/KO определили две подгруппы. Тех, у которых наблюдали потерю массы тела и трудности с выполнением плавательной нагрузки, относили к категории неадаптированных животных, а тех, у которых наблюдали только незначительные фенотипические изменения или не наблюдали изменений вовсе, относили к категории адаптированных животных. Брали образцы крови и измеряли общую окислительно-восстановительную потенциальную способность плазмы крови с помощью системы RedoxSYS® (Luoxis, Энглвуд, США). Значения, полученные для подвергнутых стрессу животных обеих, адаптированной и неадаптированной, подгрупп по сравнению с группой KO/ДТ, согласовывались с показателем потери массы тела. По окончании двухмесячного периода эксперимента животных подвергали эвтаназии, собирали паравертебральную мышечную ткань и хранили при -80°C до дальнейшего анализа.

- Выделение и очистка суммарной РНК

В соответствии с биологическими индикаторами, измеренными в каждой модели стресса, авторы изобретения определили четырех животных-представителей адаптированной и неадаптированной подгрупп; также было отобрано четыре животных из контрольной группы. С помощью гомогенизатора FastPrep-24 5GTM (mpbio®) и 1,4 мм керамических шариков (6913-100, mpbio®) образцы мышцы гомогенизировали в буферном растворе Tri Reagent (Sigma®) по 1,5 мл на 100 мг ткани, дважды по 40 с и со скоростью 6 м/с. После центрифугирования в течение 10 мин при 12 ООО g при 4°C собирали 1 мл супернатанта. Добавляли двести мкл хлороформа, и после перемешивания на вихревой мешалке смесь центрифугировали в течение 10 мин при 12 ООО g при 4°C. Собирали пятьсот мкл верхней водной фазы и осаждали РНК добавлением одного объема изопропанола 100% при комнатной температуре в течение 10 мин. После центрифугирования в течение 10 мин при 10 ООО g при 4°C супернатант удаляли и осадок высушивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Осадок РНК повторно солюбилизировали в 50 мкл воды, свободной от ДНКаз и РНКаз, и инкубировали в течение 10 мин на льду. Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific).

Затем суммарную РНК, включая мРНК и длинную некодирующую РНК, очищали с помощью набора реактивов RNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research). Десять мкг суммарной РНК очищали в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию и чистоту образцов РНК измеряли с помощью NanoDrop, а ее целостность (RIN) оценивали с помощью Bio-Analyzer 2100 (Agilent Technologies). Значения RIN находились в диапазоне от 8,0 до 9,6.

- Секвенирование РНК

Проводили обратную транскрипцию очищенной РНК с получением кДНК и проводили секвенирование на приборе GenomEast Plateforme, IGBMC с использованием технологии HiSeq Illumina® (HiSEQ 4000). Извлекали файлы последовательности FASTQ, содержащие считывания.

- Обработка данных секвенирования РНК

Для выполнения выравнивания считываний по сравнению с геномом в соответствии с аннотациями генома использовали инструмент HISAT2 версии 2.0.4 с параметрами по умолчанию. На этой стадии использовали следующие аннотации GTF и геномные файлы FASTA, описанные ниже: (i) Для кур использовали геном Galgal5 с его ассоциированными аннотациями Национального центра биотехнологической информации (NCBI); (ii) для свиней использовали геном Sscrofa11.1 с его ассоциированными аннотациями NCBI и (iii) для мышей использовали геном GRCm38.p5 (mm10.p5) с его ассоциированными аннотациями программы Ensembl версии M14.

Уровень экспрессии гена измеряли путем подсчета считываний, используя инструмент HTSeq версии 0.6.1 с параметрами по умолчанию. Наконец, использовали инструмент EdgeR пакета программ SARTools R для определения дифференциально экспрессируемых генов между тремя условиями тестирования: адаптированные по сравнению с контрольными, неадаптированные по сравнению с контрольными и неадаптированные по сравнению с адаптированными, соответственно обозначенными AvsC, NAvsC и NAvsA. Чтобы устранить вариабельность между образцами, авторы изобретения использовали модифицированную версию EdgeR в робастном режиме, которая выполняет расчет различных дисперсий в соответствии с методами, разработанными Zhou и Robinson (см. список литературы). Те же параметры использовали для всех моделей с применением поправки значения p методом Бенджамини-Хохберга. Дифференциально экспрессируемые (DE) гены из каждой модели определяли с использованием классического порогового значения для значения p с поправкой (padj) 0,05.

- Сравнения моделей

Как только для каждой модели был установлен перечень DE, авторы изобретения провели поиск названий человеческих ортологов каждого из этих генов с использованием инструмента BioMart, доступного в Интернете на вебсайте Ensembl (https://www.ensembl.org/). Эта стадия позволила решить проблему с межвидовой неоднородностью номенклатуры. Затем авторы изобретения загрузили все DE гены каждого сравнения в каждой модели и сравнили четыре перечня, чтобы охарактеризовать консервативные гены, вовлеченные в стрессовую реакцию. Авторы изобретения определили перечень консервативных генов путем выбора всех генов, общих для по меньшей мере трех из четырех моделей. Этот выбор был сделан, чтобы сравнение четырех строго различных моделей было более пермиссивным, и чтобы избежать систематических ошибок неверного назначения на стадии BioMart, в основном в связи с тем, что семейства генов состоят из большого количества и высокого подобия паралогичных генов.

