RU2821947C2

RU2821947C2 - Method of producing membrane protein

Info

Publication number: RU2821947C2
Application number: RU2020136185A
Authority: RU
Inventors: Скотт Тревен МЮЭРС; Торстен Хёюбюэ Бак РЕГЕЙРА; Лена Мария Тхан ЭЛЛИНГСГОР; Симон Люнго КРАББЕ
Original assignee: Акуапорин А/С
Priority date: 2018-04-06
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2024-06-28

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to a method of producing a membrane protein on a pilot or industrial scale, involving the following steps: a) expression of said membrane protein in a host organism present in an aqueous medium, b) i) release of membrane protein from host organism by mechanical lysis of cells of host organism with formation of fragments of lysed cells, including this membrane protein and ii) recovering lysed cell fragments comprising said membrane protein in form of a solid fraction by centrifugation, c) addition of detergent solution to resuspended solid fraction obtained in b) for membrane protein solubilisation, d) recovering the liquid fraction of the solubilised membrane protein obtained in c) in the form of a supernatant by centrifugation, e) chromatography of the liquid fraction for binding or retention of the membrane protein on the stationary phase and f) elution of membrane protein from stationary phase with elution buffer, to obtain said membrane protein, wherein centrifugation at step d) is carried out at 500 to 30,000 g and said method does not include ultracentrifugation of the liquid fraction obtained in d).

EFFECT: method enables to efficiently obtain relatively large amounts of membrane proteins without deterioration of the quality of the end product.

18 cl, 17 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

Настоящее изобретение касается способа получения мембранного белка. Способ по изобретению подходит для промышленного применения, при котором должно производиться большое количество мембранных белков. Так, способ направлен на применение технологических операций, подходящих по крайней мере для пилотного производства. В частности, настоящее изобретение направлено на исключение устройства для ультрацентрифугирования.The present invention relates to a method for producing a membrane protein. The method of the invention is suitable for industrial applications in which large quantities of membrane proteins are to be produced. Thus, the method is aimed at using technological operations suitable for at least pilot production. In particular, the present invention is directed to the elimination of an ultracentrifugation device.

Уровень техникиState of the art

Примерно одна треть генов в геноме человека кодирует мембранные белки. Мембранные белки играют роль во многих важных клеточных действиях, включая преобразование энергии, клеточную сигнализацию, межклеточные взаимодействия, клеточную адгезию, миграцию клеток, перенос белков, слияние вирусов, синаптическую активность нейронов и транспорт ионов и метаболитов. Мембранные белки встроены в липидный бислой клеточной мембраны и состоят как из гидрофобных, так и гидрофильных частей.Approximately one third of the genes in the human genome encode membrane proteins. Membrane proteins play a role in many important cellular activities, including energy conversion, cell signaling, cell-cell interactions, cell adhesion, cell migration, protein trafficking, viral fusion, neuronal synaptic activity, and transport of ions and metabolites. Membrane proteins are embedded in the lipid bilayer of the cell membrane and consist of both hydrophobic and hydrophilic parts.

Недавно мембранные белки были успешно встроены в тонкопленочный композитный слой, посаженный на пористую структурную подложку. Более того, мембранные белки представляют собой важные фармацевтические мишени и интересные объекты для изучения клеточной биологии и биохимии белков. Следовательно, существует потребность в пилотном или крупномасштабном получении мембранных белков.Recently, membrane proteins were successfully incorporated into a thin-film composite layer supported on a porous structural support. Moreover, membrane proteins represent important pharmaceutical targets and interesting objects for the study of cell biology and protein biochemistry. Therefore, there is a need for pilot or large-scale production of membrane proteins.

В WO 2017/137361 (A1) раскрыты самособирающиеся наноструктуры, образующиеся между трансмембранными белками типа водных каналов аквапорина (AQP) и полиалкилениминами (PAI). Самособирающиеся наноструктуры впоследствии включаются в тонкопленочные композитные (TFC) мембраны, посаженные на пористую несущую мембрану. Пористая несущая мембрана может представлять собой полое волокно, плоский лист, спирально-навитую мембрану и т.п. для обратного осмоса или прямого осмоса.WO 2017/137361 (A1) discloses self-assembled nanostructures formed between transmembrane proteins such as aquaporin (AQP) water channels and polyalkylene imines (PAI). The self-assembled nanostructures are subsequently incorporated into thin film composite (TFC) membranes supported on a porous support membrane. The porous support membrane may be a hollow fiber, a flat sheet, a spiral wound membrane, or the like. for reverse osmosis or direct osmosis.

В WO 2013/043118 раскрыты тонкопленочные композитные (TFC) мембраны, в которых водные каналы аквапорина (AQP) встроены в активный слой мембраны. Кроме того, там же раскрыт способ получения тонкопленочных композитных мембран и их применение в процессах фильтрации типа нанофильтрации и осмотической фильтрации. TFC-мембраны содержат везикулы липид-AQP/сополимер-AQP, которые встроены в активный слой TFC. В WO 2010/146365 описано получение фильтрующих мембран TFC-аквапорин-Z (AqpZ), в которых используется амфифильный триблок-сополимер в качестве везикулообразующего вещества для включения иммобилизованного AQP.WO 2013/043118 discloses thin film composite (TFC) membranes in which aquaporin (AQP) water channels are embedded in the active layer of the membrane. In addition, it also discloses a method for producing thin-film composite membranes and their use in filtration processes such as nanofiltration and osmotic filtration. TFC membranes contain lipid-AQP/copolymer-AQP vesicles that are embedded in the TFC active layer. WO 2010/146365 describes the preparation of TFC-aquaporin-Z (AqpZ) filtration membranes that use an amphiphilic triblock copolymer as a vesicle-forming agent to incorporate immobilized AQP.

В WO 2014/108827 раскрыты модули из полых волокон (HF), содержащие волокна, модифицированные тонкопленочным композитным (TFC) слоем, содержащим водные каналы аквапорина, в которых водные каналы аквапорина встроены в пузырьки перед заключением в слой TFC.WO 2014/108827 discloses hollow fiber (HF) modules comprising fibers modified with a thin film composite (TFC) layer containing aquaporin water channels, in which the aquaporin water channels are embedded in the vesicles before being encased in the TFC layer.

Промышленные способы выделения больших количеств мембранных белков из клеток обычно недоступны специалистам в данной области. На предшествующем уровне техники основное внимание уделялось производству относительно небольших количеств мембранных белков для исследовательских целей. При этом были допустимы сравнительно громоздкие и трудоемкие методы получения. Однако с недавним повышением спроса на мембранные белки в промышленных мембранах для обратного осмоса и прямого осмоса стала очевидной потребность в более эффективном способе получения. Целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения мембранных белков, при котором можно получать сравнительно большие количества мембранных белков эффективно и без ухудшения качества конечного продукта.Industrial methods for isolating large quantities of membrane proteins from cells are generally not available to those skilled in the art. Prior art has focused on the production of relatively small quantities of membrane proteins for research purposes. At the same time, relatively cumbersome and labor-intensive production methods were acceptable. However, with the recent increase in demand for membrane proteins in industrial reverse osmosis and forward osmosis membranes, the need for a more efficient production method has become apparent. An object of the present invention is to provide a method for producing membrane proteins in which relatively large quantities of membrane proteins can be produced efficiently and without compromising the quality of the final product.

Cущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящим изобретением предусмотрен способ получения мембранного белка, включающий следующие стадии:The present invention provides a method for producing a membrane protein, comprising the following steps:

a. экспрессирование мембранного белка в организме хозяина, присутствующем в водной среде,a. expression of membrane protein in a host organism present in an aquatic environment,

b. высвобождение мембранного белка из организма-хозяина,b. release of membrane protein from the host body,

c. добавление раствора детергента для солюбилизации мембранного белка,c. adding a detergent solution to solubilize the membrane protein,

d. выделение жидкой фракции солюбилизированного мембранного белка в виде супернатанта при центрифугировании,d. isolation of the liquid fraction of the solubilized membrane protein in the form of supernatant during centrifugation,

e. проведение хроматографии жидкой фракции для связывания или удержания мембранного белка на неподвижной фазе, и e. performing chromatography of the liquid fraction to bind or retain the membrane protein on the stationary phase, and

f. элюирование мембранного белка из неподвижной фазы элюирующим буфером,f. elution of the membrane protein from the stationary phase with an elution buffer,

причем центрифугирование на стадии d проводится при от 500 g до 30000 g.wherein centrifugation at stage d is carried out at from 500 g to 30000 g.

Представленный способ имеет то преимущество, что он позволяет обрабатывать большое количество водной среды, содержащей организм хозяина. Так, способ позволяет обрабатывать количества от 50 л и более типа 100 л и более с применением технологических операций, подходящих для пилотной установки или полномасштабного производства. Более того, процесс является масштабируемым и может быть легко адаптирован к большим количествам водной среды, содержащей организм хозяина.The presented method has the advantage that it allows the treatment of a large amount of aqueous medium containing the host organism. Thus, the method allows the processing of quantities from 50 liters or more to 100 liters or more using technological operations suitable for a pilot plant or full-scale production. Moreover, the process is scalable and can be easily adapted to large quantities of aquatic environments containing the host organism.

Неожиданно, авторы изобретения обнаружили, что мембранные белки, экспрессируемые организмом хозяина, солюбилизируются в большей степени, чем другие белки при добавлении раствора детергента. Оказалось, что по меньшей мере 60% белков в везикулах, образованных раствором детергента, являются мембранными белками, представляющими интерес. Кроме того, оказалось, что везикулы, образованные из детергента, имеют большие размеры, чем обычно, примерно 0,5 мкм, что свидетельствует о том, что мембранный белок образует более стабильную суперформу с детергентом, чем с фосфолипидами, используемыми в природе.Surprisingly, the inventors discovered that membrane proteins expressed by the host are solubilized to a greater extent than other proteins upon addition of a detergent solution. It turned out that at least 60% of the proteins in the vesicles formed by the detergent solution were membrane proteins of interest. In addition, the vesicles formed from the detergent were found to be larger than normal in size, approximately 0.5 μm, indicating that the membrane protein forms a more stable superform with the detergent than with the phospholipids used in nature.

