RU2827772C2 - Complex with antioxidant action and method of using same - Google Patents
Complex with antioxidant action and method of using same Download PDFInfo
- Publication number
- RU2827772C2 RU2827772C2 RU2022131410A RU2022131410A RU2827772C2 RU 2827772 C2 RU2827772 C2 RU 2827772C2 RU 2022131410 A RU2022131410 A RU 2022131410A RU 2022131410 A RU2022131410 A RU 2022131410A RU 2827772 C2 RU2827772 C2 RU 2827772C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- carotenoid
- complex
- protein
- hcbp
- delivery
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к области биотехнологии. Более подробно изобретение относится к технологии использования белковой молекулы для инкапсуляции и солюбилизации активного агента - каротиноида с целью доставки этого агента к клетке-мишени для оказания антиоксидантного действия. Изобретение может найти свое применение в медицине для лечения или профилактики некоторых заболеваний, а также для выполнения фундаментальных задач биологической науки.The invention relates to the field of biotechnology. In more detail, the invention relates to the technology of using a protein molecule for encapsulation and solubilization of an active agent - a carotenoid for the purpose of delivering this agent to a target cell to provide an antioxidant effect. The invention can find its application in medicine for the treatment or prevention of certain diseases, as well as for the implementation of fundamental tasks of biological science.
Уровень техникиState of the art
Каротиноиды представляют собой природные органические пигменты (тетратерпены и тетратерпеноиды), которые синтезируются многими представителями живой природы (грибами, бактериями, низшими и высшими растениями, некоторыми животными) для регуляции оксилительного стресса. Каротиноиды обладают выраженными антиоксидантными свойствами и способны эффективно утилизировать свободные радикалы (Vershinin, 1999; Landrum, 2010). Кроме того, каротиноиды способны акцептировать световую энергию и осуществлять ее трансформацию в тепловую энергию, что снижает световую нагрузку на другие пигменты живого организма и уменьшает количество генерируемых активных форм кислорода (Woodall et al., 1997b). Также каротиноиды, являясь липофильными молекулами, легко встраиваются в биомембраны и изменяют микровязкость, что может приводить к модификации свойств мембранных белков (Reszczynska et al., 2015; Seel et al., 2020). Комплексное действие каротиноидов обеспечивает проявление ими антимутагенных, антиканцерогенных, противовоспалительных, иммуномодулирующих и радиопротекторных свойств (Patel et al., 2022).Carotenoids are natural organic pigments (tetraterpenes and tetraterpenoids) that are synthesized by many representatives of living nature (fungi, bacteria, lower and higher plants, some animals) to regulate oxidative stress. Carotenoids have pronounced antioxidant properties and are able to effectively utilize free radicals (Vershinin, 1999; Landrum, 2010). In addition, carotenoids are able to accept light energy and transform it into thermal energy, which reduces the light load on other pigments of a living organism and reduces the amount of generated reactive oxygen species (Woodall et al., 1997b). Also, carotenoids, being lipophilic molecules, are easily embedded in biomembranes and change microviscosity, which can lead to modification of the properties of membrane proteins (Reszczynska et al., 2015; Seel et al., 2020). The complex action of carotenoids ensures the manifestation of their antimutagenic, anticarcinogenic, anti-inflammatory, immunomodulatory and radioprotective properties (Patel et al., 2022).
Исходно, в своей нативной форме каротиноиды крайне чувствительны к условиям хранения и обработки. При воздействии внешних факторов каротиноиды склонны к изомеризации, окислению и деградации, в результате чегко они теряют свою пищевую ценность (Tan et al., 2014). В этой связи, очень важно обеспечить их максимальную стабильность. Также существуют факторы, значительно ограничивающие эффективность каротиноидов при их поступлении в самом организме. Липофильность молекул каротиноидов затрудняет доставку агента к мишени воздействия через жидкости организма и в клетки центральной нервной системы вследствие наличия гематоэнцефалического барьера. Помимо этого, нативные каротиноиды плохо усваиваются в желудочно-кишечном тракте человека. Таким образом, биодоступность каротиноидов, применяемых в чистом виде, остается крайне низкой (Maurya et al., 2021).Initially, in their native form, carotenoids are extremely sensitive to storage and processing conditions. When exposed to external factors, carotenoids are prone to isomerization, oxidation and degradation, as a result of which they lose their nutritional value (Tan et al., 2014). In this regard, it is very important to ensure their maximum stability. There are also factors that significantly limit the effectiveness of carotenoids when they enter the body itself. The lipophilicity of carotenoid molecules complicates the delivery of the agent to the target of action through body fluids and into the cells of the central nervous system due to the presence of the blood-brain barrier. In addition, native carotenoids are poorly absorbed in the human gastrointestinal tract. Thus, the bioavailability of carotenoids used in pure form remains extremely low (Maurya et al., 2021).
Перспективы использования каротиноидов в медицинской технологии и пищевой промышленности связаны с разработкой методов эффективной направленной доставки. Биодоступность каротиноидов можно повысить, если заключить их в амфифильную макромолекулу или молекулярный комплекс. В современной научно-технической литературе ведется активное обсуждение новых методов обеспечения защиты от факторов, ухудшающих эффективность каротиноидов как в составе пищевых продуктов, так и для обеспечения высокой эффективности направленной доставки в организме человека (Mao et al., 2018).The prospects for using carotenoids in medical technology and the food industry are associated with the development of effective targeted delivery methods. The bioavailability of carotenoids can be increased by encapsulating them in an amphiphilic macromolecule or molecular complex. In modern scientific and technical literature, there is an active discussion of new methods for providing protection against factors that impair the effectiveness of carotenoids both in food products and for ensuring high efficiency of targeted delivery in the human body (Mao et al., 2018).
На основании вышеизложенных недостатков самой молекулы каротиноидного типа, можно сформулировать ряд требований к платформе для направленной доставки каротиноидов:Based on the above-mentioned shortcomings of the carotenoid-type molecule itself, a number of requirements can be formulated for a platform for targeted delivery of carotenoids:
1. Наличие липофильной полости - места локализации молекул каротиноида.1. The presence of a lipophilic cavity - the location of carotenoid molecules.
2. Наличие гидрофильной поверхности, обеспечивающей стабильность структуры в водных физиологических растворах.2. The presence of a hydrophilic surface, ensuring the stability of the structure in aqueous physiological solutions.
3. Высокое относительное содержание каротиноида в комплексе (по массе).3. High relative content of carotenoid in the complex (by weight).
4. Высокая эффективность загрузки частицы при создании комплекса с каротиноидом.4. High efficiency of particle loading when creating a complex with a carotenoid.
5. Эффективное высвобождение молекул каротиноида при контакте платформы для доставки с мишенью воздействия.5. Efficient release of carotenoid molecules upon contact of the delivery platform with the target of action.
6. Наличие функциональных групп на поверхности частицы для обеcпечения возможности дополнительной модификации механизмами направленной доставки.6. The presence of functional groups on the particle surface to ensure the possibility of additional modification by targeted delivery mechanisms.
7. Увеличенная термо- и фотостабильность каротиноида в составе комплекса.7. Increased thermal and photostability of the carotenoid in the complex.
8. Отсутствие цитотоксичности.8. No cytotoxicity.
9. Оптимальные параметры фармакодинамики, биоразлагаемость.9. Optimal parameters of pharmacodynamics, biodegradability.
10. Дополнительно: возможность обеcпечить селективность платформы по отношению к связыванию конкретного вида каротиноида.10. Additionally: the ability to ensure platform selectivity with respect to binding of a specific type of carotenoid.
В настоящее время исследуются способы доставки молекул каротиноидов с помощью различных платформ-носителей. В частности, среди наиболее распространенных типов подобных платформ можно выделить мицеллы (Xu et al., 1999), липосомы (Woodall et al., 1997a; Moraes et al., 2013; Elkholy et al., 2020), микрокапсулы (Santos et al., 2021), включая прямые экстракты и вытяжки из каротиноид-содержащих организмов (Arvayo-Enríquez et al., 2013). Все перечисленные варианты имеют массу недостатков - отсутствие селективности, часто большие размеры транспортных частиц, отсутствие возможности оценки эффективности загрузки платформы, низкая коллоидная стабильность в физиологических средах.Currently, methods for delivering carotenoid molecules using various carrier platforms are being investigated. In particular, among the most common types of such platforms are micelles (Xu et al., 1999), liposomes (Woodall et al., 1997a; Moraes et al., 2013; Elkholy et al., 2020), microcapsules (Santos et al., 2021), including direct extracts and infusions from carotenoid-containing organisms (Arvayo-Enríquez et al., 2013). All of the listed options have many disadvantages - lack of selectivity, often large sizes of transport particles, lack of the ability to assess the loading efficiency of the platform, low colloidal stability in physiological environments.
