RU2827186C1 - Consortium of lipophilic bacterial strains for biodegradation of palm oil - Google Patents
Consortium of lipophilic bacterial strains for biodegradation of palm oil Download PDFInfo
- Publication number
- RU2827186C1 RU2827186C1 RU2024122726A RU2024122726A RU2827186C1 RU 2827186 C1 RU2827186 C1 RU 2827186C1 RU 2024122726 A RU2024122726 A RU 2024122726A RU 2024122726 A RU2024122726 A RU 2024122726A RU 2827186 C1 RU2827186 C1 RU 2827186C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vkm
- palm oil
- consortium
- strain
- biodegradation
- Prior art date
Links
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 title claims abstract description 44
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 241000467496 Pseudomonas protegens Species 0.000 claims abstract description 28
- 241001337904 Gordonia <angiosperm> Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 22
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 241000746180 Gordonia paraffinivorans Species 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 239000001967 plate count agar Substances 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 8
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 4
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 3
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 3
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 101150089124 ACR3 gene Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100109981 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ARR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004173 biogeochemical cycle Methods 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- -1 peroxide compounds Chemical class 0.000 description 1
- IBIRZFNPWYRWOG-UHFFFAOYSA-N phosphane;phosphoric acid Chemical class P.OP(O)(O)=O IBIRZFNPWYRWOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, в частности к консорциуму липофильных бактериальных штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации пальмового масла. Данный консорциум липофильных бактериальных штаммов может быть использован для деструкции жидких отходов производства пальмового масла.The invention relates to the field of biotechnology, microbiology, in particular to a consortium of lipophilic bacterial strains Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D for the biodegradation of palm oil. This consortium of lipophilic bacterial strains can be used for the destruction of liquid waste from palm oil production.
Жидкие отходы производства пальмового масла характеризуются высоким содержанием непереработанного масла и других загрязняющих веществ. Прямой сброс таких стоков в окружающую среду без надлежащей очистки может вызвать серьезные экологические проблемы [Dominic D., Baidurah S. Recent developments in biological processing technology for palm oil mill effluent treatment - A review // Biology - 2022. - Vol. 11. - P. 525]. Бактерии играют значительную роль в биогеохимических циклах природных и антропогенных экосистем. В речных экосистемах бактерии интенсивно колонизируют иловые отложения, донные отложения могут быть источником разнообразных по метаболизму микроорганизмов, в том числе перспективных для промышленных биотехнологий [Araya R., Tani K., Takagi T., Yamaguchi N., Nasu M. Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 2003;43(1):111-119. DOI 10.1111/j.15746941.2003.tb01050.x]. Поиск эффективных микроорганизмов-деструкторов и разработка на их основе биотехнологий имеет большой потенциал для разработки промышленных технологий биодеградации пальмового масла.Liquid waste from palm oil production is characterized by a high content of unprocessed oil and other pollutants. Direct discharge of such effluents into the environment without proper treatment can cause serious environmental problems [Dominic D., Baidurah S. Recent developments in biological processing technology for palm oil mill effluent treatment - A review // Biology - 2022. - Vol. 11. - P. 525]. Bacteria play a significant role in the biogeochemical cycles of natural and anthropogenic ecosystems. In river ecosystems, bacteria intensively colonize silt sediments; bottom sediments can be a source of metabolically diverse microorganisms, including those promising for industrial biotechnology [Araya R., Tani K., Takagi T., Yamaguchi N., Nasu M. Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 2003;43(1):111-119. DOI 10.1111/j.15746941.2003.tb01050.x]. The search for effective microorganisms-destructors and the development of biotechnologies based on them has great potential for the development of industrial technologies for the biodegradation of palm oil.
Ранее опубликованы результаты выделения липофильных микроорганизмов из проб жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии, по филогенетическому анализу, определению липолитической активности и способности к росту на среде с пальмовым маслом штамм Pseudomonas protegens был признан перспективным для дальнейших исследований [Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Трифонов А.А., Топилина Ю.С., Сысоева А.Н., Франк Ю.А. Поиск и выделение липофильных бактерий для утилизации отходов производства пальмового масла // В книге: БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ. Материалы международного конгресса. Москва, 2023. С. 114-116].Previously, the results of isolation of lipophilic microorganisms from samples of liquid waste from the treatment facilities of the city of Surabaya in Indonesia were published; according to phylogenetic analysis, determination of lipolytic activity and ability to grow on a medium with palm oil, the Pseudomonas protegens strain was recognized as promising for further research [Gerasimchuk A.L., Ivasenko D.A., Trifonov A.A., Topilina Yu.S., Sysoeva A.N., Frank Yu.A. Search and isolation of lipophilic bacteria for the disposal of palm oil production waste // In the book: BIOTECHNOLOGY: STATE AND DEVELOPMENT PROSPECTS. Proceedings of the international congress. Moscow, 2023. pp. 114-116].
Известно, что Gordonia paraffinivorans актиномицет, обладает способностью разлагать углеводороды, выделен из нефтедобывающей скважины месторождения Дацин, Китай [Xue Y, Sun X, Zhou P, Liu R, Liang F, Ma Y. Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well. Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Sep; 53(Pt 5): 1643-1646. doi: 10.1099/ijs.0.02605-0. PMID: 13130063]. Об изучении липолитической активности у Gordonia paraffinivorans в отношении пальмового масла ранее опубликованных сведений не обнаружено. Gordonia paraffinivorans is a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well in Daqing, China [Xue Y, Sun X, Zhou P, Liu R, Liang F, Ma Y. Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well. Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Sep; 53(Pt 5): 1643-1646. doi: 10.1099/ijs.0.02605-0. PMID: 13130063]. No previously published data on the lipolytic activity of Gordonia paraffinivorans in relation to palm oil have been found.
Задачей данного изобретения является получение нового консорциума липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла, отличительной особенностью которого является объединение в одной ассоциации двух штаммов бактерий, способных к активному росту в среде с пальмовым маслом в качестве единственного источника органического вещества.The objective of this invention is to obtain a new consortium of lipophilic bacterial strains for the biodegradation of palm oil, the distinctive feature of which is the combination in one association of two strains of bacteria capable of active growth in a medium with palm oil as the only source of organic matter.
Для решения поставленной задачи предназначен консорциум липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла, состоящий из Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia parafinivorans VKM Ac-3071D в соотношении 1:1.To solve the problem, a consortium of lipophilic bacterial strains for the biodegradation of palm oil was designed, consisting of Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia parafinivorans VKM Ac-3071D in a 1:1 ratio.