Результаты

В предшествующих анализах для каждой модели была определена серия физиологических индикаторов (потеря массы тела, гормональные маркеры крови, измерение окислительного уровня), характерных для подвергнутых стрессу животных по сравнению с контрольными. В проведенных авторами изобретения экспериментах анализ этих маркеров показал, что ответы подвергнутых стрессу животных были в высокой степени вариабельными (немодальное распределение), некоторые из них были ближе к референтным значениям контрольной группы, а другие значимо отличались. Чтобы учесть эту дисперсию между подвергнутыми стрессу животными, авторы изобретения определили две подгруппы: адаптированных и неадаптированных животных со сходными показателями по сравнению с контрольными животными и значимо отличающимися от них соответственно. Для каждой подгруппы - адаптированной, неадаптированной и контрольной - была отобрана серия из четырех животных. Транскриптомные анализы проводили на мышцах, которые являются динамичной тканью с высоким ответом на воздействие стрессогенного фактора. Из образцов мышц выделяли суммарную РНК и секвенировали транскрипты ДНК, используя технологию RNAseq. Качество сбора данных валидировали, используя программу FASTQC. Для оценки дисперсии данных и процедуры нормализации экспрессии генов в каждом образце использовали программу SARTool. С помощью графического представления MDS было верифицировано относительное кластерное распределение анализируемых животных в каждой модели на три идентифицированных группы - контрольную, адаптированную и неадаптированную (Фиг.1), несмотря на их большую межиндивидуальную вариабельность. Тем не менее, для модели цыплята/тепловой стресс в одном из четырех контрольных образцов (a_ctrl) была выявлена нетипичная вариабельность по сравнению с другими животными этой группы (Фиг.1D), поэтому его посчитали выпадающим значением и удалили из контрольной серии для сравнительного анализа экспрессии генов.

Для модели свиньи/тепловой и воспалительный стресс авторы изобретения заметили необычную кластеризацию животных на две группы независимо от стрессового контекста, что можно было бы объяснить, в основном, различиями по полу (Фиг.1B: животные, сгруппированные на левой стороне, соответствовали самкам, за исключением j-adapt, а животные, сгруппированные на правой стороне, соответствовали самцам). Следовательно, в сравнительный анализ экспрессии генов был введен коэффициент блокировки «пол», чтобы учесть различия стрессовой реакции между самцами и самками свиней. Сравнительный анализ между тремя категориями подвергнутых стрессу и контрольных животных позволил идентифицировать перечень дифференциально экспрессируемых генов (DE) в каждой модели стресса. Количество DE генов между подвергнутыми стрессу и контрольными животными указано в таблице 1. Примечательно, что сравнение неадаптированных групп с контрольными в большинстве случаев показало большее количество DE генов, кроме одной модели (модель цыплята/тепловой стресс). На основании экспрессии геномной программы это наблюдение позволило предположить, то неадаптированные животные более дивергентны по сравнению с контролем, чем адаптированные. Этого не наблюдалось в случае модели цыплята/тепловой стресс, но в этом случае животных подвергали предварительной обработке в ходе эмбриогенеза (эмбрионального развития), которая индуцировала предварительную адаптацию, индуцирующую настройку геномной программы, стимулирующей адаптацию.

Таблица 1. Количество DE генов на одно сравнение для каждой модели с пороговым значением padj 0,05. AvsC: адаптированная группа по сравнению с контрольной; NAvsC: неадаптированная группа по сравнению с контрольной; NAvsA: неадаптированная группа по сравнению с адаптированной.

Модели	Модель свинья/тепловой и воспалительный стресс	Модель мышь/стресс, вызванный физической нагрузкой	Модель цыплята/тепловой стресс	Модель цыплята/стресс, связанный с питанием
Сравнение	Модель свинья/тепловой и воспалительный стресс	Модель мышь/стресс, вызванный физической нагрузкой	Модель цыплята/тепловой стресс	Модель цыплята/стресс, связанный с питанием
AvsC	282	356	278	65
NAvsC	339	1394	39	275
NAvsA	35	220	133	15

Анализ дифференциальной экспрессии позволил определить перечень DE генов на основании выбранного порогового значения padj 0,05. Количество DE генов, обнаруженных с помощью этого фильтра для каждого сравнения в каждой модели, сведено в таблицу 1. Для сравнения этих перечней вместе авторы изобретения сначала создали один перечень DE генов для каждой модели независимо от того, в каком сравнении они дифференциально экспрессировались, предполагая, что это всегда будет связано со стрессовой реакцией. Затем с помощью графического представления в виде диаграммы Венна было обнаружено четыре гена, консервативных между всеми четырьмя моделями (Фиг.2). Чтобы свести к минимуму систематические ошибки при этом подходе, авторы изобретения решили расширить перечень, включая гены, консервативные между по меньшей мере тремя моделями, а затем обнаружили 26 консервативных генов, дифференциально экспрессирующихся в процессе стрессовой реакции: Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc (таблица 2).

Четыре гена, консервативных между четырьмя моделями, представляли собой: Anxa1, Anxa2, Chac1 и Postn. Шесть генов, консервативных между PT, PN и CT моделями, представляли собой: Col1a1, Col12a1, Gfpt2, Mgp, Thbs1 и Tnc. Два гена, консервативных между PT, SN и CT моделями, представляли собой Mrc1 и Serpinh1. Шесть генов, консервативных между PT, PN и SN моделями, представляли собой: Cidea, Hmox1, Kctd12, Lgals1, Sh2b2 и Slit3. Восемь генов, консервативных между CT, PN и SN моделями, представляли собой: Ankrd33b, Col14a1, Efemp1, G0s2, Kera, Nes, Panx1 и Runx1.