Методы наноинженерии позволяют сконструировать системы наночастиц для доставки каротиноидов с возможным улучшением их биодоступности (Rehman et al., 2020), однако этот метод не всегда может обеспечить необходимую защиту каротиноидов от разрушающего воздействия внешней среды при хранении.Nanoengineering methods make it possible to design nanoparticle systems for the delivery of carotenoids with possible improvement in their bioavailability (Rehman et al., 2020), but this method cannot always provide the necessary protection of carotenoids from the destructive effects of the external environment during storage.
Методы инкапсуляции каротиноидов в везикулярные структуры по типу липосом или ниосом позволяют улучшить структурную стабильность каротиноидов, однако при этом значительно понижается биодоступность. Возможным вариантов доставки является инкапсуляция каротиноидов внутрь липосомальных наноэмульсий (Yuan et al., 2008). Было показано инкорпорирование липосом бета-каротином (Moraes et al., 2013), лютеином (Xia et al., 2012), астаксантином (Peng et al., 2010). При взаимодействии клеток с нагруженными каротиноидами липосомами может происходить доставка этих антиоксидантов в различные компартменты клетки. Однако, эффективность доставки сильно ограничена: инкубация клеток с липосомами, несущими микромолярные концентрации каротиноидов, обеспечивает в 1000 раз меньшую концентрацию каротиноидов в мембранах клеток-мишеней (Williams et al., 2000).Methods of encapsulating carotenoids in vesicular structures such as liposomes or niosomes improve the structural stability of carotenoids, but significantly reduce bioavailability. A possible delivery option is the encapsulation of carotenoids into liposomal nanoemulsions (Yuan et al., 2008). Incorporation of liposomes with beta-carotene (Moraes et al., 2013), lutein (Xia et al., 2012), and astaxanthin (Peng et al., 2010) has been shown. When cells interact with liposomes loaded with carotenoids, these antioxidants can be delivered to various cell compartments. However, the delivery efficiency is severely limited: incubation of cells with liposomes carrying micromolar concentrations of carotenoids results in 1000-fold lower concentrations of carotenoids in target cell membranes (Williams et al., 2000).
Исследуются механизмы адресной доставки каротиноидов в составе ниосом - коллоидных структур, образуемых поверхностно-активными веществами, инкапсулированных каротиноидами (Masjedi and Montahaei, 2021). В качестве материалов для доставки с помощью ниосом используются нейтральные полимеры, например, полоксамер P-188, позволяющий инкапсулировать бета-каротин и ликопин (Singh et al., 2017). В то же время, принципиальная синтетическая природа полимеров ограничивает биодоступность и биоразлагаемость транспортных платформ на их основе.The mechanisms of targeted delivery of carotenoids in niosomes, colloidal structures formed by surfactants encapsulated by carotenoids, are being studied (Masjedi and Montahaei, 2021). Neutral polymers, such as poloxamer P-188, which allows encapsulation of beta-carotene and lycopene, are used as delivery materials using niosomes (Singh et al., 2017). At the same time, the fundamental synthetic nature of polymers limits the bioavailability and biodegradability of transport platforms based on them.
Широко распространен способ доставки каротиноидов с помощью наноконструкций на основе различных биосовместимых полимеров (Rehman et al., 2020). Например, для доставки каротиноидов в клетки, для которых характерно повышенное потребление глюкозы, используются наночастицы на основе полисахаридных комплексов, к которым относятся хитозан, декстрины, полифенолы, ксилолигосахариды, целлюлозные комплексы (Williams et al., 2000; Nishino et al., 2009; Зяйнитдинов et al., 2020). При этом, использование полисахаридов в качестве транспортных платформ имеет ряд функциональных недостатков. Во-первых, несмотря на относительно высокую биосовместимость, адресная доставка осуществляется преимущественно в клетки с высоким уровнем потребления глюкозы, что ограничивает область применения преимущественно патологиями онкологического характера. Во-вторых, большие концентрации некоторых полисахаридов, в частности, декстринов и декстранов, значительно повышают вязкость крови. В-третьих, для доставки таких каротиноидов, как бета-каротин, лютеин, кантаксантин, в силу структурных особенностей каротиноидной молекулы используются наночастицы размерами от 200-450 нм (Rehman et al., 2020). Прямая инъекция наночастиц таких размеров в кровоток может нести серьезные риски патологических изменении реологии крови при систематическом потреблении (Lin et al., 2012).A widespread method of delivering carotenoids is using nanoconstructs based on various biocompatible polymers (Rehman et al., 2020). For example, to deliver carotenoids to cells characterized by increased glucose consumption, nanoparticles based on polysaccharide complexes are used, which include chitosan, dextrins, polyphenols, xyloligosaccharides, and cellulose complexes (Williams et al., 2000; Nishino et al., 2009; Zyaynitdinov et al., 2020). At the same time, the use of polysaccharides as transport platforms has a number of functional disadvantages. Firstly, despite the relatively high biocompatibility, targeted delivery is carried out mainly to cells with high levels of glucose consumption, which limits the scope of application mainly to oncological pathologies. Secondly, high concentrations of some polysaccharides, in particular dextrins and dextrans, significantly increase blood viscosity. Thirdly, nanoparticles of 200-450 nm in size are used to deliver carotenoids such as beta-carotene, lutein, and canthaxanthin due to the structural features of the carotenoid molecule (Rehman et al., 2020). Direct injection of nanoparticles of such sizes into the bloodstream may carry serious risks of pathological changes in blood rheology with systematic consumption (Lin et al., 2012).
Белковые макромолекулы также исследуются для доставки каротиноидов. Изучаются возможности использования как животных белков (казеин (Rehan et al., 2019), желатин (Elzoghby, 2013), коллаген, альбумины, эластины (Maghsoudi et al., 2020) и др.), так и растительных (Liao et al., 2012) (глютеновые макромолекулы, глидины, зеины и др.). Основным преимуществом использования белковых молекул для транспорта является их высокая биодоступность. Однако, так как исходно данные белки не предназначены для транспорта каротиноидов, эффективность доставки в ткани невелика. Альтернативным вариантом является создание гибридных конструкций на основе моноклональных антител в качестве транспортных агентов (Bashmakov and Petyaev, 2017). Данный метод позволяет обеспечить направленную доставку и накопление в нужных тканях, однако обладает серьезными недостатками: животные антитела могут спровоцировать иммунную реакцию, а использование гуманизированных антител значительно усложняет технологию получения конечного продукта и увеличивает его стоимость.Protein macromolecules are also being explored for carotenoid delivery. The possibilities of using both animal proteins (casein (Rehan et al., 2019), gelatin (Elzoghby, 2013), collagen, albumins, elastins (Maghsoudi et al., 2020), etc.) and plant proteins (Liao et al., 2012) (gluten macromolecules, glidins, zeins, etc.) are being studied. The main advantage of using protein molecules for transport is their high bioavailability. However, since these proteins are not originally intended for carotenoid transport, the efficiency of delivery to tissues is low. An alternative option is to create hybrid constructs based on monoclonal antibodies as transport agents (Bashmakov and Petyaev, 2017). This method allows for targeted delivery and accumulation in the desired tissues, but has serious drawbacks: animal antibodies can provoke an immune reaction, and the use of humanized antibodies significantly complicates the technology for obtaining the final product and increases its cost.