Сведения о депонировании штаммовInformation on the deposition of strains
Штаммы депонированы во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР «ПУЩИНСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК», ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИМ. Г.К. СКРЯБИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИБФМ РАН) (142290, Россия, Московская обл., Пущино, пр. Науки, 5) под регистрационным номером VKM B-3844D и VKM Ac-3071D.The strains are deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms "FEDERAL RESEARCH CENTER "PUSHCHINSK SCIENTIFIC CENTER OF BIOLOGICAL RESEARCH OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES", SKRYABIN INSTITUTE OF BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY OF MICROORGANISMS OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES (IBFM RAS) (142290, Russia, Moscow region, Pushchino, pr. Nauki, 5) under registration numbers VKM B-3844D and VKM Ac-3071D.
Штамм Strain Pseudomonas protegens Pseudomonas proteogens VKM B-3844DVKM B-3844D
Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D выделен из образцов жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии. Жидкие отходы использовали в качестве инокулята при проведении посева методом разведений на агаризованную синтетическую среду с добавлением пальмового масла и карбоксиметилцеллюлозы в конечной концентрации 1% и на богатую питательную среду Plate Count Agar (PCA). Pseudomonas protegens strain VKM B-3844D was isolated from liquid waste samples from the Surabaya wastewater treatment plant in Indonesia. Liquid waste was used as an inoculum for dilution cultures on agar synthetic medium supplemented with palm oil and carboxymethylcellulose at a final concentration of 1% and on rich nutrient medium Plate Count Agar (PCA).
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признакиCultural-morphological and physiological-biochemical characteristics
Колонии светло-бежевые, непрозрачные. Клетки представлены палочками 2-4 мкм длиной. Спор не обнаружено. Температура культивирования 28°C, продолжительность культивирования 1-2 суток.Colonies are light beige, opaque. Cells are represented by rods 2-4 µm long. Spores were not found. Cultivation temperature 28°C, cultivation duration 1-2 days.
Культивирование и хранениеCultivation and storage
Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D растет на таких средах, как ГРМ (гидролизат рыбной муки), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1 %. При росте на ТБА штамм образует зоны гидролиза вокруг колоний 1-2 мм, что свидетельствует о продукции внеклеточных липолитических ферментов. Рост на богатых питательных средах составляет 1-2 суток при температуре 4-35°C, оптимум 28-32°C. Штамм способен к росту на минеральной среде с пальмовым маслом (1%), рост составляет 2-3 суток при температуре 15-35°C, оптимум 28°C.The strain Pseudomonas protegens VKM B-3844D grows on such media as GRM (hydrolyzed fish meal), Plate Count Agar (PCA), tributyrin agar (TBA), mineral medium with palm oil at a final concentration of 1%. When growing on TBA, the strain forms hydrolysis zones around colonies of 1-2 mm, which indicates the production of extracellular lipolytic enzymes. Growth on rich nutrient media is 1-2 days at a temperature of 4-35 ° C, the optimum is 28-32 ° C. The strain is capable of growth on a mineral medium with palm oil (1%), growth is 2-3 days at a temperature of 15-35 ° C, the optimum is 28 ° C.
Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D в лабораторных условиях поддерживают способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт 2.5 г/л; NaCl 5.0 г/л; D-глюкоза 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный 5.0 г/л; агар микробиологический 15.0 г/л, вода дистиллированная до 1.0 л.The Pseudomonas protegens VKM B-3844D strain is maintained in laboratory conditions by periodic subcultures once every 2-3 months on a Plate Count Agar (PCA) medium containing the following composition: yeast extract 2.5 g/l; NaCl 5.0 g/l; D-glucose 1.0 g/l; dry enzymatic peptone 5.0 g/l; microbiological agar 15.0 g/l, distilled water to 1.0 l.
Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D также может храниться при положительной температуре 4°C в лиофилизированном состоянии с использованием натурального снятого молока в качестве защитной среды. Pseudomonas protegens strain VKM B-3844D can also be stored at a positive temperature of 4°C in a lyophilized state using natural skim milk as a protective medium.
Штамм Strain Gordonia paraffinivorans Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071DVKM Ac-3071D
Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D выделен из образцов жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии. Gordonia paraffinivorans strain VKM Ac-3071D was isolated from liquid waste samples from the Surabaya wastewater treatment plant in Indonesia.
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признакиCultural-morphological and physiological-biochemical characteristics
Колонии оранжевые, непрозрачные. Клетки представлены палочками 2-4.5 мкм длиной. Спор не обнаружено. Температура культивирования 28°C, продолжительность культивирования 1-2 суток.Colonies are orange, opaque. Cells are represented by rods 2-4.5 µm long. Spores were not found. Cultivation temperature 28°C, cultivation duration 1-2 days.
Культивирование и хранениеCultivation and storage
Штамм растет на таких средах, как гидролизат рыбной муки (ГРМ), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1%. При росте на ТБА штамм образует зоны гидролиза вокруг колоний 1-2 мм, что свидетельствует о продукции внеклеточных липолитических ферментов. Рост на богатых питательных средах составлял 1-2 суток при температуре 4-50°C, оптимум 32-40°C. Штамм способен к росту на минеральной среде с пальмовым маслом (1%), рост составлял 2-3 суток при температуре 15-40°C, оптимум 32°C.The strain grows on media such as fish meal hydrolysate (FMH), Plate Count Agar (PCA), tributyrin agar (TBA), mineral medium with palm oil at a final concentration of 1%. When growing on TBA, the strain forms hydrolysis zones around colonies of 1-2 mm, which indicates the production of extracellular lipolytic enzymes. Growth on rich nutrient media was 1-2 days at a temperature of 4-50 ° C, the optimum is 32-40 ° C. The strain is capable of growth on a mineral medium with palm oil (1%), growth was 2-3 days at a temperature of 15-40 ° C, the optimum is 32 ° C.
Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D в лабораторных условиях поддерживают способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт 2.5 г/л; NaCl 5.0 г/л; D-глюкоза 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный 5.0 г/л; агар микробиологический 15.0 г/л, вода дистиллированная до 1.0 л. Gordonia paraffinivorans strain VKM Ac-3071D is maintained in laboratory conditions by periodic reseeding once every 2-3 months on Plate Count Agar (PCA) agar medium containing the following composition: yeast extract 2.5 g/l; NaCl 5.0 g/l; D-glucose 1.0 g/l; dry enzymatic peptone 5.0 g/l; microbiological agar 15.0 g/l, distilled water up to 1.0 l.
Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D может храниться при положительной температуре 4°C в лиофилизированном состоянии с использованием натурального снятого молока в качестве защитной среды. Gordonia paraffinivorans strain VKM Ac-3071D can be stored at a positive temperature of 4°C in a lyophilized state using natural skim milk as a protective medium.
Липолитическая активность штаммовLipolytic activity of strains
Липолитическую активность штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D определяли по наличию зон гидролиза на трибутриновом агаре (ТБА). Способность утилизировать пальмовое масло определяли культивированием на бедной минеральной среде с добавлением пальмового масла (1%). Оба штамма росли на ТБА и образовывали зоны гидролиза вокруг колоний 1-2 мм, что свидетельствует о продукции клетками внеклеточных липолитических ферментов. На жидкой среде с пальмовым маслом при 28°C максимальная численность Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D составила 9.47×108 кл/мл, максимальная численность Pseudomonas protegens VKM B-3844D и 1.14×109 кл/мл. Диапазон температур для роста с пальмовым маслом составил 15-40°C для Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D и 15-35°C для Pseudomonas protegens VKM B-3844D с оптимумом при 32°C и 28°C, соответственно.The lipolytic activity of the Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D strains was determined by the presence of hydrolysis zones on tributryn agar (TBA). The ability to utilize palm oil was determined by culturing on a poor mineral medium with the addition of palm oil (1%). Both strains grew on TBA and formed hydrolysis zones around the colonies of 1-2 mm, which indicates the production of extracellular lipolytic enzymes by the cells. On a liquid medium with palm oil at 28 °C, the maximum number of Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D was 9.47×10 8 cells/ml, the maximum number of Pseudomonas protegens VKM B-3844D and 1.14×10 9 cells/ml. The temperature range for growth with palm oil was 15-40°C for Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D and 15-35°C for Pseudomonas protegens VKM B-3844D with an optimum at 32°C and 28°C, respectively.
Каждую культуру консорциума штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D получают и хранят отдельно. Далее из штаммов составляют консорциум в соотношении 1:1.Each culture of the consortium of strains Pseudomonas protegen s VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D is obtained and stored separately. The strains are then combined into a consortium in a 1:1 ratio.
Липолитическая активность консорциума штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071DLipolytic activity of the consortium of strains Pseudomonas protegen s VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D
В составе консорциума штаммы Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D и Pseudomonas protegens VKM B-3844D активно росли в присутствии 5 % пальмового масла (не менее 108 кл/мл), о гидролизе масла в ходе культивирования свидетельствовало увеличение значения кислотного числа масла более чем в три раза, по сравнению с контролем, контрольные значения перекисного числа составили 12.43 мг КОН/г, в экспериментальных образцах при культивировании консорциума - 39.97 и 51.2 мг КОН/г.As part of the consortium, the strains Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D and Pseudomonas protegen s VKM B-3844D actively grew in the presence of 5% palm oil (at least 10 8 cells/ml); the hydrolysis of the oil during cultivation was evidenced by an increase in the acid number of the oil by more than three times, compared to the control; the control values of the peroxide number were 12.43 mg KOH/g, in the experimental samples during the cultivation of the consortium - 39.97 and 51.2 mg KOH/g.
Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.The possibility of implementing the claimed invention is shown, but not limited, in examples of specific implementation.
Пример 1. Выделение и культивирование штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844DExample 1. Isolation and cultivation of the Pseudomonas protegens strain VKM B-3844D
Штамм выделен из образцов жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии. Образец воды из аэротенка объемом 450 мл транспортировали в лабораторию при положительной температуре 5±2°C. Исследованы некоторые физико-химические параметры отходов, послуживших источниками для культивирования микроорганизмов: значение рН 6.9, ХПК 92.7 мгО/л, содержание ионов аммония 31.6 мг/л, нитрат-иона 134 мг/л, нитрит-иона 30 мг/л, сульфатов 263 мг/л, хлоридов 214 мг/л, фосфора фосфатов 4.16 мг/л.The strain was isolated from liquid waste samples from the Surabaya wastewater treatment plant in Indonesia. A 450 ml sample of water from the aeration tank was transported to the laboratory at a positive temperature of 5±2°C. Some physicochemical parameters of the waste that served as a source for culturing microorganisms were studied: pH 6.9, COD 92.7 mgO/l, ammonium ion content 31.6 mg/l, nitrate ion 134 mg/l, nitrite ion 30 mg/l, sulfates 263 mg/l, chlorides 214 mg/l, phosphorus phosphates 4.16 mg/l.