Таблица 2. Перечень дифференциально экспрессируемых генов, консервативных между различными моделями. ВКМ=внеклеточный матрикс, ЭР=эндоплазматический ретикулум; цито=цитоплазма; мемб=мембрана

Ген	NM сравнительная последовательность у человека (мРНК)	NP сравнительная последовательность у человека (белок)	Идентифицированная функция белка	Локализация белка в клетке
Ankrd33b	NM_001164440	NP_001157912	Неизвестно	Неизвестно
Аннексин A1 - Anxa1	NM_000700	NP_000691	Репарация клеточной мембраны и воспаление	Мемб, секретируемый, ядро, цито
Аннексин A2 - Anxa2	NM_001002858.2	NP_001002858.1	Репарация клеточной мембраны	Секретируемый
Chac1	NM_024111.6	NP_077016.3	Деструкция глутатиона	Цито
Cidea	NM_001318383.1	NP_001305312.1	Апоптоз, энергетический метаболизм	Ядро, липидные капли
Коллаген 1 - Col1a1	NM_000088	NP_000079	Компонент ВКМ	ВКМ
Коллаген 12 - Col12a1	NM_004370.6	NP_004361.3	Компонент ВКМ, ассоциированный с фибриллами коллаген	ВКМ
Коллаген 14 - Col14a1	NM_021110	NP_066933	Компонент ВКМ, ассоциированный с фибриллами коллаген	ВКМ
Фибулин 3 - Efemp1	NM_001039348.3	NP_001034437.1	Клеточная адгезия и дифференцировка	ВКМ
G0s2	NM_015714	NP_056529	Регуляция липолиза и апоптоза	Митохондрии
Gfpt2	NM_005110	NP_005101	Глутамин-фруктозо-6-фосфаттрансаминаза 2	Цито
Hmox1	NM_002133	NP_002124	Гемоксигеназа, образует биливердин	ЭР
Kctd12	NM_138444	NP_612453	Вспомогательная субъединица ГАМК-B рецепторов	Мемб
Kera	NM_007035	NP_008966	Кератансульфатпротеогликан	ВКМ
Lgals1	NM_002305	NP_002296	Лектин-связывающий галактозид, роль в апоптозе, адгезии и клеточной дифференцировке	ВКМ
Mgp	NM_000900	NP_000891	Регуляция минерализации кальция	ВКМ
Mrc1	NM_002438	NP_002429	Рецептор маннозы макрофагов	Мемб
Nes	NM_006617	NP_006608	Посредник виментина в динамике сборки филаментов	ВКМ, цитоскелет, цито
Паннексин 1 - Panx1	NM_015368	NP_056183	Структурный компонент щелевых контактов	Мемб, ЭР
Периостин - Postn	NM_006475.3	NP_006466.2	Клеточная адгезия	Секретируемый, ВКМ
Runx1	NM_001754.4	NP_001745.2	Фактор транскрипции, важный для регенерации мышц	Ядро
Serpinh1	NM_001207014.1	NP_001193943.1	Шаперон коллагена	ЭР
Sh2b2	NM_020979.4	NP_066189.3	Белок-адаптер для рецепторов тирозинкиназы, инсулиновый ответ	Мемб, цито
Slit3	NM_001271946.1	NP_001258875.1	Клеточная миграция	ВКМ
Thbs1	NM_003246	NP_003237	Связывание адгезивного гликопротеина, гепарина и коллагена	ВКМ, ЭР
Тенаскин - Tnc	NM_002160	NP_002151	Клеточная адгезия и рост	ВКМ

Пример 2: Определение функциональных характеристик двадцати шести консервативных генов

После того, как был получен перечень 26 консервативных генов, авторы изобретения хотели узнать, играют ли они роль в одном и том же биологическом процессе, локализованы ли они совместно и могут ли взаимодействовать друг с другом.

Материалы и методы

Чтобы изучить степень взаимосвязи представляющих интерес генов, авторы изобретения использовали вебсайт String 10.5 (https://string-db.org/). Края (Edges) в данном случае соответствуют прогнозируемым функциональным ассоциациям. Для редактирования графических свойств представления программы String авторы изобретения также использовали программное обеспечение Cytoscape версии 3.6.1. Этот инструмент дал возможность окрасить точки пересечения градиентом серого цвета в соответствии с log2 кратности изменения, что дало больше информации об уровне дифференциальной экспрессии. Для получения большей информации о функции этих генов авторы изобретения выполнили анализы обогащения, опять же, используя вебсайт String, предоставляющий пользователю анализы статистического обогащения терминами системы классификации онтологии генов (Gene Ontology, GO) в дополнение к представлению сети.