Наиболее близкое решение по отношению к заявляемому способу, известное из последнего описания уровня техники, раскрыто в патентом документе RU2718065C2 «Положительно заряженные липосомы в качестве липофильных молекул-носителей», который защищает способ получения положительно заряженных липосомных везикул для применения в качестве носителей липофильных молекул, представляющих собой каротиноид, выбранный из лютеина и зеаксантина. Применение липосом с положительным зарядом здесь необходимо, в частности, для повышения эффективности метода ионтофореза в области офтальмологии. Особое внимание было уделено исследованию термо- (хранение до 6 мес. при комнатной температуре и до 3 мес. при температуре 52°С) и фотостабильности (до 48 часов облучения УФ/видимым светом) каротиноидов в составе липосом, а также цитотоксичности композиции. Из недостатков липосомальных везикул как конструкции для доставки активных соединений можно отметить большой размер частиц (в документе речь идет о липосомах с характерным размером 194 - 2482 нм в зависимости от липидной композиции после процедур гомогенизации и стерилизации), что снижает биодоступность агента. Кроме того, в документе отсутствует информация об эффективности встраивания молекул каротиноидов в липосомы, их максимальной загрузке, а также об эффективности выхода молекул каротиноида из липосомы в присутствии биологической мишени воздействия. Эти параметры являются ключевыми характеристиками эффективности конструкций для доставки активных агентов.The closest solution to the claimed method, known from the latest description of the state of the art, is disclosed in patent document RU2718065C2 "Positively charged liposomes as lipophilic carrier molecules", which protects a method for producing positively charged liposomal vesicles for use as carriers of lipophilic molecules, which are a carotenoid selected from lutein and zeaxanthin. The use of liposomes with a positive charge is necessary here, in particular, to improve the efficiency of the iontophoresis method in the field of ophthalmology. Particular attention was paid to the study of thermal (storage for up to 6 months at room temperature and up to 3 months at a temperature of 52 ° C) and photostability (up to 48 hours of UV / visible light irradiation) of carotenoids in the liposomes, as well as the cytotoxicity of the composition. Among the disadvantages of liposomal vesicles as a structure for delivering active compounds, one can note the large size of the particles (the document refers to liposomes with a characteristic size of 194 - 2482 nm depending on the lipid composition after homogenization and sterilization procedures), which reduces the bioavailability of the agent. In addition, the document does not contain information on the efficiency of incorporating carotenoid molecules into liposomes, their maximum loading, as well as the efficiency of the release of carotenoid molecules from the liposome in the presence of a biological target of action. These parameters are key characteristics of the efficiency of structures for delivering active agents.
Другое близкое решение по отношению к заявляемому способу, известное из уровня техники, раскрыто в патентом документе RU2649124C2 «Фармацевтическая композиция с каротиноидом», который защищает способ инкапсуляции липофильных агентов в частицы типа хиломикрон и мицелла из варьируемой композиции липидов и сопутствующих соединений (фитостерол, триглицериды и др.). На примере бета-каротина авторы оценили эффективность инкапсуляции в 80%, при этом пероральная биодоступность на примере соланорубина составила 9.5% в случае использования формы хиломикрона и 6.8% в случае использования формы мицеллы. В загруженном виде платформа для доставки была стабильной по крайней мере в течение 3 месяцев. Из недостатков данной технологии стоит отметить существенный разброс размеров хиломикронов (75-440 нм) и их чувствительность к манипуляциям на этапе синтеза и инкапсуляции. Кроме того, в составе комплекса с хиломикроном массовая доля инкапсулированного бета-каротина была оценена в 1%, что, на наш взгляд, говорит о низкой эффективности хиломикронов как платформы для доставки.Another solution close to the claimed method, known from the prior art, is disclosed in patent document RU2649124C2 "Pharmaceutical composition with carotenoid", which protects a method for encapsulating lipophilic agents in chylomicron and micelle-type particles from a variable composition of lipids and accompanying compounds (phytosterol, triglycerides, etc.). Using beta-carotene as an example, the authors estimated the encapsulation efficiency at 80%, while the oral bioavailability using solanorubine as an example was 9.5% in the case of using the chylomicron form and 6.8% in the case of using the micelle form. In the loaded form, the delivery platform was stable for at least 3 months. Among the disadvantages of this technology, it is worth noting the significant spread of chylomicron sizes (75-440 nm) and their sensitivity to manipulations at the stage of synthesis and encapsulation. In addition, in the complex with chylomicron, the mass fraction of encapsulated beta-carotene was estimated at 1%, which, in our opinion, indicates the low efficiency of chylomicrons as a delivery platform.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей изобретения является разработка комплекса, обладающего антиоксидантным действием, на основе активного агента каротиноидного типа в комплексе с белком для доставки в клетки, а также способприменения такого комплекса.The objective of the invention is to develop a complex with antioxidant action based on an active agent of the carotenoid type in a complex with a protein for delivery to cells, as well as a method for using such a complex.
Техническим результатом, достигаемым заявленным изобретением, является увеличение фотостабильности молекулы каротиноида за счет инкапсуляции в белковую глобулу ВКБ, отсутствие потери действующего агента-каротиноида при процедуре приготовления конструкции за счет уникальности аминокислотного состава белка., используемого для инкапсуляции. Повышение эффективности применения агента каротиноидного типа в качестве антиоксиданта за счет уменьшения размера частиц и как следствие снижения времени достижения максимальной концентрации каратиноидов в крови при энтеральном и парэнтеральном введении. Таким образом, комплекс ВКБ-каротиноид с антиоксидантным действием представляет собой эффективную конструкцию для доставки, удобную в аспектах как приготовления, так и непосредственно использования в биомедицинских целях.The technical result achieved by the claimed invention is an increase in the photostability of the carotenoid molecule due to encapsulation in the protein globule of the VKB, the absence of loss of the active agent-carotenoid during the procedure of preparing the structure due to the uniqueness of the amino acid composition of the protein used for encapsulation. Increasing the efficiency of using a carotenoid-type agent as an antioxidant due to a decrease in the particle size and, as a consequence, a decrease in the time to achieve the maximum concentration of carotenoids in the blood upon enteral and parenteral administration. Thus, the VKB-carotenoid complex with antioxidant action is an effective structure for delivery, convenient in terms of both preparation and direct use for biomedical purposes.
В заявляемом изобретении предложено использование рекомбинантных аналогов нативных водорастворимых каротиноид-связывающих белков (ВКБ), их нативных вариантов или их мутантных форм, в качестве платформы для доставки молекул каротиноида, в т.ч. направленной. Использование нативных формВКБ и рекомбинантных аналогов нативных форм ВКБ предоставляет возможности для направленной доставки молекул каротиноидов и увеличения их биодоступности в медицинских и биологических приложениях. Нативные формы ВКБ и рекомбинантные аналоги нативных форм ВКБ могут быть использованы для доставки тех каротиноидов, которые синтезируются в клетках ряда организмов (цианобактерии, зеленые водоросли, растения) или специфически накапливаются в тканях организмов употребляющих потребляющих каротиноиды с пищей. Иные каротиноиды в зависимости от задач и целей доставки могут быть инкапсулированы в мутантные формы ВКБ, полученные из исходной нативной формы любым путем сайт-направленного мутагенеза, с последующими процедурами позитивного и негативного отбора до установления однозначного соответствия между формой ВКБ и конкретным каротиноидом. Инкапсулирование молекулы каротиноида осуществляется самопроизвольно вследствие высокой избирательности внутреннего гидрофобного кармана белковой глобулы ВКБ. Каротиноид может оказывать антиоксидантное действие как в составе комплекса с ВКБ, так и отдельно после завершения процесса доставки, причем выход молекулы каротиноида из ВКБ осуществляется самопроизвольно при наличии биомолекулярных функциональных мишеней, обладающих более высоким сродством к каротиноиду. Наработка рабочей конструкции каротиноид-ВКБ производится на основе генно-инженерных штаммов бактерий, со всеми последующими биохимическими процедурами выделения и очистки.The claimed invention proposes the use of recombinant analogues of native water-soluble carotenoid-binding proteins (WBCP), their native variants or their mutant forms, as a platform for the delivery of carotenoid molecules, including targeted delivery. The use of native forms of WBCP and recombinant analogues of native forms of WBCP provides opportunities for the targeted delivery of carotenoid molecules and an increase in their bioavailability in medical and biological applications. Native forms of WBCP and recombinant analogues of native forms of WBCP can be used to deliver those carotenoids that are synthesized in the cells of a number of organisms (cyanobacteria, green algae, plants) or specifically accumulate in the tissues of organisms consuming carotenoids with food. Other carotenoids, depending on the tasks and purposes of delivery, can be encapsulated in mutant forms of VKB obtained from the original native form by any means of site-directed mutagenesis, with subsequent procedures of positive and negative selection until an unambiguous correspondence between the VKB form and a specific carotenoid is established. Encapsulation of the carotenoid molecule occurs spontaneously due to the high selectivity of the internal hydrophobic pocket of the VKB protein globule. The carotenoid can have an antioxidant effect both as part of a complex with VKB and separately after completion of the delivery process, and the release of the carotenoid molecule from VKB occurs spontaneously in the presence of biomolecular functional targets with a higher affinity for the carotenoid. The development of the working carotenoid-VKB design is based on genetically engineered bacterial strains, with all subsequent biochemical procedures for isolation and purification.