В способе может непосредственно использоваться водная среда, содержащая организм хозяина. Однако для получения более чистого продукта и чтобы избежать обращения с избыточным количеством водной среды, как правило, водную среду, содержащую организм хозяина из стадии a, фильтруют перед высвобождением мембранного белка на стадии b.The method may directly use an aqueous medium containing a host organism. However, to obtain a purer product and to avoid handling excess aqueous media, typically the aqueous media containing the host organism from step a is filtered before releasing the membrane protein in step b.

Как правило, водную среду, содержащую организм хозяина, концентрируют путем фильтрования через фильтр с достаточно мелкими порами, пропускающими клеточные осколки и среду, тогда как клетки остаются. В соответствующем воплощении водную среду, содержащую организм хозяина из стадии a, фильтруют через микрофильтрационную мембрану с диаметром пор 0,5 мкм или меньше. Предпочтительно диаметр пор составляет 0,1 мкм или меньше.Typically, the aqueous medium containing the host organism is concentrated by filtering through a filter with pores fine enough to allow cell debris and medium to pass through while the cells remain. In a corresponding embodiment, the aqueous medium containing the host organism from step a is filtered through a microfiltration membrane having a pore diameter of 0.5 μm or less. Preferably, the pore diameter is 0.1 μm or less.

После стадии фильтрования, обычно посредством микрофильтрации, можно отделить организм хозяина от оставшейся водной среды. Хотя возможны несколько способов разделения, однако предпочтительно организм хозяина после фильтрования выделяют путем центрифугирования водной среды, содержащей организм хозяина. Процесс центрифугирования обычно проводят при таком значении g, при котором за соответствующий период времени образуется осадок. Поэтому центрифугирование обычно проводят при 500 g и более, как-то 1000 g и более, а предпочтительно 2000 g и более. Плотность осадка не должна быть слишком большой, чтобы избежать трудностей на последующих стадиях. Поэтому центрифугирование обычно проводят при не выше чем 30000 g, как-то не выше 20000 g, обычно не выше 15000 g и предпочтительно не больше 8000 g.After a filtration step, usually through microfiltration, the host organism can be separated from the remaining aqueous environment. Although several separation methods are possible, preferably the host organism is isolated after filtration by centrifuging the aqueous medium containing the host organism. The centrifugation process is usually carried out at a value of g such that a precipitate is formed over an appropriate period of time. Therefore, centrifugation is usually carried out at 500 g or more, such as 1000 g or more, and preferably 2000 g or more. The density of the sediment should not be too high to avoid difficulties in subsequent stages. Therefore, centrifugation is usually carried out at no higher than 30,000 g, such as no higher than 20,000 g, usually no higher than 15,000 g, and preferably no higher than 8,000 g.

Клетки собирают в виде осадка, а супернатант можно отбросить. Предпочтительно выделенный организм хозяина промывают изотоническим солевым раствором для растворения примесных солей, а затем центрифугируют, как описано выше, для выделения промытого организма хозяина. Отработанный промывочный раствор, появляющийся в супернатанте, можно отбросить.The cells are collected as a pellet and the supernatant can be discarded. Preferably, the isolated host is washed with isotonic saline to dissolve contaminant salts and then centrifuged as described above to recover the washed host. Spent wash solution appearing in the supernatant can be discarded.

Осадок, содержащий промытые клетки, можно хранить путем замораживания при -20°C или использовать непосредственно на следующей стадии. Соответственно, перед стадией b добавляют буфер для разведения. Буфер для разведения может содержать ингибиторы протеаз для предотвращения расщепления мембранного белка, регулирующие pH вещества типа тригидроксиметиламинометана (TRIS) и фосфата для поддержания значения pH в требуемом диапазоне и/или хелаторы ионов типа EDTA.The pellet containing the washed cells can be stored by freezing at -20°C or used directly in the next step. Accordingly, a dilution buffer is added before step b. The dilution buffer may contain protease inhibitors to prevent membrane protein breakdown, pH adjusters such as trihydroxymethylaminomethane (TRIS) and phosphate to maintain the pH in the desired range, and/or ion chelators such as EDTA.

Мембранный белок можно высвобождать из организма хозяина различными способами, предпочтительно путем химического или механического лизиса клеток. При проведении химического лизиса клеток обычно добавляют водный лизирующий раствор для высвобождения мембранного белка из организма хозяина. В предпочтительном аспекте изобретения водный лизирующий буфер представляет собой раствор детергента, который одновременно солюбилизирует мембранный белок.The membrane protein can be released from the host in a variety of ways, preferably by chemical or mechanical cell lysis. When performing chemical cell lysis, an aqueous lysis solution is usually added to release the membrane protein from the host. In a preferred aspect of the invention, the aqueous lysis buffer is a detergent solution that simultaneously solubilizes the membrane protein.

Для того, чтобы произошел лизис клеток и солюбилизация мембранного белка, как правило, клетки хозяина подвергают воздействию детергента с перемешиванием. Обычно клеткам хозяина дают возможность реагировать с детергентом в течение по меньшей мере одного часа типа 2 часов, а предпочтительно по меньшей мере 6 часов.In order for cell lysis and membrane protein solubilization to occur, host cells are typically exposed to a detergent with agitation. Typically, the host cells are allowed to react with the detergent for at least one hour, such as 2 hours, and preferably at least 6 hours.

При использовании механического лизиса клеток, как правило, высвобождение мембранного белка из клеток хозяина осуществляется при помощи гомогенизатора. Удобно использовать гомогенизатор того же типа, что применяется в молочной промышленности для гомогенизации молока. Подходящий пример – гомогенизатор Stansted 7575. После обработки в гомогенизаторе клетки разрушаются, высвобождая мембранный белок.When mechanical cell lysis is used, the membrane protein is typically released from the host cells using a homogenizer. It is convenient to use a homogenizer of the same type that is used in the dairy industry to homogenize milk. A good example is the Stansted 7575 homogenizer. Once processed in the homogenizer, the cells are disrupted, releasing membrane protein.

После высвобождения мембранного белка можно добавить катионный флокулянт. Считается, что катионный флокулянт взаимодействует, среди прочего, с отрицательно заряженными клеточными остатками, тем самым образуя хлопья. В предпочтительном аспекте изобретения катионным флокулянтом является полиаминное соединение типа Superfloc C581.Once the membrane protein is released, a cationic flocculant can be added. The cationic flocculant is believed to interact, among other things, with negatively charged cellular debris, thereby forming flocs. In a preferred aspect of the invention, the cationic flocculant is a polyamine compound of the Superfloc C581 type.

Образование хлопьев обычно происходит не мгновенно. Поэтому предпочтительно, чтобы катионный флокулянт реагировал с клеточным содержимым суспензии с осторожным перемешиванием для образования хлопьев. Обычно катионный флокулянт и остатки клеток оставляют для взаимодействия на время от 10 минут до 2 часов с перемешиванием при комнатной температуре.The formation of flakes usually does not occur instantly. It is therefore preferable for the cationic flocculant to react with the cell contents of the suspension with gentle agitation to form flocs. Typically, the cationic flocculant and cell debris are left to react for 10 minutes to 2 hours with stirring at room temperature.

При использовании химического лизиса клеток жидкую фракцию из стадии e извлекают в виде супернатанта от центрифугирования суспензии, содержащей хлопья. Мембранный белок появляется в супернатанте по мере его солюбилизации раствором детергента.When chemical cell lysis is used, the liquid fraction from step e is recovered as the supernatant from the centrifugation of the floc-containing suspension. The membrane protein appears in the supernatant as it is solubilized by the detergent solution.

При использовании механического лизиса клеток жидкую фракцию из стадии e извлекают из ресуспендированной твердой фракции, причем твердую фракцию ресуспендируют в растворе детергента для солюбилизации мембранного белка. В одном воплощении изобретения твердая фракция образуется вследствие того, что фрагменты клеток, содержащие мембранный белок, взаимодействуют с флокулянтом и образуют хлопья, которые можно отделить от жидкости при центрифугировании. В другом воплощении изобретения неожиданно оказалось, что при использовании механического лизиса клеток можно собрать мембранный белок в осадок без использования флокулянта. Осадок, полученный при центрифугировании, можно ресуспендировать в растворе детергента для солюбилизации мембранного белка. На этой стадии жидкую фракцию из стадии e собирают в виде супернатанта при центрифугировании.When using mechanical cell lysis, the liquid fraction from step e is recovered from the resuspended solid fraction, the solid fraction being resuspended in a detergent solution to solubilize the membrane protein. In one embodiment of the invention, the solid fraction is formed because cell fragments containing membrane protein interact with the flocculant and form flocs that can be separated from the liquid by centrifugation. In another embodiment of the invention, it has surprisingly been found that by using mechanical cell lysis, membrane protein can be precipitated without the use of a flocculant. The centrifugation pellet can be resuspended in a detergent solution to solubilize the membrane protein. At this stage, the liquid fraction from stage e is collected as supernatant by centrifugation.