Результаты

Чтобы лучше охарактеризовать биологическую функцию 26 консервативных генов, авторы изобретения сначала использовали визуализацию в параллельных координатах, чтобы сравнить профиль экспрессии в каждой модели с использованием значений log2 кратности изменения (Фиг.3). Это представление показало, что даже если уровень дифференциальной экспрессии этих генов был неодинаковым во всех четырех моделях, большинство из них имели общий профиль экспрессии во всех моделях стресса, почти всегда повышая или понижая регуляцию вместе. Наиболее дивергентным геном, сравниваемым по этому общему признаку, был ген Chac1. Эти наблюдаемые результаты показали, что большая часть этих генов экспрессируется совместно, возможно, посредством уникального сигнального пути или фактора транскрипции. Авторы изобретения также могли бы предположить, что эти совместно экспрессируемые гены должны составлять часть одного и того же биологического процесса, играя совместную функциональную роль.

Затем авторы изобретения охарактеризовали клеточную локализацию белков, кодируемых этими генами. Объединив литературные данные и базу данных Uniprot, авторы изобретения смогли охарактеризовать подперечень из 14 белков из 26, которые могли быть локализованы вне клетки во внеклеточном матриксе (ВКМ) или секретироваться (таблица 2). Библиографическое изучение этих белков также представило доказательства того, что часть из них входит в состав семейства белков внеклеточного матрикса. Это семейство состоит из внеклеточных белков, обнаруживаемых в ВКМ, но не только вовлеченных в его структурную архитектуру. Известно, что белки внеклеточного матрикса участвуют в нескольких процессах, таких как регуляция клеточной адгезии, дифференцировка и пролиферация, межклеточные взаимодействия, а также пути преобразования сигнала.

Используя вебсайт String, авторы изобретения показали, что 15 из 26 представляющих интерес белков (13 в сети и 2 других) по меньшей мере функционально соединены, что подтверждает доказательства их совместной экспрессии и локализации (Фиг.4). Эта взаимосвязь позволяет предположить, что эти гены вовлечены в общий биологический процесс.

Кроме того, онтологическое обогащение с использованием вебсайта String также согласовывалось с концепцией о том, что внеклеточные белки играют роль в общем биологическом процессе, на что указывает обогащение такими понятиями, как «организация внеклеточного матрикса», «организация коллагеновых фибрилл» или «регуляция преобразования сигнала» (таблица 3).

Все эти доказательства, взятые вместе, указывают на то, что подгруппа 26 консервативных генов связана с уникальным биологическим процессом, проходящим вне клетки на уровне ВКМ. Авторы изобретения также могут прогнозировать, что этот биологический процесс связан не только со структурным составом ВКМ, но также вовлечен в клеточную судьбу посредством внеклеточной коммуникации и внутриклеточного преобразования сигнала в соответствии с ответом на стресс.

Таблица 3. Онтологическое обогащение в категории «биологический процесс» в соответствии с вебсайтом String. Эти данные указывают на то, что большинство из 26 генов вовлечено во внеклеточные функции, такие как организация внеклеточного матрикса и/или регуляция преобразования сигнала.

Биологический процесс (GO)
ID пути	Описание пути	Кол-во в серии генов	Частота ошибочного распознавания
GO:0030198	организация внеклеточного матрикса	9	1,54e-06
GO:0030199	организация коллагеновых фибрилл	5	4,94e-06
GO:0048731	развитие системы	16	0,000473
GO:0001501	развитие скелетной системы	7	0,00182
GO:0010033	ответ на органическое вещество	13	0,00182
GO:0007275	развитие многоклеточного организма	16	0,0191
GO:0014070	ответ на циклическое органическое соединение	16	0,0426
GO:0032963	процесс метаболизма коллагена	4	0,00442
GO:0009966	регуляция преобразования сигнала	12	0,0458
GO:0051239	регуляция процессов многоклеточного организма	12	0,0458
GO:0060351	развитие хряща, вовлеченного в морфогенез эндохондральной кости	3	0,0458
GO:0051241	отрицательная регуляция процессов многоклеточного организма	8	0,0925
GO:1901700	ответ на кислородсодержащее соединение	9	0,00951
GO:0009611	ответ на ранение	7	0,0153
GO:0031340	положительная регуляция слияния везикул	2	0,0153
GO:32964	процесс биосинтеза коллагена	2	0,0153
GO:0048583	регуляция ответа на стимул	13	0,0153
GO:0001817	регуляция выработки цитокинов	6	0,0151
GO:0010812	отрицательная регуляция адгезии клеточного субстрата	3	0,0197
GO:0051216	развитие хряща	4	0,0202
GO:0048856	развитие анатомических структур	14	0,022
GO:0060348	развитие костей	4	0,0229
GO:0060350	морфогенез эндохондральной кости	3	0,0264
GO:0000302	ответ на активные формы кислорода	4	0,0281
GO:0009653	морфогенез анатомических структур
GO:0048513	развитие органов	11	0,0367
GO:0030574	процесс катаболизма коллагена	3	0,0394
GO:0001818	отрицательная регуляция выработки цитокинов	4	0,0397
GO:0048545	ответ на стероидные гормоны	5	0,0397
GO:0051259	олигомеризация белка	5	0,0397
GO:0061448	развитие соединительной ткани	4	0,0397
GO:0033555	ответ многоклеточного организма на стресс	3	0,0437
GO:0009719	ответ на эндогенный стимул	8	0,0449
GO:0048705	морфогенез скелетной системы	4	0,0449

Пример 3: Изучение базы данных GEO

26 генов, идентифицированных в настоящем исследовании, не входят в состав классических генов, обнаруженных в большинстве других исследований стресса или стрессовой реакции. Для подтверждения их вовлечения в этот биологический процесс авторы изобретения затем проанализировали базу данных GEO (Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) из NCBI. Эта общедоступная база данных содержит необработанные данные экспериментов по RNA-seq (секвенирование РНК) и анализа на микрочипах и может быть запрошена онлайн или по запросам в строке команд.