В природе существуют водорастворимые каротиноид-связывающие белки, которые могут предоставить технологические возможности для высокоэффективного направленного транспорта каротиноидов к клеткам (Sedoud et al., 2014; Harris et al., 2018; Maksimov et al., 2020). Среди них широко исследуются белки класса OCP (Orange Carotenoid Protein). Считается, что этот класс белков эволюционно направлен на осуществление наиболее оптимальной доставки молекул каротиноидов (Hagemann et al., 2010). OCP с встроенной молекулой каротиноида также является антиоксидантом, осуществляющим нефотохимическое тушение активных форм кислорода и других окислительных радикалов (Maksimov et al., 2016). Белок OCP состоит из двух структурных доменов (N- и C-домен) (Leverenz et al., 2014). Два домена соединены длинным гибким линкером. Каротиноидный хромофор располагается во внутреннем пространстве белка и охватывает оба домена. Локализация каротиноида происходит за счет водородных связей между кетогруппой каротиноида и аминокислотами белковых частей комплекса (тирозин в положении 203 и триптофан в положении 290). Стехиометрия компонентов конструкции фиксирована и составляет 1:1. Показано, что для белок-опосредованной доставки каротиноидов также могут быть использованы производные OCP, которые содержат только один из функциональных доменов.Water-soluble carotenoid-binding proteins exist in nature, which may provide technological opportunities for highly efficient targeted transport of carotenoids to cells (Sedoud et al., 2014; Harris et al., 2018; Maksimov et al., 2020). Among them, the OCP (Orange Carotenoid Protein) class of proteins is widely studied. It is believed that this class of proteins is evolutionarily directed to implement the most optimal delivery of carotenoid molecules (Hagemann et al., 2010). OCP with an integrated carotenoid molecule is also an antioxidant that performs non-photochemical quenching of reactive oxygen species and other oxidative radicals (Maksimov et al., 2016). The OCP protein consists of two structural domains (N- and C-domain) (Leverenz et al., 2014). The two domains are connected by a long flexible linker. The carotenoid chromophore is located in the internal space of the protein and covers both domains. Localization of the carotenoid occurs due to hydrogen bonds between the keto group of the carotenoid and the amino acids of the protein parts of the complex (tyrosine at position 203 and tryptophan at position 290). The stoichiometry of the components of the structure is fixed and is 1:1. It has been shown that OCP derivatives containing only one of the functional domains can also be used for protein-mediated delivery of carotenoids.
В частности, COCP (С-domain OCP), содержащий только С-домен. Гомолог C-домена OCP, на базе водорастворимого каротинопротеина, выделенного из цианобактерий Anabaena sp. PCC 7120 (Maksimov et al., 2020) (белок Anabaena C-terminal domain homolog, AnaCTDH) способен со значительно большей, чем другие производные OCP, эффективностью связывать кетокаротиноиды (в частности, эхиненон и кантаксантин) из мембран каротиноид-синтезирующих штаммов E. coli. AnaCTDH продемонстрировал убедительные результаты по доставке каротиноида эхиненона в мембрану клеток культуры HeLa по данным спектроскопии комбинационного рассеяния. При этом доставка каротиноида с помощью AnaCTDH уменьшает последствия окислительного стресса в клетках нейробластомы Tet21N, индуцированного с помощью антимицина - разобщителя дыхательной цепи митохондрий.In particular, COCP (C-domain OCP), containing only the C-domain. Homolog of the C-domain of OCP, based on a water-soluble carotenoprotein isolated from cyanobacteria Anabaena sp. PCC 7120 (Maksimov et al., 2020) ( Anabaena C-terminal domain homolog protein, AnaCTDH) is able to bind ketocarotenoids (in particular, echinenone and canthaxanthin) from the membranes of carotenoid-synthesizing E. coli strains with significantly greater efficiency than other OCP derivatives. AnaCTDH demonstrated convincing results in the delivery of the carotenoid echinenone into the membrane of HeLa culture cells according to Raman spectroscopy. At the same time, the delivery of carotenoid using AnaCTDH reduces the effects of oxidative stress in Tet21N neuroblastoma cells induced by antimycin, an uncoupler of the mitochondrial respiratory chain.
В работе (Slonimskiy et al., 2022b) авторами настоящего патента было проведено исследование фотофизических свойств рекомбинантного астаксантин-связывающего белка (astaxanthin-binding protein, AstaP), выделенного из микроводорослей C. astaxanthina Ki-4. Этот белок представляет собой стабильный мономер молекулярной массой ~20 кДа, который может связывать одну молекулу каротиноида, причем не только астаксантин, но и другие ксантофиллы (кантаксантин и зеаксантин), а также, с несколько меньшей эффективностью, бета-каротин. Белок AstaP способен обеспечивать доставку каротиноидов как в мембранные структуры по типу липосом, так и в другие каротиноид-связывающие белковые системы, в частности, OCP и/или CTDH, тем самым предоставляя широкие возможности для дополнительного модулирования его антиоксидантных свойств.In the work (Slonimskiy et al., 2022b), the authors of the present patent conducted a study of the photophysical properties of the recombinant astaxanthin-binding protein (AstaP) isolated from the microalgae C. astaxanthina Ki-4. This protein is a stable monomer with a molecular weight of ~20 kDa, which can bind one carotenoid molecule, not only astaxanthin, but also other xanthophylls (canthaxanthin and zeaxanthin), and, with slightly less efficiency, beta-carotene. The AstaP protein is capable of delivering carotenoids both to membrane structures such as liposomes and to other carotenoid-binding protein systems, in particular, OCP and/or CTDH, thereby providing ample opportunities for additional modulation of its antioxidant properties.
Относительно недавно при исследовании шелкового фиброина - фибриллярного белка, формирующего нити коконов тутового шелкопряда Bombyx mori - было обнаружено, что за цветную окраску коконов ответственны две основные разновидности пигментов: жирорастворимые каротиноиды и водорастворимые флавоноиды (Sakudoh et al., 2007). Желтый цвет нитей коконов B. mori обусловлен накоплением каротиноидов, которые в процессе формирования кокона усваиваются гусеницами из листьев с помощью особого водорастворимого каротиноид-связывающего белка (СВР, carotenoid-binding protein). С помощью СВР часть каротиноидов интегрируется в серицин (белок, который обеспечивает склеивание фиброиновых фибрилл в процессе формирования кокона гусеницей), некоторая часть содержится в самом фиброине (Lee et al., 2020). Предполагается, что CBP может быть использован для осуществления направленного транспорта крайне широкого набора различных каротиноидов, включая бета-каротин, кетакаротиноиды и ксантофиллы.Relatively recently, during the study of silk fibroin, a fibrillar protein that forms the threads of the cocoons of the Bombyx mori silkworm, it was discovered that two main types of pigments are responsible for the color of the cocoons: fat-soluble carotenoids and water-soluble flavonoids (Sakudoh et al., 2007). The yellow color of the threads of the B. mori cocoons is due to the accumulation of carotenoids, which are absorbed by the caterpillars from the leaves during the formation of the cocoon with the help of a special water-soluble carotenoid-binding protein (CBP). With the help of CBP, some of the carotenoids are integrated into sericin (a protein that ensures the gluing of fibroin fibrils during the formation of the cocoon by the caterpillar), some is contained in the fibroin itself (Lee et al., 2020). It is proposed that CBP can be used to mediate the targeted transport of a very wide range of different carotenoids, including beta-carotene, ketocarotenoids, and xanthophylls.
Поставленная задача решается тем, что комплекс с антиоксидантым действием, представляет собой инкапсулированную в белковую глобулу ВКБ нековалентно связанную молекулу каротиноида, выбранного из группы: зеаксантин, лютеин и кантаксантин, в соотношении 1:1. Комплекс характеризуется антиоксидантым действием. Белковая глобула ВКБ подобрана такой формы и такого аминокислотного состава, что обеспечивает оптимальную инкапсуляцию соответствующего типа каротиноида.The task is solved by the fact that the complex with antioxidant action is a non-covalently bound carotenoid molecule encapsulated in a protein globule of the VKB, selected from the group: zeaxanthin, lutein and canthaxanthin, in a ratio of 1:1. The complex is characterized by antioxidant action. The protein globule of the VKB is selected in such a shape and such amino acid composition that it ensures optimal encapsulation of the corresponding type of carotenoid.