Выделение штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844D проводили путем посева десятикратных разведений воды на агаризованную синтетическую среду состава NH4Cl - 0.625 г/л, CaCl2 - 0.0025 г/л, MnCl2 - 0.005 г/л, MgSO4×7Н2О - 0.05 г/л, FeSO4×5Н2О - 0.0025 г/л, NaCl - 1.25 г/л, Na2HPO4 - 2.5 г/л, KH2PO4 - 0.25 г/л; рН 7.5 с добавлением карбоксиметилцеллюлозы в конечной концентрации 1%. Культивирование проводили при температуре 28С в течение 2 суток. Колонии пересевали не менее 3-5 раз на плотной среде Plate Count Agar (PCA) с контролем чистоты культуры с помощью микроскопии, далее полученную чистую культуру идентифицировали. В качестве основного метода видовой идентификации применялось секвенирование близкой к полной последовательности гена 16S рРНК (1415 п.о.) и последовательности gyrB (1145 п.о.). Геномную ДНК из культур выделяли с помощью набора Biolabmix (DU-50) в соответствии с инструкцией производителя (http://biolabmix.ru/). Для амплификации бактериальных генов 16S рРНК, которые являются универсальными филогенетическими маркерами, использовали праймеры 27F [DeLong E.F. Archaea in coastal marine environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1992. - Vol. 89, Iss. 12. - P. 5685-5689. - DOI: 10.1073/pnas.89.12.5685] и 1492R [Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology - 1991. - Vol. 173, Iss. 2. - P. 697-703. - DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991]. ПЦР-смесь объемом 50 мкл содержала 1×ПЦР-буфер (Biolabmix), 2.5 мМ MgCl2 (Biolabmix), 0.2 мМ смеси dNTP (Biolabmix), по 10 пм каждого праймера (ООО «Синтол»), 0.7 ед.а. термостабильной HS-Taq-полимеразы (Biolabmix), 3 мкл матрицы ДНК (в концентрации превышающей 50 нг), до конечного объема доводили стерильной деионизованной водой. Амплификацию генов 16S рРНК проводили по программе: первоначальная денатурация при 95°С в течение 20 с; последующие 6 циклов денатурация при 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров при 45°С в течение 20 с, элонгация праймеров при 72°С в течение 1.5 мин; последующие 27 циклов денатурация при 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров при 55°С в течение 20 с; элонгация праймеров при 72°С в течение 1.5 мин; окончательная элонгация при 72°С в течение 3 мин [Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Касымова А.А., Франк Ю.А. Селективное культивирование бактериальных штаммов с липолитической и нефтеокисляющей активностью из донных осадков реки Оби в Западной Сибири // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2022. Т. 26. № 5. С. 449-457. DOI: 10.18699/VJGB-22-55]. Амплификацию генов gyrB проводили с использованием праймеров UP-1 и UP-2r [Yamamoto S., Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains // Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61(3). P. 1104-1109. doi: 10.1128/aem.61.3.1104-1109.1995]. ПЦР-смесь готовили как описано выше. Проводили 30 циклов амплификации с денатурацией матричной ДНК при 94°С в течение 1 мин, отжигом праймеров при 60°С в течение 1 мин и элонгацией при 72°С в течение 2 мин. Секвенирование полученных последовательностей ДНК осуществляли с помощью генетического анализатора «НАНОФОР - 05» на базе НПФ Синтол, г. Москва. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и gyrB проводили с помощью редактора последовательностей BIOEDIT (http://www.jwbrown. mbio.ncsu.edu), программы BLAST в базе данных NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).The Pseudomonas protegens strain VKM B-3844D was isolated by inoculating tenfold dilutions of water onto an agarized synthetic medium containing NH 4 Cl - 0.625 g/l, CaCl 2 - 0.0025 g/l, MnCl 2 - 0.005 g/l, MgSO 4 ×7Н 2 О - 0.05 g/l, FeSO 4 ×5Н 2 О - 0.0025 g/l, NaCl - 1.25 g/l, Na 2 HPO 4 - 2.5 g/l, KH 2 PO 4 - 0.25 g/l; pH 7.5 with the addition of carboxymethylcellulose at a final concentration of 1%. Cultivation was carried out at a temperature of 28C for 2 days. The colonies were subcultured at least 3-5 times on a dense Plate Count Agar (PCA) medium with culture purity control using microscopy, and then the resulting pure culture was identified. Sequencing of the nearly complete 16S rRNA gene sequence (1415 bp) and the gyrB sequence (1145 bp) was used as the main method of species identification. Genomic DNA from the cultures was isolated using the Biolabmix kit (DU-50) according to the manufacturer's instructions (http://biolabmix.ru/). For amplification of bacterial 16S rRNA genes, which are universal phylogenetic markers, primers 27F were used [DeLong EF Archaea in coastal marine environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1992. - Vol. 89, Iss. 12. - P. 5685-5689. - DOI: 10.1073/pnas.89.12.5685] and 1492R [Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology - 1991. - Vol. 173, Iss. 2. - P. 697-703. - DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991]. The 50 μl PCR mixture contained 1×PCR buffer (Biolabmix), 2.5 mM MgCl 2 (Biolabmix), 0.2 mM dNTP mixture (Biolabmix), 10 pm of each primer (OOO "Synthol"), 0.7 units of a. thermostable HS-Taq polymerase (Biolabmix), 3 μl of DNA template (at a concentration exceeding 50 ng) were added to the final volume with sterile deionized water. Amplification of 16S rRNA genes was carried out according to the program: initial denaturation at 95°C for 20 s; the following 6 cycles of denaturation at 95°C for 10 s, annealing of primers at 45°C for 20 s, elongation of primers at 72°C for 1.5 min; the following 27 cycles of denaturation at 95°C for 10 s, annealing of primers at 55°C for 20 s; elongation of primers at 72°C for 1.5 min; final elongation at 72°C for 3 min [Gerasimchuk A.L., Ivasenko D.A., Kasymova A.A., Frank Yu.A. Selective cultivation of bacterial strains with lipolytic and oil-oxidizing activity from the bottom sediments of the Ob River in Western Siberia // Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2022. Vol. 26. No. 5. Pp. 449-457. DOI: 10.18699/VJGB-22-55]. Amplification of the gyrB genes was carried out using the UP-1 and UP-2r primers [Yamamoto S., Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains // Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61(3). P. 1104-1109. doi: 10.1128/aem.61.3.1104-1109.1995]. The PCR mixture was prepared as described above. Thirty amplification cycles were carried out with denaturation of the template DNA at 94°C for 1 min, annealing of the primers at 60°C for 1 min, and elongation at 72°C for 2 min. Sequencing of the obtained DNA sequences was performed using a NANOFOR-05 genetic analyzer at the Sintol Scientific and Production Company, Moscow. The analysis of the obtained nucleotide sequences of the 16S rRNA and gyrB genes was performed using the BIOEDIT sequence editor (http://www.jwbrown. mbio.ncsu.edu), the BLAST program in the NCBI GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Штамм способен к росту на таких средах, как гидролизат рыбной муки (ГРМ), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1%. Штамм образовывал зоны гидролиза на диагностической среде с трибутирином, что свидетельствует о продукции клетками внеклеточных липолитических ферментов (липаз, эстераз). Также косвенным подтверждением липолитической активности является положительная ПЦР-амплификация фрагмента длиной 250 п.о. с праймерами OXF1 и ACR3 [Bell P.J.L., Sunna A., Gibbs M.D., Curach N.C., Nevalainen H. and Bergquist P.L. Prospecting for novel lipase genes using PCR // Microbiology - 2002. - Vol. 148. - P. 2283-2291], специфичными к самой разнообразной группе липаз семейства альфа-бета гидролаз.The strain is capable of growth on such media as fish meal hydrolysate (FMH), Plate Count Agar (PCA), tributyrin agar (TBA), mineral medium with palm oil at a final concentration of 1%. The strain formed hydrolysis zones on a diagnostic medium with tributyrin, which indicates the production of extracellular lipolytic enzymes (lipases, esterases) by the cells. Also, an indirect confirmation of lipolytic activity is a positive PCR amplification of a 250 bp fragment with primers OXF1 and ACR3 [Bell P.J.L., Sunna A., Gibbs M.D., Curach N.C., Nevalainen H. and Bergquist P.L. Prospecting for novel lipase genes using PCR // Microbiology - 2002. - Vol. 148. - P. 2283-2291], specific to the most diverse group of lipases of the alpha-beta hydrolase family.