Материалы и методы

На момент выполнения авторами изобретения данного поиска (февраль 2017 г.) база данных GEO содержала около 95096 экспериментов. Чтобы запросить в базе данных GEO полученный авторами изобретения перечень генов, авторы изобретения использовали командный файл Python собственного изготовления, который позволил запрашивать в базе данных GEO каждый из 26 генов и извлекать из нее все эксперименты, в которых по меньшей мере один из этих генов дифференциально экспрессировался. Затем авторы изобретения проверили, часто ли эти гены дифференциально экспрессировались в исследованиях, посвященных воздействию стрессогенных факторов.

Результаты

Авторы изобретения обнаружили три эксперимента, в каждом из которых было показано 11 дифференциально экспрессирующихся генов из 26 генов (но не одни и те же 11 генов в каждом из трех экспериментов); один из них относился к ответу скелетных мышц на физическую нагрузку, а два других относились к изучению раковых заболеваний. При объединении генов, обнаруженных в трех экспериментах, получили следующий перечень генов: Anxa1, Anxa2, Col1a1, Col14a1, Efemp1, Hmox1, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Slit3, Thbs1 и Tnc. В большинстве случаев идентифицированные авторами изобретения эксперименты с использованием этого метода были связаны с воздействием стрессогенных факторов, заболеваниям, связанным с внеклеточным матриксом, или процессам старения. В этих исследованиях также было показано, что в эти механизмы вовлечена лишь подгруппа из 26 генов, и что часть из них часто дифференциально экспрессировалась совместно. Эти результаты, опять же, позволяют предположить, что лишь часть из исходной серии генов причастна к эволюционно консервативной стрессовой реакции, а другие больше зависят от природы стрессового фактора или более видоспецифичны.

Пример 4: Оценка от 4- до 26-генных сигнатур, выведенных из двадцати шести генов, в другой модели на животных

Результативность различных сигнатур, выведенных их двадцати шести генов, для идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта (отражаемой «баллом стресса») и/или для оценки уровня стрессовой реакции у субъекта и, в частности, для квалификации состояния адаптации у субъекта (отражаемой «баллом адаптации» или «баллом неадаптации») была проверена на животных в PN модели в состоянии неадаптации (как описано в примере 1), а также протестирована на другой модели на животных, на цыплятах, подвергнутых ксенобиотическому стрессу (индуцированному молекулой-окислителем паракват).

Материалы и методы

- Модель цыплят, подвергнутых индуцированному паракватом стрессу («модель цыплята-паракват»)

Все экспериментальные процедуры, использованные в настоящем исследовании, были одобрены комитетом по этике и исследованиям организации, в которой было проведено исследование. Однодневных цыплят-бройлеров мужского пола породы Росс 308 в общем количестве 144 со средней массой тела (МТ) 39 г выращивали с Д1 до Д21. Их размещали в батарее из 72 клеток (0,5×0,42 м²) с проволочным полом (6 цыплят на клетку) в помещениях с контролем окружающей среды. Птиц со сходной стартовой массой тела случайным образом размещали в экспериментальные загоны. Каждая клетка была оборудована одной лотковой кормушкой и одной поилкой. В течение всего исследования птицы имели свободный доступ к мешанке и воде. При размещении средняя температура составляла 33°C, затем ее снижали раз в 2 дня на 1°C до достижения температуры 23°C, чтобы обеспечить комфорт на протяжении всего исследования. На протяжении всего исследования программа освещения составляла 18 часов при свете и 6 часов в темноте в течение 24-часового периода.

Экспериментальный дизайн представлял собой полностью рандомизированный факториальный дизайн, состоящий из групп плацебо или окислительного стресса, таким образом, двух экспериментальных обработок, и 12 повторностей на одну обработку, по 6 птиц для каждой повторности. Окислительный стресс применяли только с Д7 до Д14 посредством добавления ксенобиотика, т.е. параквата дихлорида гидрата (Sigma-Aldrich Company Ltd., Дорсет, Великобритания), через систему подачи воды в дозе 110 мкг/мл. Эта дозировка была достигнута путем использования контейнеров с водой, размещенных отдельно в каждой клетке. Контрольная группа получала стандартную воду (плацебо) в тот же период с использованием аналогичных контейнеров. Стартерный и ростовой рационы обеспечивали с Д1 до Д7 и с Д8 до Д21 соответственно. Базовые рационы представляли собой стандартные рационы для бройлеров на основе пшеницы, кукурузы и сои, которые имели состав, соответствующий или превышающий питательные потребности бройлеров, в соответствии с рекомендациями Отдела климата, энергетики и землевладения (NRC, 1994). Массу тела (МТ) регистрировали в Д1, Д7, Д14 и Д21. В Д14 и Д21 по одной птице на повторный загон для каждого вида обработки умерщвляли для сбора тканей. Кратко, 100 мг ткани (грудной мышцы, печени и подвздошной кишки) погружали в пробирки типа Эппендорф на 2 мл, содержащие 1 мл RNAlater® (Sigma-Aldrich), и держали при -20°C до анализа. Выделение и очистку РНК выполняли, как описано в примере 1.