Процесс центрифугирования обычно проводят при таком значении g, при котором за соответствующий период времени образуется осадок. Поэтому центрифугирование обычно проводят при 500 g и более, как-то 1000 g и более, а предпочтительно 2000 g и более. Плотность осадка не должна быть слишком большой, чтобы избежать трудностей на последующих стадиях. Поэтому центрифугирование обычно проводят при не выше чем 30000 g, как-то не выше 20000 g, обычно не выше 10000 g и предпочтительно не больше 8000 g. Применение ускорения менее 30000 g позволяет использовать осветлители, которые обычно используются на молочных предприятиях, как-то центрифуги для удаления спор от GEA, Tetra Pak, Alfa Laval и SPX Flow Seital Separation Technology. Осветлители, используемые в настоящем изобретении, некоторые производители также могут называть бактофугами. Таким образом, настоящим изобретением устраняется применение ультрацентрифуг, которые годятся только для периодического центрифугирования и обработки небольших количеств.The centrifugation process is usually carried out at a value of g such that a precipitate is formed over an appropriate period of time. Therefore, centrifugation is usually carried out at 500 g or more, such as 1000 g or more, and preferably 2000 g or more. The density of the sediment should not be too high to avoid difficulties in subsequent stages. Therefore, centrifugation is usually carried out at no more than 30,000 g, such as no more than 20,000 g, usually no more than 10,000 g, and preferably no more than 8,000 g. The use of accelerations of less than 30,000 g allows the use of clarifiers that are commonly used in dairy plants, such as spore removal centrifuges from GEA, Tetra Pak, Alfa Laval and SPX Flow Seital Separation Technology. The clarifiers used in the present invention may also be called bactofuges by some manufacturers. Thus, the present invention eliminates the use of ultracentrifuges, which are only suitable for batch centrifugation and processing of small quantities.

Детергенты, используемые в настоящем изобретении, включают такие алкилмальтопиранозиды, как н-додецил-β-D-мальтопиранозид (DDM), н-децил-β-D-мальтопиранозид (DM) или 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозид (Cymal-5); такие алкилглюкопиранозиды, как н-октил-β-D-глюкопиранозид (OG); оксиды аминов типа N-оксида н-лаурилдиметиламина (LDAO); такие фосфохолины, как н-додецилфосфохолин (FC-12), н-тетрадецилфосфохолин (FC-14) или н-гексадецилфосфохолин (FC-16); либо полиоксиэтиленгликоли. В соответствующем воплощении изобретения детергент выбирается из группы, состоящей из N-оксида лаурилдиметиламина (LDAO), октилглюкозида (OG), додецилмальтозида (DDM) либо их комбинаций. Предпочтительным детергентом является LDAO, так как он образует большие и стабильные везикулы, свидетельствующие о том, что этот детергент способен вытеснять природные фосфолипиды.Detergents useful in the present invention include alkyl maltopyranosides such as n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM), n-decyl-β-D-maltopyranoside (DM) or 5-cyclohexylpentyl-β-D-maltoside (Cymal- 5); alkyl glucopyranosides such as n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG); amine oxides such as n-lauryldimethylamine N-oxide (LDAO); phosphocholines such as n-dodecylphosphocholine (FC-12), n-tetradecylphosphocholine (FC-14) or n-hexadecylphosphocholine (FC-16); or polyoxyethylene glycols. In a suitable embodiment of the invention, the detergent is selected from the group consisting of lauryl dimethylamine N-oxide (LDAO), octyl glucoside (OG), dodecyl maltoside (DDM), or combinations thereof. The preferred detergent is LDAO as it forms large and stable vesicles, indicating that this detergent is capable of displacing natural phospholipids.

Жидкую фракцию подвергают процессу хроматографии, при которой мембранный белок связывается с неподвижной фазой или удерживается на ней. Можно выбрать такой тип хроматографии, как аффинная хроматография, ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, вытеснительная хроматография, жидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, обратнофазовая хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий и т.п. Обычно процесс хроматографии является методом препаративной хроматографии, в отличие от аналитической хроматографии, для проведения очистки мембранного белка.The liquid fraction is subjected to a chromatography process in which the membrane protein is bound to or retained on the stationary phase. You can select a type of chromatography such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, high performance liquid chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic interaction chromatography, etc. Typically, the chromatography process is a preparative chromatography technique, as opposed to analytical chromatography, to perform membrane protein purification.

В текущем предпочтительном воплощении в качестве метода хроматографии выбрана аффинная хроматография, при которой первая часть аффинной пары связывается с мембранным белком, а вторая часть аффинной пары связывается с неподвижной фазой. Примеры неподвижной фазы включают шарики и колоночные материалы. В предпочтительном воплощении изобретения неподвижная фаза, связанная со второй частью аффинной пары, находится в колонке. Обычно части аффинных пар связаны ковалентными связями с мембранным белком или с неподвижной фазой. Однако возможны и другие типы ассоциации, как-то гибридизация, аффинное связывание посредством взаимодействия антитело-антиген и т.п.In the current preferred embodiment, the chromatography method selected is affinity chromatography, in which the first part of an affinity pair binds to a membrane protein and the second part of an affinity pair binds to a stationary phase. Examples of the stationary phase include beads and column materials. In a preferred embodiment of the invention, the stationary phase associated with the second part of the affinity pair is located in the column. Typically, parts of affinity pairs are linked by covalent bonds to a membrane protein or stationary phase. However, other types of association are also possible, such as hybridization, affinity binding through antibody-antigen interactions, etc.

Специалистам в данной области известен целый ряд аффинных пар, применимых в настоящем изобретении, включая пару биотин-стрептавидин, пары антитело-антиген, пары антитело-гаптен, пары аффинных аптамеров, пары захватывающих белков, пары Fc-рецептор-IgG, пары металл-хелатирующий липид, пары типа хелатирующий металлы липид-белок с гистидиновой меткой (HIS) либо их комбинации. В текущем предпочтительном воплощении аффинная пара представляет собой пару типа хелатирующий металлы липид-белок с гистидиновой меткой (HIS).Those skilled in the art are aware of a variety of affinity pairs useful in the present invention, including biotin-streptavidin pairs, antibody-antigen pairs, antibody-hapten pairs, affinity aptamer pairs, capture protein pairs, Fc-receptor-IgG pairs, metal-chelating pairs lipid, metal chelating lipid-protein histidine tag (HIS) pairs, or combinations thereof. In a current preferred embodiment, the affinity pair is a metal chelating lipid-protein histidine tag (HIS) pair.

Металл обычно иммобилизируют на колоночном материале по технологии, называемой аффинной хроматографией с иммобилизованным металлом (IMAC). Металл обычно выбирают типа Cu(II) или Ni(II), предпочтительно Ni(II). С помощью смолы Ni-NTA можно очищать белки с His-меткой автоматически или вручную. Подходящей неподвижной фазой является ”Capto Chelating” от GE Healthcare или же гель-фильтрующий материал HisTrap (Ni Sepharose 6 Fast Flow) от GE Healthcare.The metal is typically immobilized on a column material using a technique called immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The metal is usually of the type Cu(II) or Ni(II), preferably Ni(II). Ni-NTA resin can be used to purify His-tagged proteins automatically or manually. A suitable stationary phase is “Capto Chelating” from GE Healthcare or HisTrap gel filter material (Ni Sepharose 6 Fast Flow) from GE Healthcare.

Первая часть аффинной пары типа гистидиновой метки обычно присоединяется к C-концу мембранного белка. Хотя гистидиновая метка обычно содержит 6 последовательных аминокислот гистидина, однако в настоящем изобретении предпочтительно гистидиновая метка содержит 8 и более молекул гистидина. Большое количество аминокислоты гистидина в гистидиновой метке позволяет эффективно разделять специфически и неспецифически связывающиеся белки.The first part of an affinity pair, such as a histidine tag, is usually attached to the C-terminus of a membrane protein. Although a histidine tag generally contains 6 consecutive histidine amino acids, in the present invention, preferably the histidine tag contains 8 or more histidine molecules. The large amount of histidine amino acid in the histidine tag allows for efficient separation of specifically and nonspecifically binding proteins.

После нанесения на колонку жидкой фракции, содержащей мембранный белок, жидкость под действием силы тяжести или давления проникает в смолу. Обычно элюирующий буфер содержит имидазол. Имидазол обладает способностью взаимодействовать со связыванием His-метки с ионами металла, иммобилизованными на смоле. При определенной концентрации имидазола будет высвобождаться мембранный белок с His-меткой.After applying the liquid fraction containing the membrane protein to the column, the liquid penetrates the resin under the influence of gravity or pressure. Typically the elution buffer contains imidazole. Imidazole has the ability to interact with the binding of His tag to metal ions immobilized on the resin. At a certain concentration of imidazole, the His-tagged membrane protein will be released.

Для отделения неспецифически связывающихся мембранных белков от представляющего интерес мембранного белка обычно колонку перед пропусканием элюирующего буфера промывают промывочным буфером, содержащим имидазол в концентрации, составляющей 40% и менее от его концентрации в элюирующем буфере. Концентрация имидазола в элюирующем буфере обычно составляет от 200 мМ до 2000 мМ. В предпочтительных воплощениях изобретения концентрация имидазола в элюирующем буфере составляет 400 мМ и более. Для более эффективного элюирования мембранного белка с His-меткой концентрация имидазола в буферах обычно составляет 600 мМ или 800 мМ или еще больше.To separate nonspecifically binding membrane proteins from the membrane protein of interest, it is common to wash the column before passing the elution buffer with a wash buffer containing imidazole at a concentration of 40% or less of the concentration in the elution buffer. The imidazole concentration in the elution buffer is typically between 200 mM and 2000 mM. In preferred embodiments of the invention, the concentration of imidazole in the elution buffer is 400 mM or more. For more efficient elution of His-tagged membrane protein, the imidazole concentration in the buffers is typically 600 mM or 800 mM or higher.

Для большей части применений His-метка обычно оказывает незначительное влияние на структуру, функцию и иммуногенность белка. Однако для некоторых применений может потребоваться удалить His-метку после того, как она выполнила свою функцию связывания мембранной молекулы с колонкой. His-метку можно удалить путем введения расщепляемой связи между мембранным белком и His-меткой. Подходящие расщепляемые связи включают рН-чувствительные линкеры, дисульфидные линкеры, чувствительные к протеазам линкеры и бета-глюкуронидные линкеры.For most applications, the His tag usually has little effect on the structure, function, and immunogenicity of the protein. However, for some applications it may be necessary to remove the His tag after it has served its function of binding the membrane molecule to the column. The His tag can be removed by introducing a cleavable bond between the membrane protein and the His tag. Suitable cleavable linkages include pH-sensitive linkers, disulfide linkers, protease-sensitive linkers, and beta-glucuronide linkers.