Поставленная задача также решается тем, что способ получения активного агента каротиноидного типа в составе комплекса с белком включает следующие шаги:The stated problem is also solved by the fact that the method for obtaining an active agent of the carotenoid type in a complex with protein includes the following steps:
1. Синтез ВКБ и соответствующего каротиноида в бактериальном штамме, включая конструирование плазмиды, содержащей ген, кодирующий мутантную форму ВКБ для соответствующего каратиноида, конструирование плазмиды, содержащей необходимый набор генов для биосинтеза конкретного каротиноида, трансформацию бактериального штамма, наработку клеточную массу, процедуры выделения и очистки (большая вариативность методов не позволяет осуществить более подробное описание процедур вследствие сужения области предмета, защищаемого настоящим патентом). При этом сборка конструкции ВКБ-каротиноид происходит внутри клеток самопроизвольно.1. Synthesis of VKB and the corresponding carotenoid in a bacterial strain, including construction of a plasmid containing a gene encoding a mutant form of VKB for the corresponding carotenoid, construction of a plasmid containing the necessary set of genes for the biosynthesis of a specific carotenoid, transformation of the bacterial strain, production of cell mass, isolation and purification procedures (the large variability of methods does not allow a more detailed description of the procedures due to the narrowing of the area of the subject protected by this patent). In this case, the assembly of the VKB-carotenoid construct occurs spontaneously inside the cells.
2. Оценка коллоидной стабильности конструкции каротиноид-ВКБ осуществляется методами динамического светорассеяния и спектроскопическими методами. Конкретнее, исследуют спектр поглощения препарата в буферном растворе ПБС (рН 7.0-7.4) в области 240-700 нм, а также распределение гидродинамических размеров частиц с учетом зависимости интенсивности рассеянного света от размера частиц и с использованием лазера с длиной волны более 500 нм.2. The colloidal stability of the carotenoid-VKB structure is assessed using dynamic light scattering and spectroscopic methods. More specifically, the absorption spectrum of the preparation in a PBS buffer solution (pH 7.0-7.4) is studied in the range of 240-700 nm, as well as the distribution of the hydrodynamic sizes of particles, taking into account the dependence of the scattered light intensity on the particle size and using a laser with a wavelength of more than 500 nm.
3. Оценка фотостабильности каротиноида в комплексе с ВКБ осуществляется спектроскопическими методами. Конкретнее, измеряют динамику оптической плотности раствора, содержащего комплекс каротиноид-ВКБ, в области 350-600 нм при периодическом воздействии света с длиной волны 400-450 нм и мощностью более 500 мВт/см2.3. The photostability of the carotenoid in complex with VKB is assessed by spectroscopic methods. More specifically, the dynamics of the optical density of the solution containing the carotenoid-VKB complex is measured in the region of 350-600 nm with periodic exposure to light with a wavelength of 400-450 nm and a power of more than 500 mW/cm 2 .
Поставленная задача также решается тем, что способ применения активного агента каротиноидного типа в составе комплекса с белком включает следующие шаги:The stated problem is also solved by the fact that the method of using an active agent of the carotenoid type in a complex with protein includes the following steps:
1. Создание композиции, содержащей комплекс каротиноид-ВКБ и дополнительные вещества, для конкретных задач биотехнологии, медицины и пищевой промышленности. Под дополнительными веществами могут подразумеваться любые неорганические, низкомолекулярные органические и биоорганические соединения, способствующие селективности доставки каротиноида, коллоидной стабильности композиции, эффективности усвоения композиции в зависимости от типа введения в организм.1. Creation of a composition containing a carotenoid-VKB complex and additional substances for specific tasks in biotechnology, medicine and the food industry. Additional substances may include any inorganic, low-molecular organic and bioorganic compounds that promote selectivity of carotenoid delivery, colloidal stability of the composition, and efficiency of absorption of the composition depending on the type of administration into the body.
2. Введение в организм композиции, содержащей комплекс каротиноид-ВКБ и дополнительные вещества, энтеральным или парэнтеральным способом.2. Introduction into the body of a composition containing a carotenoid-VKB complex and additional substances, by enteral or parenteral route.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.
На фиг. 1 представлена схема структуры ВКБ в холо-форме (т.е. в связанном с каротиноидом состоянии): CBP, каротиноид-связывающий мономерный белок, осуществляющий доставку каротиноидов при формировании нитей коконов тутового шелкопряда Bombyx mori, способен связывать широкий спектр каротиноидов (на фиг. 1 изображен в комплексе с зеаксантином).Fig. 1 shows a schematic of the structure of CBP in the holo form (i.e., in the carotenoid-bound state): CBP, a carotenoid-binding monomeric protein that delivers carotenoids during the formation of cocoon threads of the Bombyx mori silkworm, is capable of binding a wide range of carotenoids (shown in Fig. 1 in a complex with zeaxanthin).
На фиг. 2 представлена технологическая блок-схема использования ВКБ как изобретения, представляющего собой платформу для направленной доставки каротиноидных антиоксидантов в мембраны клеток. Технологическая схема состоит из двух этапов. Первый этап - формирование комплексов ВКБ с целевым каротиноидом. Данный этап осуществляется благодаря уникальной способности ВКБ связывать каротиноиды из каротиноид-продуцирующих штаммов E.coli, так и из растворов органических растворителей (ВКБ устойчивы в ацетоне вплоть до 10%-ной доли по концентрации растворителя). Второй этап заключается в способности CBP доставлять каротиноид в мембраны клеток-мишеней. Данный этап реализуется благодаря двум факторам: принципиальной липофильной природе каротиноидов, и благодаря челночному механизму функционирования СВР, который при наличии липоидной фазы за счет специфических структурных конформаций обеспечивает такие условия, при которых связывание каротиноида мембраной становится энергетически более выгодным. Там самым создаются предпосылки для встраивания транспортируемого каротиноида в клеточную биомембрану для осуществления антиоксидантного и цитопротекторного действия.Fig. 2 shows the process flow chart of using CBP as an invention representing a platform for targeted delivery of carotenoid antioxidants to cell membranes. The process flow chart consists of two stages. The first stage is the formation of CBP complexes with the target carotenoid. This stage is achieved due to the unique ability of CBP to bind carotenoids from carotenoid-producing E. coli strains and from solutions of organic solvents (CBP is stable in acetone up to 10% of the solvent concentration). The second stage is the ability of CBP to deliver carotenoid to target cell membranes. This stage is achieved due to two factors: the fundamental lipophilic nature of carotenoids and the shuttle mechanism of CBP functioning, which, in the presence of a lipoid phase, due to specific structural conformations, provides conditions under which the binding of carotenoid to the membrane becomes energetically more favorable. There, the prerequisites are created for the integration of the transported carotenoid into the cellular biomembrane to implement antioxidant and cytoprotective action.