- Измерение уровней экспрессии генов методом количественной ОТ-ПЦР

Для удаления следов загрязнений геномной ДНК 2,5 мкг суммарной РНК обрабатывали 2,5 Ед. ДНКазы I (Thermo Fischer) в конечном объеме 20 мкл в течение 15 мин при 25°C. Затем ДНКазу ингибировали добавлением ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) до конечной концентрации 8 мМ и инкубировали в течение 10 мин при 70°C. Половину образца РНК, обработанного ДНКазой, подвергали обратной транскрипции (ОТ), а другую половину держали в качестве контроля без ОТ. РНК денатурировали в суммарном объеме 17,6 мкл, содержащем 1,25 мкг суммарной РНК, 5 мМ случайный девятинуклеотидный праймер (dN9) и 0,5 мкМ каждого динуклеотидтрифосфата (dNTP) (Thermo Fischer). Эту смесь нагревали до 70°C в течение 5 мин в термоциклере (SimpliAmpTM, Life Technologies). Затем добавляли буферный раствор RT-AMV (Life Sciences Advance Technology) вместе в 40 Ед. РНКазина (Promega) и 0,25 Ед. обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц AMV-RT (Life Sciences Advance Technology) и доводили объем до 21,6 мкл. Праймеры гибридизовали путем инкубации при 25°C в течение 15 минут, и удлинение проводили в течение 2 часов при 45°C в термоциклере. Контрольные образцы без ОТ обрабатывали параллельно, но пропускали стадию добавления фермента AMV-RT.

Для реакции количественной ПЦР 1 мкл образца кДНК, разведенного в 3 раза, смешивали с 2 мкл смеси специфичных праймеров, по 2,5 мМ каждого, и 5 мкл красителя 2X Takyon sybrgreen - No ROX (Eurogentec) в конечном объеме 10 мкл. Каждую реакцию ПЦР ставили в трех повторностях. Амплификацию проводили на приборе LC480 LightCycler® Nano (Roche), используя 384-луночные планшеты и следующую программу: 1 исходный цикл активации при 95°C в течение 3 мин, затем 45 циклов [95°C в течение 10 с; 60°C в течение 15 с; 72°C в течение 15 с]. Специфичность каждой амплификации отслеживали с помощью техники построения кривой слияния, выявляющей отдельный пик, соответствующий одному отдельному ампликону, состоящей в исходной денатурации при 95°C в течение 5 с и с последующим линейным повышением температуры от 55 до 95°C со скоростью 0,11°C/с и 5 регистрациями данных в с.Ct (пороговое число циклов) определяли, используя режим регрессии, где только Ct, превышающие 35 циклов, рассматривали для дальнейших анализов, и уровень дифференциальной экспрессии рассчитывали в соответствии с методом ΔΔCT.

- Алгоритмический анализ и представление в виде лепестковой диаграммы

Баллы стресса, адаптации и неадаптации определяли на основании дифференциальной экспрессии между группами окислительного стресса и плацебо для перечня генов, и с помощью алгоритма, который интегрирует результаты наблюдений, полученных для четырех сравнительных моделей стресса. Затем эти баллы наносили на диаграмму, используя адекватное представление для простой и интуитивной диагностики стрессового состояния животного.

Определение балла стресса (S)

Сначала дифференциальную экспрессию (DE) каждого из 26 генов кодировали в соответствии с техникой, используемой для измерения экспрессии генов, как описано ниже:

• Для анализов RNA-seq (используемых в исходных моделях стресса и, в частности, в PN модели в условиях неадаптации, PN-NA модели, которую оценивали в этом примере):

- При повышающей регуляции (кратность изменения, FC более 1 и значение p с поправкой не более 0,05): переменная равна u

- При понижающей регуляции (FC менее 1 и значение p с поправкой не более 0,05): переменная равна d

- При отсутствии DE (FC равна 1 или значение p с поправкой более 0,05): переменная равна -.

Значение p определяли с помощью программы EdgeR и вводили поправку методом Бенджамини-Хохберга.

• Для анализов ОТ-кПЦР (используемых в модели цыплята-паракват):

- При повышающей регуляции (кратность изменения, FC более 1,5): переменная равна u

- При понижающей регуляции (FC менее 0,6667): переменная равна d

- При отсутствии DE (FC более 0,6667 и менее 1,5): переменная равна -.

Затем с учетом того, что для генов MRC1, SERPINH1, G0S2 и CHAC1 (сгруппированы в перечне «ListA») повышающая регуляция или отсутствие DE наблюдалось только у животных, подвергнутых стрессу (адаптированных или неадаптированных), и никогда DE не было у контрольных животных:

Балл ListA=(количество генов в перечне A с переменной=u).

С учетом того, что для гена ANKRD33B («ListB») понижающая регуляция или отсутствие DE наблюдалось только у животных, подвергнутых стрессу (адаптированных или неадаптированных), и никогда DE не было у контрольных животных:

Балл ListB=1, если переменная ANKRD33B=d,

Балл ListB=0, если переменная ANKRD33B=u или -.

С учетом того, что для каждого из остальных 21 гена (обозначенных как «ListС») наблюдалась повышающая регуляция, понижающая регуляция или отсутствие DE у животных, подвергнутых стрессу (адаптированных или неадаптированных), и никогда DE не было у контрольных животных:

Балл ListC=(количество генов перечня C с переменной=u)+(количество генов перечня C с переменной=d).