Мембранные белки в своем естественном окружении пронизывают всю бислойную мембрану, то есть от внутренней части клетки до внеклеточного пространства. Многие трансмембранные белки функционируют как пропускные ворота для определенных веществ, тем самым обеспечивая обмен этих веществ между внутренней частью клетки и внеклеточной жидкостью. Характерной особенностью трансмембранных белков является наличие гидрофобной зоны, которая обеспечивает встраивание трансмембранного белка в мембрану. Трансмембранный белок также имеет гидрофильные сегменты по обе стороны области полых волокон, причем такие гидрофильные сегменты направлены внутрь клетки и к внеклеточной жидкости, соответственно.Membrane proteins in their natural environment permeate the entire bilayer membrane, that is, from the inside of the cell to the extracellular space. Many transmembrane proteins function as gates of passage for certain substances, thereby allowing the exchange of these substances between the cell interior and the extracellular fluid. A characteristic feature of transmembrane proteins is the presence of a hydrophobic zone, which ensures the integration of the transmembrane protein into the membrane. The transmembrane protein also has hydrophilic segments on either side of the hollow fiber region, with such hydrophilic segments directed into the cell and toward the extracellular fluid, respectively.

Хотя считается, что можно получить любой мембранный белок в соответствии с настоящим изобретением, но обычно требуется использовать этот процесс для получения таких мембранных белков, которые переносят ионы (ионных каналов) и воду (водных каналов аквапорина). Ионные каналы включают хлорные каналы и переносчики ионов металлов. Некоторые хлорные каналы, помимо иона хлорида, также проводят HCO₃ ^–, I^–, SCN^– и NO₃ ^–. Переносчики ионов металлов включают переносчики магния, калиевые каналы, натриевые каналы, кальциевые каналы, протонные каналы и т.д. В определенном воплощении изобретения мембранный белок представлен белком A внешней мембраны (OmpA).Although it is believed that any membrane protein can be produced in accordance with the present invention, it is generally required to use this process to produce membrane proteins that transport ions (ion channels) and water (aquaporin water channels). Ion channels include chloride channels and metal ion transporters. Some chloride channels, in addition to the chloride ion, also conduct HCO ₃ ^– , I ^– , SCN ^– and NO ₃ ^– . Metal ion transporters include magnesium transporters, potassium channels, sodium channels, calcium channels, proton channels, etc. In a certain embodiment of the invention, the membrane protein is outer membrane protein A (OmpA).

В предпочтительном воплощении изобретения мембранный белок представлен водным каналом аквапорина. Водные каналы аквапорина облегчают транспорт воды в клетку или из клетки. В промышленных мембранах водные каналы аквапорина обеспечивают потоки воды за счет осмоса, тогда как другие компоненты в растворе отклоняются. Мембранный белок типа водного канала аквапорина может происходить из различных источников, включая прокариотические и эукариотические организмы. Прокариотические источники аквапорина включают E. coli, Kyrpidia spormannii, Methanothermobacter sp., Novibacillus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae и Halomonas sp. Эукариотические источники аквапорина включают Oryza sativa Japonica (японский рис), Eucalyptus grandis, Solanum tuberosum (картофель) и Milnesium tardigradum (тихоходка “водяной медведь”).In a preferred embodiment of the invention, the membrane protein is an aquaporin water channel. Aquaporin water channels facilitate the transport of water into or out of the cell. In industrial membranes, aquaporin water channels allow water to flow through osmosis while other components in solution are diverted. The aquaporin water channel type membrane protein can come from a variety of sources, including prokaryotic and eukaryotic organisms. Prokaryotic sources of aquaporin include E. coli, Kyrpidia spormannii, Methanothermobacter sp., Novibacillus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae and Halomonas sp. Eukaryotic sources of aquaporin include Oryza sativa Japonica (Japanese rice), Eucalyptus grandis, Solanum tuberosum (potato), and Milnesium tardigradum (water bear tardigrade).

Нуклеотидную последовательность мембранного белка исходного организма обычно оптимизируют по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в организме хозяина. Полученный ген обычно синтезируют с добавлением кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами на N-конце и C-конце. Синтетический фрагмент гена можно расщепить рестрикционным ферментом и лигировать с фрагментом вектора. Полученной смесью от лигирования предпочтительно трансформируют организм типа Escherichia coli DH10B. Отбирают трансформанты, устойчивые к антибиотикам, обычно на среде с антибиотиком. Трансформанты проверяют путем секвенирования генетической конструкции. Выделенную из вектора ДНК впоследствии переносят в организм продуцента. Продуцента можно выбрать из числа подходящих прокариотических или эукариотических организмов типа Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae.The nucleotide sequence of the membrane protein of the original organism is typically codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in the host. The resulting gene is typically synthesized with the addition of histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking restriction sites at the N-terminus and C-terminus. The synthetic gene fragment can be digested with a restriction enzyme and ligated to the vector fragment. The resulting ligation mixture is preferably transformed into an organism of the Escherichia coli DH10B type. Transformants resistant to antibiotics are selected, usually on media containing an antibiotic. Transformants are verified by sequencing the genetic construct. The DNA isolated from the vector is subsequently transferred into the producer’s body. The producer can be selected from suitable prokaryotic or eukaryotic organisms such as Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.

Организм хозяина обычно подвергают манипуляциям для экспрессии нативного мембранного белка в большем количестве, чем обычно, или для экспрессии ненативного мембранного белка. Один из способов экспрессии мембранного белка может заключаться в трансформировании организма-хозяина вектором, содержащим ДНК, кодирующую мембранный белок, как обсуждалось выше. Другая возможность получения гиперэкспрессии мембранного белка – повышающая регуляция экспрессии нативного мембранного белка, напр., путем ослабления репрессора или вставки подходящего участка промотора. Еще одна возможность получения экспрессии ненативного белка – трансфекция организма-хозяина вирусом или бактериофагом, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую мембранный белок.The host is typically manipulated to express more native membrane protein than normal or to express a non-native membrane protein. One method for expressing a membrane protein may be to transform the host organism with a vector containing DNA encoding the membrane protein, as discussed above. Another possibility for overexpression of a membrane protein is to up-regulate the expression of the native membrane protein, for example by attenuating a repressor or inserting a suitable promoter region. Another possibility for obtaining expression of a non-native protein is transfection of the host organism with a virus or bacteriophage containing a nucleic acid encoding a membrane protein.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1Example 1

Получали штамм E. coli BL21, содержащий вектор, продуцирующий белки аквапорина, связанные с His-меткой на C-конце. His-метка содержит 10 последовательных молекул гистидина, прикрепленных к первичной последовательности мембранного белка аквапорина.E. coli strain BL21 was obtained containing a vector producing aquaporin proteins linked to a His tag at the C-terminus. The His tag contains 10 consecutive histidine molecules attached to the primary sequence of the membrane protein aquaporin.

Штамм E. coli культивировали в стандартной среде для получения ферментационного бульона общим объемом 150 л. Клетки E. coli собирали путем фильтрования ферментационного бульона через микрофильтрационную мембрану с диаметром пор 0,05 мкм. Фильтрат, содержащий клетки E. coli, доводили примерно до 50 л, а затем подвергали центрифугированию при 5300 g в течение 20 минут. Таким образом, клетки E. coli концентрируются при микрофильтрации, а оставшаяся среда впоследствии удаляется при центрифугировании в виде супернатанта.The E. coli strain was cultured in standard medium to obtain a fermentation broth with a total volume of 150 L. E. coli cells were collected by filtering the fermentation broth through a microfiltration membrane with a pore diameter of 0.05 μm. The filtrate containing E. coli cells was brought to approximately 50 L and then centrifuged at 5300 g for 20 minutes. Thus, E. coli cells are concentrated by microfiltration and the remaining medium is subsequently removed by centrifugation as supernatant.

Полученные при центрифугировании осадок собирали и добавляли 0,9% хлорид натрия в соотношении 1:1 для промывки клеток и растворения примесных солей. Затем промывочный раствор удаляли на центрифуге при 5300 g в течение 20 минут. Супернатант отбрасывали, а промытые клетки собирали в виде осадка. Осадок можно хранить замороженным при –20°C или использовать непосредственно на следующей стадии.The precipitate obtained during centrifugation was collected and 0.9% sodium chloride was added in a 1:1 ratio to wash the cells and dissolve impurity salts. The washing solution was then removed by centrifuge at 5300 g for 20 minutes. The supernatant was discarded, and the washed cells were collected as pellets. The sediment can be stored frozen at –20°C or used directly in the next step.

Осадок, содержащий клетки E. coli, солюбилизировали примерно в 47 л буфера TRIS, используемого в качестве связывающего буфера. После перемешивания в течение примерно 1 часа добавляли 6,4 л детергента (5% LDAO) для солюбилизации до конечной концентрации 0,6%. Смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. При ресуспендировании клеток в буфере, содержащем детергент, происходит лизис клеток. При лизисе клеток высвобождаются мембранные белки из внутренних мембран клеток и солюбилизируются детергентом.The pellet containing E. coli cells was solubilized in approximately 47 L of TRIS buffer used as binding buffer. After stirring for approximately 1 hour, 6.4 L of detergent (5% LDAO) was added to solubilize to a final concentration of 0.6%. The mixture was incubated overnight at room temperature with gentle stirring. When cells are resuspended in a buffer containing detergent, cell lysis occurs. Cell lysis releases membrane proteins from the inner cell membranes and is solubilized by the detergent.