На фиг. 3 приведена демонстрация антиоксидантного и цитопротекторного эффекта зеаксантина в комплексе с каротиноидным белком CBP в холо-форме (комплекс hCBP). Диаграммы распределений усредненных значений длительности аутофлуоресценции липофусцина в культуре клеток зрительного пигментного эпителия до и после фотоокисления (облучение с помощью светодиодной лампы, белый свет). Комплекс каротиноида зеаксантина с каротиноидным белком СВР (комплекс hCBP) обладает выраженным антиоксидантным и цитопротекторным эффектом. На фиг. 3 изображены распределения средних значений длительности флуоресценции липофусцина в клетках зрительного пигментного эпителия человека (линия ARPE-19). Липофусцин - это пигмент гликопротеиновой природы, являющийся биологическим маркером старения и различных патологий. Липофусцин накапливается в клетках в виде гранул и подвержен окислительным процессам, в результате которых в клетке накапливаются токсичные соединения. Фиг. 3 показывает, что комплекс hCBP уменьшает in vitro цитотоксический эффект липофусцина при фотоокислении. Фотоокисление было проведено путем 18-часового облучения культуры белым светом (интенсивность 0.5 мВт/см2) в клеточном инкубаторе с помощью светодиодной лампы. Были проведены измерения для следующих образцов: «необлученный hСВР-» (Образец №1, необлученные клетки, нагруженные гранулами липофусцина, без добавления hСВР); «необлученный hСВР+» (Образец №2, необлученные клетки, нагруженные липофусцином с добавлением hСВР в ростовую среду в концентрации 500 μМ); «облученный hСВР-» (Образец №3, облученные клетки, нагруженные гранулами липофусцина, без добавления hСВР); «облученный hСВР+» (Образец №4, облученные клетки, нагруженные гранулами липофусцина, с добавлением hСВР в ростовую среду в концентрации 500 μМ). Известно, что в ходе окислительного процесса существует корреляция между значением длительности флуоресценции липофусцина и выраженности его цитотоксического действия (Jung et al., 2010). Из фиг. 3 видно, что, во-первых, наличие hСВР в клеточной среде уменьшает цитотоксический эффект липофусцина даже без дополнительного облучения культуры (см. диаграммы №1 и №2). Во-вторых, еще более значителен эффект при фотоиндуцированном окислении липофусцина (образцы №3 и №4). В облученных клетках без hСВР наблюдалось значительное увеличение среднего значения длительности флуоресценции, что свидетельствует об интенсивном окислительном стрессе. В случае, когда в культуральную среду был помещен hCBP, увеличение длительности флуоресценции было менее значительно, и, следовательно, токсический эффект липофусцина был выражен слабее. Таким образом, в рамках заявленного изобретения подтверждается, что зеаксантин, внесенный в культуру в виде hСВР, оказывает выраженное антиоксидантное и противотоксическое действие.Fig. 3 shows demonstration of the antioxidant and cytoprotective effect of zeaxanthin in complex with the carotenoid protein CBP in holo form (hCBP complex). Diagrams of distributions of average values of lipofuscin autofluorescence duration in the culture of visual pigment epithelium cells before and after photooxidation (irradiation with a LED lamp, white light). The complex of the carotenoid zeaxanthin with the carotenoid protein CBP (hCBP complex) has a pronounced antioxidant and cytoprotective effect. Fig. 3 shows the distributions of the average values of lipofuscin fluorescence duration in human visual pigment epithelium cells (ARPE-19 line). Lipofuscin is a glycoprotein pigment that is a biological marker of aging and various pathologies. Lipofuscin accumulates in cells as granules and is subject to oxidative processes, resulting in the accumulation of toxic compounds in the cell. Fig. 3 shows that the hCBP complex reduces the in vitro cytotoxic effect of lipofuscin upon photooxidation. Photooxidation was carried out by irradiating the culture with white light for 18 hours (intensity 0.5 mW/cm2) in a cell incubator using a LED lamp. The following samples were measured: "non-irradiated hCBP-" (Sample 1, non-irradiated cells loaded with lipofuscin granules, without the addition of hCBP); "non-irradiated hCBP+" (Sample 2, non-irradiated cells loaded with lipofuscin with the addition of hCBP to the growth medium at a concentration of 500 μM); "irradiated hCBP-" (Sample 3, irradiated cells loaded with lipofuscin granules, without the addition of hCBP); "irradiated hCBP+" (Sample 4, irradiated cells loaded with lipofuscin granules, with the addition of hCBP to the growth medium at a concentration of 500 μM). It is known that during the oxidative process there is a correlation between the value of the fluorescence duration of lipofuscin and the severity of its cytotoxic effect (Jung et al., 2010). From Fig. 3 it is evident that, firstly, the presence of hCBP in the cell medium reduces the cytotoxic effect of lipofuscin even without additional irradiation of the culture (see diagrams No. 1 and No. 2). Secondly, the effect is even more significant with photoinduced oxidation of lipofuscin (samples No. 3 and No. 4). In irradiated cells without hCBP, a significant increase in the average value of fluorescence duration was observed, which indicates intense oxidative stress. In the case when hCBP was placed in the culture medium, the increase in fluorescence duration was less significant, and, consequently, the toxic effect of lipofuscin was expressed less strongly. Thus, within the framework of the claimed invention, it is confirmed that zeaxanthin introduced into the culture in the form of hCBP has a pronounced antioxidant and antitoxic effect.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Для осуществления изобретения необходимо провести биосинтез конструкции ВКБ-каротиноид внутри бактериального штамма, а затем выделить данную конструкцию в чистом виде. Конкретнее, конструируют плазмиду, содержащую ген, кодирующий белок ВКБ. Поскольку узнавание конкретного каротиноида специфично, заранее выбирают конкретную мутантную форму ВКБ с известной аминокислотной последовательностью. Плазмида подбирается с учетом работы в заранее выбранном бактериальном штамме. Аналогично, конструируют плазмиду, содержащую необходимый набор генов для биосинтеза конкретного каротиноида. Далее, осуществляют трансформацию бактериального штамма и нарабатывают клеточную массу. Сборка конструкции ВКБ-каротиноид происходит внутри клеток самопроизвольно. Затем осуществляют лизис клеток, проводят процедуры выделения и очистки искомого соединения (конструкция ВКБ-каротиноид). Полученный раствор можно модифицировать с помощью дополнительных компонентов, поддерживающих функциональность препарата при хранении.To implement the invention, it is necessary to carry out the biosynthesis of the VKB-carotenoid construct inside the bacterial strain, and then isolate this construct in pure form. More specifically, a plasmid containing a gene encoding the VKB protein is constructed. Since recognition of a specific carotenoid is specific, a specific mutant form of VKB with a known amino acid sequence is selected in advance. The plasmid is selected taking into account the work in the previously selected bacterial strain. Similarly, a plasmid containing the necessary set of genes for the biosynthesis of a specific carotenoid is constructed. Next, the bacterial strain is transformed and cellular mass is accumulated. The assembly of the VKB-carotenoid construct occurs spontaneously inside the cells. Then, cell lysis is carried out, procedures for the isolation and purification of the desired compound (VKB-carotenoid construct) are carried out. The resulting solution can be modified using additional components that maintain the functionality of the drug during storage.
Ниже представлены детальные примеры, описание которых не ограничивает возможные применения заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.Below are detailed examples, the description of which does not limit the possible applications of the claimed invention, but demonstrates the possibility of implementing the invention with the achievement of the claimed technical result.
Пример 1.Example 1.
Синтез высокоэффективного ВКБ на основе каротиноид-связывающего белка тутового шелкопряда Bombyx mori (carotenoid-binding protein, CBP).Synthesis of highly effective VKB based on carotenoid-binding protein of silkworm Bombyx mori (carotenoid-binding protein, CBP).
Синтезируется кДНК, соответствующая остаткам 68-297 в генетической последовательности ВКБ BmCBP (последовательность кодирующих генов проверяется по базе Uniprot и должна соответствовать идентификационному номеру Q8MYA9). Последовательность генов подвергается кодон-оптимизации согласно методике, описанной в авторской работе (Slonimskiy et al., 2022a). После оптимизации происходит клонирование с использованием вектора pET28b-His-3C, обеспечивающего клеткам устойчивость к канамицину. Получаемый конструкт, после надлежащей генетической проверки с помощью секвенирования, обеспечивает наработку холо-формы hCBP в клетках C41(DE3), для наработки каротиноида предварительно трансформированных с помощью плазмиды pACCAR25ΔcrtX. Для ВКБ CBP доступен альтернативный вариант, в котором холо-форма hCBP содержит кантаксантин в качестве каротиноидного агента. Данный результат достигается с помощью ко-экспрессии путем активации гена crtW фермента кетолазы. Наработка белка индуцируется обработкой клеточного материала 0.1 мМ-раствором изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида в течение 12 часов при 25°С. Необходимая процедура очистки белка осуществляется с помощью иммобилизованной метал-аффинной и гель-эксклюзионной хроматографии. Для увеличения выхода холоформы BmCBP в комплексе с зеаксантином, в процессе лизирования клеток добавляется бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве дополнительного этапа очистки вводится стадия очистки препарата белка на гидроксиапатитной хроматографической колонке. После очистки образцы белков замораживаются и хранятся при -80°C.cDNA corresponding to residues 68-297 in the genetic sequence of BmCBP is synthesized (the coding gene sequence is verified against the Uniprot database and should correspond to the identification number Q8MYA9). The gene sequence is codon optimized according to the method described in the author's work (Slonimskiy et al., 2022a). After optimization, cloning occurs using the pET28b-His-3C vector, which provides cells with resistance to kanamycin. The resulting construct, after proper genetic verification by sequencing, provides for the production of the holo form of hCBP in C41(DE3) cells, for carotenoid production previously transformed using the pACCAR25ΔcrtX plasmid. An alternative variant is available for BmCBP, in which the holo form of hCBP contains canthaxanthin as a carotenoid agent. This result is achieved by co-expression of the ketolase enzyme via activation of the crtW gene. Protein production is induced by treating the cellular material with a 0.1 mM solution of isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside for 12 hours at 25°C. The necessary protein purification procedure is carried out using immobilized metal affinity and gel-exclusion chromatography. To increase the yield of the holoform of BmCBP in complex with zeaxanthin, bovine serum albumin (BSA) is added during cell lysis, and as an additional purification step, a stage of purification of the protein preparation on a hydroxyapatite chromatography column is introduced. After purification, protein samples are frozen and stored at -80°C.