Рост на богатых питательных средах составлял 1-2 суток. Диапазон рН для роста 4-10, оптимум 8-9. Диапазон температур для роста 4-35°C, оптимум 28-32°C. Штамм способен к росту на минеральной среде с пальмовым маслом (1%) в качестве единственного источника углерода, рост составляет 2-3 суток, численность 108-109 кл/мл, при температуре 15-35°C, оптимум 28°C при котором максимальная численность составляет 1.14×109 кл/мл.Growth on rich nutrient media was 1-2 days. The pH range for growth was 4-10, optimum 8-9. The temperature range for growth was 4-35°C, optimum 28-32°C. The strain is capable of growth on a mineral medium with palm oil (1%) as the only carbon source, growth was 2-3 days, the number was 10 8 -10 9 cells/ml, at a temperature of 15-35°C, the optimum was 28°C, at which the maximum number was 1.14×10 9 cells/ml.
Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D в лабораторных условиях поддерживали способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт - 2.5 г/л; NaCl - 5.0 г/л; D-глюкоза - 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный - 5.0 г/л; агар микробиологический - 15.0 г/л, вода дистиллированная - до 1.0 л.The Pseudomonas protegens VKM B-3844D strain was maintained in laboratory conditions by periodic subcultures once every 2-3 months on a Plate Count Agar (PCA) medium containing the following composition: yeast extract - 2.5 g/l; NaCl - 5.0 g/l; D-glucose - 1.0 g/l; dry enzymatic peptone - 5.0 g/l; microbiological agar - 15.0 g/l, distilled water - up to 1.0 l.
Пример 2. Способ коллекционного (долговременного) хранения штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844DExample 2. Method of collection (long-term) storage of the strain Pseudomonas protegens VKM B-3844D
Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D выращивали на жидкой оптимальной питательной среде (например, PCA) путем внесения 5% инокулята и культивирования в течение 24 часов при температуре 28°C. В экспоненциальной фазе роста жидкую культуру осаждали центрифугированием и удаляли супернатант. К полученному осадку добавляли снятое молоко в качестве протектора. Суспензию клеток в протекторе разливали по стеклянным ампулам и обезвоживали методом лиофилизации. Хранение флаконов или ампул проводили при положительной температуре 4°C. Pseudomonas protegens strain VKM B-3844D was grown in liquid optimal nutrient medium (e.g., PCA) by adding 5% inoculum and culturing for 24 hours at 28°C. In the exponential growth phase, the liquid culture was precipitated by centrifugation and the supernatant was removed. Skim milk was added to the resulting sediment as a protectant. The cell suspension in the protector was poured into glass ampoules and dehydrated by lyophilization. Storage of vials or ampoules was carried out at a positive temperature of 4°C.
Пример 3. Выделение и культивирование штамма Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071DExample 3. Isolation and cultivation of Gordonia paraffinivorans strain VKM Ac-3071D
Штамм выделен из проб жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии. Образец воды из аэротенка объемом 450 мл транспортировали в лабораторию при положительной температуре 5±2°C. Выделение штамма Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D проводили путем посева десятикратных разведений воды на агаризованную синтетическую среду, состав которой описан в Примере 1, с добавлением карбоксиметилцеллюлозы в конечной концентрации 1%. Культивирование при температуре 28°C в течение 2 суток. Колонии пересевали не менее 3-5 раз на плотной среде PCA с контролем чистоты культуры с помощью микроскопии, далее полученную чистую культуру идентифицировали на основании анализа последовательности гена 16S рРНК, а также на основе культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик. В качестве основного метода видовой идентификации применялось секвенирование близкой к полной последовательности гена 16S рРНК (1415 п.о.). Геномную ДНК из культур выделяли с помощью набора Biolabmix (DU-50) в соответствии с инструкцией производителя (http://biolabmix.ru/). Для амплификации бактериальных генов 16S рРНК, которые являются универсальными филогенетическими маркерами, использовали праймеры 27F и 1492R также, как описано для штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844D в Примере 1. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК проводили с помощью редактора последовательностей BIOEDIT (http://www.jwbrown. mbio.ncsu.edu) и инструмента UGENE Unipro (https://ugene.net/ru/download.html), а также программы BLAST в базе данных NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).The strain was isolated from samples of liquid waste from the Surabaya treatment plant in Indonesia. A 450 ml sample of water from an aeration tank was transported to the laboratory at a positive temperature of 5±2°C. The Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D strain was isolated by inoculating tenfold dilutions of water on an agarized synthetic medium, the composition of which is described in Example 1, with the addition of carboxymethylcellulose at a final concentration of 1%. Cultivation was at a temperature of 28°C for 2 days. Colonies were subcultured at least 3-5 times on a dense PCA medium with culture purity control using microscopy, then the resulting pure culture was identified based on the analysis of the 16S rRNA gene sequence, as well as on the basis of cultural-morphological and physiological-biochemical characteristics. Sequencing of the nearly complete 16S rRNA gene sequence (1415 bp) was used as the main method of species identification. Genomic DNA from the cultures was isolated using the Biolabmix kit (DU-50) in accordance with the manufacturer's instructions (http://biolabmix.ru/). For amplification of bacterial 16S rRNA genes, which are universal phylogenetic markers, primers 27F and 1492R were used as described for the Pseudomonas protegens strain VKM B-3844D in Example 1. Analysis of the obtained nucleotide sequences of the 16S rRNA genes was performed using the BIOEDIT sequence editor (http://www.jwbrown. mbio.ncsu.edu) and the UGENE Unipro tool (https://ugene.net/ru/download.html), as well as the BLAST program in the NCBI GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Штамм способен к росту на таких средах, как гидролизат рыбной муки (ГРМ), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1%. Штамм образовывал зоны гидролиза на диагностической среде с трибутирином, что свидетельствует о продукции клетками внеклеточных липолитических ферментов. Кроме того, штамм рос на жидкой синтетической среде с пальмовым маслом (1% v/v) в качестве единственного источника углерода и при 28°C максимальная численность Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D составляла 9.47×108 кл/мл. На минеральной среде с пальмовым маслом (1%) рост составлял 2-3 суток с образованием численности 108-109 кл/мл при температуре 15-40°C, оптимум 32°C.The strain is capable of growth on such media as fish meal hydrolysate (FMH), Plate Count Agar (PCA), tributyrin agar (TBA), mineral medium with palm oil at a final concentration of 1%. The strain formed hydrolysis zones on a diagnostic medium with tributyrin, which indicates the production of extracellular lipolytic enzymes by the cells. In addition, the strain grew on a liquid synthetic medium with palm oil (1% v/v) as the only carbon source and at 28°C the maximum number of Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D was 9.47×10 8 cells/ml. On a mineral medium with palm oil (1%), growth was 2-3 days with the formation of a number of 10 8 -10 9 cells/ml at a temperature of 15-40°C, the optimum is 32°C.