Для удаления отрицательно заряженного клеточного материала добавляли полиамин (Superfloc C581) в объеме 427 мл. Смесь инкубировали 30 минут с перемешиванием при комнатной температуре для коагуляции отрицательно заряженных молекул типа обломков клеток, ДНК, РНК и, в некоторой степени, белков. Мембранные белки, солюбилизированные детергентом, остаются в водной фазе. Смесь центрифугировали при максимальной скорости в 5300 g в течение 15 мин. Осадок, содержащий клеточный дебрис, ДНК, РНК и солюбилизованные белки, отбрасывали, а супернатант собирали. Супернатант переносили в ёмкость, содержащую 107 л буфера для разведения, получая конечный объем 160 л при конечной концентрации лаурилдиметиламин N-оксида (LDAO) 0,2%.To remove negatively charged cellular material, polyamine (Superfloc C581) was added in a volume of 427 ml. The mixture was incubated for 30 minutes with stirring at room temperature to coagulate negatively charged molecules such as cell debris, DNA, RNA and, to some extent, proteins. Membrane proteins solubilized by the detergent remain in the aqueous phase. The mixture was centrifuged at a maximum speed of 5300 g for 15 minutes. The pellet containing cell debris, DNA, RNA, and solubilized proteins was discarded and the supernatant was collected. The supernatant was transferred to a container containing 107 L of dilution buffer, yielding a final volume of 160 L at a final lauryl dimethylamine N-oxide (LDAO) concentration of 0.2%.

Устанавливали колонку, содержащую аффинную смолу “Capto Chelating” от GE Healthcare. Смола заряжена Ni²⁺, который связывается с меткой His10. На колонку наносили разбавленный супернатант, а затем промывали 10 колоночными объемами промывочного буфера, содержащего 200 мМ имидазола, чтобы смыть компоненты неспецифического связывания. После этого использовали 2,5 колоночных объема элюирующего буфера с 1000 мМ имидазола для высвобождения мембранного белка из колонки. Элюированный из колонки белок проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), который проявлял главным образом одну полосу, что означает чистоту более 80%.A column containing “Capto Chelating” affinity resin from GE Healthcare was installed. The resin is charged with Ni ²⁺ , which binds to the His10 tag. The diluted supernatant was applied to the column and then washed with 10 column volumes of wash buffer containing 200 mM imidazole to wash away nonspecific binding components. Subsequently, 2.5 column volumes of elution buffer with 1000 mM imidazole were used to release the membrane protein from the column. The protein eluted from the column was checked by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), which showed mainly one band, indicating a purity of greater than 80%.

Пример 2Example 2

Штамм E. coli культивировали в стандартной среде для получения ферментационного бульона общим объемом 250 л. Клетки E. coli собирали путем фильтрования ферментационного бульона через плоскую пластинчатую мембрану из PES с диаметром пор 0,05 мкм. Фильтрат, содержащий клетки E. coli, доводили примерно до 50 л, а затем подвергали центрифугированию при 5300 g в центрифуге Sorvall 16 L в течение 20 минут. Таким образом, клетки E. coli концентрируют при микрофильтрации, а оставшуюся среду впоследствии удаляют при центрифугировании в виде супернатанта. Осадок можно хранить замороженным при –20°C или использовать непосредственно на следующей стадии.The E. coli strain was cultured in standard medium to obtain a fermentation broth with a total volume of 250 L. E. coli cells were collected by filtering the fermentation broth through a flat plate PES membrane with a pore diameter of 0.05 μm. The filtrate containing E. coli cells was brought to approximately 50 L and then centrifuged at 5300 g in a Sorvall 16 L centrifuge for 20 minutes. Thus, the E. coli cells are concentrated by microfiltration and the remaining medium is subsequently removed by centrifugation as a supernatant. The sediment can be stored frozen at –20°C or used directly in the next step.

Осадок, содержащий клетки E. coli, ресуспендировали примерно в 50 л буфера (водный раствор с ингибитором протеаз PMSF и EDTA) и гомогенизировали при 1000 бар в гомогенизаторе Stansted nm-GEN 7575. Для выделения представляющего интерес клеточного материала добавляли полиамин (Superfloc C581) в соотношении 12 мл/л. Поддерживали температуру на уровне 10-15°C. Смесь инкубировали 30 мин с перемешиванием при комнатной температуре. Смесь центрифугировали при максимальной скорости 5300 g в течение 30 мин. Осадок содержит мембранный белок, а супернатант отбрасывали.The pellet containing E. coli cells was resuspended in approximately 50 L of buffer (aqueous solution with protease inhibitor PMSF and EDTA) and homogenized at 1000 bar in a Stansted nm-GEN 7575 homogenizer. To isolate the cellular material of interest, polyamine (Superfloc C581) was added to ratio 12 ml/l. The temperature was maintained at 10-15°C. The mixture was incubated for 30 min with stirring at room temperature. The mixture was centrifuged at a maximum speed of 5300 g for 30 min. The pellet contained membrane protein and the supernatant was discarded.

Осадок ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия до общей концентрации белка примерно 50 мг/мл. Солюбилизацию мембранного белка проводили путем добавления 28 л связывающего буфера TRIS и 4,5 л 5% LDAO к 5 л ресуспендированного материала осадка. Смеси инкубировали от 2 до 24 часов при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.The pellet was resuspended in 0.9% sodium chloride solution to a total protein concentration of approximately 50 mg/ml. Membrane protein solubilization was performed by adding 28 L of TRIS binding buffer and 4.5 L of 5% LDAO to 5 L of resuspended pellet material. The mixtures were incubated for 2 to 24 hours at room temperature with gentle stirring.

После процесса солюбилизации смесь центрифугировали в ёмкостях на 2 л при 5300 g в течение 90 мин. Собирали супернатант и доводили концентрацию LDAO до 0,2% добавлением буфера для разведения.After the solubilization process, the mixture was centrifuged in 2 L containers at 5300 g for 90 minutes. The supernatant was collected and the LDAO concentration was adjusted to 0.2% by adding dilution buffer.

Устанавливали колонку, содержащую аффинную смолу “Capto Chelating” от GE Healthcare. Смола заряжена Ni²⁺, который связывается с меткой His10. Колонку уравновешивали пропусканием связывающего буфера, содержащего 0,2% LDAO. После этого на колонку наносили разбавленный супернатант и промывали 10 колоночными объемами промывочного буфера, содержащего 200 мМ имидазола, чтобы смыть компоненты неспецифического связывания. После этого использовали 2,5 колоночных объема элюирующего буфера с 1000 мМ имидазола для высвобождения мембранного белка из колонки. Элюированный из колонки белок проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), который проявлял только одну полосу, что означает чистоту более 95%.A column containing “Capto Chelating” affinity resin from GE Healthcare was installed. The resin is charged with Ni ²⁺ , which binds to the His10 tag. The column was equilibrated by passing binding buffer containing 0.2% LDAO. The diluted supernatant was then applied to the column and washed with 10 column volumes of wash buffer containing 200 mM imidazole to wash away nonspecific binding components. Subsequently, 2.5 column volumes of elution buffer with 1000 mM imidazole were used to release the membrane protein from the column. The protein eluted from the column was checked by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), which showed only one band, indicating greater than 95% purity.

Пример 3Example 3

Штамм E. coli культивировали в стандартной среде для получения ферментационного бульона общим объемом 250 л. Ферментационный бульон собирали при OD₆₀₀ = 13 после индукции в течение 42,5 часов. Материал гомогенизировали дважды при 100 МПа в гомогенизаторе Stansted nm-GEN 7575. Из лизированного материала отбирали по 10 мл и вносили в пробирки Falcon на 15 мл.The E. coli strain was cultured in standard medium to obtain a fermentation broth with a total volume of 250 L. The fermentation broth was collected at OD ₆₀₀ = 13 after induction for 42.5 hours. The material was homogenized twice at 100 MPa in a Stansted nm-GEN 7575 homogenizer. 10 ml were taken from the lysed material and added to 15 ml Falcon tubes.

Затем проводили центрифугирование в течение 1 часа при 5300 g и отделяли осадок от супернатанта. Затем осадок ресуспендировали в 10 мл 0,9% NaCl. Для определения концентрации (общего белка в мг/мл) в ресуспендированном осадке и выделенном после первого центрифугирования супернатанте использовали метод с использованием набора реагентов для определения белка с помощью бицинхониновой кислоты (BCA).Then centrifugation was carried out for 1 hour at 5300 g and the sediment was separated from the supernatant. The sediment was then resuspended in 10 ml of 0.9% NaCl. The bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit method was used to determine the concentration (total protein in mg/ml) in the resuspended pellet and the supernatant recovered after the first centrifugation.

Наконец, ресуспендированный осадок и выделенный супернатант солюбилизировали (1 мл) в течение 2 часов в 0,6% LDAO (120 мкл исходного 5% LDAO от Carbosynth на 1 мл материала) и снова центрифугировали при 5300 g в течение 15 мин. Опять же отделяли супернатант от осадка. Осадок ресуспендировали (опять до 1 мл) в связывающем буфере без LDAO.Finally, the resuspended pellet and isolated supernatant were solubilized (1 ml) for 2 hours in 0.6% LDAO (120 μl of Carbosynth 5% LDAO stock per ml of material) and centrifuged again at 5300 g for 15 min. Again, the supernatant was separated from the sediment. The pellet was resuspended (again to 1 ml) in binding buffer without LDAO.

Все образцы анализировали на SDS-геле, который показал, что около 60% белков в супернатанте представляют мембранный белок аквапорин.All samples were analyzed on an SDS gel, which showed that about 60% of the proteins in the supernatant were the membrane protein aquaporin.

Пример 4Example 4

После очистки аквапорина Z в примере 2 измеряли распределение по размерам солюбилизированного белка в LDAO.After purification of aquaporin Z in Example 2, the size distribution of the solubilized protein in LDAO was measured.

Проводили сравнение одного и того же элюирующего буфера с белком и без него, чтобы оценить, влияют ли компоненты буфера (включая детергент) или мембранный белок на распределение частиц по размерам.The same elution buffer with and without protein was compared to evaluate whether buffer components (including detergent) or membrane protein affected particle size distribution.