Наконец, значение балла стресса рассчитывали следующим образом:

Балл стресса (S)=(балл ListA+балл ListB+балла ListC)/количество генов с рассматриваемой сигнатурой × 100.

Определение баллов адаптации (A) и неадаптации (NA)

В четырех сравнительных моделях, полученных авторами изобретения (модели PN, PT, CT и SN) повышающая или понижающая регуляция 15 генов была обнаружена только у неадаптированных животных, а повышающая или понижающая регуляция 1 гена наблюдалась только у адаптированных животных.

С учетом того, что для генов COL1A1, PANX1, EFEMP1, CIDEA, TNC, GFPT2, SLIT3, THBS1, MGP, LGALS1, POSTN и ANXA2 (сгруппированных в перечень «ListD») понижающая регуляция наблюдалась только для неадаптированных животных и никогда не наблюдалась ни у адаптированных, ни у контрольных животных:

Балл ListD=(количество генов в перечне D с переменной=d).

С учетом того, что для гена SH2B2 («ListE») повышающая регуляция наблюдалась только у неадаптированных животных и никогда не наблюдалась ни у адаптированных, ни у контрольных животных:

Балл ListE=1, если переменная SH2B2=u,

Балл ListE=0, если переменная SH2B2=d или -.

С учетом того, что для генов KCTD12 и NES (сгруппированы в перечне «ListF») DE (повышающая или понижающая регуляции) было обнаружено только у неадаптированных животных и никогда не наблюдалось у адаптированных животных:

Балл ListF=(количество генов перечня F с переменной=u)+(количество генов перечня F с переменной=d).

Значение балла неадаптации рассчитывали следующим образом:

Балл неадаптации (NA)=(балл ListD+балл ListE+балл ListF)/количество генов с сигнатурой, которые претерпевают повышающую или понижающую регуляцию только у неадаптированных животных, × 100.

С учетом того, что для гена SH2B2 («ListG») понижающая регуляция наблюдалась только у адаптированных животных и никогда не наблюдалась ни у неадаптированных, ни у контрольных животных:

Балл ListG=1, если переменная SH2B2=d,

Балл ListG=0, если переменная SH2B2=u или -.

Значение балла адаптации рассчитывали следующим образом:

Балл адаптации (A)=(балл ListG)/количество генов с сигнатурой, которые претерпевают повышающую или понижающую регуляцию только у адаптированных животных, × 100.

Нанесение баллов на диаграмму

Баллы S, NA и A наносили на три соответствующие оси в форме лепестковой диаграммы. Числа на диаграмме относятся к проценту каждого балла.

Результаты

Баллы S, NA и A, полученные с использованием либо двадцати шести генов, либо четырех наиболее консервативных генов (Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn) в модели PN-NA и в модели цыплята-паракват, представлены на Фиг.5. Схожие результаты были получены с обеими сигнатурами. Как и ожидалось, модель PN-NA характеризовалась высокими баллами стресса (S) и неадаптации (NA), при этом балл адаптации (A) был равен 0% (Фиг.5, сверху). В модели цыплята-паракват метод, разработанный авторами изобретения, свидетельствовал о высоких баллах стресса (S) и неадаптации (NA) при использовании любой из сигнатур (Фиг.5, снизу). Это неадаптированное состояние согласуется с потерей массы тела, зарегистрированной у животных, обработанных паракватом. В целом эти результаты наблюдений, полученные в модели на животных, отличной от четырех сравнительных моделей на животных, используемых авторами изобретения, подтвердили правильность метода.

Затем авторы изобретения сравнили баллы стресса, адаптации и неадаптации, полученные для всех сигнатур от 4-генных до 26-генных, которые можно вывести из двадцати шести генов, в модели цыплята-паракват. Результаты представлены в таблице 4.

Среднее значение баллов стресса для любого размера сигнатуры было идентично значению баллов стресса, полученных с 26-генной сигнатурой, но стандартное отклонение уменьшалось по мере увеличения количества генов в сигнатуре. Среднее значение баллов неадаптации было сходным (составляло от 78,2 до 80,0%), и стандартное отклонение также уменьшалось по мере увеличения количества генов в сигнатуре. Что касается балла адаптации, в данной модели состояние адаптации выявлено не было, что, опять же, согласуется с потерей массы тела у всех подвергнутых стрессу животных.

Эти результаты показывают, что различные сигнатуры от 4 до 26 генов, выведенные из двадцати шести генов, можно использовать для идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или для оценки уровня стрессовой реакции у субъекта.

Таблица 4. Значения баллов стресса, неадаптации и адаптации (среднее и стандартное отклонение), рассчитанное для различных размеров сигнатур (от 4 до 26 генов) в модели цыплят-паракват. Для сравнения баллы, полученные с использованием четырех наиболее консервативных генов, указаны в первой строке.