Рост на богатых питательных средах составлял 1-2 суток при температуре 28°C. Диапазон рН для роста 4-10, оптимум 7.5. Диапазон температур для роста 4-50°C, оптимум 32-40°C.Growth on rich nutrient media lasted 1-2 days at a temperature of 28°C. The pH range for growth was 4-10, with an optimum of 7.5. The temperature range for growth was 4-50°C, with an optimum of 32-40°C.
Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D в лабораторных условиях поддерживали способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт 2.5 г/л; NaCl 5.0 г/л; D-глюкоза 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный 5.0 г/л; агар микробиологический 15.0 г/л, вода дистиллированная до 1.0 л. Gordonia paraffinivorans strain VKM Ac-3071D was maintained in laboratory conditions by periodic reseeding once every 2-3 months on a Plate Count Agar (PCA) medium containing the following composition: yeast extract 2.5 g/l; NaCl 5.0 g/l; D-glucose 1.0 g/l; dry enzymatic peptone 5.0 g/l; microbiological agar 15.0 g/l, distilled water up to 1.0 l.
Пример 4. Способ коллекционного (долговременного) хранения штамма Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071DExample 4. Method of collection (long-term) storage of strain Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D
Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D выращивают на жидкой оптимальной питательной среде (например, PCA) путем внесения 5% инокулята и культивирования в течение 24 часов при температуре 28°C. В экспоненциальной фазе роста жидкую культуру осаждают центрифугированием и удаляют супернатант. К полученному осадку добавляют снятое молоко в качестве протектора. Суспензию клеток в протекторе разливают по стеклянным ампулам и обезвоживают методом лиофилизации. Хранение флаконов или ампул проводят при положительной температуре 4°C.Strain Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D is grown in liquid optimal nutrient medium (e.g. PCA) by adding 5% inoculum and culturing for 24 hours at 28°C. In the exponential growth phase, the liquid culture is precipitated by centrifugation and the supernatant is removed. Skim milk is added to the resulting sediment as a protectant. The cell suspension in the protector is poured into glass ampoules and dehydrated by lyophilization. Storage of vials or ampoules is carried out at a positive temperature of 4°C.
Пример 5. Применение консорциума Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации пальмового маслаExample 5. Application of the consortium Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D for the biodegradation of palm oil
Эксперименты проводили в стерильных условиях в стеклянных колбах объемом 19 л, содержащих 10 л минеральной питательной среды с добавлением 5% пальмового масла. Аэрацию осуществляли с помощью подачи стерильного воздуха в колбы с помощью компрессора. В экспериментальные колбы добавляли 2% инокулята - жидкую культуру штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D, выращенных по отдельности, в соотношении 1:1. Культивирование проводили при комнатной температуре 22-23°C. В эксперименте А для наблюдения за динамикой процессов деструкции через 5, 10 и 15 суток фиксировали визуальные изменения в культуральной жидкости, а также собирали остатки масла и проводили анализ кислотного и перекисного числа. Эксперимент В включал экспериментальную колбу с консорциумом (опыт) и контрольную колбу без добавления инокулята (контроль), включая анализ кислотного и перекисного числа через 15 суток инкубирования при описанных выше условиях.The experiments were carried out under sterile conditions in 19-liter glass flasks containing 10 liters of mineral nutrient medium with the addition of 5% palm oil. Aeration was performed by supplying sterile air to the flasks using a compressor. 2% inoculum was added to the experimental flasks - a liquid culture of Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D strains grown separately in a 1:1 ratio. Cultivation was carried out at room temperature of 22-23°C. In experiment A, visual changes in the culture liquid were recorded after 5, 10 and 15 days to observe the dynamics of destruction processes, and oil residues were collected and acid and peroxide values were analyzed. Experiment B included an experimental flask with the consortium (experiment) and a control flask without the addition of inoculum (control), including analysis of the acid and peroxide values after 15 days of incubation under the conditions described above.
По результатам эксперимента А через 5 суток культивирования общая численность консорциума составляла не менее 108 кл/мл и не снижалась до конца эксперимента А. Значительная часть пальмового масла эмульгировала в питательную среду. Значения кислотного числа увеличилось по сравнению с сырым пальмовым маслом в 32, 132 и более чем в 240 раз через 5, 10 и 15 суток эксперимента по биодеструкции, что свидетельствует об активных процессах гидролиза пальмового масла под воздействием консорциума штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D.According to the results of experiment A, after 5 days of cultivation, the total number of the consortium was at least 10 8 cells/ml and did not decrease until the end of experiment A. A significant portion of the palm oil was emulsified into the nutrient medium. The acid number values increased compared to crude palm oil by 32, 132 and more than 240 times after 5, 10 and 15 days of the biodegradation experiment, indicating active processes of palm oil hydrolysis under the influence of the consortium of Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D strains.
В эксперименте В показано, что в контрольной колбе под действием аэрации происходил химический гидролиз пальмового масла, однако в экспериментальной колбе под действием консорциума штаммов гидролиз проходил эффективнее, более чем в 3.2 раза (при сравнении кислотного числа). Показатели перекисного числа не менялись, что может свидетельствовать о том, что в ходе экспериментов не происходило процессов химического или биологического образования перекисных соединений. Кроме того, в культуральной жидкости происходило увеличение количества свободных жирных кислот (С16:1, С18:2) и изменение их состава. Под воздействием консорциума появлялись жирные кислоты 18:0, 18:1, которых не обнаружено в химическом контроле без внесения консорциума.Experiment B showed that chemical hydrolysis of palm oil occurred in the control flask under the influence of aeration, but in the experimental flask under the influence of the consortium of strains, hydrolysis was more effective, more than 3.2 times (when comparing the acid number). The peroxide number indicators did not change, which may indicate that no processes of chemical or biological formation of peroxide compounds occurred during the experiments. In addition, an increase in the amount of free fatty acids (C16:1, C18:2) and a change in their composition occurred in the culture liquid. Under the influence of the consortium, fatty acids 18:0, 18:1 appeared, which were not detected in the chemical control without the addition of the consortium.