Белок аквапорин Z элюировали из колонки IMAC, используя элюирующий буфер с 1000 мМ имидазола и 0,2% вес/об LDAO. В очищенном белке измеряли концентрацию белка методом аминокислотного анализа. Прозрачный солюбилизированный белок при 6,44 мг/мл в элюирующем буфере вносили в 3 отдельные кюветы (Sarstedt, 4 мл, PMMA, кат. № 67.755, Nümbrecht, Германия) и анализировали распределение по размерам на Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) с помощью программы Malvern Zetasizer v.7.02. Результаты приведены в табл. 1 и представляют средние значения для образцов по трем повторам.Aquaporin Z protein was eluted from the IMAC column using elution buffer with 1000 mM imidazole and 0.2% w/v LDAO. The protein concentration of the purified protein was measured by amino acid analysis. Clear solubilized protein at 6.44 mg/ml in elution buffer was added to 3 separate cuvettes (Sarstedt, 4 ml, PMMA, cat. no. 67.755, Nümbrecht, Germany) and the size distribution was analyzed on a Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd ., Malvern, UK) using the Malvern Zetasizer v.7.02 program. The results are shown in table. 1 and represent the average values for samples from three replicates.

Таблица 1Table 1

ОбразецSample Концентрация AqpZ (мг/мл)AqpZ concentration (mg/ml) Размер, диаметр (d в нм)Size, diameter (d in nm) Интенсивность популяции (%)Population intensity (%) Population intensityPopulation intensity Поп. 1Pop. 1 Поп. 2Pop. 2 Поп. 3Pop. 3 Очищенный AqpZ в элюир. буфере (средн.)Purified AqpZ in eluent. buffer (average) 6,446.44 315,6 ± 116,8 нм
45,9%315.6 ± 116.8 nm
45.9% 108 ± 32,3 нм
35,5%108 ± 32.3 nm
35.5% 17,1 ± 2,5 нм
14,9%17.1 ± 2.5 nm
14.9% Элюирующий буферElution buffer 00 0,85 ± 0,16 нм
56,8%0.85 ± 0.16 nm
56.8% 8,6 ± 1,2 нм
41,1%8.6 ± 1.2 nm
41.1% 103 ± 5,5 нм
2,1%103 ± 5.5 nm
2.1%

Образец элюирующего буфера (без белка) содержал популяцию частиц, в которой 97,9% составляли частицы размером 8,6 нм и меньше, что указывает на отсутствие в растворе крупных мицелл детергента, которые могли бы удерживаться при микрофильтрации. В образце с белком 81,4% частиц проявляли размеры 108 нм и больше, что указывает на то, что в присутствии белка вместе с детергентом образуются крупные растворимые частицы, которые удерживаются при микрофильтрации. Неожиданно эксперимент показал, что образуются большие стабильные частицы, состоящие из мицелл LDAO и мембранного белка.The elution buffer sample (no protein) contained a particle population that was 97.9% 8.6 nm or smaller, indicating that there were no large detergent micelles in the solution that could be retained by microfiltration. In the protein sample, 81.4% of the particles exhibited particle sizes of 108 nm or larger, indicating that the presence of protein along with detergent produced large soluble particles that were retained during microfiltration. Unexpectedly, the experiment showed that large, stable particles were formed consisting of LDAO micelles and membrane protein.

Пример 5. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Oryza sativa Japonica (японского риса) в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 5: Expression of a histidine-tagged aquaporin from Oryza sativa Japonica (Japanese rice) in Escherichia coli and its purification using IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Oryza sativa Japonica (UNIPROT: A3C132), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Oryza_sativa_Japonica). Синтетические фрагменты гена расщепляли рестрикционными ферментами NdeI/XhoI и лигировали с расщепленным NdeI/XhoI очищенным фрагментом вектора pUP1909. Полученной смесью от лигирования трансформировали Escherichia coli DH10B и отбирали устойчивые к канамицину трансформанты на чашках с LB-агаром и канамицином. Трансформанты проверяли путем секвенирования генетической конструкции. Выделенную из вектора ДНК впоследствии переносили в организм продуцента, Escherichia coli BL21.The gene encoding aquaporin from Oryza sativa Japonica (UNIPROT: A3C132) was codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Oryza_sativa_Japonica). Synthetic gene fragments were digested with NdeI/XhoI restriction enzymes and ligated with the NdeI/XhoI digested purified fragment of the pUP1909 vector. The resulting ligation mixture was used to transform Escherichia coli DH10B, and kanamycin-resistant transformants were selected on LB agar and kanamycin plates. Transformants were verified by sequencing the genetic construct. The DNA isolated from the vector was subsequently transferred into the producer organism, Escherichia coli BL21.

Для гетерологической экспрессии аквапорина в E. coli организм-продуцент культивировали в минимальной среде, состоящей из 30 г/л глицерина, 6 г/л (NH₄)₂HPO₄, 3 г/л KH₂PO₄, 5 г/л NaCl, 0,25 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 0,4 г/л цитрата Fe(III) и 1 мл/л стерилизованно-го фильтрованием раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов состоял из 1 г/л EDTA, 0,8 г/л CoCl₂⋅6H₂O, 1,5 г/л MnCl₂⋅4H₂O, 0,4 г/л CuCl₂⋅2H₂O, 0,4 г/л H₃BO₃, 0,8 г/л Na₂MoO₄⋅2H₂O, 1,3 г/л Zn(CH₃COO)₂⋅2H₂O. После инокуляции и роста в течение ночи добавляли еще 0,25 г/л MgSO₄⋅7H₂O.For heterologous expression of aquaporin in E. coli _{, the producing organism was cultured in a minimal medium consisting of 30 g/l glycerol, 6 g/l (NH4)2HPO4} _, ₃ g/l _KH2PO4 _, 5 g/l NaCl , 0.25 g/l MgSO ₄ ⋅7H ₂ O, 0.4 g/l Fe(III) citrate and 1 ml/l filter-sterilized solution of trace elements. The trace element solution consisted of 1 g/l EDTA, 0.8 g/l CoCl ₂ ⋅6H ₂ O, 1.5 g/l MnCl ₂ ⋅4H ₂ O, 0.4 g/l CuCl ₂ ⋅2H ₂ O, 0 .4 g/l H ₃ BO ₃ , 0.8 g/l Na ₂ MoO ₄ ⋅2H ₂ O, 1.3 g/l Zn(CH ₃ COO) ₂ ⋅2H ₂ O. After inoculation and overnight growth another 0.25 g/l MgSO ₄ ⋅ 7H ₂ O was added.

E. coli культивировали в 3-литровых биореакторах Applikon с ez-Control в режиме периодической ферментации. Продукцию белка индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ при оптической плотности (OD 600 нм) примерно 30. Культуры индуцировали в течение примерно 24 часов и собирали бактериальные клетки центрифугированием при 5300 g в течение 20 мин.E. coli was cultured in 3-liter Applikon bioreactors with ez-Control in batch fermentation mode. Protein production was induced by the addition of IPTG to a final concentration of 0.5 mM at an optical density (OD 600 nm) of approximately 30. Cultures were induced for approximately 24 hours and bacterial cells were collected by centrifugation at 5300 g for 20 min.

Осадок, содержащий клетки E. coli, ресуспендировали в буфере (водный раствор с ингибитором протеаз фенилметилсульфонил фторидом (PMSF) и ЭДТК) и гомогенизировали при 1000 бар в гомогенизаторе Stansted nm-GEN 7575. Поддерживали температуру на уровне 10-15°C. Смесь центрифугировали при максимальной скорости 5300 g в течение 30 мин. Осадок содержит мембранный белок, а супернатант отбрасывали.The pellet containing E. coli cells was resuspended in buffer (an aqueous solution with the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and EDTA) and homogenized at 1000 bar in a Stansted nm-GEN 7575 homogenizer. The temperature was maintained at 10-15°C. The mixture was centrifuged at a maximum speed of 5300 g for 30 minutes. The pellet contained membrane protein and the supernatant was discarded.

После солюбилизации и осветления белок захватывали на IMAC и элюировали элюирующим буфером, содержащим 1000 мМ имидазола и 0,2% вес/об LDAO. Элюированные фракции анализировали методом SDS-PAGE, который проявлял только одну главную полосу, которая мигрировала при 27 кДа, что соответствует размеру аквапорина из японского риса. Кроме того, результат проверяли путем сравнения с очисткой отрицательного контроля из E. coli, трансформированных пустым вектором. Отрицательный контроль не давал очищенного белка. Анализ методом вестерн-блот с помощью антител (TaKaRa Bio), специфичных к гистидиновой метке, давал, как и ожидалось, четкий сигнал от очищенного белка и никакого сигнала от отрицательного контроля, что подтверждает происхождение очищенного белка как мембранного белка с гистидиновой меткой.After solubilization and clarification, the protein was captured on IMAC and eluted with elution buffer containing 1000 mM imidazole and 0.2% w/v LDAO. The eluted fractions were analyzed by SDS-PAGE, which showed only one major band that migrated at 27 kDa, which corresponds to the size of aquaporin from Japanese rice. In addition, the result was verified by comparison with negative control purification from E. coli transformed with the empty vector. The negative control did not produce purified protein. Western blot analysis with an antibody (TaKaRa Bio) specific for the histidine tag gave, as expected, a clear signal from the purified protein and no signal from the negative control, confirming the origin of the purified protein as a histidine-tagged membrane protein.

Пример 6. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Eucalyptus grandis в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 6 Expression of a histidine-tagged aquaporin from Eucalyptus grandis in Escherichia coli and its purification by IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Eucalyptus grandis (UNIPROT: A0A059C9Z4), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Eucalyptus_grandis). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.The gene encoding aquaporin from Eucalyptus grandis (UNIPROT: A0A059C9Z4) was codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Eucalyptus_grandis). The gene was cloned and expressed as described in Example 5. The protein was successfully purified and verified as described in Example 5.

Пример 7. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Solanum tuberosum (датского картофеля) в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 7 Expression of a histidine-tagged aquaporin from Solanum tuberosum (Danish potato) in Escherichia coli and its purification using IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Solanum tuberosum (UNIPROT: Q38HT6), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Solanum_tuberosum). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.The gene encoding aquaporin from Solanum tuberosum (UNIPROT: Q38HT6) was codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Solanum_tuberosum). The gene was cloned and expressed as described in Example 5. The protein was successfully purified and verified as described in Example 5.