Пример 2.Example 2.
Трансформация клеток E. coli для осуществления экспрессии целевых ВКБ.Transformation of E. coli cells to express target IgGs.
Осуществляется трансформация клеток E. coli плазмидой, кодирующей кластер генов биосинтеза каротиноидов (см. Пример выше) и несущей ген устойчивости к хлорамфениколу, после чего делают трансформанты компетентными с помощью стандартных протоколов. Второй раунд трансформации проводят с помощью плазмиды, кодирующей выбранный ВКБ (например, имеющей ампициллиновую устойчивость). После трансформации клетки высевают на плашки со средой LB-агар, содержащей ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (34 мкг/мл) и оставляют на ночь при 37°С. Стартовые культуры получают путем забора клеточного материала из одной выросшей колонии, помещают в 10 мл среды LB и выращивают при 37°С в течение суток на орбитальном шейкере (200 rpm). Для экспрессии белка отбирают суспензию и разбавляют до оптической плотности 0.1 средой LB (конечный объем 2*500 мл), далее растят при 37°С на орбитальном шейкере (200 rpm) до показателей оптической плотности 0,8. Затем вносят изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид до концентрации 500 мкМ и растят культуру при 25°С в течение 48 ч. Уровень экспрессии белка обнаруживают путем центрифугирования аликвоты суспензии - осажденные клетки должны иметь оранжево-красноватый цвет. В случае зеаксантина цвет культуры желтый. Аликвоту ресуспендируют в фосфатном буфере, содержащем 100 мг лизоцима и ингибитора протеаз Complete® (Roche), и лизируют с 3-4 циклами заморозки/оттаивания (используют сухой лед и абсолютный этанол). Полученный раствор центрифугируют (12000 g, 4°С), окрашенный супернатант подвергают очистке с помощью аффинной хроматографии. Элюцию проводят в градиенте имидазола (20-500 мМ), полученный раствор конструкции белок-каротиноид концентрируют (например, на Amicon Centrifugal Filter Units, Merck Millipore) и очищают от соли (колонка D-10 от GE Healthcare), затем хранят при -80°С в фосфатном буфере. E. coli cells are transformed with a plasmid encoding a carotenoid biosynthesis gene cluster (see example above) and carrying a chloramphenicol resistance gene, after which the transformants are made competent using standard protocols. A second round of transformation is performed using a plasmid encoding the selected CBC (e.g. ampicillin resistance). After transformation, the cells are plated on LB agar plates containing ampicillin (50 μg/ml) and chloramphenicol (34 μg/ml) and left overnight at 37°C. Starter cultures are obtained by taking cell material from one grown colony, placing it in 10 ml of LB medium and growing at 37°C for 24 hours on an orbital shaker (200 rpm). For protein expression, the suspension is collected and diluted to an optical density of 0.1 with LB medium (final volume 2*500 ml), then grown at 37°C on an orbital shaker (200 rpm) to an optical density of 0.8. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside is then added to a concentration of 500 μM and the culture is grown at 25°C for 48 h. The protein expression level is detected by centrifugation of an aliquot of the suspension - the sedimented cells should have an orange-reddish color. In the case of zeaxanthin, the culture color is yellow. The aliquot is resuspended in phosphate buffer containing 100 mg lysozyme and Complete® protease inhibitor (Roche) and lysed with 3-4 freeze/thaw cycles (using dry ice and absolute ethanol). The resulting solution is centrifuged (12000 g, 4°C), the colored supernatant is purified using affinity chromatography. Elution is performed in an imidazole gradient (20-500 mM), the resulting solution of the protein-carotenoid construct is concentrated (e.g., on Amicon Centrifugal Filter Units, Merck Millipore) and purified from salt (D-10 column from GE Healthcare), then stored at -80°C in phosphate buffer.
Пример 3.Example 3.
Оценка коллоидной стабильности конструкции каротиноид-ВКБ.Evaluation of the colloidal stability of the carotenoid-VKB construct.
Стабильность комплекса в растворе может оцениваться с помощью стандартных оптических методов, основанных на регистрации спектральных характеристик конструкции каротиноид-ВКБ и их изменений. Так, например, образование неспецифических агрегатов при денатурации белка приводит к появлению в растворе крупных частиц, помутнению раствора и выпадению осадка. Поэтому удобными способами оценки стабильности белка являются абсорбционная спектроскопия и методы регистрации гидродинамических характеристик белковых комплексов. В первом случае спектры поглощения могут быть измерены с помощью спектрофотометра, собранного на базе спектрометра Maya 2000 Pro (Ocean Optics, США) или аналогичных моделей детекторов на ПЗС-матрицах. В качестве источника белого света можно использовать стабилизированную дейтериевую лампу (SL S204, Thorlabs, USA) с выходом в многомодовое оптическое волокно, поскольку характеристики лампы позволяют проводить измерение интенсивности светового потока в УФ и видимой части спектра (от 250 до 700 нм). В экспериментах с конструкциями каротиноид-ВКБ следует обращать внимание на отношение интенсивности полосы поглощения каротиноида (видимая область) и аминокислотных остатков белка, поглощающих УФ-излучение, поскольку эта величина характеризует насыщенность комплекса каротиноидом. Также следует обращать внимание на увеличение оптической плотности, связанное с рассеянием света, поскольку это указывает на образование крупных частиц. Для оценки размеров частиц могут быть проведены эксперименты по измерению гидродинамического радиуса с помощью Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Англия) или аналогичных приборов. Коллоидная стабильность конструкции каротиноид-ВКБ может нарушаться при неоптимальных условиях хранения белкового препарата и/или наличии в растворе денатурирующих агентов.The stability of the complex in solution can be assessed using standard optical methods based on recording the spectral characteristics of the carotenoid-WCB structure and their changes. For example, the formation of non-specific aggregates during protein denaturation leads to the appearance of large particles in the solution, turbidity of the solution and precipitation. Therefore, convenient methods for assessing protein stability are absorption spectroscopy and methods for recording the hydrodynamic characteristics of protein complexes. In the first case, the absorption spectra can be measured using a spectrophotometer assembled on the basis of a Maya 2000 Pro spectrometer (Ocean Optics, USA) or similar models of detectors on CCD matrices. A stabilized deuterium lamp (SL S204, Thorlabs, USA) with an output into a multimode optical fiber can be used as a source of white light, since the characteristics of the lamp allow measuring the intensity of the light flux in the UV and visible parts of the spectrum (from 250 to 700 nm). In experiments with carotenoid-WCB constructs, attention should be paid to the ratio of the intensity of the absorption band of the carotenoid (visible region) and the amino acid residues of the protein absorbing UV radiation, since this value characterizes the saturation of the complex with carotenoid. Attention should also be paid to the increase in optical density associated with light scattering, since this indicates the formation of large particles. To estimate the particle size, experiments can be carried out to measure the hydrodynamic radius using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, England) or similar devices. The colloidal stability of the carotenoid-WCB construct can be impaired by suboptimal storage conditions of the protein preparation and/or the presence of denaturing agents in the solution.
Пример 4.Example 4.
Способ применения комплекса с антиоксидантным действием.Method of application of a complex with antioxidant action.