Пример 6. Применение консорциума Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации отходов производства пальмового маслаExample 6. Application of the consortium Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D for the biodegradation of palm oil production waste
В качестве модели прудов-накопителей выступали стеклянные аквариумы объемом 5 л со смесью из 2 л нестерильной водопроводной воды и 100 г сырых жидких отходов из пруда-накопителя, находящегося на предприятии PT Agro Indomas, координаты места обора проб -0.9141973777308665, 116.83024569376929. Сырые жидкие отходы из пруда накопителя представляли собой вязкую массу с высоким (89.5%) содержанием пальмового масла. С помощью компрессора в двух аквариумах были созданы условия аэрации толщи воды, в один из которых (опыт) был внесен консорциум штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D в количестве, соответствующем 109 кл/мл на 1 м3 жидких отходов. В качестве контрольных (без внесения консорциума штаммов) выступали аквариум без аэрации (контроль 1) и аквариум с аэрацией (контроль 2). Эксперимент проводился при комнатной температуре около 22°C. Продолжительность эксперимента составила 33 суток. Меньше, чем через 24 ч в опытном аквариуме наблюдали помутнение воды, что свидетельствует об активном росте внесенного консорциума и развитии бактериальной биомассы. Плотные вязкие отходы с большим содержанием масла (массовая доля жира - 89.5%), использованные для проведения эксперимента и анализа их деструкции, оставались нерастворимыми на протяжении всего эксперимента и покрывали поверхность жидкости в аквариумах. Однако по завершении эксперимента внешний вид и консистенция отходов из опытного аквариума с консорциумом отличались от образцов из контрольных аквариумов. Результаты анализа показали, что экспериментальный образец (опыт) содержал наименьшее количество жира в сухом веществе (64.28%) по сравнению с контролем 2 (68.5%) и контролем 1 (82.01%). Кроме того, в экспериментальном аквариуме выявлено значимое повышение таких свободных жирных кислот, как C18:2 и C18:3 (показатели измеренной площади пика увеличились со 192.27 до 1378.97 мВ⋅сек и с 50.00 до 118.25 мВ⋅сек, соответственно), что свидетельствует о деструкции жиросодержащих отходов сточных вод предприятий пищевой промышленности под влиянием консорциума липофильных бактериальных штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D.The model storage ponds were 5 L glass aquariums with a mixture of 2 L of non-sterile tap water and 100 g of raw liquid waste from the storage pond located at PT Agro Indomas, sampling location coordinates -0.9141973777308665, 116.83024569376929. The raw liquid waste from the storage pond was a viscous mass with a high (89.5%) content of palm oil. Using a compressor, conditions for aeration of the water column were created in two aquariums, into one of which (the experiment) a consortium of Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D strains was introduced in an amount corresponding to 10 9 cells/ml per 1 m 3 of liquid waste. An aquarium without aeration (control 1) and an aquarium with aeration (control 2) served as controls (without introducing the consortium of strains). The experiment was conducted at room temperature of about 22°C. The duration of the experiment was 33 days. Less than 24 hours later, turbidity of the water was observed in the experimental aquarium, indicating active growth of the introduced consortium and development of bacterial biomass. The dense viscous waste with a high oil content (89.5% fat mass fraction) used for the experiment and analysis of its destruction remained insoluble throughout the experiment and covered the surface of the liquid in the aquariums. However, at the end of the experiment, the appearance and consistency of the waste from the experimental aquarium with the consortium differed from the samples from the control aquariums. The results of the analysis showed that the experimental sample (experiment) contained the lowest amount of fat in dry matter (64.28%) compared to control 2 (68.5%) and control 1 (82.01%). In addition, a significant increase in free fatty acids such as C18:2 and C18:3 was detected in the experimental aquarium (the measured peak area values increased from 192.27 to 1378.97 mV⋅sec and from 50.00 to 118.25 mV⋅sec, respectively), indicating the destruction of fat-containing wastewater from food industry enterprises under the influence of the consortium of lipophilic bacterial strains Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D.
Таким образом, получен консорциум липофильных бактериальных штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации пальмового масла, отличительной особенностью которого является объединение в одной ассоциации двух штаммов бактерий, способных к активному росту в среде с пальмовым маслом в качестве единственного органического вещества. Полученный консорциум может применяться в технологиях биоремедиации жидких отходов производства пальмового масла (POME).Thus, a consortium of lipophilic bacterial strains Pseudomonas protegens VKM B-3844D and Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D for biodegradation of palm oil was obtained, the distinctive feature of which is the unification in one association of two bacterial strains capable of active growth in a medium with palm oil as the only organic substance. The obtained consortium can be used in technologies for bioremediation of liquid waste from palm oil production (POME).
Список использованных источниковList of references
1. Dominic D., Baidurah S. Recent developments in biological processing technology for palm oil mill effluent treatment - A review // Biology - 2022. - Vol. 11. - P. 525.1. Dominic D., Baidurah S. Recent developments in biological processing technology for palm oil mill effluent treatment - A review // Biology - 2022. - Vol. 11. - P. 525.
2. Araya R., Tani K., Takagi T., Yamaguchi N., Nasu M. Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 2003; 43(1): 111-119. DOI 10.1111/j.15746941.2003.tb01050.x.2. Araya R., Tani K., Takagi T., Yamaguchi N., Nasu M. Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 2003; 43(1): 111-119. DOI 10.1111/j.15746941.2003.tb01050.x.
3. Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Трифонов А.А., Топилина Ю.С., Сысоева А.Н., Франк Ю.А. Поиск и выделение липофильных бактерий для утилизации отходов производства пальмового масла // В книге: БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ. Материалы международного конгресса. Москва, 2023. С. 114-116.3. Gerasimchuk A.L., Ivasenko D.A., Trifonov A.A., Topilina Yu.S., Sysoeva A.N., Frank Yu.A. Search and isolation of lipophilic bacteria for the utilization of palm oil production waste // In the book: BIOTECHNOLOGY: STATE AND DEVELOPMENT PROSPECTS. Proceedings of the international congress. Moscow, 2023. P. 114-116.