Пример 8. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Milnesium tardigradum (тихоходки) в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 8: Expression of a histidine-tagged aquaporin from Milnesium tardigradum (tardigrade) in Escherichia coli and its purification using IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Milnesium tardigradum (UNIPROT: G5CTG2), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Milnesium_tardigradum). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.The gene encoding aquaporin from Milnesium tardigradum (UNIPROT: G5CTG2) was codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Milnesium_tardigradum). The gene was cloned and expressed as described in Example 5. The protein was successfully purified and verified as described in Example 5.

Пример 9. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Halomonas sp. в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 9 Expression of histidine-tagged aquaporin from Halomonas sp. in Escherichia coli and its purification using IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Halomonas sp. (UNIPROT: A0A2N0G6U6), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Halomonas_sp). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.The gene encoding aquaporin from Halomonas sp. (UNIPROT: A0A2N0G6U6), codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Halomonas_sp). The gene was cloned and expressed as described in Example 5. The protein was successfully purified and verified as described in Example 5.

Пример 10. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Kyrpidia spormannii в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 10 Expression of a histidine-tagged aquaporin from Kyrpidia spormannii in Escherichia coli and its purification using IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Kyrpidia sp. (UNIPROT: A0A2K8N5Z5), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Kyrpidia_spormannii). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.The gene encoding aquaporin from Kyrpidia sp. (UNIPROT: A0A2K8N5Z5), codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Kyrpidia_spormannii). The gene was cloned and expressed as described in Example 5. The protein was successfully purified and verified as described in Example 5.

Пример 11. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Methanothermobacter sp. в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 11 Expression of histidine-tagged aquaporin from Methanothermobacter sp. in Escherichia coli and its purification using IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Methanothermobacter sp. (UNIPROT: A0A223ZC Q2), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Methanothermobacter_sp). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.The gene encoding aquaporin from Methanothermobacter sp. (UNIPROT: A0A223ZC Q2), codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Methanothermobacter_sp). The gene was cloned and expressed as described in Example 5. The protein was successfully purified and verified as described in Example 5.

Пример 12. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Novibacillus thermophilus sp. в Escherichia coli и его очистка с помощью IMACExample 12 Expression of histidine-tagged aquaporin from Novibacillus thermophilus sp. in Escherichia coli and its purification using IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Novibacillus thermophilus (UNIPROT: A0A1U9K5 R2), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Novibacillus_thermophilus). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.The gene encoding aquaporin from Novibacillus thermophilus (UNIPROT: A0A1U9K5 R2) was codon optimized using Geneart (a subsidiary of Thermo Fischer Scientific) to improve expression in E. coli. The resulting gene was synthesized with the addition of 10 histidine-encoding codons at the C-terminus along with flanking NdeI/XhoI restriction sites at the N-terminus and C-terminus, respectively (Gene ID: aquaporin_Novibacillus_thermophilus). The gene was cloned and expressed as described in Example 5. The protein was successfully purified and verified as described in Example 5.

Пример 13. Экспрессия белка A внешней мембраны (OmpA) из Escherichia coli в E. coli Example 13 Expression of outer membrane protein A (OmpA) from Escherichia coli in E. coli

Экспрессию и очистку OmpA (UNIPROT: P0A910) в E. coli проводили в основном, как описано в Примере 5, за исключением того, что E. coli трансформировали пустым вектором, а солюбилизацию продлевали до 24 часов. Полученный солюбилизированный белок имел чистоту примерно 30-50% по SDS-PAGE, что четко означает, что OmpA был успешно выделен в мембранной фракции после стандартной процедуры очистки. OmpA можно было бы дополнительно очистить на дополнительной стадии эксклюзионной хроматографии (SEC).Expression and purification of OmpA (UNIPROT: P0A910) in E. coli was performed essentially as described in Example 5, except that E. coli was transformed with an empty vector and solubilization was extended to 24 hours. The resulting solubilized protein was approximately 30–50% pure by SDS-PAGE, which clearly means that OmpA was successfully isolated in the membrane fraction after the standard purification procedure. OmpA could be further purified by an additional size exclusion chromatography (SEC) step.

Пример 14. Конструирование штамма Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующего аквапорин-Z (AqpZ) из Escherichia coli, слитый с yEGFP с N-концевой гистидиновой меткой и разделенный сайтом расщепления протеазы вируса гравировки табака (TEV)Example 14 Construction of a Saccharomyces cerevisiae strain expressing aquaporin-Z (AqpZ) from Escherichia coli fused to yEGFP with an N-terminal histidine tag and separated by a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site

AqpZ (UNIPROT ID: P60844) из E. coli оптимизировали по кодонам для экспрессии в S. cerevisiae с помощью сервиса Geneart для улучшения экспрессии в S. cerevisiae. Для экспрессии в S. cerevisiae AqpZ сливали с дрожжевым усиленным зеленым флуоресцентным белком (yEGFP) на N-конце (Brendan P. Cormack et al., Microbiology (1997), 143, 303-311), чтобы обеспечить визуальное обнаружение и измерение экспрессии мембранного белка. Кроме того, добавляли 8 гистидинов (His8) на N-конец yEGFP в качестве метки-тега для очистки по IMAC. His8-yEGFP и AqpZ были генетически разделены сайтом расщепления для протеазы TEV, включенным с помощью ПЦР-праймеров при конструировании.AqpZ (UNIPROT ID: P60844) from E. coli was codon optimized for expression in S. cerevisiae using the Geneart service to improve expression in S. cerevisiae. For expression in S. cerevisiae, AqpZ was fused to yeast enhanced green fluorescent protein (yEGFP) at the N terminus (Brendan P. Cormack et al., Microbiology (1997), 143, 303-311) to allow visual detection and measurement of membrane expression squirrel. In addition, 8 histidines (His8) were added to the N-terminus of yEGFP as a tag for IMAC purification. His8-yEGFP and AqpZ were genetically separated by a cleavage site for TEV protease incorporated by PCR primers during construction.

Быстрое и эффективное конструирование плазмиды, кодирующей слитый белок His8-yEGFP-TEV-AqpZ, проводили путем гомологической рекомбинации in vivo перекрывающихся участков, включенных при помощи праймеров в S. cerevisiae между ПЦР-фрагментом His8-yEGFP-TEV, ПЦР-фрагментом TEV-AqpZ и линеаризованной экспрессионной плазмидой, полученной при расщеплении с помощью SalI, HindIII и BamHI плазмиды pEMBLyex4, как описано в (Scientific Reports 7: 16899). Сайт расщепления для TEV обеспечивает последующее удаление белка His8-yEGFP при помощи протеазы TEV.Rapid and efficient construction of a plasmid encoding the His8-yEGFP-TEV-AqpZ fusion protein was carried out by in vivo homologous recombination of overlapping regions included by primers in S. cerevisiae between the His8-yEGFP-TEV PCR fragment and the TEV-AqpZ PCR fragment and a linearized expression plasmid obtained by digestion with SalI, HindIII and BamHI of plasmid pEMBLyex4 as described in (Scientific Reports 7: 16899). The cleavage site for TEV allows for subsequent removal of the His8-yEGFP protein by TEV protease.

Отбор трансформантов S. cerevisiae проводили на чашках с минимальной средой, дефицитной по урацилу, но с добавлением лейцина и лизина для обеспечения выживания бактериальных клеток с правильно рекомбинированными фрагментами ДНК. Состав среды и концентрации аминокислот, используемые в этом примере, были идентичны тем, которые приведены в Примере 15.Selection of S. cerevisiae transformants was carried out on dishes with minimal medium, deficient in uracil, but with the addition of leucine and lysine to ensure the survival of bacterial cells with correctly recombined DNA fragments. The composition of the medium and amino acid concentrations used in this example were identical to those given in Example 15.

Пример 15. Экспрессия His8-yEGFP-TEV-AqpZ в Saccharomyces cerevisiae Example 15 Expression of His8-yEGFP-TEV-AqpZ in Saccharomyces cerevisiae

Одиночные колонии трансформированных дрожжевых клеток избирательно размножали до насыщения в 5 мл минимальной среды с глюкозой и с добавлением 60 мг/л лейцина и 30 мг/л лизина. По 200 мкл этих культур впоследствии размножали в 5 мл минимальной среды с глюкозой и с добавлением 30 мг/л лизина для отбора на высокое число копий плазмиды. Готовили замороженные исходные образцы клеток с высоким числом копий плазмиды.Single colonies of transformed yeast cells were selectively propagated to saturation in 5 ml of minimal medium with glucose and supplemented with 60 mg/L leucine and 30 mg/L lysine. 200 μl of these cultures were subsequently propagated in 5 ml of minimal medium with glucose and supplemented with 30 mg/l lysine to select for high plasmid copy numbers. Frozen stock samples of high plasmid copy number cells were prepared.

Вносили 200 мкл размороженного исходного раствора в 10 мл минимальной среды с добавлением лизина и культивировали до насыщения. Переносили 1 мл этой культуры в 100 мл такой же среды. После роста в течение ночи переносили аликвоту, соответствующую конечному OD₆₀₀ = 0,05, в 1,5 литра минимальной среды с начальной концентрацией 20 г/л глюкозы в качестве источника углерода и 30 г/л глицерина с добавлением дополнительных аминокислот. Культуру выращивали в 3-литровом биореакторе Applikon^®, снабженном системой ez-Control, подключенной к ПК с рабочей программой Lucullus^® (Applikon, Голландия, и SecureCell, Швейцария).200 μl of the thawed stock solution was added to 10 ml of minimal medium with the addition of lysine and cultured until saturation. 1 ml of this culture was transferred to 100 ml of the same medium. After overnight growth, an aliquot corresponding to a final OD ₆₀₀ = 0.05 was transferred to 1.5 liters of minimal medium with an initial concentration of 20 g/L glucose as a carbon source and 30 g/L glycerol supplemented with additional amino acids. The culture was grown in a 3-liter Applikon ^® bioreactor equipped with an ez-Control system connected to a PC running the Lucullus ^® operating program (Applikon, Holland, and SecureCell, Switzerland).