Примером антиоксидантного и цитопротекторного эффекта конструкции каротиноид-ВКБ является результат его взаимодействия с клетками, подверженными окислительному стрессу. Например, это могут быть клетки зрительного пигментного эпителия человека, в которых накапливаются липофусциновые гранулы, которые, при облучении способны генерировать активные формы кислорода, вызывающие окислительный стресс. Каротиноиднй белок CBP в холо-форме (комплекс hCBP) способен доставлять каротиноиды, в частности зеаксантин в мембраны клеток. Дальнейшее распределение каротиноида по клеточным мембранам приводит к попаданию природного антиоксиданта в области клетки, подверженные окислительному стрессу, что позволяет предотвратить появление активных форм кислорода и связанные с этим патологические процессы. Для оценки эффектов защиты клеток от окисления с помощью CBP в холо-форме могут быть использованы методы флуоресцентной спектроскопии для регистрации распределений усредненных значений длительности аутофлуоресценции липофусцина в культуре клеток зрительного пигментного эпителия до и после фотоокисления (облучение с помощью светодиодной лампы, белый свет). Для этого наиболее удобным методом является лазерная конфокальная сканирующая микроскопия с регистрацией длительности возбужденных состояний (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM). Метод реализуется с помощью импульсного пикосекундного возбуждения образца при 473 нм с помощью пикосекундного лазера и системы время-коррелированного счета единичных фотонов SPC-150, DCC-100 с детектором HMP-100, установленного на гальвано-сканер DSC-120 (все Becker & Hickl, Германия). В результате измерения автофлуоресценции липофусцина в клетках получают гистограммы распределения времен жизни возбужденных состояний и оценивают их изменения в присутствии CBP в холо-форме в культуральной среде до и после облучения клеток.An example of the antioxidant and cytoprotective effect of the carotenoid-VKB construct is the result of its interaction with cells exposed to oxidative stress. For example, these may be human visual pigment epithelium cells, in which lipofuscin granules accumulate, which, when irradiated, are capable of generating active oxygen species that cause oxidative stress. The carotenoid protein CBP in holo form (hCBP complex) is capable of delivering carotenoids, in particular zeaxanthin, to cell membranes. Further distribution of the carotenoid over cell membranes leads to the entry of the natural antioxidant into areas of the cell exposed to oxidative stress, which helps prevent the appearance of active oxygen species and the associated pathological processes. To assess the effects of cell protection from oxidation using CBP in holo form, fluorescence spectroscopy methods can be used to record the distributions of averaged values of lipofuscin autofluorescence duration in the visual pigment epithelial cell culture before and after photooxidation (irradiation using a LED lamp, white light). The most convenient method for this purpose is laser confocal scanning microscopy with registration of the duration of excited states (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM). The method is implemented using pulsed picosecond excitation of the sample at 473 nm using a picosecond laser and a time-correlated single photon counting system SPC-150, DCC-100 with an HMP-100 detector installed on a DSC-120 galvano scanner (all Becker & Hickl, Germany). As a result of measuring the autofluorescence of lipofuscin in cells, histograms of the distribution of lifetimes of excited states are obtained and their changes are assessed in the presence of CBP in the holo form in the culture medium before and after irradiation of the cells.
Антиоксидантная активность CBP в холо-форме может быть использована для модуляции окислительного стресса различного рода. Например, комплекс потенциально может быть использован в виде глазных капель для предотвращения фотоповреждения сетчатки или мази на водной основе для обработки поверхностных ран.The antioxidant activity of CBP in the holo form can be used to modulate oxidative stress of various kinds. For example, the complex could potentially be used as eye drops to prevent retinal photodamage or as a water-based ointment for treating superficial wounds.
Claims (5)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2022131410A RU2022131410A (en) | 2024-06-03 |
| RU2827772C2 true RU2827772C2 (en) | 2024-10-01 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6132790A (en) * | 1991-09-06 | 2000-10-17 | Betatene Limited | Carotenoid composition |
| RU2649124C2 (en) * | 2013-12-11 | 2018-03-29 | Хэлс-Эвер Биотэк Ко. Лтд | Pharmaceutical composition with carotenoid |
| AU2017203491B2 (en) * | 2013-03-11 | 2018-05-24 | Mjn U.S. Holdings Llc | Nutritional compositions containing structured fat globules and uses thereof |
| CN109588721A (en) * | 2019-01-25 | 2019-04-09 | 集美大学 | One Carotenoids-protein particle and its preparation method and application |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6132790A (en) * | 1991-09-06 | 2000-10-17 | Betatene Limited | Carotenoid composition |
| AU2017203491B2 (en) * | 2013-03-11 | 2018-05-24 | Mjn U.S. Holdings Llc | Nutritional compositions containing structured fat globules and uses thereof |
| RU2649124C2 (en) * | 2013-12-11 | 2018-03-29 | Хэлс-Эвер Биотэк Ко. Лтд | Pharmaceutical composition with carotenoid |
| CN109588721A (en) * | 2019-01-25 | 2019-04-09 | 集美大学 | One Carotenoids-protein particle and its preparation method and application |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A. Katz et al. Isolation and Characterization of a Protein Associated with Carotene Globules in the Alga Dunaliella bardawil September 1995 Plant Physiology 108(4): 1657-1664, найдено онлайн, найдено в Интернете: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC157547/pdf/1081657.pdf. * |
| Fernando Muzzopappa Changing Color for Photoprotection: The Orange Carotenoid Protein, Journal home page for Trends in Plant Science Volume 25, Issue 1, January 2020, Pages 92-104, найдено онлайн, найдено в Интернете: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138519302559?pes=vor#sec3. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yan et al. | Enhanced physicochemical stability of lutein-enriched emulsions by polyphenol-protein-polysaccharide conjugates and fat-soluble antioxidant | |
| Yang et al. | Urea-driven epigallocatechin gallate (EGCG) permeation into the ferritin cage, an innovative method for fabrication of protein–polyphenol co-assemblies | |
| Dosselli et al. | Synthesis, spectroscopic, and photophysical characterization and photosensitizing activity toward prokaryotic and eukaryotic cells of porphyrin-magainin and-buforin conjugates | |
| Jafari et al. | Nanotechnology-abetted astaxanthin formulations in multimodel therapeutic and biomedical applications | |
| Li et al. | Chemical modification of M13 bacteriophage and its application in cancer cell imaging | |
| Zhou et al. | Multifunctional nanocomplex for surface-enhanced Raman scattering imaging and near-infrared photodynamic antimicrobial therapy of vancomycin-resistant bacteria | |
| US8877207B2 (en) | Nanoparticles of cerium oxide targeted to an amyloid-beta antigen of Alzheimer's disease and associated methods | |
| CA2298932A1 (en) | Linear peptides derived from antibiotic peptides, preparation and use for vectoring active substances | |
| Ebrahimi et al. | Nanoliposomal peptides derived from Spirulina platensis protein accelerate full-thickness wound healing | |
| Mohkam et al. | Exploring the potential and safety of quantum dots in allergy diagnostics | |
| Zou et al. | A near-infrared light-triggered nano-domino system for efficient biofilm eradication: Activation of dispersing and killing functions by generating nitric oxide and peroxynitrite via cascade reactions | |
| Zhang et al. | Protein and peptide‐based nanotechnology for enhancing stability, bioactivity, and delivery of anthocyanins | |
| Hu et al. | Vanadyl nanocomplexes enhance photothermia-induced cancer immunotherapy to inhibit tumor metastasis and recurrence | |
| Pistone et al. | Silk fibroin film from golden‐yellow B ombyx mori is a biocomposite that contains lutein and promotes axonal growth of primary neurons | |
| RU2827772C2 (en) | Complex with antioxidant action and method of using same | |
| Pal et al. | Bioactive peptide nano-assemblies with pH-triggered shape transformation for antibacterial therapy | |
| Chotphruethipong et al. | Effects of sonication and ultrasound on properties and bioactivities of liposomes loaded with hydrolyzed collagen from defatted sea bass skin conjugated with epigallocatechin gallate | |
| Song et al. | A hypoxia-activated and microenvironment-remodeling nanoplatform for multifunctional imaging and potentiated immunotherapy of cancer | |
| Zhang et al. | Nanoemulsions loaded with compound photosensitisers: synergistic photodynamic inactivation effects of curcumin and riboflavin tetra butyrate | |
| Shahlaei et al. | Sustained release of sulforaphane by bioactive extracellular vesicles for neuroprotective effect on chick model | |
| WO2016072500A1 (en) | Molecular assembly containing modified rna, and rna delivery system using same | |
| Abreu et al. | Synthesis, photophysical and photobiological characterization of BSA nanoparticles loaded with chloroaluminium phthalocyanine by one-step desolvation technique for photodynamic therapy action | |
| CN108697802B (en) | Targeting Shells for Drug Delivery Systems Using Carbosilane Dendrimers | |
| Pereira Martins et al. | Nanoencapsulation of R-phycoerytrin extracted from Solieria filiformis improves protein stability and enables its biological application as a fluorescent dye | |
| Amaral et al. | The response surface methodology speeds up the search for optimal parameters in the photoinactivation of E. coli by photodynamic therapy |