4. Xue Y, Sun X, Zhou P, Liu R, Liang F, Ma Y. Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well. Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Sep;53(Pt 5):1643-1646. doi: 10.1099/ijs.0.02605-0. PMID: 13130063.4. Xue Y, Sun X, Zhou P, Liu R, Liang F, Ma Y. Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well. Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Sep;53(Pt 5):1643-1646. doi: 10.1099/ijs.0.02605-0. PMID: 13130063.
5. [DeLong E.F. Archaea in coastal marine environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1992. - Vol. 89, Iss. 12. - P. 5685-5689. - DOI: 10.1073/pnas.89.12.5685.5. [DeLong E.F. Archaea in coastal marine environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1992. - Vol. 89, Iss. 12. - P. 5685-5689. - DOI: 10.1073/pnas.89.12.5685.
6. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology - 1991. - Vol. 173, Iss. 2. - P. 697-703. - DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991.6. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology - 1991. - Vol. 173, Iss. 2. - P. 697-703. - DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991.
7. Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Касымова А.А., Франк Ю.А. Селективное культивирование бактериальных штаммов с липолитической и нефтеокисляющей активностью из донных осадков реки Оби в Западной Сибири // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2022. Т. 26. № 5. С. 449-457. DOI: 10.18699/VJGB-22-55.7. Gerasimchuk A.L., Ivasenko D.A., Kasymova A.A., Frank Yu.A. Selective cultivation of bacterial strains with lipolytic and oil-oxidizing activity from the bottom sediments of the Ob River in Western Siberia // Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2022. Vol. 26. No. 5. P. 449-457. DOI: 10.18699/VJGB-22-55.
8. Yamamoto S., Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains // Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61(3). P. 1104-1109. doi: 10.1128/aem.61.3.1104-1109.1995.8. Yamamoto S., Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains // Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61(3). P. 1104-1109. doi: 10.1128/aem.61.3.1104-1109.1995.
9. Bell P.J.L., Sunna A., Gibbs M.D., Curach N.C., Nevalainen H. and Bergquist P.L. Prospecting for novel lipase genes using PCR // Microbiology - 2002. - Vol. 148. - P. 2283-2291.9. Bell P.J.L., Sunna A., Gibbs M.D., Curach N.C., Nevalainen H. and Bergquist P.L. Prospecting for novel lipase genes using PCR // Microbiology - 2002. - Vol. 148. - P. 2283-2291.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2827186C1 true RU2827186C1 (en) | 2024-09-23 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2691317C1 (en) * | 2018-12-28 | 2019-06-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Зельдар" (ООО "Зельдар") | Consortium of bacteria strains for treatment of waste water from oil and fat pollution |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2691317C1 (en) * | 2018-12-28 | 2019-06-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Зельдар" (ООО "Зельдар") | Consortium of bacteria strains for treatment of waste water from oil and fat pollution |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XUE Y, et al., Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well. Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Sep;53(Pt 5):1643-1646. doi: 10.1099/ijs.0.02605-0. PMID: 13130063. ГЕРАСИМЧУК А.Л. и др., Поиск и выделение липофильных бактерий для утилизации отходов производства пальмового масла, Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы международного конгресса. Москва, 2023., с. 114-116. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhumibhamon et al. | Biotreatment of high fat and oil wastewater by lipase producing microorganisms | |
| CN102994428B (en) | One strain ocean surfactant producing bacteria strain LHOD-1 and application thereof | |
| Krishnaswamy et al. | Studies on the efficiency of the removal of phosphate using bacterial consortium for the biotreatment of phosphate wastewater | |
| Alhamdani et al. | Isolation and identification of lipase producing bacteria from oil-contaminant soil | |
| CN112625942A (en) | Aerobic denitrifying bacterium and application thereof | |
| Bunmadee et al. | Isolation and identification of a newly isolated lipase-producing bacteria (Acinetobacter baumannii RMUTT3S8-2) from oily wastewater treatment pond in a poultry processing factory and its optimum lipase production | |
| US5369029A (en) | Method for degrading nucleic acids in waste fermentation solutions with Paecilomyces lilacinus | |
| KR20140119856A (en) | A novel microorganism Rhodococcus pyridinovorans EDB2 degrading aromatic compounds | |
| Yun et al. | Contaminated bacterial effects and qPCR application to monitor a specific bacterium in Chlorella sp. KR-1 culture | |
| Dey et al. | An Approach to the identification and characterisation of a psychrotrophic lipase producing Pseudomonas sp ADT3 from Arctic region | |
| RU2827186C1 (en) | Consortium of lipophilic bacterial strains for biodegradation of palm oil | |
| Nadhman et al. | Production of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) depolymerase from Aspergillus sp. NA-25 | |
| CN112574918A (en) | Ammonia nitrogen degrading bacteria, microbial agent and application thereof | |
| KR101475589B1 (en) | A novel microorganism Rhodococcus pyridinovorans EDB2 degrading aromatic compounds | |
| JP2002301494A (en) | Activated sludge and wastewater treatment method | |
| WO2023286593A1 (en) | Aromatic polyester decomposing bacteria | |
| JP4088690B2 (en) | New microorganisms and methods for removing arsenic by microorganisms | |
| JP5334527B2 (en) | Novel microorganism, wastewater treatment method and wastewater treatment apparatus using the novel microorganism | |
| JP3091758B1 (en) | Oil-decomposing bacteria and method for treating oil-containing wastewater using the same | |
| KR101722167B1 (en) | Novel Marinomonas arctica PT-1 and uses thereof | |
| KR101581998B1 (en) | A novel microorganism Rhodococcus pyridinovorans EDB2 degrading aromatic compounds | |
| RU2759662C2 (en) | Strain of bacteria rhodococcus degradans h33 ac-2901d - petroleum and petroleum products destructor | |
| JP7106370B2 (en) | oil-degrading microorganisms | |
| Hassana et al. | Molecular identification of hydrocarbon degrading bacteria isolated from contaminated soil of automobile mechanic workshop in lapai, Niger State | |
| Tanweer et al. | Production of lipase by Bacillus altitudinis isolated from tannery effluent. |