Начальную часть ферментации проводили при 20°C в минимальной среде. В биореактор подавали глюкозу до конечной концентрации 3% вес/об, когда израсходовалось исходное количество глюкозы. Значение pH среды роста поддерживали на уровне 6,0 добавлением 1 М NH₄OH под контролем компьютера. Когда выделение CO₂ выровнялось вследствие ограниченного поступления глюкозы, биореактор охлаждали до 15°C перед индукцией вырабатывания рекомбинантного AQP. Экспрессию рекомбинантного белка запускали добавлением 50 мл/л экспрессионной среды, состоящей из 400 мл/л ASD-10, 400 мл/л дополнительных аминокислот, 200 г/л глицерина и 20 г/л галактозы. Дрожжевые клетки собирали через ~96 ч.The initial part of the fermentation was carried out at 20°C in minimal medium. Glucose was fed into the bioreactor to a final concentration of 3% w/v when the initial amount of glucose was consumed. The pH of the growth medium was maintained at 6.0 by adding 1 M NH ₄ OH under computer control. When CO ₂ production leveled off due to limited glucose supply, the bioreactor was cooled to 15°C before inducing recombinant AQP production. Expression of the recombinant protein was triggered by the addition of 50 ml/L expression medium consisting of 400 ml/L ASD-10, 400 ml/L additional amino acids, 200 g/L glycerol and 20 g/L galactose. Yeast cells were harvested after ~96 h.

Минимальная среда состояла из 20 г/л глюкозы, 100 мл/л ASD-10, 5 мл/л V-200, 30 г/л глицерина, 0,1 г/л CaCl₂. Смесь ASD-10 состояла из 50 г/л (NH₄)₂SO₄, 8,75 г/л KH₂PO₄, 1,25 г/л K₂HPO₄, 5 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 1 г/л NaCl, 5 мг/л H₃BO₃, 1 мг/л KI, 4 мг/л MnSO₄⋅1H₂O, 4,2 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O, 0,4 мг/л CuSO₄⋅5H₂O, 2 мг/л FeCl₃ и 2 мг/л Na₂MoO₄⋅2H₂O. Смесь V-200 состояла из 4 мг/л биотина, 400 мг/л D-пантотеновой кислоты, 0,4 мг/л фолиевой кислоты, 2000 мг/л мио-инозитола, 80 мг/л ниацина, 40 мг/л п-аминобензоата, 80 мг/л пиридоксина, 40 мг/л рибофлавина и 80 мг/л тиамина. Если указано, среда содержала дополнительные аминокислоты, которые состояли из 600 мг/л аланина, 600 мг/л аргинина, 600 мг/л цистеина, 3000 мг/л глутаминовой кислоты, 2000 мг/л лизина, 600 мг/л метионина, 1500 мг/л фенилаланина, 600 мг/л пролина, 10000 мг/л серина, 900 мг/л тирозина, 4500 мг/л валина, 2000 мг/л аспарагиновой кислоты, 4000 мг/л треонина, 600 мг/л гистидина и 600 мг/л триптофана.The minimal medium consisted of 20 g/L glucose, 100 ml/L ASD-10, 5 ml/L V-200, 30 g/L glycerol, 0.1 g/L CaCl ₂ . The ASD-10 mixture consisted of 50 g/l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 8.75 g/l KH ₂ PO ₄ , 1.25 g/l K ₂ HPO ₄ , 5 g/l MgSO ₄ ⋅7H ₂ O , 1 g/l NaCl, 5 mg/l H ₃ BO ₃ , 1 mg/l KI, 4 mg/l MnSO ₄ ⋅1H ₂ O, 4.2 mg/l ZnSO ₄ ⋅7H ₂ O, 0.4 mg /l CuSO ₄ ⋅5H ₂ O, 2 mg/l FeCl ₃ and 2 mg/l Na ₂ MoO ₄ ⋅2H ₂ O. The V-200 mixture consisted of 4 mg/l biotin, 400 mg/l D-pantothenic acid, 0.4 mg/L folic acid, 2000 mg/L myo-inositol, 80 mg/L niacin, 40 mg/L p-aminobenzoate, 80 mg/L pyridoxine, 40 mg/L riboflavin and 80 mg/L thiamine. If indicated, the medium contained additional amino acids, which consisted of 600 mg/L alanine, 600 mg/L arginine, 600 mg/L cysteine, 3000 mg/L glutamic acid, 2000 mg/L lysine, 600 mg/L methionine, 1500 mg /l phenylalanine, 600 mg/l proline, 10000 mg/l serine, 900 mg/l tyrosine, 4500 mg/l valine, 2000 mg/l aspartic acid, 4000 mg/l threonine, 600 mg/l histidine and 600 mg/ l tryptophan.

Пример 16. Клонирование His8-yEGFP-TEV-AQP5 из Milnesium tardigradum в биореакторе с Saccharomyces cerevisiae Example 16: Cloning of His8-yEGFP-TEV-AQP5 from Milnesium tardigradum in a bioreactor with Saccharomyces cerevisiae

Получали конструкцию His8-yEGFP-TEV-AQP5 по методике, изложенной в Примере 14. Белок AQP5 из M. tardigradum (UNIPROT: G5CTG2) оптимизировали по кодонам для экспрессии в E. coli, несмотря на то, что требовалась экспрессия в дрожжах.The His8-yEGFP-TEV-AQP5 construct was prepared using the procedure outlined in Example 14. The AQP5 protein from M. tardigradum (UNIPROT: G5CTG2) was codon optimized for expression in E. coli, although expression in yeast was required.

Пример 17. Очистка His8-yEGFP-TEV-AqpZ и His8-yEGFP-TEV-AQP5 из S. cerevisiae Example 17 Purification of His8-yEGFP-TEV-AqpZ and His8-yEGFP-TEV-AQP5 from S. cerevisiae

Очистку экспрессированного гетерологически мембранного белка из S. cerevisiae проводили, как описано в Примере 2, за исключением того, что применяемые объемы буфера уменьшали так, чтобы они соответствовали снижению объема культуры, а лизис проводили при 1800 бар. Продукция и чистота белка была успешно подтверждена для обоих слитых белков методами SDS-PAGE и вестерн-блоттинга и не было обнаружено никаких примесных белков.Purification of heterologously expressed membrane protein from S. cerevisiae was performed as described in Example 2, except that the buffer volumes used were reduced to match the reduction in culture volume and lysis was performed at 1800 bar. Protein production and purity were successfully confirmed for both fusion proteins by SDS-PAGE and Western blotting, and no contaminating proteins were detected.

Claims

1. A method for producing a membrane protein on a pilot or industrial scale, including the following steps:

a) expression of this membrane protein in the host organism present in the aquatic environment,

b) i) releasing the membrane protein from the host by mechanically lysing cells of the host to produce lysed cell fragments comprising the membrane protein, and

ii) isolating fragments of lysed cells containing this membrane protein as a solid fraction by centrifugation,

c) adding a detergent solution to the resuspended solid fraction obtained in b) to solubilize the membrane protein,

d) isolating the liquid fraction of the solubilized membrane protein obtained in c) as a supernatant by centrifugation,

e) performing chromatography on the liquid fraction to bind or retain the membrane protein on the stationary phase, and

f) eluting the membrane protein from the stationary phase with an elution buffer to obtain said membrane protein,

wherein the centrifugation in step d) is carried out at from 500 to 30,000 g, and this method does not include ultracentrifugation of the liquid fraction obtained in d).

2. The method according to claim 1, wherein the aqueous medium containing the host organism from step a) is filtered before releasing the membrane protein from the host in step b).

3. The method according to claim 2, wherein the aqueous medium containing the host organism from step a) is filtered through a microfiltration membrane having a pore diameter of 0.5 μm or less.

4. The method according to claim 2, wherein the host organism is isolated by centrifugation of the aqueous medium containing the host organism.

5. Method according to any one of paragraphs. 1-4, while centrifugation is carried out at from 1000 to 10000 g.

6. Method according to any one of paragraphs. 1-5, with a dilution buffer being added before step b).

7. Method according to any one of paragraphs. 1-6, wherein the release of the membrane protein from the host cells is carried out using a homogenizer.

8. Method according to any one of paragraphs. 1-7, wherein a cationic flocculant is added to the solubilized membrane protein in the liquid fraction from d) to form a suspension before centrifugation.

9. The method according to claim 8, wherein the cationic flocculant is a polyamine compound.

10. Method according to claim 8 or 9, wherein the cationic flocculant is left to react with the cellular contents of the resuspension with gentle stirring to form flocs.

11. The method according to claim 10, wherein the liquid fraction from step d) is recovered in the form of a supernatant from centrifugation of a suspension containing flakes.

12. Method according to any one of paragraphs. 1-11, wherein the detergent solution added in c) is selected from the group consisting of lauryl dimethylamine N-oxide (LDAO), octyl glucoside (OG), dodecyl maltoside (DDM), or combinations thereof.

13. Method according to any one of paragraphs. 1-12, wherein the membrane protein binds to the first part of the affinity pair, and the stationary phase binds to the second part of the affinity pair.

14. The method according to claim 13, wherein the first part of the affinity pair is a histidine tag.

15. The method according to claim 14, wherein the histidine tag contains 8 or more histidine molecules.

16. Method according to any one of paragraphs. 1-15, wherein the elution buffer contains imidazole.

17. The method of claim 16, wherein a stationary phase capable of binding or retaining a membrane protein is present in a column, and the column is washed before passing the elution buffer with a wash buffer containing imidazole at a concentration of 40% or less in the elution buffer.

18. The method according to claim 16 or 17, wherein the concentration of imidazole in the elution buffer is 400 mM or more.