Количество генов в сигнатуре	Количество соответствующих сигнатур	Балл стресса (%)	Балл неадаптации (%)	Балл адаптации (%)
4 наиболее консервативных гена	1	75	100	0
4	14 950	69,2±21,6	78,2±29,5	0,0±0,0
5	65 780	69,2±18,9	79,4±24,8	0,0±0,0
6	230 230	69,2±16,8	79,8±21,5	0,0±0,0
7	657 800	69,2±15,2	79,9±19,0	0,0±0,0
8	1 562 275	69,2±13,8	80,0±17,0	0,0±0,0
9	3 124 550	69,2±12,7	80,0±15,4	0,0±0,0
10	5 311 735	69,2±11,7	80,0±14,1	0,0±0,0
11	7 726 160	69,2±10,8	80,0±13,0	0,0±0,0
12	9 657 700	69,2±10,0	80,0±12,0	0,0±0,0
13	10 400 600	69,2±9,2	80,0±11,0	0,0±0,0
14	9 657 700	69,2±8,5	80,0±10,2	0,0±0,0
15	7 726 160	69,2±7,9	80,0±9,4	0,0±0,0
16	5 311 735	69,2±7,3	80,0±8,7	0,0±0,0
17	3 124 550	69,2±6,7	80,0±7,9	0,0±0,0
18	1 562 275	69,2±6,2	80,0±7,3	0,0±0,0
19	657 800	69,2±5,6	80,0±6,6	0,0±0,0
20	230 230	69,2±5,0	80,0±6,0	0,0±0,0
21	65 780	69,2±4,5	80,0±5,3	0,0±0,0
22	14 950	69,2±3,9	80,0±4,6	0,0±0,0
23	2600	69,2±3,3	80,0±3,9	0,0±0,0
24	325	69,2±2,7	80,0±3,1	0,0±0,0
25	26	69,2±1,8	80,0±2,2	0,0±0,0
26 генов	1	69,2±0,0	80,0±0,0	0,0±0,0

Claims

1. Способ in vitro идентификации наличия или отсутствия стрессового состояния у субъекта и/или оценки уровня стрессовой реакции у субъекта, включающий стадию выявления экспрессии и/или количественного определения уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов, выбранных из группы, состоящей из Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc, в образце указанного субъекта; и дополнительно включающий стадию сравнения уровня экспрессии генов в указанном образце указанного субъекта с референтным значением или с уровнем экспрессии генов в референтном образце.

2. Способ in vitro по п. 1, в котором указанные по меньшей мере четыре гена представляют собой различные гены, которые соответственно выбраны из каждого из перечней 1-4:

- Перечень 1: Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, Col12a1, Gfpt2, Mgp, Thbs1, Tnc, Col1a1,

- Перечень 2: Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, Mrc1, Serpinh1,

- Перечень 3: Anxa1, Anxa2, Chac1, Postn, Lgals1, Cidea, Hmox1, Kctd12, Sh2b2, Slit3,

3. Способ in vitro по п. 1 или 2, в котором указанные по меньшей мере четыре гена включают по меньше мере гены Anxa1, Anxa2, Chac1 и Postn.

4. Способ in vitro по любому из пп. 1-3, в котором указанные по меньшей мере четыре гена включают по меньше мере гены Anxa1, Anxa2, Chac1 и Postn и дополнительно включают:

- по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из Col12a1, Gfpt2, Mgp, Thbs1, Tnc и Col1a1;

- по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из Mrc1 и Serpinh1;

- по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из Lgals1, Cidea, Hmox1, Kctd12, Sh2b2 и Slit3; или

- по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из Col14a1, Efemp1, G0s2, Kera, Nes, Panx1, Runx1 и Ankrd33b.

5. Способ in vitro по любому из пп. 2-4, в котором указанные по меньшей мере четыре гена включают по меньшей мере все гены перечня 1, по меньшей мере все гены перечня 2, по меньшей мере все гены перечня 3 или по меньшей мере все гены перечня 4.

6. Способ in vitro по любому из пп. 1-5, в котором указанные по меньшей мере четыре гена включают по меньшей мере гены Ankrd33b, Anxa1, Anxa2, Chac1, Cidea, Col1a1, Col12a1, Col14a1, Efemp1, G0s2, Gfpt2, Hmox1, Kctd12, Kera, Lgals1, Mgp, Mrc1, Nes, Panx1, Postn, Runx1, Serpinh1, Sh2b2, Slit3, Thbs1 и Tnc.

7. Способ in vitro по любому из пп. 1-6, в котором указанный субъект представляет собой человека.

8. Способ in vitro по любому из пп. 1-6, в котором указанный субъект представляет собой животное.

9. Способ in vitro по п. 8, в котором указанное животное представляет собой животное, относящееся к домашнему скоту.

10. Способ in vitro по любому из пп. 1-9, в котором указанный образец выбран из группы, состоящей из мышечной ткани, ткани молочной железы, ткани печени, жировой ткани, кожи, лимфоидной ткани, плацентарной ткани, ткани желудочно-кишечного тракта, ткани половых путей, ткани центральной нервной системы, спинного мозга, ганглия тройничного нерва, мочи, фекалий, перьев, слез, спермы, семенной жидкости, спинномозговой жидкости, мокроты, бронхоальвеолярной лаважной жидкости, желудочного секрета, слюны, сыворотки крови, плазмы крови и крови.

11. Способ in vitro по любому из пп. 1-10, в котором экспрессию генов выявляют и/или количественно определяют на уровне мРНК.

12. Способ in vitro по п. 11, в котором экспрессию генов выявляют и/или количественно определяют методами амплификации, методами гибридизации или методами секвенирования.

13. Способ in vitro по любому из пп. 1-10, в котором экспрессию генов выявляют и/или количественно определяют на уровне белка.

14. Способ in vitro по п. 13, в котором экспрессию генов выявляют и/или количественно определяют методами ИФА (иммуноферментный анализ), Вестерн-блоттинга, иммуногистохимии, проточной цитометрии или протеомики.